DE102018000815A1 - Method for the detection of biomarkers in the stool for the detection of diseases of the intestinal tract - Google Patents

Method for the detection of biomarkers in the stool for the detection of diseases of the intestinal tract Download PDF

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Abstract

Die Erfindung lehrt ein Verfahren zum Nachweis eines eines Tumors im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1, PRSS2“ gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Proteinen ausgewählt aus der Gruppe „CTRB, ELA3B, ELA3A“bestimmt wird sowie Testkits zur Durchführung eines solchen Verfahrens.The invention teaches a method for detecting a tumor in the pancreas, wherein in a sample of human or animal stool one or more proteins selected from the group "PLRP1, PRSS2" optionally together with one or more proteins selected from the group "CTRB, ELA3B, ELA3A "and test kits for carrying out such a method.

Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die Erfindung betrifft Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis von Biomarkern im menschlichen oder tierischen Stuhl, welche zum Nachweis eines pathologischen Geschehens im Darm (z.B. chronische Pankreatitis CP, Pankreaskarzinom PC, Choledocholithiasis CDS, exokrine Pankreasinsuffizienz), insbesondere eines malignen Geschehens im Pankreas dienen. Die Erfindung betrifft des Weiteren Testkits sowie Reagenzien zur Durchführung dieser Verfahren.The invention relates to methods for the qualitative and / or quantitative detection of biomarkers in the human or animal stool, which serve to detect a pathological event in the intestine (eg chronic pancreatitis CP, pancreatic carcinoma PC, choledocholithiasis CDS, exocrine pancreatic insufficiency), in particular a malignant event in the pancreas , The invention further relates to test kits and reagents for carrying out these methods.

Stand der Technik und Hintergrund der ErfindungPrior art and background of the invention

Der Gastrointestinaltrakt ist ein System, an dem die meisten Erkrankungen mit entzündlicher und/oder nicht entzündlicher Genese aber auch Tumoren im Vergleich zu anderen Organsystemen des Körpers auftreten.Eine der schwer in der Frühphase erkennbaren Tumorarten ist das Pankreaskarzinom. Zwischen der Erstdiagnose (leider oft zu spät gestellt, da es bisher kein einfaches Verfahren zur Früherkennung des Pankreastumors gibt)und dem Ableben des Patienten liegen oft nur wenige Monate.The gastrointestinal tract is a system in which most diseases with inflammatory and / or noninflammatory genesis but also tumors occur in comparison to other organ systems of the body. One of the hard-to-detect types of tumors is pancreatic carcinoma. Between the first diagnosis (unfortunately often too late, since there is no simple method for the early detection of the pancreatic tumor) and the death of the patient are often only a few months.

Aus den Literaturstellen WO 01/21826 A2 , WO 02/50546 A2 und WO 03/069343 A2 sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Markern (genauer: Biomarkern, insbesondere Tumormarkern) für Tumore des Gastrointestinaltrakts bekannt, bei welchen der Stuhl eines Probanden auf den Tumormarker untersucht wird. Einige Verfahren haben sich ausgezeichnet bewährt (siehe z.B. Kim, Y. C. et al., „The Usefulness of a Novel Screenig Kit for Colorectal Cancer using the Immunochromatographic Fecal Tumor M2 Pyruvate Kinase Test“, Gut and Liver, 2014, in print). Einige Verfahren weisen allerdings noch eine zu hohe Anzahl von falsch-negativen und/oder falsch-positiven Ergebnissen auf (siehe auch Brenner et al., European Journal of Cancer Prevention, 2013, 22:305-310 ). Dies ist verbesserungsfähig. Ähnliches gilt für histologische Nachweismethoden: Auch diese sind falsch-negativen, aber auch falsch-positiven Ergebnissen behaftet.
Auf der anderen Seite sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Tumormarkern für Tumore bekannt, welche auf einem Nachweis der Tumormarker in Blut bzw. Serum basieren(siehe z. B. Anticancer Research 19:2785-2820 (1999); WO 03/065003 A2 ; Leman ES et al., Cancer Res. 67(12):5600-5605 (2007) und Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008) ). Während dies einerseits vorteilhaft ist, um eine Tumorerkrankung überhaupt zu diagnostizieren, lässt andererseits der Nachweis eines Markers für verschiedenste Tumorerkrankungen keine sichere Aussage über die Art und die Lokalisation des betroffenen Organs oder Gewebes zu, da Tumormarker in den seltensten Fällen wirklich Gewebe-spezifisch sind und damit bei einem positiven Ergebnis einer Blutanalyse auf den Tumormarker kein sicherer Rückschluss auf das betroffene Gewebe möglich ist. Es sind also zusätzlich aufwändige und komplizierte Diagnosemethoden notwendig, um die tatsächlich vorliegende Tumorart sicher festzustellen.
From the literature WO 01/21826 A2 . WO 02/50546 A2 and WO 03/069343 A2 Various methods for the detection of markers (more precisely, biomarkers, in particular tumor markers) for tumors of the gastrointestinal tract are known in which the stool of a subject is examined for the tumor marker. Some methods have proven to be excellent (see, for example, Kim, YC et al., "The Usefulness of a Novel Screening Kit for Colorectal Cancer Using the Immunochromatographic Fecal Tumor M2 Pyruvate Kinase Test," Gut and Liver, 2014, in print). However, some methods still have too many false-negative and / or false-positive results (see also Brenner et al., European Journal of Cancer Prevention, 2013, 22: 305-310 ). This is capable of improvement. The same applies to histological detection methods: These too are associated with false-negative but also false-positive results.
On the other hand, various methods for the detection of tumor markers for tumors are known which are based on detection of the tumor markers in blood or serum (see, for example, Anticancer Research 19: 2785-2820 (1999); WO 03/065003 A2 ; Leman ES et al., Cancer Res. 67 (12): 5600-5605 (2007) and Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14: 1349-1354 (2008) ). While this is on the one hand advantageous to diagnose a tumor disease at all, on the other hand, the detection of a marker for a variety of tumors no reliable statement about the nature and localization of the affected organ or tissue to, as tumor markers are really tissue-specific in the rarest cases, and Thus, in the case of a positive result of a blood analysis on the tumor marker, no reliable inference to the affected tissue is possible. In addition, complicated and complicated diagnostic methods are therefore necessary in order to determine the type of tumor actually present.

Tumormarker sind Genprodukte, die in Tumorgewebe differenziell gegenüber normalem Vergleichsgewebe exprimiert werden, i.e. ein Tumormarker wird in Tumorgewebe gegenüber normalem Gewebe entweder über- oder unterexprimiert. Für die Praxis sind Tumormarker wichtiger, welche überexprimiert werden, da dann ein positives Analysenergebnis (Vorliegen des Markers) einer Probe indizielle für das Vorliegen des Marker-spezifischen Tumors ist. Tumormarker liegen im Zytoplasma der Gewebezellen vor, können jedoch auch in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin, Schweiss, Sperma, Speichel usw. aber auch im Stuhl vorkommen.Tumor markers are gene products which are expressed in tumor tissue differentially from normal reference tissue, i.e. a tumor marker is either over- or under-expressed in tumor tissue over normal tissue. In practice, tumor markers are more important, which are overexpressed, since then a positive analysis result (presence of the marker) of a sample is indizielle for the presence of the marker-specific tumor. Tumor markers are present in the cytoplasm of the tissue cells, but may also be found in body fluids such as blood, urine, sweat, semen, saliva, etc. but also in the stool.

Ein Tumormarker sollte folgende Eigenschaften haben: i) hohe Spezifität, d. h. bei benignen Erkrankungen und gesunden Personen nicht nachweisbar, ii) hohe Sensitivität, d. h. er kann in einem hohen Prozentsatz der Tumorpatienten nachgewiesen werden, iii) Organspezifität, iv) gute Korrelation mit den Tumorstadien bzw. der Tumormasse, v) Beziehung zur Prognose und vi) verlässliche Vorhersagewerte. Die Kriterien der 100 % igen Spezifität und der 100 % igen Sensitivität sowie die anderen aufgeführten Kriterien werden bis heute von keinem der bekannten Tumormarker erfüllt.A tumor marker should have the following properties: i) high specificity, i. H. undetectable in benign diseases and healthy individuals, ii) high sensitivity, d. H. it can be detected in a high percentage of tumor patients, iii) organ specificity, iv) good correlation with tumor stages or mass, v) relationship with prognosis, and vi) reliable predictive values. The criteria of 100% specificity and 100% sensitivity as well as the other criteria listed are still not met by any of the known tumor markers.

U.a. für Tumore des Gastrointestinaltraktes spezifische Tumormarker umfassen CCSA-2, CCSA-3, CCSA-4, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6a, CC6b, L1, L2, N1, N2, N3, N4, N5, und N6 (siehe z. B. WO 03/065003 A2 ; Leman ES et al., Cancer Res. 67(12):5600-5605 (2007) und Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008) ). Diese Tumormarker werden im Stand der Technik jedoch nur im Rahmen von Blut- bzw.- Plasmatests verwendet, was zu den vorstehend genannten Nachteilen führt.Tumor markers specific to tumors of the gastrointestinal tract include CCSA-2, CCSA-3, CCSA-4, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6a, CC6b, L1, L2, N1, N2, N3, N4, N5, and N6 (see eg WO 03/065003 A2 ; Leman ES et al., Cancer Res. 67 (12): 5600-5605 (2007) and Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14: 1349-1354 (2008) ). However, these tumor markers are used in the prior art only in the context of blood and plasma tests, which leads to the disadvantages mentioned above.

Zur Diagnose eines Pankreastumors kann CA 19-9 im Blut bestimmt werden. Die Bestimmung dieses Markers im Blut ist jedoch nicht zur Frühdiagnose eines Pankreastumors geeignet, da das CA 19-9 erst im Blut auftritt, wenn der Tumor des Pankreas in seiner Entwicklung bereits einen Zugang zum Gefäßsystem erstellt hat. Es ist jedoch ein großer Wunsch, Verfahren bereits zu stellen, die eine Frühdiagnose des Pankreastumors erlauben. Dieses technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bestimmung der folgenden Genprodukte (Proteine) im Stuhl von Probanden/Tumorpatienten. Das Auftreten der erfindungsgemäßen Biomarker (im Folgenden) ist früher als im Blut (Gefäßsystem), da z.B. das Pankreas eine exokrine Drüse darstellt, die einen direkten Zugang zum Gastrointestinaltrakt besitzt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Proteine (im Folgenden) schon sehr früh in der Tumorgenese im Probenmaterial des Stuhls nachzuweisen sind. Dieser Marker eignet sich jedoch nicht zur Erstdiagnose, da der Marker ebenfalls beim Magenkarzinom und beim Gallenwegskarzinom erhöht ist. Weiterhin ist der Marker CA 19-9, wie alle Tumormarker, auch bei entzündlichen Prozessen erhöht. Die Bestimmung von CA 19-9 erfolgt in der klinischen Routine nur im Rahmen einer Verlaufs- und Therapiekontrolle.To diagnose a pancreatic tumor, CA 19-9 can be determined in the blood. The determination of this marker in the blood is not suitable for the early diagnosis of a pancreatic tumor, since the CA 19-9 occurs only in the blood, if the tumor of the pancreas in its development has already created access to the vascular system. However, it is a great desire to already provide methods that allow early diagnosis of the pancreatic tumor. This technical problem is solved according to the invention by the determination of the following gene products (proteins) in the stool of volunteers / tumor patients. The occurrence of the invention Biomarker (hereafter) is earlier than in the blood (vascular system) because, for example, the pancreas is an exocrine gland that has direct access to the gastrointestinal tract. Surprisingly, it has been found that the proteins according to the invention (hereinafter) are detectable very early in tumorigenesis in the sample material of the stool. However, this marker is not suitable for the first diagnosis, since the marker is also increased in gastric carcinoma and bile duct carcinoma. Furthermore, the marker CA 19-9, like all tumor markers, is also increased in inflammatory processes. The determination of CA 19-9 takes place in clinical routine only in the context of a course and therapy control.

Es ist wünschenswert, mittels einfacher Verfahren z.B. immunchemischen, molekularbiologischen z.B. PCR-Verfahren möglichst frühzeitig ein tumoröses Geschehen im Pankreas, insbesondere in einer Wachstumsphase, in der der Tumor noch keinen Kontakt mit dem Gefäßsystem des Körpers aufgenommen hat nachweisen zu können.It is desirable to use simple methods, e.g. immunochemical, molecular biological, e.g. PCR procedure as early as possible to detect tumorous events in the pancreas, especially in a growth phase in which the tumor has not yet taken contact with the vascular system of the body.

Da es beim Pankreaskarzinom häufig zu einer exokrinen Pankreasinsuffizienz kommt oder eine schwere chronische Pankreatitis mit Insuffizienz zum Pankreaskarzinom entarten kann, empfiehlt es sich, das Protein Elastase 1 im Stuhl mitzubestimmen, um neben dem tumorösen Geschehen gleichzeitig eine exokrine Pankreasinsuffizienz zu diagnostizieren und anschließend mit Substitutionspräparaten zu behandeln oder auszuschließen.Since pancreatic carcinoma often leads to exocrine pancreatic insufficiency or severe chronic pancreatitis with insufficiency can degenerate into pancreatic carcinoma, it is advisable to co-determine the protein elastase 1 in the stool in order to simultaneously diagnose exocrine pancreatic insufficiency in addition to the tumorous event and then to use substitution preparations treat or exclude.

Technisches Problem der ErfindungTechnical problem of the invention

Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, ein Verfahren zum Nachweis von Tumormarkern aus Tumoren oder Vorstufen von Tumoren des Pankreas anzugeben, welches in Hinblick auf die Sicherheit der erhaltenen diagnostischen Aussage verbessert ist.Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zu Grunde, den weiterhin bestehenden Bedarf an spezifischen, leicht durchzuführenden Verfahren zu befriedigen, sodass ein entzündliches, nicht entzündliches aber auch neoplastisches Geschehen im Intestinaltrakt, bevorzugt jedoch des Pankreas, besonders frühzeitig und zweifelsfrei nachgewiesen werden kann. Bei diesem Verfahren zur Pankreaskarzinom-Diagnostik sollen entzündliche Prozesse möglichst nicht erkannt werden.The invention is based on the technical problem of specifying a method for the detection of tumor markers from tumors or precursors of tumors of the pancreas, which is improved with regard to the safety of the diagnostic information obtained. The invention is based, in particular, on the technical problem To meet existing needs for specific, easy to carry out procedures, so that an inflammatory, non-inflammatory but also neoplastic events in the intestinal tract, but preferably of the pancreas, particularly early and can be proven beyond doubt. In this method for pancreatic carcinoma diagnosis, inflammatory processes should as far as possible not be detected.

Grundzüge der Erfindung und bevorzugte AusführungsformenBroad features of the invention and preferred embodiments

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung Verfahren und Testkits mit allen Reagenzien zur Durchführung und zum Nachweis eines malignen Geschehens im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1, CTRB (CTBR1), ELA3A, ELA3B und PRSS2“ bestimmt werden. Bevorzugt werden PLRP1 und/oder PRSS2 jeweils einzeln oder in Kombination bestimmt. Ganz besonders bevorzugt wird PLRP1 bestimmt.To solve this technical problem, the invention teaches methods and test kits with all reagents for carrying out and detecting a malignant event in the pancreas, wherein in a sample of human or animal stool one or more proteins selected from the group "PLRP1, CTRB (CTBR1), ELA3A , ELA3B and PRSS2 ". Preferably, PLRP1 and / or PRSS2 are each determined individually or in combination. Most preferably, PLRP1 is determined.

Für den erfindungsgemäßen Zweck kann es ausreichend sein, Fragmente der genannten Tumormarker zu bestimmen. Ferner können post-translationale Modifikationen, Isoenzyme und/oder kodierende RNA/DNA, insbesondere mRNA(messenger RNA)Sequenzen der Proteine bestimmt werden.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Nachweis eines malignen Geschehens im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls eine oder mehrere der o.g. Proteine bestimmt wird.
For the purpose of the invention it may be sufficient to determine fragments of said tumor markers. Furthermore, post-translational modifications, isoenzymes and / or coding RNA / DNA, in particular mRNA (messenger RNA) sequences of the proteins can be determined.
To solve this technical problem, the invention further teaches a method for detecting a malignant event in the pancreas, wherein one or more of the above proteins is determined in a sample of human or animal stool.

Bei dem Protein PLRP1 handelt es sich um das „pancreatic lipase related protein 1“ mit einem Molekulargewicht von 50 kDa (EC 3.1.1., EC 3.1.1.3)gehört PLRP1 zur Familie der Lipasen und wirkt als negativer Regulator der pankreatischen Lipase. Es tritt im Pankreassaft auf.The protein PLRP1 is the "pancreatic lipase related protein 1" with a molecular weight of 50 kDa (EC 3.1.1., EC 3.1.1.3) PLRP1 belongs to the family of lipases and acts as a negative regulator of pancreatic lipase. It occurs in the pancreatic juice.

Bei dem Protein PRSS2 (Serine proteinase-2 Preproprotein) handelt es sich um ein Protein von 27 kDa. Es handelt sich um die Protease, Serin 2 (Trypsin-2) (EC 3.4.21.4) und gehört zu den Serin Proteasen. Es findet sich im Pankreassaft.
Bei dem Protein CTRB handelt es sich um Chymotrypsin (EC 3.4.21.1). (Chymotrypsinogen B)
Bei dem Protein PLRP1 (PNLIPRP1) handelt es sich um pancreatic lipase-related protein-1.
Bei dem Protein ELA3B handelt es sich um das Protein Elastase 3B. Bei dem Protein ELA3A handelt es sich um das chymotrypsin like elastase family member 3A.
Bei dem Protein ELA3B handelt es sich um das chymotrypsin like elastase family member 3B.
The protein PRSS2 (serine proteinase-2 preproprotein) is a protein of 27 kDa. It is the protease, serine 2 (trypsin-2) (EC 3.4.21.4) and belongs to the serine proteases. It is found in pancreatic juice.
The protein CTRB is chymotrypsin (EC 3.4.21.1). (Chymotrypsinogen B)
The protein PLRP1 (PNLIPRP1) is pancreatic lipase-related protein-1.
The protein ELA3B is the protein elastase 3B. The protein ELA3A is the chymotrypsin like elastase family member 3A.
The protein ELA3B is the chymotrypsin like elastase family member 3B.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werdenzwei Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1 und PRSS2“ bestimmt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Proteine PLRP1 und PRSS2 in einer Stuhlprobe bestimmt.In a preferred embodiment of the invention, two proteins selected from the group "PLRP1 and PRSS2" are determined. In a particularly preferred embodiment of the invention, the proteins PLRP1 and PRSS2 are determined in a stool sample.

Es wurde gefunden, dass sich der Gehalt der o.g. Proteine im Stuhl von Pankreastumorpatienten nachweisen und bestimmen lässt, wobei der Gehalt an der betreffenden Kombination der Tumormarker mit dem Grad des malignen Geschehens im Pankreas korreliert ist: Der Gehalt der Proteine, z.B. von PLRP1 und PRSS2,im Stuhl steigt mit der Größe des Tumors. Dies ist umso überraschender, weil umfangreiche Untersuchungen bezüglich anderer spezifischer Proteine im Stuhl keine Hinweise auf ihre Verwendung als Tumormarker zuließen. Aufgrund dieser Korrelation der Tumorgröße mit dem Gehalt des Markers im Stuhl ist auch eine Verlaufskontrolle der Therapie möglich.
Sowohl die Struktur als auch die physiko-chemischen Eigenschaften der genannten Tumormarker werden offensichtlich in Folge der erheblichen proteolytischen Aktivität und den extremen physiologischen Gegebenheiten (z. B. alkalisch im Darm) des Gastrointestinaltraktes nicht nachhaltig beeinträchtigt. Dies gilt auch für den Nachweis der Proteine mittels immunologischer Methoden. Besonders überraschen war, dass bei Messung von Proteinkombinationen eine deutliche Verbesserung der Diagnosegenauigkeit(insbesondere bezüglich der Abgrenzung zwischen PC, CP, CDS) eintrat, insbesondere eine signifikante Absenkung der falsch-negativen, aber auch der falsch-positiven Befunde.
It has been found that the content of the above-mentioned proteins in the stools of pancreatic cancer patients can be detected and determined, the content of the relevant combination of tumor markers being correlated with the degree of malignant events in the pancreas: the content of the proteins, eg of PLRP1 and PRSS2 , in the stool increases with the size of the tumor. This is all the more surprising because extensive investigations regarding other specific proteins in the stool did not allow any indication of their use as tumor markers. Based on these Correlation of the tumor size with the content of the marker in the stool is also a follow-up of the therapy possible.
Both the structure and the physico-chemical properties of said tumor markers are apparently not permanently impaired as a result of the considerable proteolytic activity and the extreme physiological conditions (eg alkaline in the intestine) of the gastrointestinal tract. This also applies to the detection of proteins by immunological methods. It was particularly surprising that when measuring protein combinations, a significant improvement in diagnostic accuracy (in particular with regard to the demarcation between PC, CP, CDS) occurred, in particular a significant reduction of the false-negative, but also the false-positive findings.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt und gezeigt, dass sich trotz der oben beschriebenen Proteindenaturierung und Proteinverdauung im Gastrointestinaltrakt ein spezifischer Nachweis mehrerer der Proteine im Stuhl von menschlichen Probanden/Tumorpatienten durchführen lässt.According to the invention, it has been found and demonstrated that despite the protein denaturation and protein digestion in the gastrointestinal tract described above, a specific detection of several of the proteins in the stool can be carried out by human subjects / tumor patients.

Es wird darauf hingewiesen, dass eine Stuhlprobe nicht als eine „Körperflüssigkeit“-Probe betrachtet werden kann, da sich der gesamte Gastrointestinaltrakt biologisch gesehen außerhalb des Körpers befindet.It should be noted that a stool sample can not be considered as a "body fluid" sample because the entire gastrointestinal tract is biologically outside the body.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nun möglich, in einem nicht-invasiven Verfahren auf einfache Weise durch Bestimmung mehrerer der besagten Proteine ein malignes Tumorgeschehen im Stuhl nachzuweisen und gleichzeitig bei positiver Testführung eindeutig festlegen zu können, dass ein Tumor im Pankreas und nicht sonstwo im Körper vorliegt.With the method according to the invention, it is now possible to easily detect a malignant tumor occurrence in the stool in a non-invasive method by determining a plurality of the said proteins and at the same time be able to clearly establish, with a positive test procedure, that a tumor is present in the pancreas and not elsewhere in the body is present.

Mit diesem Verfahren gelingt nicht nur die Primärdiagnose, sondern es kann auch eine Verlaufskontrolle vorgenommen werden. Wegen der individuellen Proteinverteilung ist eine individuelle Diagnostik möglich.Not only does the primary diagnosis work with this procedure, but also a follow-up check can be carried out. Due to the individual protein distribution, an individual diagnosis is possible.

Überraschenderweise ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die besagten Tumormarker mit entsprechend angepassten Testsystemen nach dem Stand der Technik als freie Proteine im Stuhl nachzuweisen. Damit ist keine Isolierung von Zellen aus dem Stuhl und die Analyse der in den Zellen enthaltenen Proteine erforderlich. Diese Möglichkeit, nämlich dass diese Biomarker nach z. B. Darmpassage im Stuhl immunchemisch nachweisbar bleiben, war nicht zu erwarten, da normalerweise eine weitgehende Zersetzung (Denaturierung bewirkt immunchemische Veränderung, d.h. z.B. beeinträchtigte Bindungseigenschaften für z.B. Antikörper)der betreffenden Proteine im Zuge des normalen Verdauungsvorganges zu erwarten gewesen wäre.Surprisingly, it is possible with the method according to the invention to detect the said tumor markers with appropriately adapted test systems according to the prior art as free proteins in the stool. This does not require isolation of cells from the stool and analysis of the proteins contained in the cells. This possibility, namely that these biomarkers after z. Intestinal passage in the stool should not be expected to be immunochemically detectable, as would normally have been expected to result in extensive degradation (denaturation causing immunochemical change, e.g., impaired binding properties, for example, to antibodies) of the subject proteins during the normal digestive process.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass besagte Proteine quantitativ sogar auch bei intensiv homogenisierten, länger gelagerten Stuhlproben (zum Beispiel beim Probenversand) immunchemisch nachweisbar bleiben. Auch bei starker Verdünnung des Stuhls wird eine deutliche Reaktion erhalten. Vorzugsweise ist jedoch ein Extraktionsverfahren beispielsweise unter Verwendung eines speziellen Detergens (z.B. CHAPS) zu verwenden (das Extraktionsverfahren wird näher in Beispiel 2 beschrieben).In the context of the invention, it was found that said proteins remain quantitatively detectable immunochemically even in intensively homogenized, longer-stored stool samples (for example, during sample shipment). Even with strong dilution of the stool, a clear reaction is obtained. Preferably, however, an extraction procedure using, for example, a specific detergent (e.g., CHAPS) is to be used (the extraction procedure is described in more detail in Example 2).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das maligne Geschehen im Pankreas eines Menschen oder eines Tieres bestimmt. Dadurch ist es möglich Beschwerden, die durch einen Pankreastumor verursacht werden durch Messung von PLRP1 und/oder PRSS2 von anderen Krankheiten z.B. PC, CP, CDS abzugrenzen, weil sich letztere insbesondere durch die Erhöhung von ELA3A, ELA3B und/oder CRBT bemerkbar machen. Weiterhin ist es bevorzugt, das oder die Proteine immunochemisch nachzuweisen, insbesondere mittels anti-Protein-Antikörper. Es können monoklonale oder polyklonale Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden Antikörper eingesetzt, welche nicht mit anderen Bestandteilen des Stuhls, insbesondere nicht mit anderen Stuhlproteinen kreuzreagieren.In the method according to the invention, the malignant event in the pancreas of a human or an animal is preferably determined. This makes it possible to cause discomfort caused by a pancreatic tumor by measuring PLRP1 and / or PRSS2 from other diseases, e.g. PC, CP, CDS, because the latter are particularly noticeable by the increase of ELA3A, ELA3B and / or CRBT. Furthermore, it is preferred to immunochemically detect the protein (s), in particular by means of anti-protein antibodies. It is possible to use monoclonal or polyclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies. Advantageously, antibodies are used which do not cross-react with other constituents of the stool, in particular with other stool proteins.

Fragmente im Sinne der Erfindung sind Proteine oder Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, welche identisch mit einer Teilsequenz eines der besagten Tumormarker ist. Die Länge eines Fragments kann von 5 aa (aa = Aminosäuren) bis zu n-1 aa (n = Länge des Tumormarkers, aus welchem das Fragment herrührt) betragen. Typischerweise wird die Länge mehr als 10 aa betragen.Fragments within the meaning of the invention are proteins or polypeptides having an amino acid sequence which is identical to a partial sequence of one of the tumor markers. The length of a fragment may be from 5 aa (aa = amino acids) to n-1 aa (n = length of the tumor marker from which the fragment is derived). Typically, the length will be more than 10 aa.

Erfindungsgemäß einsetzbare polyklonale, monoklonale Antikörper können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen, polyklonalen Antikörpern gut bekannt. Beispielsweise wird hierzu das Antigen, im vorliegenden Fall also ein ausgewähltes Protein, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. Prinzipiell kann hierzu das Verfahren, welches erstmals von Koehler und Milstein beschrieben wurde, angewandt werden, wobei dem Fachmann auch Abwandlungen und Weiterentwicklungen dieser Verfahren bekannt sind. Mit dieser Herstellung können spezifische monoklonale Antikörper erhalten werden, wobei die Spezifität durch Selektion festgestellt werden kann. Die Selektion erfolgt auf spezifische Antikörper, welche an eines der ausgewählten Proteine, jedoch nicht an andere Stuhlproteine binden.Polyclonal monoclonal antibodies which can be used according to the invention can be prepared according to methods known in the art. Methods for producing specific monoclonal polyclonal antibodies are well known to those skilled in the art. For example, for this purpose, the antigen, in this case a selected protein, used to generate antibodies. In principle, the method described for the first time by Koehler and Milstein can be used for this purpose, with the person skilled in the art also being aware of modifications and further developments of these methods. With this preparation, specific monoclonal antibodies can be obtained, whereby the specificity can be determined by selection. Selection is for specific antibodies that bind to one of the selected proteins but not to other stool proteins.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis nach dem Prinzip des Immunoassays. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Immunoassay wird in der Weise durchgeführt, dass man a) die Probe mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren in Kontakt bringt, von denen der erste Rezeptor R1 in fester Phase vorliegt und mit dem ausgewählten Protein bindefähig ist und der zweite Rezeptor R2 in flüssiger Phase vorliegt und ebenfalls mit dem gleichen Protein bindefähig ist, wobei der Rezeptor R2 eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt, b) die feste von der flüssigen Phase trennt, und c) die Markierung oder das detektierbare Molekül in einer der Phasen, bevorzugt in der festen Phase bestimmt und entsprechend die Menge an in der Probe vorhandenemProtein quantifiziert, wobei man als mindestens einen der Rezeptoren R1 oder R2 einen Antikörper verwendet, der spezifisch mit dem Protein bindefähig ist und insbesondere an kein anderes Stuhlprotein bindet. In a particularly preferred embodiment, the detection is carried out according to the principle of the immunoassay. An immunoassay preferred according to the invention is carried out by a) bringing the sample into contact with at least two different receptors, of which the first receptor R1 is in the solid phase and is capable of binding with the selected protein and the second receptor R2 is in the liquid phase and is also capable of binding with the same protein, wherein the receptor R2 carries a label or mediates the binding to a detectable molecule, b) separates the solid from the liquid phase, and c) the label or the detectable molecule in one of the phases, preferably determined in the solid phase and quantified accordingly the amount of protein present in the sample, wherein as at least one of the receptors R1 or R2 is used an antibody which is specifically bindable with the protein and in particular does not bind to any other stool protein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird sowohl als Rezeptor R1 als auch als Rezeptor R2 ein Antikörper gegen das jeweils zu bestimmende Protein eingesetzt.
Neben der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Immunoassays und insbesondere eines ELISA können auch andere Nachweistechnologien eingesetzt werden, z. B. die Schwingquarz-Technologie, Mikrowaage-Technologie, Lateral-Flow-Technologie, Kandelaber-Technologie, TRACE-Technologie oder Elektrochemilumineszenz-Technologie aber auch die Agglutination mit Mikro- oder Nanopartikeln sowie Multiplex-Technologien an der Flüssig- oder Festphase oder Array-Technologien, wie beispielsweise mittels Proteinchips.
In a particularly preferred embodiment, an antibody against the respective protein to be determined is used both as receptor R1 and as receptor R2.
In addition to performing the method according to the invention in the form of an immunoassay and in particular an ELISA, other detection technologies can be used, for. As the quartz crystal technology, microbalance technology, lateral flow technology, candelabra technology, TRACE technology or electrochemiluminescence technology but also the agglutination with micro or nanoparticles and multiplexing technologies at the liquid or solid phase or array Technologies, such as protein chips.

In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens kann die feste Phase des Immunoassays auch durch Mikro-Stereolithographie hergestellt sein. Alternative Separationsmöglichkeiten werden beschrieben von Jungbauer et al., „Monoliths for fast bioseparation and bioconversion and their applications in biotechnology“, Journal of seperation science, 27:767-778, July 2004 . Weitere Verbesserungen der Chromatographietechniken werden beschrieben von Novakova et al., „A review of current trends and advances in modern bioanalytical methods: Chromatography and sample preparation“, Analytica Chimica Acta, 656 (2009) 8 - 35 . Weitere Methoden werden beschrieben von Pfaunmiller E.L., „Affinity monolith chromatography: a review of principles and recent analytical applications“, Anal Bioanal Chem., 2013 (405) 2133-2145 . Weitere Verbesserungen der Nachweisbarkeit können über sogenannte „optical fiber arrays, insbesondere optical fiber microarrays“ erzielt werden, siehe z.B. „Analytical chemistry on the femtoliter scale“, Walt D. R., Angewandte Chemie 2010, 49, 3880-3895 sowie weitere Publikationen von D. R. Walt. Darüber hinaus können Verbesserungen durch Verwendung von gedruckten Sensoren erzielt werden. Hierzu sind beispielsweise hybride CMOS Sensoren verwendbar, auf die die stationäre Phase eines Immunassays mit Drucktechniken, wie beispielsweise Tintenstrahldruckern aufgetragen sind. Alternativ ist es möglich, einen entsprechenden Sensor, z. B. einen CMOS Sensor auf eine herkömmliche stationäre Phase, beispielsweise enthaltend Nitrozellulose, aufzubringen. Diese Aufbringung kann beispielsweise nach der Auftragung der Probe erfolgen. Eine derartige Technologie erlaubt es entsprechende Tests stärker zu automatisieren und damit unabhängig zu machen von den subjektiven Eindrücken von Ärzten und/oder Laboranten. Die Auswertung basiert auf der ortsaufgelösten Bestimmung von Strom bzw. Widerständen, der Impedanz oder von magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel, die sich nach den Prinzipien der Chromatographie auf der stationären Phase verteilen.In an alternative embodiment of the method, the solid phase of the immunoassay may also be prepared by micro-stereolithography. Alternative separation options are described by Jungbauer et al., "Monoliths for fast bioseparation and bioconversion and their applications in biotechnology", Journal of Seperation Science, 27: 767-778, July 2004 , Further improvements of chromatographic techniques are described by Novakova et al., "A review of current trends and advances in modern bioanalytical methods: chromatography and sample preparation", Analytica Chimica Acta, 656 (2009) 8-35 , Further methods are described by Pfaunmiller EL, "Affinity monolith chromatography: a review of principles and recent analytical applications", Anal Bioanal Chem., 2013 (405) 2133-2145 , Further improvements of the detectability can be achieved via so-called "optical fiber arrays, in particular optical fiber microarrays", see eg "Analytical chemistry on the femtoliter scale", Walt DR, Angewandte Chemie 2010, 49, 3880-3895 as well as other publications by DR Walt. In addition, improvements can be achieved by using printed sensors. For example, hybrid CMOS sensors can be used for this purpose, to which the stationary phase of an immunoassay with printing techniques, such as, for example, inkjet printers, are applied. Alternatively, it is possible to use a corresponding sensor, for. B. a CMOS sensor on a conventional stationary phase, for example, containing nitrocellulose apply. This application can be done, for example, after the application of the sample. Such technology makes it possible to automate corresponding tests more effectively and thus to make independent of the subjective impressions of physicians and / or laboratory technicians. The evaluation is based on the spatially resolved determination of current or resistance, the impedance or magnetic properties of the nanoparticles, which are distributed according to the principles of chromatography on the stationary phase.

Verbesserungen an den üblichen Teststreifen, welche für lateral-flow tests herangezogen werden führen bereits heute zu signifikant besseren Testergebnisse, siehe z.B. Fenton E. M. et al., „Multiplex lateral-flow test strips fabricated by twodimensional shaping“, ACS Appl. mater. interfaces, 2009, 1, 124-129.Improvements to the usual test strips used for lateral-flow tests already lead to significantly better test results, see, e.g. Fenton E.M. et al., "Multiplex lateral-flow test strips fabricated by twodimensional shaping", ACS Appl. mater. interfaces, 2009, 1, 124-129.

Diese Technologien sind dem Fachmann gut vertraut und brauchen daher hier nicht näher erläutert zu werden.These technologies are well known to those skilled in the art and therefore need not be discussed further here.

Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Testkit zum Nachweis oder/und zur Diagnose eines malignen Tumorgeschehens im Pankreas in Menschen oder Tieren, welcher insbesondere zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens vorgesehen ist, mittels Bestimmung von Proteinen ausgewählt aus „PLRP1, CTRB, PRSS2, ELA3B und ELA3A“, insbesondere einer Proteinkombination, wobei der Testkit mindestens zwei monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen mindestens zwei der genannten Proteine enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des Testkits ist einer der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper ein Antikörper gegen PLRP1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Testkits ist neben dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen PLRP1 eine Bestimmung von ELA3B oder ELA3A vorgesehen. In alternativen Ausführungsform des Testkits ist neben dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen PLRP1 eine Bestimmung von PRSS2 oder CTRB vorgesehen.In addition to the method according to the invention, a further subject of the present invention is a test kit for detecting or / and diagnosing a malignant tumor occurrence in pancreas in humans or animals, which is intended in particular for carrying out the method described above, by means of determining proteins selected from "PLRP1, CTRB, PRSS2, ELA3B and ELA3A ", in particular a protein combination, wherein the test kit contain at least two monoclonal or polyclonal antibodies against at least two of said proteins. In a preferred embodiment of the test kit, one of the monoclonal or polyclonal antibodies is an antibody to PLRP1. In a further preferred embodiment of the test kit, a determination of ELA3B or ELA3A is provided in addition to the monoclonal or polyclonal antibody against PLRP1. In an alternative embodiment of the test kit, a determination of PRSS2 or CTRB is provided in addition to the monoclonal or polyclonal antibody against PLRP1.

Bevorzugt enthält das Testkit einen Antikörper für das entsprechende Protein, der mit keinem anderen Stuhleiweiß kreuzreagiert. Das Testkit kann gegebenenfalls weitere für die Durchführung eines Immunoassays oder für die Durchführung des jeweils vorgesehenen Testverfahrens notwendige Reagenzien enthalten. Vorzugsweise enthält das Testkit einen an eine Festphase gebundenen, für mindestens einen der genannten Proteine spezifischen Antikörper.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Antikörpern gegen eines der besagten Proteine zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Tumormarkern im menschlichen oder tierischen Stuhl sowie ein Reagenz zur selektiven quantitativen Bestimmung des Tumormarkers.
Preferably, the test kit contains an antibody for the corresponding protein that does not cross-react with any other stool protein. If necessary, the test kit may provide further for the implementation of a Immunoassays or reagents necessary for carrying out the respective test procedure. Preferably, the test kit contains an antibody bound to a solid phase and specific for at least one of said proteins.
The invention further relates to the use of antibodies against one of said proteins for the qualitative or quantitative determination of tumor markers in the human or animal stool and a reagent for the selective quantitative determination of the tumor marker.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, welche spezifisch eines der besagten Proteine binden und vorzugsweise mit keinem anderen Stuhlprotein kreuzreagieren. Die Antikörper können beispielsweise nach der Methode von Koehler und Milstein (Nature 256,495-497 (1995)) erzeugt werden.Another object of the invention are antibodies, in particular monoclonal antibodies which specifically bind one of said proteins and preferably cross-react with no other stool protein. The antibodies can be generated, for example, by the method of Koehler and Milstein (Nature 256, 495-497 (1995)).

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Aptamere oder Spiegelmere und deren Verwendung an Stelle der vorstehend beschriebenen Antikörper (es gelten alle Antikörper-bezogenen Ausführungen analog), welche spezifisch an eines der besagten Proteine binden und optional mit keinem anderen Stuhlprotein kreuzreagieren. Aptamere sind Oligonukleotidsequenzen, welche spezifische Bindeeigenschaften aufweisen. Solche Aptamere können beispielsweise nach den in US 5,270,163 oder in Sumedha, Clin. Chem. 45 (1999), 1628-1650 beschriebenen Methoden hergestellt bzw. identifiziert werden. Spiegelmere sind Aptamere, welche aus L-Oligonukleotiden gebildet sind.Furthermore, the present invention relates to aptamers or spiegelmers and their use in place of the antibodies described above (all antibody-related embodiments apply analogously) which bind specifically to one of said proteins and optionally cross-react with no other stool protein. Aptamers are oligonucleotide sequences which have specific binding properties. Such aptamers may, for example, according to the in US 5,270,163 or in Sumedha, Clin. Chem. 45 (1999), 1628-1650. Spiegelmers are aptamers formed from L oligonucleotides.

Die Auswertung der erfindungsgemäßen Tests erfolgt unter Nutzung der automatischen Klassifikation, Clusteranalyse, Mustererkennung. Insbesondere werden Verfahren der „maximumlikelihood-Methode“ bzw. der Clusterzugehörigkeit über Wahrscheinlichkeitsverteilungen angewandt. S. auch z. B. Attia, John, „Moving beyond sensitivity and specifity: Using likelihood ratios to help interprete diagnostic tests“ sowie Deeks, J. J., „Diagnostic tests 4: Likelihood ratios,“ BMJ 2004; 329 (7458): 168-169 .The evaluation of the tests according to the invention is carried out using automatic classification, cluster analysis, pattern recognition. In particular, methods of the "maximumlikelihood method" or the cluster membership via probability distributions are used. See also z. B. Attia, John, "Moving beyond sensitivity and specifity: using likelihood ratios to help interprete diagnostic tests" and Deeks, JJ, "Diagnostic tests 4: likelihood ratios," BMJ 2004; 329 (7458): 168-169 ,

Die Messung der in den Ansprüchen genannten Proteine kann auch im Rahmen eines sogenannten Multiplexing-Assays, z.B. eines Multiplexing-ELISA-Assays geschehen.The measurement of the proteins mentioned in the claims can also be carried out as part of a so-called multiplexing assay, e.g. done by a multiplexing ELISA assay.

In jedem Fall enthält ein erfindungsgemäßes Testkit eine Probenentnahmevorrichtung für Stuhl. Hierfür kommen alle fachüblichen Vorrichtungen in Frage, z.B. die in der DE10205709A1 genannte.In any case, a test kit of the invention includes a stool sampler. For this purpose, all customary devices in question, for example, in the DE10205709A1 called.

Es versteht sich von selbst, dass die erfindungsgemäßen Tests auch zur Bestimmung von Gewebeproben, z.B. von Biopsien, verwendet werden könnenIt goes without saying that the tests according to the invention are also suitable for the determination of tissue samples, e.g. from biopsies, can be used

BeispieleExamples

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.The invention is further illustrated by the following examples.

Beispiel 1: Testkit zur erfindungsgemäßen Tumormarker-Bestimmung mittels Lateral-Flow TechnologieExample 1: Test kit for tumor marker determination according to the invention by means of lateral-flow technology

Das Testkit auf Basis eines Immunossays besteht aus einer Probeentnahme- und vorbereitungsvorrichtung sowie einer Testkassette.
Die Probeentnahmevorrichtung enthält ein Stäbchen, welches die benötigte Stuhlmenge (4-30 mg , bevorzugt 25 mg) aufzunehmen vermag. Die Probeentnahmevorrichtung enthält weiterhin ein Röhrchen zur Probenaufnahme, welche mit Pufferlösung gefüllt ist.
Die wässrige Pufferlösung für den Tumor PLRP1-Test enthält folgende Bestandteile:

  • Puffer 1 = 10-70 mM Phosphatpuffer (pH 6,7-7,6) oder Puffer 2 = 10-70 mM Hepespuffer (pH 7,6-8,2) oder Puffer 3 = 10-70 mM Triäthanolamin (pH 7,3-7,7) bevorzugte Mischungen hiervon jeweils Volume 1:1:1
  • Detergenz 1 = CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, 10 mM-50 mM (Sigma), Detergenz 2 = Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01% - 0,1 %), z.B. von Biochrom, Detergenz 3 = Lauryldimethylamine Oxide (10 mM-50mM), z.B. von Biochrom oder Mischungen hiervon.
The test kit based on an immuno-set consists of a sampling and preparation device and a test cassette.
The sampling device contains a rod which is able to take up the required amount of stool (4-30 mg, preferably 25 mg). The sampler further includes a sample receiving tube filled with buffer solution.
The aqueous buffer solution for the tumor PLRP1 test contains the following components:
  • Buffer 1 = 10-70 mM phosphate buffer (pH 6.7-7.6) or buffer 2 = 10-70 mM Hepes buffer (pH 7.6-8.2) or buffer 3 = 10-70 mM triethanolamine (pH 7, 3-7,7) preferred mixtures thereof each volume 1: 1: 1
  • Detergent 1 = CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 10mM-50mM (Sigma), detergent 2 = sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.01% -0.1%), eg of biochrome, detergent 3 = lauryldimethylamine oxides (10 mM-50 mM), eg of biochrome or mixtures thereof.

Verwendete AntikörperUsed antibodies

Die zur Messung benötigten 2 Antikörper (jeweils 1 in der „Flüssigphase“ und 1 Antikörper in der „festen Phase“ befindliche spezifisch bindefähige Antikörper) können jeweils polyklonal bevorzugt jedoch monoklonal sein.
Die polyklonalen, als auch die monoklonalen Antikörper sind erhältlich nach dem Stand der Technik durch die klassischen Methoden der Immunisierung von Tieren mit dem jeweiligen Antigen oder bevorzugt durch die Verwendung der Hybridoma-Methode nach Köhler und Mielstein.
The 2 antibodies required for the measurement (1 each in the "liquid phase" and 1 antibody in the "solid phase" are specifically bindable antibodies) may each be polyclonal but preferably monoclonal.
The polyclonal, as well as the monoclonal antibodies are obtainable according to the prior art by the classical methods of immunizing animals with the respective antigen or preferably by using the hybridoma method according to Köhler and Mielstein.

PLRP1 AntikörperPLRP1 antibody

Bevorzugt zum Aufsprühen auf die Nitrozellulosemembran ist ein monoklonaler Antikörper der Maus. Dieser Klon kann durch Hybridisierung von Myelomazellen mit B-Lymphozyten der Maus generiert worden. Als Immunogen dient beispielsweise rekombinante humane PLRP1 aus E. coli.Preferred for spraying onto the nitrocellulose membrane is a mouse monoclonal antibody. This clone can be generated by hybridization of myeloma cells with mouse B lymphocytes. The immunogen used is, for example, recombinant human PLRP1 from E. coli.

Eine der wichtigen Bedingungen zur Auswahl des Antikörpers ist, dass dieser nicht mit anderen Bestandteilen des Stuhls kreuzreagieren dürfen. One of the important conditions for selecting the antibody is that it must not cross-react with other constituents of the stool.

Detergenz 1 (CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, 10 mM (Sigma)), Detergenz 2 = Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01% - 0,1 %), z.B. von, Detergenz 3 = Lauryldimethylamine Oxide (10 mM-50mM), z.B. von Biochrom oder Mischungen hiervon.Detergent 1 (CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 10 mM (Sigma)), detergent 2 = sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.01% -0.1%), e.g. of, detergent 3 = lauryldimethylamine oxides (10 mM-50 mM), e.g. of biochrome or mixtures thereof.

Die Entnahmevorrichtung zur Durchführung des Hämoglobintests enthält einen der oben beschriebenen Puffer (1,5-2,5 ml). Die zu testende Person sticht mit der Dosierspitze in den Stuhl und überführt die Stuhlprobe in das mit dem entsprechenden Puffer gefüllte Röhrchen.
Die Entnahmevorrichtung für den PLRP1 Test, die der zu testenden Person vom Arzt übergeben wird, enthält keinen Puffer. Der Patient sticht mit der Dosierspitze in den Stuhl und überführt die Stuhlprobe in das leere Röhrchen.
Das erfindungsgemäße Testkit enthält weiterhin eine Testkassette, in der die nach dem Stand der Technik verbesserten beiden Immunoassays durch Lateral-Flow-Technologie durchgeführt werden. Die Testkassette enthält zu diesem Zweck eine, vorzugsweise runde, Aussparung zum Auftragen der Stuhlproben sowie eine weitere, vorzugsweise längliche, Aussparung zur Ablesung der Testergebnisse.
Die Testkassette enthält in ihrem Inneren als stationäre Phase Nitrozellulose folgender bevorzugter Kapillarflussrate von 135 sec/4 cm.
Die Antikörper sind an Kolloide, bevorzugt Goldkolloide oder Latexkolloide gekoppelt, bevorzugt an Goldkolloide mit 20 Nanometern Durchmesser.
The sampling device for performing the hemoglobin test contains one of the above-described buffers (1.5-2.5 ml). The person to be tested pierces the stool with the dosing tip and transfers the stool sample into the tube filled with the appropriate buffer.
The sampling device for the PLRP1 test given to the person to be tested by the physician contains no buffer. The patient pricks the stool into the stool and transfers the stool sample to the empty tube.
The test kit according to the invention also contains a test cassette in which the two immunoassays improved according to the prior art are carried out by lateral flow technology. The test cassette contains for this purpose a, preferably round, recess for applying the stool samples and a further, preferably elongated, recess for reading the test results.
The test cassette contains in its interior as a stationary phase nitrocellulose the following preferred capillary flow rate of 135 sec / 4 cm.
The antibodies are coupled to colloids, preferably gold colloids or latex colloids, preferably to 20 nm diameter gold colloids.

Der Anwender startet den chromatographischen Test durch Auftropfen von PLRP1-Stuhlproben-Extrakt in das Probenfenster der Kassette (stellt dann den Timer auf 5 Minuten). Das Ergebnis des Tests wird nach Ablauf der 5-minütigen Stoppzeit abgelesen.The user starts the chromatographic test by dropping PLRP1 Stool Sample Extract into the sample window of the cassette (then sets the timer to 5 minutes). The result of the test is read after the 5-minute stop time has elapsed.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Analytkonzentration mittels Biosensoren zu bestimmen wie z.B. amperometrische Sensoren, potentiometrische, ionenselektive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET), chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET), suspendedgate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in E. A. H. Hall und G. Hummel in „Biosensoren“, Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in „Aktuelle Trends in der Immunsensorik“, Labor 2000, S. 70-96 (1993) beschrieben.According to the invention it is also possible to determine the analyte concentration by means of biosensors such as amperometric sensors, potentiometric, ion-selective potentiometric or photometric sensors or by means of semiconductor electrodes such as field effect transistors (FET), chemosensitive field effect transistors (CHEMFET), suspendedgate field effect transistors (SGFET) or ion-sensitive field effect transistors , Such biosensors are summarized in EAH Hall and G. Hummel in "Biosensors", Springer Verlag Heidelberg, Germany, 1995 described. Further developments of ion sensitive field effect transistors (ISFETs) or optical detectors are among others of F. Aberl and H. Wolf in "Current Trends in Immune Sensor Technology", Labor 2000, pp. 70-96 (1993) described.

Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sogenannte Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit dem zu analysierenden Protein gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von A. Leidl et al. in „Proceedings of the Second International Symposium on Minaturized Total Analyses Systems, µTAS“, Basel 1996, beschrieben.Also suitable is the method according to the invention for the implementation by means of piezoelectric quartz crystals and surface acoustic wave elements, which can be used as microbalances. In this case, the primary antibody (the so-called catcher) is immobilized on a piezoelectric substrate and measured after binding with the protein to be analyzed. Such sensors are described, for example, by A. Leidl et al. in "Proceedings of the Second International Symposium on Minaturized Total Analysis Systems, μTAS", Basel 1996.

Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349 : 349-354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen oder z. B. auch die Kandelaber-Technologie von IBM, Inc. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Analytkonzentration mittels immunchromatographischer Methoden, d. h. mittels sogenannter Visual-Rapid-Tests (Lateral-Flow-Tests) zu bestimmen.Quartz crystal microbalances, as described by C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349: 349-354 have been found to be particularly suitable or z. B. also the candelabra technology of IBM, Inc. According to the invention it is also possible, the analyte concentration by means of immunochromatographic methods, d. H. to be determined by means of so-called visual-rapid tests (lateral flow tests).

Eine signifikante Verbesserung bezüglich Sensitivität, dynamischer Messbereich, Analysenkinetik und Formatflexibilität lässt sich durch die Verwendung der Elektrochemolumineszenz-Technologie erreichen. Unter Elektrochemolumineszenz versteht man einen Prozess, bei welchem Licht freigesetzt wird. Die Lichtfreisetzung wird dadurch induziert, indem ein elektrisches Potenzial an eine Elektrode angelegt wird, welche eine zyklische Oxidation/Reaktion beispielsweise eines Ruthenium-Metallions vermittelt ( Bruno, G. (1997) Rec. Rp. S. 175-179 ; Williams R. (1996), Amer. Biotech., S. 26 ). Eine ähnliche Technologie ist die TRACE-Technologie der Firma CIS.Significant improvements in sensitivity, dynamic range, analytical kinetics, and format flexibility can be achieved through the use of electrochemiluminescent technology. Electrochemiluminescence is a process in which light is released. The release of light is induced by applying an electrical potential to an electrode which mediates cyclic oxidation / reaction of, for example, a ruthenium metal ion ( Bruno, G. (1997) Rec. Rp. Pp. 175-179; Williams R. (1996), Amer. Biotech., P. 26 ). A similar technology is the TRACE technology of the company CIS.

Es ist aber auch möglich, das Protein mittels einer massenspektrometrischen Methode, beispielsweise mittels MALDI-TOF nach fachüblicher Aufbereitung der Stuhlprobe direkt zu bestimmen.However, it is also possible to determine the protein directly by means of a mass spectrometric method, for example by means of MALDI-TOF, according to customary preparation of the stool sample.

Beispiel 3 Einwiegen der StuhlprobenExample 3 Weighing the stool samples

Ein etwa 12 ml umfassendes Einwegröhrchen und eine mikrobiologische Impföse (z. B. Sarstedt) werden mit einer empfindlichen digitalen Laborwaage auf 0 austariert. Anschließend wird mit der Impföse der Stuhl eingewogen, indem man mit der Öse in die Stuhlprobe sticht und die an der Spitze verbleibende Stuhlmenge (etwa 100 mg) in das Einwegröhrchen einbringt. Anstelle der Impföse kann auch ein Zahnstocher benutzt werden.A disposable tube of about 12 ml and a microbiological loop (eg Sarstedt) are calibrated to 0 with a sensitive digital laboratory balance. Then the stool is weighed in with the loop by inserting the eyelet into the stool sample and inserting the amount of stool remaining at the tip (about 100 mg) into the disposable tube. Instead of the Impföse can also be used a toothpick.

Entsprechend der gewogenen Stuhlprobenmasse werden die Volumina des zuzugebenden Extraktionspuffers variiert (z. B. 100 mg Stuhl + 10 ml Puffer oder 75 m g Stuhl + 7,5 mi Puffer). Endkonzentration : 10 mg Stuhl/ml Extraktionspuffer.According to the weighed stool sample mass, the volumes of the stool to be added are Extraction buffer varies (eg 100 mg stool + 10 ml buffer or 75 mg stool + 7.5 ml buffer). Final concentration: 10 mg stool / ml extraction buffer.

Beispiel 4: Homogenisation und Extraktion der StuhlprobenExample 4: Homogenization and extraction of stool samples

Die Stuhlprobensuspension wird bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglas-Schüttelgerät (z. B. VORTEX) gemixt. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein. Um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten, ist es zweckmäßig, dem phosphatgepufferten Extraktionspuffer das Detergenz CHAPS (3- [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- propansulfonat, 10 mM (Sigma) beizumischen.The stool sample suspension is mixed vigorously several times at room temperature with a test tube shaker (eg VORTEX). The chairs must be well homogenized. To ensure complete extraction, it is desirable to add the detergent CHAPS (3- [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 10 mM (Sigma) to the phosphate-buffered extraction buffer.

Beispiel 5: StuhlprobenpräparationExample 5: Stool sample preparation

Die Stuhlprobe lässt sich vorteilhaft mit dem Stuhldosierungssystem (Quick-Prep) der Firma ScheBo®Biotech AG durchführen.The stool sample can advantageously be performed with the chair dosing system (Quick-Prep) from ScheBo ® Biotech AG.

Beispiel 6: StuhlprobeExample 6: Stool sample

  1. a) Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung des Proteins PLRP1 im Stuhl. Positiver Befund, d.h. eine Konzentration (eine Abweichung von den Normalwerten) von >75 µg/g Stuhl PLRP1 und/oder 100 µg/g Stuhl für PRSS2deutet auf ein Pankreaskarzinom hin.a) According to the determination of the protein PLRP1 takes place in the stool. Positive finding, i. a concentration (deviation from normal) of> 75 μg / g stool PLRP1 and / or 100 μg / g stool for PRSS2 indicates pancreatic carcinoma.
  2. b) In einer Variante der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Proteinkombination „PLRP1 und/oder PRSS2, ELA3B, Elastase 1“ in Stuhl. Positiver Befund, d.h. eine Konzentration von >75 µg/g Stuhl PLRP1 und/oder > 100 µg/g Stuhl für PRSS2deutet auf ein Pankreaskarzinom hin. Ist die Konzentration von ELA3A, ELA3B, Elastase 1 < 200 µg/g Stuhl, so deutet dieses zusätzlich auf eine exokrine Pankreasinsuffizienz hin.b) In a variant of the invention, the determination of the protein combination "PLRP1 and / or PRSS2, ELA3B, elastase 1" takes place in stool. Positive finding, i. a concentration of> 75 μg / g stool PLRP1 and / or> 100 μg / g stool for PRSS2 indicates pancreatic carcinoma. If the concentration of ELA3A, ELA3B, elastase 1 is <200 μg / g stool, this additionally indicates an exocrine pancreatic insufficiency.

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Claims (14)

Verfahren zum in-vitro Nachweis eines malignen Tumors im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1 und PRSS2“ qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.A method for in vitro detection of a malignant tumor in the pancreas, wherein in a sample of human or animal stool one or more proteins selected from the group "PLRP1 and PRSS2" is determined qualitatively or quantitatively. Verfahren zum in-vitro Nachweis eines malignen Tumors im Pankreas, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls die eine Kombination der Proteine „PLRP1 und PRSS2“ bestimmt wird.Method for the in-vitro detection of a malignant tumor in the pancreas, wherein a combination of the proteins "PLRP1 and PRSS2" is determined in a sample of human or animal stool. Verfahren zurin-vitro Differenzierung eines malignen Tumors im Pankreas von einer entzündlichen Pankreaserkrankung, wobei in einer Probe menschlichen oder tierischen Stuhls ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1, PRSS2“ und ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe „CRMT, ELA3A, ELA3B“ qualitativ oder quantitativ bestimmt werden.A method for in vitro differentiation of a malignant tumor in the pancreas from an inflammatory pancreatic disease, wherein in a sample of human or animal stool one or more proteins selected from the group "PLRP1, PRSS2" and one or more proteins selected from the group "CRMT, ELA3A, ELA3B "can be determined qualitatively or quantitatively. Verfahren einem der Ansprüche 1-3, wobei mindestens einProtein immunchemisch mittels für das jeweilige Protein spezifischer Antikörper bestimmt wird.Method one of Claims 1 - 3 in which at least one protein is determined immunochemically by means of antibodies specific for the respective protein. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis mittels für das Protein spezifischer monoklonaler oder polyklonalerAntikörper erfolgt, welche nicht mit anderen Bestandteilen des Stuhls, insbesondere nicht mit anderen Proteinen, kreuzreagieren.Method according to one of Claims 1 to 4 wherein the detection is by means of protein-specific monoclonal or polyclonal antibodies which do not cross-react with other constituents of the stool, in particular not with other proteins. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis mittels eines Immunoassays durchführt wird.Method according to one of Claims 1 to 4 wherein the detection is performed by means of an immunoassay. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein qualitativ oder/und quantitativ bestimmt wird.Method according to one of Claims 1 to 6 , wherein the protein is determined qualitatively and / or quantitatively. Verfahren nach einem der Ansprüche6 oder 7, wobei für das Proteinspezifische Antikörper eingesetzt werden zur selektiven Bestimmung des Proteins durch a) Inkubation mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren, von denen der erste Rezeptor R1 in fester Phase vorliegt und mit dem Protein bindefähig ist und von denen mindestens ein weiterer Rezeptor R2, der ebenfalls mit dem Protein bindefähig ist, in flüssiger Phase, insbesondere gelöst, vorliegt, wobei der Rezeptor R2 eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt, b) Trennung der festen von der flüssigen Phase und c) Bestimmung oder Messung der Markierung in einer der Phasen, wobei als mindestens einer der Rezeptoren ein Antikörper ist, der spezifisch an das Protein bindet.A method according to any one of claims 6 or 7, wherein the protein-specific antibody is used for the selective determination of the protein a) incubation with at least two different receptors, of which the first receptor R1 is present in the solid phase and is capable of binding with the protein and of which at least one further receptor R2, which is also capable of binding to the protein, is present in the liquid phase, in particular dissolved wherein the receptor R2 carries a label or mediates the binding to a detectable molecule, b) separation of the solid from the liquid phase and c) determining or measuring the label in one of the phases, wherein as at least one of the receptors is an antibody that specifically binds to the protein. Verfahren nach Anspruch 8, wobei als an die feste Phase gebundener Antikörper ein Antikörper verwendet wird, der spezifisch an das Protein bindet und als löslicher Rezeptor ein verschiedener an das Protein bindender Antikörper verwendet wird, welcher eine Markierung trägt oder die Bindung an ein detektierbares Molekül vermittelt.Method according to Claim 8 in which, as antibody bound to the solid phase, an antibody is used which specifically binds to the protein and which uses, as a soluble receptor, a different protein-binding antibody which carries a label or mediates binding to a detectable molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Proteins oder der Proteine mittels der ELISA-, Schwingquarz-, Mikrowaage-, Lateral Flow-, Kandelaber-, TRACE-, oder Elektrochemilumineszenz-Technologie erfolgt.Method according to one of Claims 1 to 9 , characterized in that the detection of the protein or proteins by means of the ELISA, quartz oscillator, microbalance, lateral flow, candelabra, TRACE, or electrochemiluminescence technology takes place. Testkit zum Nachweis eines malignen Tumorgeschehensim Pankreas, zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, mit einer Zusammensetzung enthaltend mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, welcher an einProtein ausgewählt aus der Gruppe „PLRP1, PRSS2, CTRB, ELA3B, ELA3A“ bindet, sowie mit einer Stuhlprobenentnahmevorrichtung.Test kit for the detection of a malignant tumor occurrence in the pancreas, for performing a method according to one of Claims 1 to 10 containing a composition containing at least one monoclonal or polyclonal antibody which binds to a protein selected from the group consisting of "PLRP1, PRSS2, CTRB, ELA3B, ELA3A" and a stool sampling device. Testkit nach Anspruch 11, wobei der Antikörper mit keinem anderen Protein des Stuhls kreuzreagiert, und/oder wobei das Testkit weitere für die Durchführung eines Immunoassays notwendige Reagenzien enthält.Testkit after Claim 11 wherein the antibody cross-reacts with no other protein of the stool, and / or wherein the test kit contains other reagents necessary for performing an immunoassay. Testkit nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei der Antikörper an eine Festphase gebunden ist.Testkit after one of the Claims 11 or 12 wherein the antibody is bound to a solid phase. Testkit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, mit mindestens einem Antikörper gegen PLRP1.Testkit after one of the Claims 11 to 13 , with at least one antibody against PLRP1.
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