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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis von Biomarkern im menschlichen oder tierischen Stuhl, welche zum Nachweis eines pathologischen Geschehens im Darm (z.B. chronische Pankreatitis CP, Pankreaskarzinom PC, Choledocholithiasis CDS, exokrine Pankreasinsuffizienz), insbesondere eines malignen Geschehens im Pankreas dienen. Die Erfindung betrifft des Weiteren Testkits sowie Reagenzien zur Durchführung dieser Verfahren.
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Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
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Der Gastrointestinaltrakt ist ein System, an dem die meisten Erkrankungen mit entzündlicher und/oder nicht entzündlicher Genese aber auch Tumoren im Vergleich zu anderen Organsystemen des Körpers auftreten.Eine der schwer in der Frühphase erkennbaren Tumorarten ist das Pankreaskarzinom. Zwischen der Erstdiagnose (leider oft zu spät gestellt, da es bisher kein einfaches Verfahren zur Früherkennung des Pankreastumors gibt)und dem Ableben des Patienten liegen oft nur wenige Monate.
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Aus den Literaturstellen
WO 01/21826 A2 ,
WO 02/50546 A2 und
WO 03/069343 A2 sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Markern (genauer: Biomarkern, insbesondere Tumormarkern) für Tumore des Gastrointestinaltrakts bekannt, bei welchen der Stuhl eines Probanden auf den Tumormarker untersucht wird. Einige Verfahren haben sich ausgezeichnet bewährt (siehe z.B. Kim, Y. C. et al., „The Usefulness of a Novel Screenig Kit for Colorectal Cancer using the Immunochromatographic Fecal Tumor M2 Pyruvate Kinase Test“, Gut and Liver, 2014, in print). Einige Verfahren weisen allerdings noch eine zu hohe Anzahl von falsch-negativen und/oder falsch-positiven Ergebnissen auf (siehe auch
Brenner et al., European Journal of Cancer Prevention, 2013, 22:305-310). Dies ist verbesserungsfähig. Ähnliches gilt für histologische Nachweismethoden: Auch diese sind falsch-negativen, aber auch falsch-positiven Ergebnissen behaftet.
Auf der anderen Seite sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Tumormarkern für Tumore bekannt, welche auf einem Nachweis der Tumormarker in Blut bzw. Serum basieren(siehe z. B. Anticancer Research 19:2785-2820 (1999);
WO 03/065003 A2 ;
Leman ES et al., Cancer Res. 67(12):5600-5605 (2007) und
Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008)). Während dies einerseits vorteilhaft ist, um eine Tumorerkrankung überhaupt zu diagnostizieren, lässt andererseits der Nachweis eines Markers für verschiedenste Tumorerkrankungen keine sichere Aussage über die Art und die Lokalisation des betroffenen Organs oder Gewebes zu, da Tumormarker in den seltensten Fällen wirklich Gewebe-spezifisch sind und damit bei einem positiven Ergebnis einer Blutanalyse auf den Tumormarker kein sicherer Rückschluss auf das betroffene Gewebe möglich ist. Es sind also zusätzlich aufwändige und komplizierte Diagnosemethoden notwendig, um die tatsächlich vorliegende Tumorart sicher festzustellen.
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Tumormarker sind Genprodukte, die in Tumorgewebe differenziell gegenüber normalem Vergleichsgewebe exprimiert werden, i.e. ein Tumormarker wird in Tumorgewebe gegenüber normalem Gewebe entweder über- oder unterexprimiert. Für die Praxis sind Tumormarker wichtiger, welche überexprimiert werden, da dann ein positives Analysenergebnis (Vorliegen des Markers) einer Probe indizielle für das Vorliegen des Marker-spezifischen Tumors ist. Tumormarker liegen im Zytoplasma der Gewebezellen vor, können jedoch auch in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin, Schweiss, Sperma, Speichel usw. aber auch im Stuhl vorkommen.
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Ein Tumormarker sollte folgende Eigenschaften haben: i) hohe Spezifität, d. h. bei benignen Erkrankungen und gesunden Personen nicht nachweisbar, ii) hohe Sensitivität, d. h. er kann in einem hohen Prozentsatz der Tumorpatienten nachgewiesen werden, iii) Organspezifität, iv) gute Korrelation mit den Tumorstadien bzw. der Tumormasse, v) Beziehung zur Prognose und vi) verlässliche Vorhersagewerte. Die Kriterien der 100 % igen Spezifität und der 100 % igen Sensitivität sowie die anderen aufgeführten Kriterien werden bis heute von keinem der bekannten Tumormarker erfüllt.
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U.a. für Tumore des Gastrointestinaltraktes spezifische Tumormarker umfassen CCSA-2, CCSA-3, CCSA-4, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6a, CC6b, L1, L2, N1, N2, N3, N4, N5, und N6 (siehe z. B.
WO 03/065003 A2 ;
Leman ES et al., Cancer Res. 67(12):5600-5605 (2007) und
Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008)). Diese Tumormarker werden im Stand der Technik jedoch nur im Rahmen von Blut- bzw.- Plasmatests verwendet, was zu den vorstehend genannten Nachteilen führt.
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Zur Diagnose eines Pankreastumors kann CA 19-9 im Blut bestimmt werden. Die Bestimmung dieses Markers im Blut ist jedoch nicht zur Frühdiagnose eines Pankreastumors geeignet, da das CA 19-9 erst im Blut auftritt, wenn der Tumor des Pankreas in seiner Entwicklung bereits einen Zugang zum Gefäßsystem erstellt hat. Es ist jedoch ein großer Wunsch, Verfahren bereits zu stellen, die eine Frühdiagnose des Pankreastumors erlauben. Dieses technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bestimmung der folgenden Genprodukte (Proteine) im Stuhl von Probanden/Tumorpatienten. Das Auftreten der erfindungsgemäßen Biomarker (im Folgenden) ist früher als im Blut (Gefäßsystem), da z.B. das Pankreas eine exokrine Drüse darstellt, die einen direkten Zugang zum Gastrointestinaltrakt besitzt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Proteine (im Folgenden) schon sehr früh in der Tumorgenese im Probenmaterial des Stuhls nachzuweisen sind. Dieser Marker eignet sich jedoch nicht zur Erstdiagnose, da der Marker ebenfalls beim Magenkarzinom und beim Gallenwegskarzinom erhöht ist. Weiterhin ist der Marker CA 19-9, wie alle Tumormarker, auch bei entzündlichen Prozessen erhöht. Die Bestimmung von CA 19-9 erfolgt in der klinischen Routine nur im Rahmen einer Verlaufs- und Therapiekontrolle.
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Es ist wünschenswert, mittels einfacher Verfahren z.B. immunchemischen, molekularbiologischen z.B. PCR-Verfahren möglichst frühzeitig ein tumoröses Geschehen im Pankreas, insbesondere in einer Wachstumsphase, in der der Tumor noch keinen Kontakt mit dem Gefäßsystem des Körpers aufgenommen hat nachweisen zu können.
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Da es beim Pankreaskarzinom häufig zu einer exokrinen Pankreasinsuffizienz kommt oder eine schwere chronische Pankreatitis mit Insuffizienz zum Pankreaskarzinom entarten kann, empfiehlt es sich, das Protein Elastase 1 im Stuhl mitzubestimmen, um neben dem tumorösen Geschehen gleichzeitig eine exokrine Pankreasinsuffizienz zu diagnostizieren und anschließend mit Substitutionspräparaten zu behandeln oder auszuschließen.
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Technisches Problem der Erfindung
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Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, ein Verfahren zum Nachweis von Tumormarkern aus Tumoren oder Vorstufen von Tumoren des Pankreas anzugeben, welches in Hinblick auf die Sicherheit der erhaltenen diagnostischen Aussage verbessert ist.Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zu Grunde, den weiterhin bestehenden Bedarf an spezifischen, leicht durchzuführenden Verfahren zu befriedigen, sodass ein entzündliches, nicht entzündliches aber auch neoplastisches Geschehen im Intestinaltrakt, bevorzugt jedoch des Pankreas, besonders frühzeitig und zweifelsfrei nachgewiesen werden kann. Bei diesem Verfahren zur Pankreaskarzinom-Diagnostik sollen entzündliche Prozesse möglichst nicht erkannt werden.
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Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
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Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung Verfahren und Testkits mit allen Reagenzien zur Durchführung und zum Nachweis eines malignen Geschehens im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1, CTRB (CTBR1), ELA3A, ELA3B und PRSS2“ bestimmt werden. Bevorzugt werden PLRP1 und/oder PRSS2 jeweils einzeln oder in Kombination bestimmt. Ganz besonders bevorzugt wird PLRP1 bestimmt.
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Für den erfindungsgemäßen Zweck kann es ausreichend sein, Fragmente der genannten Tumormarker zu bestimmen. Ferner können post-translationale Modifikationen, Isoenzyme und/oder kodierende RNA/DNA, insbesondere mRNA(messenger RNA)Sequenzen der Proteine bestimmt werden.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Nachweis eines malignen Geschehens im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls eine oder mehrere der o.g. Proteine bestimmt wird.
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Bei dem Protein PLRP1 handelt es sich um das „pancreatic lipase related protein 1“ mit einem Molekulargewicht von 50 kDa (EC 3.1.1., EC 3.1.1.3)gehört PLRP1 zur Familie der Lipasen und wirkt als negativer Regulator der pankreatischen Lipase. Es tritt im Pankreassaft auf.
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Bei dem Protein PRSS2 (Serine proteinase-2 Preproprotein) handelt es sich um ein Protein von 27 kDa. Es handelt sich um die Protease, Serin 2 (Trypsin-2) (EC 3.4.21.4) und gehört zu den Serin Proteasen. Es findet sich im Pankreassaft.
Bei dem Protein CTRB handelt es sich um Chymotrypsin (EC 3.4.21.1). (Chymotrypsinogen B)
Bei dem Protein PLRP1 (PNLIPRP1) handelt es sich um pancreatic lipase-related protein-1.
Bei dem Protein ELA3B handelt es sich um das Protein Elastase 3B. Bei dem Protein ELA3A handelt es sich um das chymotrypsin like elastase family member 3A.
Bei dem Protein ELA3B handelt es sich um das chymotrypsin like elastase family member 3B.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werdenzwei Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1 und PRSS2“ bestimmt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Proteine PLRP1 und PRSS2 in einer Stuhlprobe bestimmt.
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Es wurde gefunden, dass sich der Gehalt der o.g. Proteine im Stuhl von Pankreastumorpatienten nachweisen und bestimmen lässt, wobei der Gehalt an der betreffenden Kombination der Tumormarker mit dem Grad des malignen Geschehens im Pankreas korreliert ist: Der Gehalt der Proteine, z.B. von PLRP1 und PRSS2,im Stuhl steigt mit der Größe des Tumors. Dies ist umso überraschender, weil umfangreiche Untersuchungen bezüglich anderer spezifischer Proteine im Stuhl keine Hinweise auf ihre Verwendung als Tumormarker zuließen. Aufgrund dieser Korrelation der Tumorgröße mit dem Gehalt des Markers im Stuhl ist auch eine Verlaufskontrolle der Therapie möglich.
Sowohl die Struktur als auch die physiko-chemischen Eigenschaften der genannten Tumormarker werden offensichtlich in Folge der erheblichen proteolytischen Aktivität und den extremen physiologischen Gegebenheiten (z. B. alkalisch im Darm) des Gastrointestinaltraktes nicht nachhaltig beeinträchtigt. Dies gilt auch für den Nachweis der Proteine mittels immunologischer Methoden. Besonders überraschen war, dass bei Messung von Proteinkombinationen eine deutliche Verbesserung der Diagnosegenauigkeit(insbesondere bezüglich der Abgrenzung zwischen PC, CP, CDS) eintrat, insbesondere eine signifikante Absenkung der falsch-negativen, aber auch der falsch-positiven Befunde.
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Erfindungsgemäß wurde festgestellt und gezeigt, dass sich trotz der oben beschriebenen Proteindenaturierung und Proteinverdauung im Gastrointestinaltrakt ein spezifischer Nachweis mehrerer der Proteine im Stuhl von menschlichen Probanden/Tumorpatienten durchführen lässt.
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Es wird darauf hingewiesen, dass eine Stuhlprobe nicht als eine „Körperflüssigkeit“-Probe betrachtet werden kann, da sich der gesamte Gastrointestinaltrakt biologisch gesehen außerhalb des Körpers befindet.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nun möglich, in einem nicht-invasiven Verfahren auf einfache Weise durch Bestimmung mehrerer der besagten Proteine ein malignes Tumorgeschehen im Stuhl nachzuweisen und gleichzeitig bei positiver Testführung eindeutig festlegen zu können, dass ein Tumor im Pankreas und nicht sonstwo im Körper vorliegt.
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Mit diesem Verfahren gelingt nicht nur die Primärdiagnose, sondern es kann auch eine Verlaufskontrolle vorgenommen werden. Wegen der individuellen Proteinverteilung ist eine individuelle Diagnostik möglich.
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Überraschenderweise ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die besagten Tumormarker mit entsprechend angepassten Testsystemen nach dem Stand der Technik als freie Proteine im Stuhl nachzuweisen. Damit ist keine Isolierung von Zellen aus dem Stuhl und die Analyse der in den Zellen enthaltenen Proteine erforderlich. Diese Möglichkeit, nämlich dass diese Biomarker nach z. B. Darmpassage im Stuhl immunchemisch nachweisbar bleiben, war nicht zu erwarten, da normalerweise eine weitgehende Zersetzung (Denaturierung bewirkt immunchemische Veränderung, d.h. z.B. beeinträchtigte Bindungseigenschaften für z.B. Antikörper)der betreffenden Proteine im Zuge des normalen Verdauungsvorganges zu erwarten gewesen wäre.
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Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass besagte Proteine quantitativ sogar auch bei intensiv homogenisierten, länger gelagerten Stuhlproben (zum Beispiel beim Probenversand) immunchemisch nachweisbar bleiben. Auch bei starker Verdünnung des Stuhls wird eine deutliche Reaktion erhalten. Vorzugsweise ist jedoch ein Extraktionsverfahren beispielsweise unter Verwendung eines speziellen Detergens (z.B. CHAPS) zu verwenden (das Extraktionsverfahren wird näher in Beispiel 2 beschrieben).
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das maligne Geschehen im Pankreas eines Menschen oder eines Tieres bestimmt. Dadurch ist es möglich Beschwerden, die durch einen Pankreastumor verursacht werden durch Messung von PLRP1 und/oder PRSS2 von anderen Krankheiten z.B. PC, CP, CDS abzugrenzen, weil sich letztere insbesondere durch die Erhöhung von ELA3A, ELA3B und/oder CRBT bemerkbar machen. Weiterhin ist es bevorzugt, das oder die Proteine immunochemisch nachzuweisen, insbesondere mittels anti-Protein-Antikörper. Es können monoklonale oder polyklonale Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden Antikörper eingesetzt, welche nicht mit anderen Bestandteilen des Stuhls, insbesondere nicht mit anderen Stuhlproteinen kreuzreagieren.
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Fragmente im Sinne der Erfindung sind Proteine oder Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, welche identisch mit einer Teilsequenz eines der besagten Tumormarker ist. Die Länge eines Fragments kann von 5 aa (aa = Aminosäuren) bis zu n-1 aa (n = Länge des Tumormarkers, aus welchem das Fragment herrührt) betragen. Typischerweise wird die Länge mehr als 10 aa betragen.
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Erfindungsgemäß einsetzbare polyklonale, monoklonale Antikörper können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen, polyklonalen Antikörpern gut bekannt. Beispielsweise wird hierzu das Antigen, im vorliegenden Fall also ein ausgewähltes Protein, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. Prinzipiell kann hierzu das Verfahren, welches erstmals von Koehler und Milstein beschrieben wurde, angewandt werden, wobei dem Fachmann auch Abwandlungen und Weiterentwicklungen dieser Verfahren bekannt sind. Mit dieser Herstellung können spezifische monoklonale Antikörper erhalten werden, wobei die Spezifität durch Selektion festgestellt werden kann. Die Selektion erfolgt auf spezifische Antikörper, welche an eines der ausgewählten Proteine, jedoch nicht an andere Stuhlproteine binden.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis nach dem Prinzip des Immunoassays. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Immunoassay wird in der Weise durchgeführt, dass man a) die Probe mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren in Kontakt bringt, von denen der erste Rezeptor R1 in fester Phase vorliegt und mit dem ausgewählten Protein bindefähig ist und der zweite Rezeptor R2 in flüssiger Phase vorliegt und ebenfalls mit dem gleichen Protein bindefähig ist, wobei der Rezeptor R2 eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt, b) die feste von der flüssigen Phase trennt, und c) die Markierung oder das detektierbare Molekül in einer der Phasen, bevorzugt in der festen Phase bestimmt und entsprechend die Menge an in der Probe vorhandenemProtein quantifiziert, wobei man als mindestens einen der Rezeptoren R1 oder R2 einen Antikörper verwendet, der spezifisch mit dem Protein bindefähig ist und insbesondere an kein anderes Stuhlprotein bindet.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird sowohl als Rezeptor R1 als auch als Rezeptor R2 ein Antikörper gegen das jeweils zu bestimmende Protein eingesetzt.
Neben der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Immunoassays und insbesondere eines ELISA können auch andere Nachweistechnologien eingesetzt werden, z. B. die Schwingquarz-Technologie, Mikrowaage-Technologie, Lateral-Flow-Technologie, Kandelaber-Technologie, TRACE-Technologie oder Elektrochemilumineszenz-Technologie aber auch die Agglutination mit Mikro- oder Nanopartikeln sowie Multiplex-Technologien an der Flüssig- oder Festphase oder Array-Technologien, wie beispielsweise mittels Proteinchips.
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In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens kann die feste Phase des Immunoassays auch durch Mikro-Stereolithographie hergestellt sein. Alternative Separationsmöglichkeiten werden beschrieben von Jungbauer et al., „Monoliths for fast bioseparation and bioconversion and their applications in biotechnology", Journal of seperation science, 27:767-778, July 2004. Weitere Verbesserungen der Chromatographietechniken werden beschrieben von Novakova et al., „A review of current trends and advances in modern bioanalytical methods: Chromatography and sample preparation", Analytica Chimica Acta, 656 (2009) 8 - 35. Weitere Methoden werden beschrieben von Pfaunmiller E.L., „Affinity monolith chromatography: a review of principles and recent analytical applications", Anal Bioanal Chem., 2013 (405) 2133-2145. Weitere Verbesserungen der Nachweisbarkeit können über sogenannte „optical fiber arrays, insbesondere optical fiber microarrays“ erzielt werden, siehe z.B. „Analytical chemistry on the femtoliter scale“, Walt D. R., Angewandte Chemie 2010, 49, 3880-3895 sowie weitere Publikationen von D. R. Walt. Darüber hinaus können Verbesserungen durch Verwendung von gedruckten Sensoren erzielt werden. Hierzu sind beispielsweise hybride CMOS Sensoren verwendbar, auf die die stationäre Phase eines Immunassays mit Drucktechniken, wie beispielsweise Tintenstrahldruckern aufgetragen sind. Alternativ ist es möglich, einen entsprechenden Sensor, z. B. einen CMOS Sensor auf eine herkömmliche stationäre Phase, beispielsweise enthaltend Nitrozellulose, aufzubringen. Diese Aufbringung kann beispielsweise nach der Auftragung der Probe erfolgen. Eine derartige Technologie erlaubt es entsprechende Tests stärker zu automatisieren und damit unabhängig zu machen von den subjektiven Eindrücken von Ärzten und/oder Laboranten. Die Auswertung basiert auf der ortsaufgelösten Bestimmung von Strom bzw. Widerständen, der Impedanz oder von magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel, die sich nach den Prinzipien der Chromatographie auf der stationären Phase verteilen.
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Verbesserungen an den üblichen Teststreifen, welche für lateral-flow tests herangezogen werden führen bereits heute zu signifikant besseren Testergebnisse, siehe z.B. Fenton E. M. et al., „Multiplex lateral-flow test strips fabricated by twodimensional shaping“, ACS Appl. mater. interfaces, 2009, 1, 124-129.
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Diese Technologien sind dem Fachmann gut vertraut und brauchen daher hier nicht näher erläutert zu werden.
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Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Testkit zum Nachweis oder/und zur Diagnose eines malignen Tumorgeschehens im Pankreas in Menschen oder Tieren, welcher insbesondere zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens vorgesehen ist, mittels Bestimmung von Proteinen ausgewählt aus „PLRP1, CTRB, PRSS2, ELA3B und ELA3A“, insbesondere einer Proteinkombination, wobei der Testkit mindestens zwei monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen mindestens zwei der genannten Proteine enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des Testkits ist einer der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper ein Antikörper gegen PLRP1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Testkits ist neben dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen PLRP1 eine Bestimmung von ELA3B oder ELA3A vorgesehen. In alternativen Ausführungsform des Testkits ist neben dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen PLRP1 eine Bestimmung von PRSS2 oder CTRB vorgesehen.
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Bevorzugt enthält das Testkit einen Antikörper für das entsprechende Protein, der mit keinem anderen Stuhleiweiß kreuzreagiert. Das Testkit kann gegebenenfalls weitere für die Durchführung eines Immunoassays oder für die Durchführung des jeweils vorgesehenen Testverfahrens notwendige Reagenzien enthalten. Vorzugsweise enthält das Testkit einen an eine Festphase gebundenen, für mindestens einen der genannten Proteine spezifischen Antikörper.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Antikörpern gegen eines der besagten Proteine zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Tumormarkern im menschlichen oder tierischen Stuhl sowie ein Reagenz zur selektiven quantitativen Bestimmung des Tumormarkers.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, welche spezifisch eines der besagten Proteine binden und vorzugsweise mit keinem anderen Stuhlprotein kreuzreagieren. Die Antikörper können beispielsweise nach der Methode von Koehler und Milstein (Nature 256,495-497 (1995)) erzeugt werden.
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Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Aptamere oder Spiegelmere und deren Verwendung an Stelle der vorstehend beschriebenen Antikörper (es gelten alle Antikörper-bezogenen Ausführungen analog), welche spezifisch an eines der besagten Proteine binden und optional mit keinem anderen Stuhlprotein kreuzreagieren. Aptamere sind Oligonukleotidsequenzen, welche spezifische Bindeeigenschaften aufweisen. Solche Aptamere können beispielsweise nach den in
US 5,270,163 oder in Sumedha, Clin. Chem. 45 (1999), 1628-1650 beschriebenen Methoden hergestellt bzw. identifiziert werden. Spiegelmere sind Aptamere, welche aus L-Oligonukleotiden gebildet sind.
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Die Auswertung der erfindungsgemäßen Tests erfolgt unter Nutzung der automatischen Klassifikation, Clusteranalyse, Mustererkennung. Insbesondere werden Verfahren der „maximumlikelihood-Methode“ bzw. der Clusterzugehörigkeit über Wahrscheinlichkeitsverteilungen angewandt. S. auch z. B.
Attia, John, „Moving beyond sensitivity and specifity: Using likelihood ratios to help interprete diagnostic tests" sowie Deeks, J. J., „Diagnostic tests 4: Likelihood ratios," BMJ 2004; 329 (7458): 168-169.
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Die Messung der in den Ansprüchen genannten Proteine kann auch im Rahmen eines sogenannten Multiplexing-Assays, z.B. eines Multiplexing-ELISA-Assays geschehen.
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In jedem Fall enthält ein erfindungsgemäßes Testkit eine Probenentnahmevorrichtung für Stuhl. Hierfür kommen alle fachüblichen Vorrichtungen in Frage, z.B. die in der
DE10205709A1 genannte.
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Es versteht sich von selbst, dass die erfindungsgemäßen Tests auch zur Bestimmung von Gewebeproben, z.B. von Biopsien, verwendet werden können
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Beispiele
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1: Testkit zur erfindungsgemäßen Tumormarker-Bestimmung mittels Lateral-Flow Technologie
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Das Testkit auf Basis eines Immunossays besteht aus einer Probeentnahme- und vorbereitungsvorrichtung sowie einer Testkassette.
Die Probeentnahmevorrichtung enthält ein Stäbchen, welches die benötigte Stuhlmenge (4-30 mg , bevorzugt 25 mg) aufzunehmen vermag. Die Probeentnahmevorrichtung enthält weiterhin ein Röhrchen zur Probenaufnahme, welche mit Pufferlösung gefüllt ist.
Die wässrige Pufferlösung für den Tumor PLRP1-Test enthält folgende Bestandteile:
- Puffer 1 = 10-70 mM Phosphatpuffer (pH 6,7-7,6) oder Puffer 2 = 10-70 mM Hepespuffer (pH 7,6-8,2) oder Puffer 3 = 10-70 mM Triäthanolamin (pH 7,3-7,7) bevorzugte Mischungen hiervon jeweils Volume 1:1:1
- Detergenz 1 = CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, 10 mM-50 mM (Sigma), Detergenz 2 = Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01% - 0,1 %), z.B. von Biochrom, Detergenz 3 = Lauryldimethylamine Oxide (10 mM-50mM), z.B. von Biochrom oder Mischungen hiervon.
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Verwendete Antikörper
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Die zur Messung benötigten 2 Antikörper (jeweils 1 in der „Flüssigphase“ und 1 Antikörper in der „festen Phase“ befindliche spezifisch bindefähige Antikörper) können jeweils polyklonal bevorzugt jedoch monoklonal sein.
Die polyklonalen, als auch die monoklonalen Antikörper sind erhältlich nach dem Stand der Technik durch die klassischen Methoden der Immunisierung von Tieren mit dem jeweiligen Antigen oder bevorzugt durch die Verwendung der Hybridoma-Methode nach Köhler und Mielstein.
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PLRP1 Antikörper
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Bevorzugt zum Aufsprühen auf die Nitrozellulosemembran ist ein monoklonaler Antikörper der Maus. Dieser Klon kann durch Hybridisierung von Myelomazellen mit B-Lymphozyten der Maus generiert worden. Als Immunogen dient beispielsweise rekombinante humane PLRP1 aus E. coli.
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Eine der wichtigen Bedingungen zur Auswahl des Antikörpers ist, dass dieser nicht mit anderen Bestandteilen des Stuhls kreuzreagieren dürfen.
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Detergenz 1 (CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, 10 mM (Sigma)), Detergenz 2 = Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01% - 0,1 %), z.B. von, Detergenz 3 = Lauryldimethylamine Oxide (10 mM-50mM), z.B. von Biochrom oder Mischungen hiervon.
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Die Entnahmevorrichtung zur Durchführung des Hämoglobintests enthält einen der oben beschriebenen Puffer (1,5-2,5 ml). Die zu testende Person sticht mit der Dosierspitze in den Stuhl und überführt die Stuhlprobe in das mit dem entsprechenden Puffer gefüllte Röhrchen.
Die Entnahmevorrichtung für den PLRP1 Test, die der zu testenden Person vom Arzt übergeben wird, enthält keinen Puffer. Der Patient sticht mit der Dosierspitze in den Stuhl und überführt die Stuhlprobe in das leere Röhrchen.
Das erfindungsgemäße Testkit enthält weiterhin eine Testkassette, in der die nach dem Stand der Technik verbesserten beiden Immunoassays durch Lateral-Flow-Technologie durchgeführt werden. Die Testkassette enthält zu diesem Zweck eine, vorzugsweise runde, Aussparung zum Auftragen der Stuhlproben sowie eine weitere, vorzugsweise längliche, Aussparung zur Ablesung der Testergebnisse.
Die Testkassette enthält in ihrem Inneren als stationäre Phase Nitrozellulose folgender bevorzugter Kapillarflussrate von 135 sec/4 cm.
Die Antikörper sind an Kolloide, bevorzugt Goldkolloide oder Latexkolloide gekoppelt, bevorzugt an Goldkolloide mit 20 Nanometern Durchmesser.
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Der Anwender startet den chromatographischen Test durch Auftropfen von PLRP1-Stuhlproben-Extrakt in das Probenfenster der Kassette (stellt dann den Timer auf 5 Minuten). Das Ergebnis des Tests wird nach Ablauf der 5-minütigen Stoppzeit abgelesen.
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Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Analytkonzentration mittels Biosensoren zu bestimmen wie z.B. amperometrische Sensoren, potentiometrische, ionenselektive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET), chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET), suspendedgate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in E. A. H. Hall und G. Hummel in „Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in „Aktuelle Trends in der Immunsensorik", Labor 2000, S. 70-96 (1993) beschrieben.
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Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sogenannte Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit dem zu analysierenden Protein gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von A. Leidl et al. in „Proceedings of the Second International Symposium on Minaturized Total Analyses Systems, µTAS“, Basel 1996, beschrieben.
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Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349 : 349-354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen oder z. B. auch die Kandelaber-Technologie von IBM, Inc. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Analytkonzentration mittels immunchromatographischer Methoden, d. h. mittels sogenannter Visual-Rapid-Tests (Lateral-Flow-Tests) zu bestimmen.
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Eine signifikante Verbesserung bezüglich Sensitivität, dynamischer Messbereich, Analysenkinetik und Formatflexibilität lässt sich durch die Verwendung der Elektrochemolumineszenz-Technologie erreichen. Unter Elektrochemolumineszenz versteht man einen Prozess, bei welchem Licht freigesetzt wird. Die Lichtfreisetzung wird dadurch induziert, indem ein elektrisches Potenzial an eine Elektrode angelegt wird, welche eine zyklische Oxidation/Reaktion beispielsweise eines Ruthenium-Metallions vermittelt (Bruno, G. (1997) Rec. Rp. S. 175-179 ; Williams R. (1996), Amer. Biotech., S. 26). Eine ähnliche Technologie ist die TRACE-Technologie der Firma CIS.
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Es ist aber auch möglich, das Protein mittels einer massenspektrometrischen Methode, beispielsweise mittels MALDI-TOF nach fachüblicher Aufbereitung der Stuhlprobe direkt zu bestimmen.
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Beispiel 3 Einwiegen der Stuhlproben
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Ein etwa 12 ml umfassendes Einwegröhrchen und eine mikrobiologische Impföse (z. B. Sarstedt) werden mit einer empfindlichen digitalen Laborwaage auf 0 austariert. Anschließend wird mit der Impföse der Stuhl eingewogen, indem man mit der Öse in die Stuhlprobe sticht und die an der Spitze verbleibende Stuhlmenge (etwa 100 mg) in das Einwegröhrchen einbringt. Anstelle der Impföse kann auch ein Zahnstocher benutzt werden.
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Entsprechend der gewogenen Stuhlprobenmasse werden die Volumina des zuzugebenden Extraktionspuffers variiert (z. B. 100 mg Stuhl + 10 ml Puffer oder 75 m g Stuhl + 7,5 mi Puffer). Endkonzentration : 10 mg Stuhl/ml Extraktionspuffer.
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Beispiel 4: Homogenisation und Extraktion der Stuhlproben
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Die Stuhlprobensuspension wird bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglas-Schüttelgerät (z. B. VORTEX) gemixt. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein. Um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten, ist es zweckmäßig, dem phosphatgepufferten Extraktionspuffer das Detergenz CHAPS (3- [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- propansulfonat, 10 mM (Sigma) beizumischen.
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Beispiel 5: Stuhlprobenpräparation
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Die Stuhlprobe lässt sich vorteilhaft mit dem Stuhldosierungssystem (Quick-Prep) der Firma ScheBo®Biotech AG durchführen.
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Beispiel 6: Stuhlprobe
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- a) Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung des Proteins PLRP1 im Stuhl. Positiver Befund, d.h. eine Konzentration (eine Abweichung von den Normalwerten) von >75 µg/g Stuhl PLRP1 und/oder 100 µg/g Stuhl für PRSS2deutet auf ein Pankreaskarzinom hin.
- b) In einer Variante der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Proteinkombination „PLRP1 und/oder PRSS2, ELA3B, Elastase 1“ in Stuhl. Positiver Befund, d.h. eine Konzentration von >75 µg/g Stuhl PLRP1 und/oder > 100 µg/g Stuhl für PRSS2deutet auf ein Pankreaskarzinom hin. Ist die Konzentration von ELA3A, ELA3B, Elastase 1 < 200 µg/g Stuhl, so deutet dieses zusätzlich auf eine exokrine Pankreasinsuffizienz hin.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 0121826 A2 [0003]
- WO 0250546 A2 [0003]
- WO 03/069343 A2 [0003]
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