DE102017123891A1

DE102017123891A1 - Biokompatibles Formteil und Verfahren zur Herstellung eines kollagenbasierten Schichtmaterials

Info

Publication number: DE102017123891A1
Application number: DE102017123891.3A
Authority: DE
Inventors: Kathrin Harre; Tobias Pietsch; Daniel Firzlaff; Edda Tobiasch
Original assignee: Hochschule fuer Technik und Wirtschaft Dresden
Current assignee: Hochschule fuer Technik und Wirtschaft Dresden
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2019-04-18
Anticipated expiration: 2037-10-14
Also published as: DE102017123891B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein biokompatibles Formteil aus einem kollagenbasierten Schichtmaterial zur Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat und ein Verfahren zur Herstellung eines kollagenbasierten Schichtmaterials. Das biokompatible Formteil zur Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat weist ein kollagenbasiertes Schichtmaterial auf, bei dem mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegende Schichten eines quellfähigen Kollagenmaterials durch Lufttrocknen miteinander vernetzt sind. Das Verfahren zum Bereitstellen eines kollagenbasierten Schichtmaterials, weist folgende Schritte auf:
- Bereitstellen mindestens eines quellfähigen Kollagenmaterials,
- Kontaktieren des quellfähigen Kollagenmaterials mit einer wässrigen Lösung, sodass das quellfähige Kollagenmaterial quellen kann,
- schichtweises Anordnen des gequollenen Kollagenmaterials, sodass eine Schichtanordnung mit mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegenden Schichten gebildet wird, und
- Lufttrocknen der Schichtanordnung, wobei die oberflächig aneinander liegenden Schichten miteinander vernetzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein biokompatibles Formteil aus einem kollagenbasierten Schichtmaterial zur Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat und ein Verfahren zur Herstellung eines kollagenbasierten Schichtmaterials.
Zur Herstellung von Substraten für die Zellkultur und für das Tissue Engineering werden Materialien aus hydrogelbildenden Proteinen, wie beispielsweise Kollagen, eingesetzt. Tierisches Kollagen zeichnet sich durch geringe Antigenität und hohe Biokompatibilität aus, sodass bevorzugt tierisches Kollagen als Ausgangsmaterial zur Bereitstellung von Zellkultursubstraten oder als Gerüstmaterial für das Tissue Engineering eingesetzt wird. Bekanntermaßen wird tierisches Kollagen aus tierischen Häuten gewonnen. Dabei wird so vorgegangen, dass kollagenhaltige Häute zunächst alkalisch mit Natronlauge aufgeschlossen werden, um nichtkollagene Begleitstoffe aus der Hautmatrix zu entfernen. Die dabei gequollenen Kollagenschwarten werden anschließend zu einer gelartigen Masse zerkleinert. Diese gelartige Masse kann beispielsweise durch Extrusion weiterverarbeitet werden, wobei die gelartige Masse durch Düsen hindurch zu flächigen Formen oder Schläuchen geformt werden kann. Als weitere Verarbeitungsverfahren sind das Spin-Coating-Verfahren oder das Solvent-Cast-Verfahren bekannt, die eine Herstellung von dünnen Kollagenfilmen ermöglichen. Mit den bekannten Verfahren werden vorzugsweise flächige Formen unterschiedlicher Dicke als Ausgangsmaterial zur weiteren Verwendung bereitgestellt.
Einzelschichten, insbesondere dickere Einzelschichten weisen den Nachteil einer geringen Formstabilität auf, da aufgrund eines erhöhten Schwindvermögens Spannungen auftreten, die eine Formveränderung hervorrufen können. Weiterhin besteht das Problem, dass die Transparenz mit größerer Schichtdicke sinkt, wodurch eine mikroskopische Untersuchung mit einfachen Durchlichtmikroskopen nicht mehr möglich ist. Dünne Formen, wie Folien, die beispielsweise mit Solvent-Cast-Verfahren bereitgestellt werden können, sind mechanisch empfindlich und neigen zur Rissbildung, was deren Anwendung und weitere Verarbeitung erschwert.
Eine verbesserte Formstabilität und Handhabbarkeit kann durch mehrschichtige kollagenhaltige Trägermaterialien erreicht werden, wobei die Stabilität des Materials im Wesentlichen durch die Anzahl der einzelnen Schichten beeinflusst werden kann.
Die wesentliche Herausforderung zur Bereitstellung von mehrschichtigen Trägermaterialien bestand bisher darin, dass die einzelnen Schichten miteinander verbunden werden müssen, um einen konsistenten Verbund zu erreichen, der den Anforderungen an ein Zellkulturmaterial gerecht wird. Bekanntermaßen kann ein Flächenverbund zwischen einzelnen Schichten durch chemische oder physikalische Vernetzungsbehandlung erreicht werden. Eine chemische Vernetzung von Kollagen kann mit verschiedenen vernetzenden Substanzen erzielt werden. Beispielsweise kann Glutaraldehyd eingesetzt werden, wobei sich das Glutaraldehyd in die Kollagenstruktur einfügt und dabei eine kovalente Verbindung zwischen zwei Kollagensträngen bewirkt. Werden hingegen Carbodiimide eingesetzt, aktivieren diese nur bereits am Kollagen vorhandene funktionelle Gruppen, die daraufhin untereinander reagieren und vernetzen. Eine physikalische Vernetzung von Kollagen kann durch einen bei erhöhten Temperaturen oberhalb von 60 °C im Vakuum durchgeführten Trocknungsprozess, der als Dehydrothermalverfahren bezeichnet wird, erreicht werden. Der Trocknungsprozess begünstigt Kondensationsreaktionen, wodurch sich neue Amidbindungen zwischen ε- Aminogruppen und ε-Carboxylgruppen ausbilden. Weitere Verfahren nutzen Gammastrahlung oder ultraviolette Strahlung um eine Vernetzung von Kollagenschichten zu erreichen.
Der Vorteil der physikalischen Methoden liegt darin, dass bei der Vernetzung des Kollagens keine zusätzlichen Chemikalien eingebracht werden, die bei der Verwendung des Kollagens als Zellkultursubstrat oder Implantat eine zytotoxische Wirkung hervorrufen können. Die Anwendung von Gammastrahlung oder ultravioletter Strahlung führt jedoch zu einer Denaturierung von Kollagen. Bei dem Dehydrothermalverfahren besteht der Nachteil darin, dass es durch die Anwendung vergleichsweise hoher Temperaturen oberhalb von 60 °C in Verbindung mit Unterdruck ebenfalls zu einer unkontrollierten Denaturierung des Kollagens kommt, wobei die gewünschte Form oder Matrix zerstört werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung besteht nunmehr darin, ein Kollagen basiertes Formteil mit verbesserter Formstabilität für die Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat vorzuschlagen. Weiterhin ist es Aufgabe, eine Möglichkeit zur schonenden Verbindung von Kollagenschichten vorzuschlagen, sodass ein kollagenbasiertes Schichtmaterial für die Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat bereitgestellt werden kann.
Die Aufgabe wird durch ein biokompatibles Formteil mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und einem Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 11 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsvarianten oder Weiterbildungen sind in den jeweils abhängigen Patentansprüchen angegeben.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ein physikalischer Flächenverbund zwischen Schichten oder Lagen eines Kollagenmaterials auf einfache Weise bereits dadurch erreicht werden kann, dass gequollene flächig aneinander liegende kollagenbasierte Schichten bei Raumtemperatur gemeinsam getrocknet werden, ohne dass eine erhöhte Temperatur und eine wesentliche Druckänderung erforderlich sind. Die Erfindung betrifft daher ein biokompatibles Formteil zur Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat, wobei das biokompatible Formteil ein kollagenbasiertes Schichtmaterial aufweist, bei dem mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegende Schichten eines quellfähigen Kollagenmaterials durch Lufttrocknen miteinander vernetzt sind. Dadurch, dass das erfindungsgemäße Formteil aus einem kollagenbasierten Schichtmaterial gebildet ist, bei dem die mindestens zwei quellfähigen Kollagenmaterialschichten durch Lufttrocknen miteinander vernetzt sind, weist das erfindungsgemäße Formteil keine zusätzlichen, eine Biokompatibilität für eine Anwendung als Zellkultursubstrat oder als Implantat beeinträchtigenden Vernetzungssubstanzen auf.
Das erfindungsgemäße biokompatible Formteil kann daher vorteilhaft als Trägermaterial für die Besiedlung mit Zellkulturen eingesetzt werden und weist eine ausreichend hohe mechanische Stabilität auf, um einen Kratztest zerstörungsfrei zu überstehen. Bei einem Kratztest handelt es sich um eine Form eines Zelladhäsionstest, bei dem mit einem Kratzinstrument über eine mit Zellen besiedelte Kollagenschicht gekratzt wird, um Zellmaterial zu entfernen, eine Zelladhäsion zu bestimmen und/oder Zellmaterial zu erhalten.
Das erfindungsgemäße biokompatible Formteil eignet sich, insbesondere als in vitro Modell, für Blutgefäße.
Die Formgebung des erfindungsgemäßen biokompatiblen Formteils wird mit einer Matrize erreicht, auf der mindestens zwei, vorzugsweise mehrere Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials im gequollenen Zustand angeordnet und anschließend getrocknet werden. Ein wiederholtes Quellen des Schichtmaterials in wässriger Umgebung führt nicht zum selbstständigen Lösen der untereinander vernetzten Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials. Das erfindungsgemäße Formteil kann daher in wässriger Umgebung formstabil sein, wobei auch in einem wiederholt gequollenen Zustand eine vergleichsweise gute Stabilität gewährleistet ist.
Bei dem quellfähigen Kollagenmaterial kann es sich um ein Folienmaterial, ein Vliesmaterial, ein Netzmaterial und/oder ein Schaummaterial handeln.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des biokompatiblen Formteils kann das kollagenbasierte Schichtmaterial mindestens eine weitere Schicht eines weiteren folienartigen, netzartigen, schaumartigen oder vliesartigen Materials, vorzugsweise quellfähigen Polymermaterials aufweisen. Dabei kann es vorgesehen sein, dass die mindestens eine weitere Schicht aus Polyester, Polyurethan, Gelatine, Polymilchsäure oder Polyhydroxybuttersäure gebildet ist.
Es kann vorgesehen sein, dass die weitere Schicht als Zwischenschicht zwischen zwei Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials im kollagenbasierten Schichtmaterial angeordnet ist. Dabei kann die weitere Schicht derart zwischen zwei Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials angeordnet sein, dass die zwei Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegend miteinander vernetzt sind. Auf diese Weise kann das weitere Material als bereichsweise Zwischenschicht vollständig von zwei Schichten des quellfähigen Kollagenmaterials eingebettet sein. Dadurch kann das kollagenbasierte Schichtmaterial des Formteils auch bereichsweise ausgebildete Zwischenschichten aus einem Material aufweisen, das selbst keine Verbindung oder Vernetzung mit den aus Kollagenmaterial gebildeten Schichten eingeht, da das weitere Material zwischen zwei bereichsweise oberflächig miteinander vernetzten Kollagenmaterialschichten eingeschlossen ist. Solche bereichsweise ausgebildeten Zwischenschichten können beispielsweise als Raumfüller eingesetzt sein, um dem Formteil an vorgegebenen Bereichen oder Positionen ein größeres Volumen oder eine Form zu verleihen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen biokompatiblen Formteils kann das kollagenbasierte Schichtmaterial eine Transparenz von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 % aufweisen. Eine Transparenz des kollagenbasierten Schichtmaterials von mindestens 30 % ist ausreichend, um eine Untersuchung des Formteils mit einem Durchlichtmikroskop zu ermöglichen. Vorteilhaft ist eine Transparenz insbesondere zur Untersuchung von Zellwachstum in unterschiedlichen Schichttiefen im kollagenbasierten Schichtmaterial des Formteils.
Das erfindungsgemäße biokompatible Formteil kann eine Röhrenform aufweisen, wobei das kollagenbasierte Schichtmaterial eine Wickelstruktur des quellfähigen Kollagenmaterials aufweisen kann. Röhrenformen eignen sich beispielsweise für vaskuläre in-vitro Modelle oder als vaskuläres Implantat. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial eine flächige Form mit oder ohne Strukturierung aufweist.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zum Bereitstellen eines kollagenbasierten Schichtmaterials. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:

- Bereitstellen mindestens eines quellfähigen Kollagenmaterials,
- Kontaktieren des quellfähigen Kollagenmaterials mit einer wässrigen Lösung, sodass das quellfähige Kollagenmaterial quellen kann,
- schichtweises Anordnen des gequollenen Kollagenmaterials, sodass eine Schichtanordnung mit mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegenden Schichten gebildet wird, und
- Lufttrocknen der Schichtanordnung, wobei die oberflächig aneinander liegenden Schichten miteinander vernetzt werden.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass eine ausreichend starke physikalische Vernetzung von oberflächig aneinander liegenden gequollenen Schichten aus quellfähigem Kollagenmaterial bereits dadurch erreicht werden kann, dass die oberflächig aneinander liegenden gequollenen Schichten aus Kollagenmaterial gemeinsam miteinander bei Temperaturen unterhalb von 60 °C, beispielsweise bei Raumtemperatur, ohne Einwirkung einer Druckänderung getrocknet werden. Die Lufttrocknung kann daher bei einer Temperatur kleiner als 60 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur kleiner als 50 °C, durchgeführt werden, wobei das Kollagenmaterial vernetzt wird, ohne denaturiert zu werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann somit ein kollagenbasiertes Schichtmaterial auf besonders schonende Weise hergestellt werden, ohne dass Kollagendenaturierende Verfahrensparameter wie Druck, hohe Temperaturen oder die Biokompatibilität beeinflussende Chemikalien zur Vernetzung einzelner Kollagenmaterialschichten erforderlich sind. Durch die Lufttrocknung von oberflächig aneinander liegenden gequollenen Schichten des Kollagenmaterials kann eine Vernetzung erreicht werden, die ausreicht, um ein Lösen der Schichten bei wiederholtem Quellen des kollagenbasierten Schichtmaterials zu verhindern. Vorteilhafterweise ist das kollagenbasierte Schichtmaterial auch im gequollenen Zustand formstabil. Da zur Vernetzung von oberflächig aneinander liegenden gequollenen Kollagenmaterialschichten keine weiteren Substanzen oder denaturierenden Verfahrensschritte erforderlich sind, kann ein kollagenbasiertes Schichtmaterial mit hoher Biokompatibilität zur Verwendung als Zellkulturmaterial oder als Implantatmaterial bereitgestellt werden.
Zur Bereitstellung des kollagenbasierten Schichtmaterials wird zunächst mindestens ein quellfähiges, vorzugsweise flächiges Kollagenmaterial als Ausgangsmaterial bereitgestellt. Dabei kann es vorgesehen sein, dass das mindestens eine quellfähige Kollagenmaterial aus einer Kollagen enthaltenden Flüssigkeit durch Gießen nach einem Solvent-Cast-Verfahren oder nach einem Spin-Coating-Verfahren bereitgestellt wird. Vorzugsweise kann eine quellfähige Kollagenfolie als quellfähiges Kollagenmaterial zur Herstellung des kollagenbasierten Schichtmaterials eingesetzt werden. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass das quellfähige Kollagenmaterial eine Vliesstruktur, eine Netzstruktur und/oder eine Schaumstruktur aufweist, wobei das quellfähige Kollagenmaterial vorzugsweise flächig ausgebildet ist.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Schichtanordnung durch Umschlagen oder Falten des mindestens einen gequollenen Kollagenmaterials gebildet werden. Durch mehrfaches Umschlagen erhält die Schichtanordnung weitere Schichten. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Schichtanordnung aus mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Teilen eines gequollenen Kollagenmaterials gebildet wird, wobei die einzelnen Teile verschiedene Flächengeometrien aufweisen können.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorgesehen sein, dass mindestens eine Schicht aus quellfähigem Kollagenmaterial gewickelt wird, um die mehrlagige Schichtanordnung zu erhalten.
Es kann vorgesehen sein, dass die Kollagen enthaltende Flüssigkeit vor der Durchführung des Solvent-Cast-Verfahrens oder des Spin-Coating-Verfahrens filtriert wird, wobei ein Filter eingesetzt wird, der eine Porenweite kleiner als 200 µm aufweist. Beim Filtern werden lange Kollagenfasern entfernt, sodass eine verbesserte Transparenz des bereitgestellten quellfähigen Kollagenmaterials erreicht werden kann. Es hat sich gezeigt, dass beim Filtern mit einem Filter, der eine Porenweite kleiner als 200 µm aufweist, eine Transparenz erreicht werden kann, die ausreicht, um eine Untersuchung des kollagenbasierten Schichtmaterials mit einem Durchlichtmikroskop zu ermöglichen.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorgesehen sein, dass mindestens ein weiteres folienartiges, netzartiges, vliesartiges oder schaumartiges Material, vorzugsweise quellfähiges Polymermaterial bereitgestellt wird, welches als mindestens eine weitere Schicht in die Schichtanordnung eingebracht wird. Durch die Verwendung von weiteren Materialien können die mechanischen oder chemischen Eigenschaften des kollagenbasierten Schichtmaterials beeinflusst werden. Als weiteres Material kann Polyester, Polyurethan, Gelatine, Polymilchsäure oder Polyhydroxybuttersäure als Schicht in die Schichtanordnung eingebracht werden.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass das weitere Material als Zwischenschicht, zumindest bereichsweise zwischen zwei Kollagenmaterialschichten, angeordnet wird. Dabei kann auch ein weiteres Material, das selbst nicht quellfähig ist und keine Vernetzung mit dem Kollagenmaterial verursacht, als bereichsweise Zwischenschicht zwischen zwei Kollagenschichten eingeschlossen werden. Dabei sollte gewährleistet sein, dass die mindestens zwei Kollagenmaterialschichten zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegen können, um einen ausreichenden Verbund zwischen den mindestens zwei Kollagenmaterialschichten zu ermöglichen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorgesehen sein, dass die Schichtanordnung in, an oder um eine Matrize angeordnet getrocknet wird, wobei die Matrize der Schichtanordnung eine Form verleiht, die nach dem Lufttrocknungsschritt im kollagenbasierten Schichtmaterial erhalten bleibt. Als Matrize kann eine Flachform, eine Zylinderform oder eine Hohlform aus einem vorzugsweise elastischen Material, beispielsweise Silikon, eingesetzt werden.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorgesehen sein, dass die Schichtanordnung vor oder nach dem Lufttrocknungsschritt einer chemischen Vernetzungsbehandlung unterzogen wird. Bei der chemischen Vernetzungsbehandlung kann 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) als Vernetzungssubstanz einsetzt werden. Des Weiteren kann bei dieser Vernetzungsreaktion N-Hydroxysuccinimid (NHS) als Hilfssubstanz eingesetzt werden. Der Vorteil dieser zusätzlichen Vernetzungsmethode besteht darin, dass die verwendeten Chemikalien bei der Reaktion nicht in das Kollagennetzwerk eingebaut werden, sodass die Biokompatibilität des Kollagens nicht beeinträchtigt wird. EDC dient ausschließlich zur Aktivierung von Carboxylgruppen für den nachfolgenden Vernetzungsschritt und kann nach der Reaktion durch Auswaschen wieder entfernt werden.
Die Lufttrocknung der Schichtanordnung kann bei Unterdruck durchgeführt werden, wobei ein Unterdruck eingestellt wird, der nicht zur Denaturierung des Kollagenmaterials beiträgt. Ein geringer Unterdruck wirkt sich vorteilhaft auf die Vernetzung aus und beschleunigt den Vernetzungsprozess, ohne dass das Kollagenmaterial denaturiert wird.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen.
Es zeigen:

1: eine schematische Darstellung zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bereitstellung eines flächigen kollagenbasierten Schichtmaterials und
2: eine schematische Darstellung zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bereitstellung eines kollagenbasierten Schichtmaterials als röhrenförmiger Hohlkörper.

In den Figuren sind wiederkehrende Merkmale mit gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt eine schematische Darstellung zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bereitstellung eines flächigen kollagenbasierten Schichtmaterials. Zum Bereitstellen eines kollagenbasierten flächigen Schichtmaterials wird schrittweise wie folgt vorgegangen. Zunächst wird mindestens ein flächiges quellfähiges Kollagenmaterial 1 bereitgestellt, das nach einer gewünschten Formvorgabe in mehrere Kollagenmaterialschichten 1.1 bis 1.5 geteilt wird. Anschließend werden die Kollagenmaterialschichten 1.1 bis 1.5 zum Quellen, vorzugsweise getrennt voneinander, mit einer wässrigen Lösung kontaktiert. Die gequollenen Kollagenmaterialschichten 1.1 bis 1.5 werden nun oberflächig aneinander liegend zu einer Schichtanordnung 2 angeordnet. Abschließend wird die Schichtanordnung 2 in einem Lufttrocknungsschritt (in 1 mit einem Pfeil gekennzeichnet) bei einer Temperatur kleiner als 60 °C und unter Normaldruck luftgetrocknet, wobei die oberflächig aneinander liegenden Kollagenmaterialschichten miteinander physikalisch vernetzt werden und ein kollagenbasiertes Schichtmaterial 3 ausbilden. Das gebildete kollagenbasierte Schichtmaterial ist als biokompatibler Formkörper einsetzbar.
2 zeigt eine schematische Darstellung zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bereitstellung eines kollagenbasierten Schichtmaterials als röhrenförmiger Hohlkörper. Im Unterschied zur 1 wird die Schichtanordnung 2 in 2 an einer zylinderförmigen Matrize 4 gebildet, wobei die Schichtanordnung 2 drei Kollagenmaterialschichten 1.1 bis 1.3 aufweist. Dabei sind die drei Kollagenmaterialschichten 1.1 bis 1.3 im gequollenen Zustand oberflächig aneinander liegend angeordnet. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante kann es vorgesehen sein, dass die Schichtanordnung 2 aus einer einzelnen Kollagenmaterialschicht 1.1 gebildet wird, wobei die Kollagenmaterialschicht 1.1 zumindest zweimal um die zylinderförmige Matrize gewickelt wird. Die bereitgestellte Schichtanordnung 2 wird mit der zylinderförmigen Matrize 4 in einem Lufttrocknungsschritt bei einer Temperatur kleiner als 60 °C und unter Normaldruck luftgetrocknet, wobei die oberflächig aneinander liegenden Kollagenmaterialschichten miteinander physikalisch vernetzt werden und ein kollagenbasiertes Schichtmaterial 5 ausbilden, das nach Entfernen der zylinderförmigen Matrize 4 eine Röhrenform aufweist.
Nachfolgend werden einzelne Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Bereitstellung von Kollagenmaterial in Form von Kollagenfolien natives Kollagen Typ 1 aus Rinderhaut mit 95 % Wasser-Anteil verwendet. Zur Vorbereitung der Kollagenfolien wird eine wässrige Kollagenlösung 150 mg/ml, bezogen auf das feuchte Rohkollagen, hergestellt. Zur Herstellung der wässrigen Kollagenlösung wird entionisiertes Wasser verwendet. Im Folgenden wird das Kollagen in einem Zeitraum von 4 Stunden bei 45 °C in einem Becherglas suspendiert. Die erhaltene Suspension wird unter Rühren nassklassiert, wobei ein Polypropylensieb mit einer Maschenweite von 200 µm eingesetzt wird. Bei der Nassklassierung werden 70 % der klassierten Suspension als Siebdurchgang gewonnen. Die dadurch erhaltene klare Suspension wird in einem Zeitraum von 5 Stunden bei einem Druck von 100 mbar in einem Exsikkator entgast. Jeweils 7 ml des entgasten Siebdurchganges werden in eine runde Silikonform mit einem Durchmesser von 55 mm gegeben und bei 40 °C 24 Stunden luftgetrocknet.
Zur Bildung der Schichtanordnung werden die Kollagenfolien zunächst aus den Silikonformen gelöst und anschließend 30 Sekunden mit entionisiertem Wasser kontaktiert, sodass die Kollagenfolien quellen können. Sechs der gequollenen Kollagenfolien werden auf einer Silikonmatte übereinander gestapelt, wobei eine Schichtanordnung mit sechs Schichten gebildet wird. Anschließend wird die Schichtanordnung im Trockenschrank 4 Stunden bei einer Temperatur von 40 °C luftgetrocknet. Dabei werden die einzelnen Schichten miteinander physikalisch vernetzt, sodass ein Lösen der Schichten nicht mehr möglich ist. Auch ein erneutes Aufquellen führt nicht zur Ablösung von einzelnen Schichten. Die Anzahl der Schichten der Schichtanordnung ist variierbar, sodass ein Schichtmaterial mit verschiedenen Dicken bereitgestellt werden kann.
Weiterhin kann es gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass die Schichten der Schichtanordnung chemisch vernetzt werden. Für die chemische Vernetzung wird EDC in Form von Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid) (EDC-HCL) verwendet. Weiterhin wird eine NHS-Lösung eingesetzt. Die EDC-Lösungen und NHS-Lösungen sind separat voneinander vorzubereiten. Die den ermittelten Stoffmengen entsprechenden Massen an EDC und NHS werden jeweils in einem 0,05 M 2-(-N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (MES-Puffer) mit einem pH-Wert von 5,5 gelöst. Der pH-Wert der verwendeten MES-Lösung wird mit 1 M NaOH eingestellt. Vor der Vernetzung wird die aus mehreren Kollagenfolien gebildete Schichtanordnung 12 Stunden bei einer Temperatur von 40 °C getrocknet. Die Vernetzung der Schichtanordnung kann in einer Petrischale aus Polystyrol (Durchmesser 85 mm) durchgeführt werden. Dabei können die EDC-Lösung und die NHS-Lösung vorzugsweise erst in der Petrischale miteinander gemischt werden. Nach dem Mischen beider Vernetzungskomponenten EDC-Lösung und NHS-Lösung kann die Schichtanordnung mit dem Gemisch aus EDC-Lösung und NHS-Lösung kontaktiert werden. Vorzugsweise wird die Schichtanordnung während der Kontaktierung mit dem Gemisch aus EDC-Lösung und NHS-Lösung geschwenkt. Die Kontaktierungsdauer beträgt vorzugsweise 4 Stunden. Zum Entfernen des Gemischs aus EDC-Lösung und NHS-Lösung kann die vernetzte Schichtanordnung nunmehr als Schichtmaterial zweimal je 1 Stunde mit 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Puffer (Na2HPO4-Puffer) (pH = 9.4) gewaschen werden. In einem zweiten einstündigen Reinigungsschritt kann das gebildete Schichtmaterial mit entionisiertem Wasser gewaschen werden. Anschließend kann das Schichtmaterial auf einer Silikonmatte bei Raumtemperatur getrocknet werden. Aufgrund der chemischen Vernetzungsbehandlung der Schichtanordnung kann ein biokompatibles Schichtmaterial bereitgestellt werden, das eine erhöhte Reißfestigkeit und insbesondere eine größere Stabilität bei einem Kratztest aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann ein kollagenbasiertes Schichtmaterial mit unterschiedlichen Kollagenmaterialien bereitgestellt werden, wobei zusätzlich zu Kollagenfolien Kollagenschaum als weiteres Schichtmaterial eingesetzt werden kann. Beispielsweise können ScinTemp®-Kollagenschäume der Firma HumanBioScience GmbH eingesetzt werden. Zur Bildung einer Schichtanordnung können gequollene Kollagenfolien im Wechsel mit ScinTemp®-Kollagenschäumen zu einem Stapel aus je drei Kollageneinzelfolien und zwei ScinTemp®-Kollagenschäumen angeordnet werden. Die derart gebildete Schichtanordnung wird anschließend bei einer Temperatur von 40 °C 4 Stunden luftgetrocknet.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass als weiteres Material ein quellbares Polyurethan in Form einer quellbaren Polyurethanfolie als zusätzliche Schicht der Schichtanordnung eingesetzt wird. Zur Bereitstellung von Polyurethanfolien werden 24 ml Polyethylenglykol PEG 40 und 4,3 ml Glycerin unter Rühren vermischt. Anschließend werden 17 ml Hexamethylendiisocyanat hinzudosiert und weitere 90 Sekunden gerührt. Die dabei bereitgestellte Reaktionsmischung wird in eine Polytetrafluorethylen (PTFE)-Form gegossen und bei einer Temperatur von 40 °C zunächst unter Vakuum und anschließend 24 Stunden unter Stickstoff bei einem Druck von 1 bar temperiert. Die erhaltene Polyurethanfolie wird entformt, gegebenenfalls geteilt und anschließend zur Bildung einer Schichtanordnung im Wechsel mit Kollageneinzelfolien zu einem Stapel aus je drei Kollageneinzelfolien und zwei Polyurethanfolien angeordnet. Die derart gebildete Schichtanordnung wird anschließend bei einer Temperatur von 40 °C 4 Stunden luftgetrocknet. Das erhaltene Schichtmaterial weist fest verbundene Schichten auf, wobei sich die Schichten auch bei erneutem Aufquellen nicht voneinander lösen.
Zur Bereitstellung eines röhrenförmigen Formteils aus dem kollagenbasierten Schichtmaterial können eine längliche Kollagenfolie oder mehrere einzelne Kollagenfolien zur Bildung einer Schichtanordnung im gequollenen Zustand um einen Kunststoffrundstab gewickelt werden, wobei der Kunststoffrundstab als Matrize dient. Die um den Kunststoffrundstab gewickelte Schichtanordnung wird 4 Stunden bei einer Temperatur von 40 °C luftgetrocknet, wobei die oberflächig aneinander liegenden Schichten physikalisch miteinander vernetzt werden. Anschließend wird der Kunststoffrundstab entfernt, wobei eine formstabile kollagenbasierte Hohlform erhalten wird. Da sich die Schichten auch beim Quellen nicht voneinander lösen, kann ein formstabiles röhrenartiges Formteil bereitgestellt werden. Zur Bereitstellung von weiteren Formteilen können unterschiedliche Matrizen eingesetzt werden.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass zur Bildung eines Formteils eine Schichtanordnung eingesetzt wird, die mindestens eine weitere Schicht aufweist, die nicht aus Kollagen gebildet ist. Beispielsweise können Zwischenschichten aus einem Textilmaterial oder aus Polyurethan eingesetzt werden.
Bezugszeichenliste

1: quellfähiges Kollagenmaterial
1.1 bis 1.5: Schichten / Kollagenmaterialschichten
2: Schichtanordnung
3: kollagenbasiertes Schichtmaterial
4: zylinderförmige Matrize
5: röhrenförmiges kollagenbasiertes Schichtmaterial

Claims

Biokompatibles Formteil zur Anwendung als Implantat oder Zellkultursubstrat, aufweisend ein kollagenbasiertes Schichtmaterial (3) bei dem mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegende Schichten (1.1 bis 1.5) eines quellfähigen Kollagenmaterials (1) durch Lufttrocknen miteinander vernetzt sind.
Biokompatibles Formteil nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das quellfähige Kollagenmaterial (1) ein Folienmaterial, ein Vliesmaterial, ein Netzmaterial und/oder ein Schaummaterial ist.
Biokompatibles Formteil nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial (3) mindestens eine weitere Schicht eines weiteren folienartigen, netzartigen, schaumartigen oder vliesartigen Materials, insbesondere quellfähigen Polymermaterials, aufweist.
Biokompatibles Formteil nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine weitere Schicht aus Kollagen, Polyester, Polyurethan, Gelatine, Polymilchsäure oder Polyhydroxybuttersäure gebildet ist.
Biokompatibles Formteil nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Schicht als Zwischenschicht zumindest bereichsweise zwischen zwei Schichten (1.1 bis 1.5) des quellfähigen Kollagenmaterials (1) des kollagenbasierten Schichtmaterials (3) angeordnet ist.
Biokompatibles Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial (3) eine Transparenz von mindestens 30 %, insbesondere mindestens 50 %, aufweist.
Biokompatibles Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial (3) eine Röhrenform aufweist.
Biokompatibles Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial (3) eine Wickelstruktur des quellfähigen Kollagenmaterials (1) aufweist.
Biokompatibles Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das kollagenbasierte Schichtmaterial (3) eine flächige Form aufweist.
Biokompatibles Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Formteil in wässriger Umgebung formstabil ist.
Verfahren zum Bereitstellen eines kollagenbasierten Schichtmaterials (3), aufweisend folgende Schritte, - Bereitstellen mindestens eines quellfähigen Kollagenmaterials (1), - Kontaktieren des quellfähigen Kollagenmaterials (1) mit einer wässrigen Lösung, sodass das quellfähige Kollagenmaterial (1) quellen kann, - schichtweises Anordnen des gequollenen Kollagenmaterials (1), sodass eine Schichtanordnung (2) mit mindestens zwei zumindest bereichsweise oberflächig aneinander liegenden Schichten (1.1 bis 1.5) gebildet wird, und - Lufttrocknen der Schichtanordnung (2), wobei die oberflächig aneinander liegenden Schichten (1.1 bis 1.5) miteinander vernetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtanordnung (2) bei einer Temperatur kleiner als 60 °C, insbesondere bei einer Temperatur kleiner als 50 °C, luftgetrocknet wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine quellfähige Kollagenmaterial (1) aus einer Kollagen enthaltenden Flüssigkeit durch Gießen nach einem Solvent-Cast-Verfahren oder nach einem Spin-Coating-Verfahren bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagen enthaltende Flüssigkeit vor der Durchführung des Solvent-Cast-Verfahrens oder des Spin-Coating-Verfahrens filtriert wird, wobei ein Filter eingesetzt wird, der eine Porenweite kleiner als 200 µm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das quellfähige Kollagenmaterial (1) eine Vliesstruktur, eine Netzstruktur und/oder ein Schaumstruktur aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiteres folienartiges, netzartiges, vliesartiges oder schaumartiges Material, insbesondere quellfähiges Polymermaterial, bereitgestellt wird, welches als mindestens eine weitere Schicht in die Schichtanordnung (2) eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als weiteres Material Polyester, Polyurethan, Gelatine, Polymilchsäure oder Polyhydroxybuttersäure eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Material als Zwischenschicht zumindest bereichsweise zwischen zwei Schichten aus quellfähigem Kollagenmaterial (1) angeordnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtanordnung (2) an einer Matrize angeordnet luftgetrocknet wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Matrize eine Flachform, eine Zylinderform oder eine Hohlform aus einem vorzugsweise elastischen Material eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Schicht aus quellfähigem Kollagenmaterial (1) gewickelt wird, um die mehrlagige Schichtanordnung (2) zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtanordnung (2) vor oder nach der Lufttrocknung einer chemischen Vernetzungsbehandlung unterzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Lufttrocknung bei Unterdruck durchgeführt wird.