DE102016117096A1

DE102016117096A1 - Verfahren zum hochaufgelösten lokalen Abbilden einer Struktur in einer Probe

Info

Publication number: DE102016117096A1
Application number: DE102016117096.8A
Authority: DE
Inventors: Stefan W. Hell; Fabian Göttfert; Volker Westphal
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2017-03-23
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: US20170082844A1; US9891417B2; JP6730895B2; DE102016117096C5; JP2017072586A; DE102016117096B4

Abstract

Zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe wird Licht (2), das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die eine von Intensitätsmaxima (3) benachbarte Nullstelle (4) aufweist. Ein abzutastender Teilbereich der Probe wird mit der Nullstelle (4) abgetastet, und aus dem Bereich der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlicht wird registriert und dem Ort der Nullstelle (4) in der Probe zugeordnet. Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs der Probe in mindestens einer Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) in der Probe benachbart sind, werden dabei so begrenzt, dass sie nicht größer sind als 75 % eines Abstands (D0) der Intensitätsmaxima (3) in dieser Richtung.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zur Durchführung dieser Verfahren.
Die Erfindung fällt auf das Gebiet der hochauflösenden Rasterlumineszenzlichtmikroskopie, bei der Maßnahmen getroffen werden, die es erlauben, aus der jeweiligen Probe emittiertes Lumineszenzlicht mit höherer Ortsauflösung als der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts und bei der Wellenlänge von etwaigem Anregungslicht, mit dem die Lumineszenzmarker räumlich begrenzt zur Emission von Lumineszenzlicht angeregt werden, einem Ort in der Probe zuzuordnen. Vielfach handelt es sich bei den Lumineszenzmarkern um Fluoreszenzmarker, die nach Anregung durch Anregungslicht Fluoreszenzlicht als Lumineszenzlicht emittieren. Dann spricht man von Fluoreszenzmikroskopie.
STAND DER TECHNIK
Bei bekannten Verfahren und Rasterlumineszenzlichtmikroskopen nach den Oberbegriffen der unabhängigen Patenansprüche wird zur Erhöhung der Ortsauflösung Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die eine von Intensitätsmaxima benachbarte Nullstelle aufweist. Vielfach handelt es sich bei diesem Licht um Lumineszenzverhinderungslicht, mit dem die Emission von Lumineszenzlicht durch diejenigen Lumineszenzmarker verhindert wird, welche sich außerhalb der Nullstelle befinden. Das aus der Probe emittierte Lumineszenzlicht kann so dem Ort der Nullstelle zugeordnet werden, weil nur dort angeordnete Lumineszenzmarker in der Lage sind, Lumineszenzlicht zu emittieren.
So werden bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie zuvor mit Anregungslicht angeregte Fluoreszenzmarker mittels Stimulationslicht als Fluoreszenzverhinderungslicht bis auf diejenigen im Bereich der Nullstelle durch stimulierte Emission wieder abgeregt, so dass nur die im Bereich der Nullstelle befindlichen Fluoreszenzmarker das anschließend gemessene Fluoreszenzlicht emittiert haben können. Dieses Fluoreszenzlicht kann so dem Ort der Nullstelle in der Probe zugeordnet werden. Durch Abtasten der Probe mit der Nullstelle wird die räumliche Verteilung der Fluoreszenzmarker in der Probe bestimmt. Auf diese Weise können der Aufbau und die räumliche Verteilung einer mit den Fluoreszenzmarkern markierten Struktur in der Probe abgebildet werden.
Bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie werden mit Fluoreszenzverhinderungslicht diejenigen Fluoreszenzmarker außerhalb des Bereichs der Nullstelle in einen elektronischen Dunkelzustand überführt und sind so durch Anregungslicht nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar.
Bei der RESOLFT-Fluoreszenzmikroskopie kommt Fluoreszenzverhinderungslicht zum Einsatz, das photochrome Fluoreszenzmarker aus einem fluoreszenten Zustand bis auf diejenigen im Bereich der Nullstelle in einen nicht fluoreszenten Zustand überführt. Bei anschließender Anregung der Fluoreszenzmarker mit Anregungslicht werden entsprechend nur die Fluoreszenzmarker im Bereich der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts von Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. So kann auch hier das von den Fluoreszenzmarkern aus der Probe emittierte Fluoreszenzlicht dem Ort der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts zugeordnet werden.
Bei allen bis hierher geschilderten Verfahren der hochauflösenden Rasterlumineszenzlichtmikroskopie besteht eine nicht unerhebliche Gefahr, die Lumineszenzmarker in der jeweiligen Probe vorübergehend oder gar dauerhaft zu bleichen, d. h. zu inaktivieren, so dass diese kein Lumineszenzlicht mehr emittieren. Diese Gefahr beruht auf der Tatsache, dass die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts, um alle Lumineszenzmarker außerhalb des Bereichs der Nullstelle an der Emission von Lumineszenzlicht zu hindern und um zugleich die räumlichen Abmessungen des Bereichs der Nullstelle, aus dem heraus die Lumineszenzmarker noch Lumineszenzlicht emittieren können, stark einzuengen, sehr hoch eingestellt werden muss. Das Lumineszenzverhinderungslicht wirkt mit dieser hohen Intensität bereits dann auf die Lumineszenzmarker in der Probe ein, wenn sich ihnen der Bereich der Nullstelle des Lumineszenzverhinderungslichts nähert, d. h., schon bevor sie zum ersten Mal in den Bereich der Nullstelle gelangen und damit zum ersten Mal von ihnen emittiertes Lumineszenzlicht registriert wird. Dies kann zur Folge haben, dass zum Bleichen neigende Lumineszenzmarker bei den beschriebenen Verfahren nicht eingesetzt werden können oder zumindest nicht mit sehr hohen Intensitäten des Lumineszenzverhinderungslichts, wie sie zur Maximierung der Ortsauflösung wünschenswert wären.
Um der geschilderten Problematik des vorübergehenden und insbesondere des dauerhaften Bleichens bei der hochauflösenden Rasterlumineszenzlichtmikroskopie zu begegnen, sind verschiedene Ansätze verfolgt worden. Die DE 10 2005 027 896 A1 lehrt, das Fluoreszenzverhinderungslicht bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie in Pulsen mit vergleichsweise großen zeitlichen Abständen oder unter schnellem Abtasten der jeweiligen Probe mit der Nullstelle auf die Probe aufzubringen, so dass dieselben Bereiche der Probe nur in einem optimierten zeitlichen Wiederholungsabstand der hohen Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts ausgesetzt werden. Auf diese Weise wird die Intensität des von der Probe erhältlichen Fluoreszenzlichts erhöht, weil die Rate, mit der die Fluoreszenzmarker aus einem angeregten Zwischenzustand durch weitere Anregung in einen permanenten oder nur langsam abklingenden Dunkelzustand gelangen, erheblich reduziert wird. Anders gesagt wird mit einem relativ großen Wiederholungsabstand des Beaufschlagens jedes einzelnen Bereichs der Probe mit der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts die in einem bestimmten Zeitraum von der gesamten Probe erhältliche Menge an Fluoreszenzlicht maximiert. Diese Vorgehensweise reduziert auch die Neigung der Fluoreszenzmarker zu bleichen, weil eine stärkere Besetzung von angeregten Zuständen, aus denen heraus eine photochemische Zerstörung der Fluoreszenzmarker erfolgt, vermieden wird.
Zur Durchführung hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie auch mit zum Bleichen neigenden Fluoreszenzmarkern lehrt die DE 10 2011 051 086 A1 , Abtastbedingungen, die neben einer Abtastgeschwindigkeit, mit der die jeweilige Probe abgetastet wird, und Lichtintensitäten einer Intensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht Eigenschaften und eine Konzentration der Fluoreszenzmarker in der Probe umfassen, so aufeinander abzustimmen, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Bereich der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts emittiert wird. Ein Bild einer mit den Fluoreszenzmarkern markierten Struktur in der Probe wird dann aus den Orten zusammengesetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens der Probe mit der Nullstelle zugeordnet wurden. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit des Bleichens der Fluoreszenzmarker reduziert, bevor sie erstmalig von der Nullstelle erreicht und somit erfasst werden. Dies beruht darauf, dass die Wahrscheinlichkeit des Bleichens mit der Intensität des von den einzelnen Fluoreszenzmarkern erhaltenen Fluoreszenzlichts korreliert ist. Da das Fluoreszenzlicht auf einzelne Photonen minimiert wird, wird auch die Gefahr des Bleichens minimiert. Grundsätzlich werden bei dem aus der DE 10 2011 051 086 A1 bekannten Verfahren die einzelnen Fluoreszenzmarker von der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts aber weiterhin erst dann erreicht, nachdem sie zuvor den hohen Intensitäten im Bereich der angrenzenden Intensitätsmaxima ausgesetzt waren.
Um bei der hochauflösenden Rasterlumineszenzlichtmikroskopie auch gegenüber Bleichen empfindliche Substanzen einsetzen zu können, ist es aus der WO 2011/131591 bekannt, eine Probe, in der sich eine mit Lumineszenzmarkern markierte interessierende Struktur befindet, mit einer Messfront zu überfahren. Dabei nehmen die Intensitäten von optischen Signalen über eine Tiefe der Messfront, die kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge der optischen Signale ist, derart zu, dass ein Anteil der Lumineszenzmarker, der Lumineszenzlicht emittiert, durch Überführen der Lumineszenzmarker in einen lumineszenten Zustand von nicht vorhanden anwächst und durch Überführen der Lumineszenzmarker in einen nicht lumineszierenden Zustand wieder auf nicht vorhanden abfällt. Das Lumineszenzlicht aus dem Bereich der Messfront wird erfasst und den zugehörigen Positionen der Messfront in der Probe zugeordnet. Die Zuordnung des Lumineszenzlichts längs der Messfront kann dabei ebenfalls mit einer Ortsauflösung jenseits der Beugungsgrenze erfolgen, beispielsweise unter Zuordnung der registrierten Photonen zu einem einzigen Lumineszenzmarker, wie dies beispielsweise bei einem als GSDIM bekannten lichtmikroskopischen Verfahren erfolgt.
Eine Möglichkeit, die Geschwindigkeit beim Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe in der Rasterlumineszenzlichtmikroskopie zu erhöhen, ist es, die Probe mit mehreren Nullstellen des Lumineszenzverhinderungslichts parallel abzutasten. Dabei wird das aus der Probe emittierte Lumineszenzlicht den einzelnen Nullstellen des Lumineszenzverhinderungslichts getrennt zugeordnet. Aus der DE 10 2006 009 833 B4 ist es bekannt, eine Intensitätsverteilung von Lumineszenzverhinderungslicht mit einem Raster von Nullstellen auszubilden, indem zwei orthogonal zueinander verlaufende Linienmuster aus Lumineszenzverhinderungslicht in der Probe miteinander überlagert werden. Dabei wird eine Interferenz zwischen den Linienmustern verhindert, so dass sich ihre Intensitätsverteilungen aufaddieren. Die gewünschten von Intensitätsmaxima benachbarten Nullstellen der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts verbleiben an den Kreuzungspunkten der linienförmigen Nullstellen der beiden Liniengitter. Um die Probe im Bereich der rasterförmigen Anordnung der Nullstellen vollständig abzutasten, reicht es aus, jede Nullstelle über die Abstände zu den ihr in Richtung beider Linienmuster nächstbenachbarten Nullstellen zu verschieben. Auch dabei werden die meisten Lumineszenzmarker in der Probe hohen Lichtintensitäten des Lumineszenzverhinderungslichts ausgesetzt, bevor sie von der Nullstelle erreicht und damit erstmalig erfasst werden. Die Lumineszenzmarker müssen daher so ausgewählt werden, dass sie diesen hohen Lichtintensitäten standhalten, ohne zu bleichen.
Li D et al.: Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics, Science 2015 Aug 28; 349(6251) offenbaren ein Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit aktivierbaren Fluoreszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe, wobei die Probe mit zusammenfallenden linien- oder ebenenförmigen Nullstellen von Lichtintensitätsverteilungen von Fluoreszenzaktivierungslicht und Fluoreszenzanregungslicht nacheinander in unterschiedlichen Richtungen abgetastet wird und dabei das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht mit einer Kamera erfasst wird. Aus der Auswertung der erfassten Lichtintensitäten kann ein Abbild einer interessierenden Struktur in der Probe rekonstruiert werden, dessen Ortsauflösung durch die Einengung der übereinstimmenden Nullstellen des Fluoreszenzaktivierungslichts und des Fluoreszenzanregungslichts, aus denen jeweils kein Fluoreszenzlicht von der Probe stammt, erhöht ist. Auch bei diesem bekannten Verfahren sind die Nullstellen des Fluoreszenzaktivierungslichts und des zugleich als Fluoreszenzdeaktivierungslicht wirkenden Fluoreszenzanregungslichts von Intensitätsmaxima des Fluoreszenzaktivierungslichts und des Fluoreszenzanregungslichts benachbart. Mit den hohen Intensitäten des Fluoreszenzaktivierungslichts und des Fluoreszenzanregungslichts im Bereich dieser Intensitätsmaxima werden alle Lumineszenzmarker in der Probe beaufschlagt, bevor sie in den Bereich der zusammenfallenden Nullstellen des Fluoreszenzaktivierungslichts und des Fluoreszenzanregungslichts gelangen. Damit ist auch bei diesem bekannten Verfahren das Risiko eines Bleichens der Fluoreszenzmarker, noch bevor sie zu dem relevanten Messsignal beitragen, sehr hoch.
Aus der WO 2014/108455 A1 ist ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur einer Probe bekannt, bei dem die Probe wie in der STED-Fluoreszenzmikroskopie mit Anregungslicht und mit Stimulationslicht als Lumineszenzverhinderungslicht beaufschlagt wird, um den Bereich der Probe, dem aus der Probe emittiertes und detektiertes Fluoreszenzlicht zugeordnet werden kann, auf den Bereich einer Nullstelle des Stimulationslichts zu begrenzen. Um dabei die Lumineszenzmarker vor den hohen Intensitäten des Stimulationslichts im Bereich seiner an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsmaxima zu schützen, wird die Probe zusätzlich mit Anregungsverhinderungslicht beaufschlagt, dessen Intensitätsverteilung ein lokales Minimum aufweist, das mit der Nullstelle des Stimulationslichts zusammenfällt. Dieses Anregungsverhinderungslicht kann insbesondere Ausschaltlicht sein, das schaltbare Lumineszenzmarker außerhalb des Minimums des Anregungsverhinderungslichts in einen inaktiven Zustand ausschaltet, in dem sie mit dem Anregungslicht nicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Konkret kann es sich bei den Lumineszenzmarkern um schaltbare Fluoreszenzfarbstoffe handeln, wie sie bei der hochauflösenden RESOLFT-Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz kommen. Bei dem aus der WO 2014/108455 bekannten Verfahren wird die Schaltbarkeit der Lumineszenzmarker primär aber nicht zur Erhöhung der räumlichen Auflösung genutzt, sondern um sie vor dem Bleichen durch die hohen Intensitäten des Stimulationslichts zu schützen.
Aus R A Hoebe et al.: Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging, Nature Biotechnology, Volume 25, No. 2, February 2007, Seiten 249 bis 253 ist ein Verfahren der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bekannt, bei dem eine Probe mit fokussiertem Anregungslicht abgetastet wird, um eine mit Lumineszenzmarkern markierte Struktur in der Probe abzubilden. Dabei wird in jeder Position des fokussierten Anregungslichts in der Probe das Anregungslicht abgeschaltet, sobald eine Anzahl an Photonen, die von den angeregten Lumineszenzmarkern in der Probe emittiert und mit einem Detektor registriert wurden, einen oberen Grenzwert erreicht, der einem gewünschten Signal zu Rauschen-Verhältnis entspricht. Das Abschalten des Anregungslichts erfolgt auch, wenn die Anzahl der emittierten und registrierten Photonen einen unteren Grenzwert binnen eines vorgegebenen Teilzeitraums der maximalen Pixel Dwell Time nicht erreicht, weil dies darauf hinweist, dass sich an der jeweiligen Position des fokussierten Anregungslichts keine relevante Konzentration an Lumineszenzmarkern befindet. Auf diese Weise wird die Belastung der Probe mit Anregungslicht gegenüber einer Beaufschlagung der Probe mit derselben Lichtmenge in jeder Position des fokussierten Anregungslichts deutlich reduziert.
Aus T. Staudt et al.: Far-field optical nanoscopy with reduced number of state transition cycles, Optics Express Vol. 19, No. 6, 14 March 2011, Seiten 5644 bis 5657 ist ein als RESCue-STED bezeichnetes Verfahren bekannt, das das von R A Hoebe et al. für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie beschriebene Verfahren auf die STED-Fluoreszenzmikroskopie überträgt. Dadurch wird die Probe nur solange als nötig oder sinnvoll mit den hohen Intensitäten des Stimulationslichts beaufschlagt.
Aus der DE 10 2013 100 147 A1 ist ein Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer einen Luminophor aufweisenden Struktur einer Probe bekannt, bei dem die Probe in einem Messbereich mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Lumineszenzverhinderungslicht beaufschlagt wird. Danach wird die Probe in dem Messbereich mit Lumineszenzanregungslicht beaufschlagt, das den Luminophor aus einem elektronischen Grundzustand heraus in einen lumineszierenden Zustand anregt; und aus dem Messbereich emittiertes Lumineszenzlicht wird registriert. Das registrierte Lumineszenzlicht wird der Position des lokalen Minimums in der Probe zugeordnet. Mit dem Lumineszenzverhinderungslicht wird der elektronische Grundzustand des Luminophors so gestört, dass der Luminophor in dem gestörten elektronischen Grundzustand einen reduzierten Absorptionsquerschnitt für das Lumineszenzanregungslicht aufweist. Zusätzlich kann die Probe vor dem Registrieren des Lumineszenzlichts in dem Messbereich mit STED-Licht beaufschlagt werden, das ebenfalls ein lokales Minimum im Zentrum des Messbereichs aufweist. Wenn dieses lokale Minimum noch kleiner ist als das lokale Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts, kann hierdurch die räumliche Zuordnung des Lumineszenzlichts noch stärker eingegrenzt werden, wodurch die räumliche Auflösung bei der Abbildung der Struktur noch weiter erhöht wird. Die lokalen Minima des STED-Lichts und des Fluoreszenzverhinderungslichts sind in allen Positionen des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts in der Probe konzentrisch zueinander angeordnet.
Aus der DE 10 2013 114 860 B3 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe bekannt, bei dem sich die einzelnen Moleküle der Substanz in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, und die Abstände der einzelnen Moleküle der Substanz einen Mindestwert einhalten. Die einzelnen Moleküle der Substanz werden mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, wobei eine Intensitätsverteilung des Annäherungslichts mindestens eine Nullstelle aufweist. Das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz wird für verschiedene Positionen der mindestens einen Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts registriert. Dabei sind die Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen der mindestens einen Nullstelle, in dem das Fluoreszenzlicht von den angeregten einzelnen Molekülen der Substanz registriert wird, nicht größer als der halbe Mindestwert. Dann werden die Orte der Einzelmoleküle der Substanz aus dem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen Molekül über den Positionen der mindestens einen Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in dem interessierenden Bereich der Probe abgeleitet.
Aus der WO 2010/069987 A1 ist ein Verfahren zur dynamischen Verlagerung eines Lichtstrahls gegenüber einer den Lichtstrahl fokussierenden Optik bekannt. Dieses Verfahren kann in der STED-Mikroskopie zur Anwendung kommen. Beim Abtasten der Probe können schnelle adaptive Rastermuster realisiert werden, die dunkle Hintergrundbereiche oder aus anderen Gründen uninteressante Objektbereiche auslassen, um durch eine reduzierte Bildpunkteanzahl eine höhere Bildwiederholungsrate zu erreichen.
Die US 2012/0104279 A1 beschreibt ein Fluoreszenzlichtrastermikroskop mit einer doppeltbrechenden chromatischen Strahlformungseinrichtung. Das Rastermikroskop ist insbesondere ein STED-Mikroskop. Durch die doppeltbrechende chromatische Strahlformungseinrichtung tritt sowohl Anregungslicht als auch STED-Licht hindurch, wobei die Strahlformungseinrichtung die Ausbildung eines Intensitätsmaximums des Anregungslichts im Fokus eines nachgeschalteten Objektivs nicht beeinträchtigt, hingegen aber zur Folge hat, dass das STED-Licht eine Intensitätsverteilung mit einem Intensitätsminimum am Ort des Intensitätsmaximums des Anregungs-lichts ausbildet.
Aus der EP 2 317 362 A1 ist ein mikroskopisches Verfahren mit gesteigerter Auflösung bekannt, bei dem eine Probe zweimal mit einem Intensitätsmaximum von Anregungslicht abgetastet wird, um zwei Bilder der Probe zu erzeugen. Dabei werden die Abtastpunkte, die den beiden Bildern zugrunde liegen, um eine Schrittweite unterhalb einer optischen Auflösungsgrenze des Verfahrens zueinander versetzt, und die resultierenden Unterschiede der Bilder werden zur Erzielung einer erhöhten räumlichen Auflösung ausgewertet. Ein entsprechendes Verfahren ist auch aus der DE 10 2013 017 468 A1 bekannt.
Aus der US 2013/0201558 A1 ist eine Strahlformungseinrichtung zur Formung eines Strahls mit einer zentralen Nullstelle bekannt. Diese Strahlformungseinrichtung kann in der STED-Mikroskopie Verwendung finden. Bei der Strahlformungseinrichtung ist ein Scanwinkel, der beim Abtasten einer Probe mit dem Strahl eingestellt wird, begrenzt, weil er die durch verschiedene Verzögerungsplatten zur Ausbildung der zentralen Nullstelle eingestellten relativen Verzögerungen des Strahls stört.
Aus der US 7,679,741 B2 ist ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben bekannt, das zur RESOLFT-Mikroskopie mit schaltbaren Substanzen zählt. In einer Aus-führungsform weist das bekannte Verfahren das parallele Ausbildung mehrerer Nullstellen von Fluoreszenzverhinderungslicht aus, um die Probe parallel, d. h. zugleich in mehreren Teilbereichen, zu untersuchen.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe sowie ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zur Durchführung solcher Verfahren aufzuzeigen, mit denen die Belastung der Lumineszenzmarker in der Probe durch hohe Lichtintensitäten grundsätzlich reduziert wird, so dass auch gegenüber hohen Lichtintensitäten empfindliche Lumineszenzmarker Verwendung finden können und/oder eine Struktur in der jeweiligen Probe auch wiederholt abgebildet werden kann, um beispielsweise Veränderungen der Struktur im Verlauf eines biologischen Prozesses zu verfolgen.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 1 und 5 gelöst. Patentanspruch 20 ist auf ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren gerichtet. Die abhängigen Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren und des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe wird Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die eine von Intensitätsmaxima benachbarte Nullstelle aufweist. Ein abzutastender Teilbereich der Probe wird mit der Nullstelle abgetastet, und aus dem Bereich der Nullstelle emittiertes Lumineszenzlicht wird registriert und dem Ort der Nullstelle in der Probe zugeordnet. Dabei werden Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs der Probe in mindestens einer Richtung und vorzugsweise in jeder Richtung, in der die Nullstelle durch die Intensitätsmaxima begrenzt ist, auf nicht mehr als 75 % eines Abstands der Intensitätsmaxima in dieser Richtung begrenzt.
Soweit hier von Lumineszenzmarkern die Rede ist, kann es sich insbesondere um Fluoreszenzmarker handeln. Es können aber auch andere Lumineszenzmarker zum Einsatz kommen, deren Lumineszenzeigenschaften beispielsweise auf Chemilumineszenz oder Elektrolumineszenz basieren. Dies schließt ein, dass die Anregung der Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf bestimmte Mechanismen festgelegt ist. Vielfach wird jedoch eine Anregung der Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht durch Anregungslicht erfolgen.
Bei dem Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, kann es sich um Lumineszenzverhinderungslicht handeln, das die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker verhindert, indem es beispielsweise die Lumineszenzmarker in einen Dunkelzustand überführt oder angeregte Lumineszenzmarker durch stimulierte Emission wieder abregt und so an der Emission von Lumineszenzlicht hindert. Bei dem Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, kann es sich aber auch um Licht handeln, das die Lumineszenzmarker aus einem nicht lumineszenten Zustand in einen weiteren nicht lumineszenten Zustand überführt, in dem sie vor Bleichen besonders gut geschützt sind. Weiterhin kann es sich bei dem Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, auch um solches handeln, das sich nicht allein sondern erst in Verbindung mit weiterem Licht so auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, dass diese nur noch aus dem Bereich der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Lichts erfolgt.
In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, um Lumineszenzermöglichungslicht, das die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker überhaupt erst ermöglicht, indem es beispielsweise die Lumineszenzmarker zur Lumineszenz anregt oder aus einem Dunkelzustand in einen anregbaren Zustand überführt.
Bei der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Lichts, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, handelt es sich zumindest um ein lokales Intensitätsminimum des Lichts. Vielfach wird es sich um ein Intensitätsminimum handeln, in dem die Intensität des Lichts im Wesentlichen auf null zurückgeht. Im Idealfall geht die Intensität des Lichts im Zentrum der Nullstelle tatsächlich auf null zurück. Dies ist aber kein zwingendes Erfordernis. Wenn es sich bei dem Licht beispielsweise um Lumineszenzverhinderungslicht handelt, reicht es aus, wenn die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts im Bereich der Nullstelle so gering bleibt, dass sie zu keiner oder zumindest keiner wesentlichen, d. h. zumindest zu keiner überwiegenden, Verhinderung der Lumineszenz der Lumineszenzmarker führt. Die Nullstelle wird dabei durch die Bereiche begrenzt, in denen das Lumineszenzverhinderungslicht die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker zumindest im Wesentlichen verhindert. Alles zwischen diesen Bereichen, in denen das Lumineszenzverhinderungslicht die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker zumindest im Wesentlichen verhindert, wird hier mit "Nullstelle" oder "Bereich der Nullstelle" bezeichnet.
Wenn hier von den Intensitätsmaxima, die der Nullstelle der Intensitätsverteilung des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts benachbart sind, im Plural die Rede ist, so soll hierdurch nicht der Fall ausgeschlossen sein, dass die Nullstelle von einem sich beispielsweise ringförmig um die Nullstelle erstreckenden Intensitätsmaximum umschlossen ist. In jedem Schnitt durch die Intensitätsverteilung des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht auswirkenden Lichts zeigt sich ein solches ringförmiges Intensitätsmaximum in Form von zwei Intensitätsmaxima, die der Nullstelle in dem Schnitt auf beiden Seiten benachbart sind.
Die Nullstelle kann in ein, zwei oder drei Richtungen von den Intensitätsmaxima benachbart sein. Es kann sich also um eine ebenen-, linien- oder punkförmige Nullstelle handeln. Dabei kann die Nullstelle eine zwei- oder eindimensionale Probe so schneiden, dass auch eine linien- oder punktförmige Nullstelle in den Dimensionen der Probe allseitig von den Intensitätsmaxima benachbart ist. Zudem kann der abzutastende Teilbereich der Probe mit einer Nullstelle, die nicht in allen Dimensionen der Probe von den Intensitätsmaxima benachbart ist, in unterschiedlichen Richtungen abgetastet werden, um die Ortsauflösung beim Abbilden in allen Richtungen zu maximieren. Die Beschränkung der Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs der Probe erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in mindestens einer Richtung und vorzugsweise in allen Richtungen, in der/denen die Nullstelle in der Probe von den Intensitätsmaxima benachbart ist.
Die der Nullstelle in der Probe benachbarten Intensitätsmaxima sind vielfach von viel höherer Lichtintensität als die Bereiche der Intensitätsverteilung des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts, die direkt an die Nullstelle angrenzen und in denen sich das Licht bereits in der angestrebten Weise auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, indem es diese Emission beispielsweise verhindert. Die sehr hohen Intensitäten im Bereich der Intensitätsmaxima sind Folge der insgesamt hohen Intensität des Lichts, welche wiederum Voraussetzung dafür ist, dass der Bereich der Nullstelle, in dem sich das Licht auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker zumindest im Wesentlichen nicht auswirkt, stark räumlich eingegrenzt wird. In der Konsequenz verbleiben zwischen den die Nullstelle unmittelbar begrenzenden Bereichen und den Intensitätsmaxima der Intensitätsverteilung Zwischenbereiche, in denen die Lichtintensität deutlich unterhalb der Lichtintensität in den Intensitätsmaxima liegt. Diese Zwischenbereiche werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gezielt genutzt, indem die Abmessungen des abgetasteten Teilbereichs der Probe 75 % des Abstands der Intensitätsmaxima in dieser Richtung nicht überschreiten. Wenn die Abmessungen des abgetasteten Teilbereichs in der jeweiligen Richtung kleiner bleiben als 50 % des Abstands der Intensitätsmaxima in der jeweiligen Richtung, wird kein Punkt des abgetasteten Teilbereichs der vollen Intensität des Lichts in den Intensitätsmaxima ausgesetzt. Aber auch schon bei einer Beschränkung auf 75 % des Abstands ergibt sich eine signifikante Beschränkung der mittleren Intensität des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht auswirkenden Lichts, mit der der abzutastende Teilbereich der Probe beaufschlagt wird. Es versteht sich, dass die mittlere Intensität des Lichts, mit der der abzutastende Teilbereich der Probe beaufschlagt wird, umso weiter zurückgeht, desto weiter seine Abmessungen unter dem Abstand der Intensitätsmaxima in der jeweiligen Richtung bleiben. Absolut können die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs in der jeweiligen Richtung zwischen den Intensitätsmaxima maximal 300 nm, vorzugsweise maximal 200 nm und noch mehr bevorzugt etwa 100 nm betragen. Diese absoluten Angaben beziehen sich auf Wellenlängen des Lumineszenzlichts, des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts und/oder von etwaigem Anregungslicht im sichtbaren Bereich.
Bei dem abzutastenden Teilbereich der Probe kann es sich um einen Teilbereich der Probe handeln, der bei einer Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens allein, d. h. ausschließlich, abgetastet wird und der entsprechend auf einen interessierenden Bereich der Probe, d. h. ein interessierendes Detail der mit den Lumineszenzmarkern markierten Struktur in der Probe, auszurichten ist.
Die Erfindung nimmt bewusst in Kauf, dass der abgetastete und damit abgebildete Teilbereich der Probe sehr klein bleibt. Vielfach erstreckt er sich über eine Entfernung von der Größenordnung der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts. Durch die erhebliche Reduzierung der sich im Mittel auf den abgetasteten Teilbereich auswirkenden Lichtintensitäten wird es jedoch möglich, auch relativ stark zum Bleichen neigende Lumineszenzmarker erfolgreich einzusetzen bzw. den abgetasteten Teilbereich der Probe wiederholt mit der Nullstelle der Intensitätsverteilung abzutasten.
Die Möglichkeit, die Probe in dem Teilbereich schnell wiederholt mit der Nullstelle der Intensitätsverteilung abzutasten, ermöglicht es auch, dynamische Vorgänge bei der interessierenden Struktur in der Probe zeitlich aufzulösen. Da die Lumineszenzmarker in der Probe durch das erfindungsgemäße Verfahren besonders wenig zum Bleichen neigen, also besonders viele Photonen von jedem einzelnen Fluoreszenzmarker in dem abzutastenden Teilbereich der Probe erhalten werden, können besonders viele Bilder des abzutastenden Teilbereichs der Probe aufgenommen werden und damit auch längerfristige Veränderungen der interessierenden Struktur in der Probe beobachtet werden. In der Regel wird ein Teilbereich der Probe bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in nicht mehr als 100 × 100 = 10.000 Bildpunkten abgetastet. Dies ist in wenigen Millisekunden möglich. Damit können Bildfrequenzen von 100 Hz und mehr realisiert werden.
Vorteilhafterweise sind die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs der Probe in jeder Richtung, in der die Intensitätsmaxima der Nullstelle in der Probe benachbart sind, nicht größer als 45 %, 25 % oder gar 10 % des Abstands der Intensitätsmaxima in dieser Richtung. Bezogen auf die Intensität des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts ist es vorteilhaft, wenn die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs der Probe in jeder Richtung, in der die Intensitätsmaxima der Nullstelle in der Probe benachbart sind, nicht größer als die Strecke sind, über die die Intensität des Lichts ausgehend von der Nullstelle in der jeweiligen Richtung auf 50 %, 25 %, 10 % oder 5 % der Intensität des Lichts in den benachbarten Intensitätsmaxima ansteigt. Entsprechend wird dann auch die maximale Belastung der Lumineszenzmarker in dem abzutastenden Bereich auf 50 %, 25 %, 10 % oder 5 % der Intensität des Lichts in den angrenzenden Intensitätsmaxima beschränkt.
Von denselben Erkenntnissen wie das bis hierher beschriebene erfindungsgemäße Verfahren macht ein anderes erfindungsgemäßes Verfahren Gebrauch, bei dem der abgetastete Teilbereich der Probe beginnend an einem Mittelpunkt und mit zunehmendem Abstand zu seinem Mittelpunkt abgetastet wird. Solange der Abstand zu dem Mittelpunkt dabei kleiner bleibt als 75 % des Abstands der der Nullstelle in der Probe benachbarten Intensitätsmaxima in derselben Richtung, bleibt die mittlere Belastung des abgetasteten Teilbereichs mit dem sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts klein gegenüber bekannten Rasterlumineszenzmikroskopieverfahren. In jedem Fall werden die nahe des Mittelpunkts liegenden Lumineszenzmarker bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren bezüglich ihrer Lage in der Probe erfasst, bevor sie mit höheren Intensitäten des sich auf ihre Emission von Lumineszenzlicht auswirkenden Lichts beaufschlagt werden. So mag bei zum Bleichen neigenden Lumineszenzmarkern zwar die relative Intensität des erfassten Lumineszenzlichts mit zunehmendem Abstand zu dem Mittelpunkt abnehmen, insbesondere wenn er sich auf und über den Abstand der Intensitätsmaxima in dieser Richtung vergrößert. Der unmittelbar an den Mittelpunkt angrenzende Teilbereich der Probe wird aber ungeachtet dessen mit hoher Ausbeute an Lumineszenzlicht abgetastet und abgebildet.
Praktisch umgesetzt werden kann das hier zuletzt beschriebene erfindungsgemäße Verfahren dadurch, dass der abzutastende Teilbereich der Probe längs einer Spiralbahn um den Mittelpunkt abgetastet wird.
Bei allen erfindungsgemäßen Verfahren ist es vielfach sinnvoll, vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe die mit den Lumineszenzmarkern markierte Struktur in der Probe auf andere Weise abzubilden, um die Lage des abzutastenden Teilbereichs der Probe festzulegen. Der abzutastende Teilbereich der Probe ist regelmäßig ein interessierender Teilbereich der Probe, in dem besondere Details der Struktur oder auch Entwicklungen der Struktur über einen biologischen Prozess hinweg auftreten. Dieses Abbilden kann unter lokaler oder großflächiger Anregung der Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht bei und ganz ohne Einsatz des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht auswirkenden Lichts erfolgen.
Vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe kann auch ein größerer Bereich der Probe mit der Nullstelle mit einer um mindestens 50 % geringeren Intensität des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht auswirkenden Lichts und/oder mit einer um mindestens 50 % höheren Abtastgeschwindigkeit abgetastet werden, um die Lage des abzutastenden Teilbereichs der Probe festzulegen. Bei diesem vorhergehenden Abtasten werden zwar alle Punkte des größeren Bereichs der Probe mit der hohen Intensität des Lichts im Bereich der Intensitätsmaxima beaufschlagt. Dafür wird aber diese Intensität gezielt zurückgenommen, und/oder sie wirkt nur über kürzere Zeit auf die Lumineszenzmarker ein.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden zum Abtasten eines größeren Bereichs der Probe andere Abtastmittel verwendet als zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe.
Bei Verwendung unterschiedlicher Abtastmittel zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe, um den abzutastenden Teilbereich der Probe festzulegen, und zum anschließenden Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe können auf das Abtasten des eng begrenzten abzutastenden Teilbereichs der Probe speziell abgestimmte Abtastmittel zum Einsatz kommen. Aufgrund der geringen Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs in der Probe können dies Abtastmittel sein, die keine großen Verlagerungen der Lichtintensitätsverteilung mit der Nullstelle ermöglichen, die aber die von ihnen abdeckbaren Verlagerungen sehr schnell und/oder präzise umsetzen. So kann ein sehr schnell wiederholtes Abtasten des abzutastenden Teilbereichs erfolgen, um beispielsweise schnelle Veränderungen der interessierenden Struktur der Probe in dem Teilbereich zu verfolgen.
Konkret kann zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe in mindestens einer Richtung eine Probenhalterung für die Probe relativ zu einem Objektiv bewegt werden, mit dem das Licht auf die Probe gerichtet wird, während zum Abtasten das abzutastenden Teilbereichs der Probe in mindestens einer Richtung ein elektro-optischer Scanner, ein akusto-optischer Deflektor oder ein Galvospiegel, d. h. ein Ablenkspiegel mit Galvanometerantrieb, verwendet wird. Die Einrichtung zum Abtasten das abzutastenden Teilbereichs der Probe kann mit einem zusätzlichen elektro-optischen oder akusto-optischen Modulator als Phasenschieber zur Verlagerung der Nullstelle der Lichtintensitätsverteilung kombiniert werden.
Wie schon angesprochen wurde, kann es sich bei dem sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Licht insbesondere um Lumineszenzverhinderungslicht handeln, das außerhalb der Nullstelle die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker verhindert. Beispielsweise überführt oder schaltet das Lumineszenzverhinderungslicht Lumineszenzmarker in Form von schaltbaren Proteinen in einen Dunkelzustand, in dem sie nicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Das Lumineszenzverhinderungslicht kann insbesondere zusammen mit Anregungslicht auf die Probe gerichtet werden, das die Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht anregt und das eine Intensitätsverteilung mit einem Intensitätsmaximum im Bereich der Nullstelle des Lumineszenzverhinderungslichts aufweist. Dies entspricht bis auf die engen Grenzen für den abzutastenden Teilbereich der Probe bzw. das Abtasten mit zunehmendem Abstand zu dem Mittelpunkt des abzutastenden Teilbereichs der Probe dem üblichen Vorgehen bei der STED-, RESOLFT- oder GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das aus der WO 2014/108455 A1 bekannte Konzept, STED-Fluoreszenzmikroskope mit schaltbaren Lumineszenzmarkern durchzuführen, um die Lumineszenzmarker durch Schalten in einen inaktiven Zustand vor den hohen Intensitäten im Bereich des Intensitätsmaxima des Stimulationslichts zu schützen, in abgewandelter Form angewandt. Konkret wird dazu vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe mit der Nullstelle zusätzliches Ausschaltlicht mit einer solchen Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, dass es die schaltbaren Lumineszenzmarker in einem an dem abzutastenden Teilbereich angrenzenden Teilbereich der Probe in einen inaktiven Zustand ausschaltet. Dieser angrenzende Teilbereich grenzt in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima der Nullstelle des Stimulationslichts in der Probe benachbart sind, an den abzutastenden Teilbereich an. Damit werden die Lumineszenzmarker dort in den inaktiven Zustand geschaltet, wo die Intensitätsmaxima des Stimulationslichts auftreten und wo ohne diese Schutzmaßnahme die Lumineszenzmarker durch die hohen Intensitäten des Stimulationslichts beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe weggeblichen würden. Indem das Bleichen der Lumineszenzmarker bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entfällt, kann es sukzessive auch für direkt nebeneinanderliegende oder einander sogar überlappende abzutastende Teilbereiche durchgeführt werden. Anders gesagt kann die Probe mit dem abzutastenden Teilbereich abgetastet werden, wobei der abzutastende Teilbereich an allen oder zumindest an ausgewählten Positionen in der Probe seinerseits mit der Nullstelle abgetastet wird.
Die Intensitätsverteilung des Ausschaltlichts kann in dem jeweils anschließend abzutastenden Teilbereich ein durch destruktive Interferenz ausgebildetes lokales Intensitätsminimum aufweisen, in dem sie die Lumineszenzmarker zumindest im Wesentlichen nicht ausschaltet, d. h., in dem sie die Lumineszenzmarker zumindest im Wesentlichen in ihrem aktiven Zustand belässt, in dem sie durch das Anregungslicht anregbar sind. Je nach Auswahl der schaltbaren Lumineszenzmarker kann es dieser aktive Zustand erfordern oder zumindest sinnvoll machen, dass vor und/oder zeitlich überlappend mit dem Richten des Ausschaltlichts auf die Probe Einschaltlicht auf den jeweils abzutastenden Teilbereich der Probe gerichtet wird, das die schaltbaren Lumineszenzmarker in ihren aktiven Zustand einschaltet.
Beim Einschalten und/oder Ausschalten emittieren schaltbare Lumineszenzmarker vielfach ebenfalls Lumineszenzlicht. Dieses Lumineszenzlicht kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren registriert und ausgewertet werden. Ziel dieser Auswertung kann beispielsweise eine Entscheidung darüber sein, ob der von dem jeweils angrenzenden Teilbereich begrenzte abzutastende Teilbereich überhaupt mit der Nullstelle abgetastet wird oder ob er nur insgesamt mit Anregungslicht beaufschlagt wird, wobei das dann emittierte Lumineszenzlicht konfokal registriert wird, oder ob er gar nicht mit Anregungslicht beaufschlagt wird, weil die geringe Intensität des beim Einschalten und/oder Ausschalten registrierten Lumineszenzlichts darauf hinweist, dass keine relevante Konzentration an Lumineszenzmarkern in dem jeweiligen abzutastenden Teilbereich vorliegt. Weiter kann die Auswertung das Ziel haben, festzulegen, unter welchen Bedingungen das Richten des Stimulationslichts auf die Probe in jeder Position der Nullstelle in dem von dem angrenzenden Teilbereich begrenzten abzutastenden Teilbereich und das Registrieren des aus dem Bereich der Nullstelle emittierten Lumineszenzlichts sinnvollerweise abgebrochen wird. Das heißt, es kann zum Beispiel ein oberer und/oder unterer Grenzwert für die Durchführung eines RESCue-Verfahrens in dem jeweiligen abzutastenden Teilbereich abhängig von dem Ergebnis der Auswertung festgelegt werden.
In einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird aus dem Bereich der Nullstelle emittiertes Lumineszenzlicht mit einem Punktsensor registriert, dessen Lage gegenüber der Probe beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe nicht verändert wird. Das heißt, beim Registrieren des Lumineszenzlichts mit dem Punktsensor wird die Lageveränderung der Nullstelle der Lichtintensitätsverteilung des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts nicht berücksichtigt. Dies ist möglich, weil die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs regelmäßig kleiner als der Erfassungsbereich eines Punktsensors bezogen auf die Probe sind. Dies gilt auch für einen zum Mittelpunkt des abzutastenden Teilbereichs konfokal angeordneten Punktsensor. Selbst diesen erreicht regelmäßig das Lumineszenzlicht aus dem gesamten abzutastenden Teilbereich der Probe, weil dessen Abmessungen regelmäßig unterhalb der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts liegen. Der lagefeste Punktsensor bedeutet, dass die Nullstelle zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe durch Einwirken allein auf das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkende Licht verlagert wird. Auch etwaiges Anregungslicht muss nicht zusammen mit dem sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Licht verlagert werden, da sich auch sein Intensitätsmaximum typischerweise über den gesamten abzutastenden Teilbereich der Probe erstreckt.
Wie ebenfalls schon angesprochen wurde, kann es sich bei dem sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Licht alternativ um Lumineszenzermöglichungslicht handeln, das außerhalb der Nullstelle die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker überhaupt erst ermöglicht. Dies schließt ein, dass es sich bei dem Licht um Lumineszenzanregungslicht als einziges Licht handelt, das auf die Probe gerichtet wird. Es schließt auch ein, dass das Licht Lumineszenzaktivierungslicht ist, das die Lumineszenzmarker aus einem Dunkelzustand in einen zur Lumineszenz anregbaren Zustand überführt, d. h. aktiviert. Das Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, kann auch beide Funktionen, d. h. des Aktivierens und des Anregens, haben und dazu auch zwei Komponenten unterschiedlicher Wellenlängen aufweisen. Wenn dann ein Teilbereich der Probe mit der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Lichts, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, abgetastet wird, wird dieser Teilbereich erfindungsgemäß klein gehalten, um die in dem Teilbereich befindlichen Lumineszenzmarker nicht oder doch zumindest möglichst wenig mit den hohen Lichtintensitäten im Bereich der an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsmaxima zu beaufschlagen. Das Erfassen des von den Lumineszenzmarkern in der Probe emittierten Lumineszenzlichts erfolgt bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens typischerweise mit einer Kamera, und die Auswertung erfolgt durch Entfalten der registrierten Intensitätsverteilungen im Hinblick auf die aktuelle Lage der Nullstelle in der Probe und der damit verbundenen Änderung der Intensitätsverteilung des aus der Probe emittierten und mit der Kamera erfassten Lumineszenzlichts.
Der Nachteil der erfindungsgemäßen Verfahren, dass der abgetastete und damit abgebildete Teilbereich der Probe jeweils sehr klein bleibt, kann zumindest teilweise dadurch kompensiert werden, dass die Probe in mehreren Teilbereichen zugleich abgetastet wird. Dabei kann insbesondere ein Raster von Nullstellen des sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkenden Lichts zum Einsatz kommen, wie es grundsätzlich bekannt ist. Dabei wird das Raster der Nullstellen erfindungsgemäß aber nicht so weit verschoben, dass die Probe insgesamt abgebildet wird, d. h. über das volle Rastermaß. Vielmehr bleiben die einzelnen Teilbereiche, in denen die Probe abgetastet wird, auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens voneinander getrennt. Nur so wird die erfindungsgemäße Reduktion der Gefahr des Bleichens der Lumineszenzmarker in den abgetasteten Teilbereichen der Probe erreicht. Es versteht sich, dass dann, wenn diese parallelisierte Ausführungsform der Erfindung mit schaltbaren Lumineszenzmarkern durchgeführt wird, die jeweils nur in den abzutastenden Teilbereichen der Probe in ihrem fluoreszenten Zustand sind, die Probe ergänzend auch mit den abzutastenden Teilbereichen abgetastet werden kann, um sie vollständig abzubilden.
Wenn jedoch mehrere Exemplare eines interessierenden Objekts jeweils überschneidend mit einem der mehreren abzutastenden Teilbereiche der Probe angeordnet werden, wird beim Abtasten jedes Teilbereichs ein Teilbild dieses Objekts gewonnen. Wenn diese Teilbilder statistisch über das Objekt verteilt sind und ihre Zahl ausreichend groß ist, kann aus ihnen ein Abbild des gesamten interessierenden Objekts rekonstruiert werden. Es versteht sich, dass dies voraussetzt, dass die verschiedenen Exemplare des interessierenden Objekts zumindest weitgehend übereinstimmen. Zur Zuordnung der Teilbilder zu bestimmten Punkten des interessierenden Objekts können die Exemplare des interessierenden Objekts in der Probe zusätzlich auf andere Weise abgebildet werden, um ihre Lage und Ausrichtung gegenüber den abgetasteten Teilbereichen der Probe zu bestimmen. Das in mehreren Exemplaren in der Probe angeordnete Objekt kann beispielsweise ein Molekül oder ein Virus oder dergleichen sein. Weiterhin kann bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Mehrzahl der Exemplare des interessierenden Objekts veränderten Umgebungsbedingungen unterworfen werden, um hierauf erfolgende Reaktionen des interessierenden Objekts zu erfassen. Dazu werden die einzelnen Teilbereiche der Probe während und/oder vor und nach den veränderten Umgebungsbedingungen mit der jeweiligen Nullstelle abgetastet. Die Abfolge der aufeinanderfolgenden Abtastungen der Teilbereiche mit der jeweiligen Nullstelle kann sehr schnell sein, so dass auch schnelle Veränderungen bei dem interessierenden Objekt erfasst werden können.
Ein erfindungsgemäßes Rasterlumineszenzlichtmikroskop weist eine Lichtquelle für das Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, Lichtformungsmittel, die das Licht mit der Intensitätsverteilung auf die Probe richten, welche die von den Intensitätsmaxima benachbarte Nullstelle aufweist, Abtastmittel, u m e i n e n abzutastenden Teilbereich der Probe mit der Nullstelle abzutasten, einen Detektor, der aus dem Bereich der Nullstelle emittiertes Lumineszenzlicht registriert, und eine Steuerung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren auf.
Der Detektor kann ein Punktdetektor sein, wobei die Lage des Punktdetektors gegenüber der Probe beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe fest sein kann, d. h. das aus der Probe emittierte Lumineszenzlicht erfassen kann, ohne dass dieses entscannt wird, weil der abzutastende Teilbereich in der Regel Abmessungen unterhalb der Beugungsgrenze aufweist. Dann können weitere Abtastmittel vorhanden sein, die sich von den Abtastmitteln zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe mit der Nullstelle unterscheiden und zum Abtasten eines größeren Bereichs der Probe vorgesehen sind.
Auch hier können die Abtastmittel zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe in mindestens einer Richtung eine relativ zu einem Objektiv der Lichtformungsmittel bewegliche Probenhalterung aufweisen, während die Abtastmittel zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe in mindestens einer Richtung einen elektro-optischen Scanner, einen akusto-optischer Deflektor oder einen Galvospiegel umfassen können.
Der Detektor kann aber beispielsweise auch ein Punktdetektor sein, der das entscannte Lumineszenzlicht von der Probe erfasst, oder ein flächiger Detektor, wie eine Kamera, der das nicht entscannte Lumineszenzlicht aus einer festen Relativposition zu der Probe erfasst.
Bei einem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop zur Durchführung eines erfindungsgemäßen STED-Verfahrens ist das von der Lichtquelle bereitgestellte Licht Stimulationslicht, und es ist eine weitere Lichtquelle für Anregungslicht vorgesehen, wobei die Lichtformungsmittel das Anregungslicht mit einer Lichtintensitätsverteilung auf die Probe richten, die ein Maximum im Bereich der Nullstelle des Lumineszenzverhinderungslichts aufweist.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das von schaltbaren Lumineszenzmarkern Gebrauch macht, ist bei dem Rasterlumineszenzlichtmikroskop zusätzlich eine Ausschaltlichtquelle für Ausschaltlicht vorzusehen, wobei die Lichtformungsmittel das Ausschaltlicht mit einer solchen Intensitätsverteilung auf die Probe richten, dass es die schaltbaren Lumineszenzmarker in einem an den abzutastenden Teilbereich angrenzenden Teilbereich der Probe in einen inaktiven Zustand ausschaltet. Der angrenzende Teilbereich grenzt dabei in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima der Nullstelle des Stimulationslichts in der Probe benachbart sind, an den abzutastenden Teilbereich an. Darüber hinaus kann eine Einschaltlichtquelle für Einschaltlicht vorgesehen sein, das die schaltbaren Lumineszenzmarker in ihren aktiven Zustand einschaltet, wobei die Lichtformungsmittel das Einschaltlicht vor und/oder zeitlich überlappend mit dem Richten des Ausschaltlichts auf die Probe auf einen den abzutastenden Teilbereich umfassenden Teilbereich der Probe richten.
Bei experimentellen Erprobungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine Erhöhung der Ausbeute der Photonen von den Lumineszenzmarkern in der Probe um einen Faktor > 100 erzielt. Dies z. B. bedeutet, dass 100 mal mehr Bilder einer sich verändernden interessierenden Struktur aufgenommen werden können, um die Veränderungen zu dokumentieren. Für jedes einzelne Bild wird zudem weniger Zeit benötigt, weil auch anhaltend mehr Photonen pro Zeiteinheit von den Lumineszenzmarkern in der Probe emittiert werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einer Lichtquelle die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau eine Lichtquelle, zwei Lichtquellen oder mehr Lichtquellen vorhanden sind. Diese Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, aus denen das jeweilige Erzeugnis besteht oder die das jeweilige Verfahren aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt schematisch Intensitätsverteilungen von Anregungslicht und von Fluoreszenzverhinderungslicht als Beispiel für Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch in einer Probe angeordnete Lumineszenzmarker auswirkt, sowie die resultierende effektive Anregung von Fluoreszenzmarkern in einer Probe zur Emission von Fluoreszenzlicht.
2 zeigt für die Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts gemäß 1 Abmessungen eines mit den Intensitätsverteilungen gemäß 1 bei einem erfindungsgemäßen Verfahren abzutastenden Teilbereichs einer Probe.
3 ist eine schematische Darstellung eines abzutastenden Teilbereichs einer Probe in einer Draufsicht, wobei das Abtasten längs einer mäanderförmigen Bahn erfolgt.
4 ist eine schematische Darstellung eines abzutastenden Teilbereichs einer Probe in einer Draufsicht, wobei das Abtasten längs einer Spiralbahn erfolgt.
5 ist eine schematische Darstellung eines abzutastenden Teilbereichs einer Probe in einer Draufsicht bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Abtasten ebenfalls längs einer Spiralbahn erfolgt.
6 illustriert schematisch ein Fluoreszenzmikroskop als Beispiel für ein erfindungsgemäßes Rasterlumineszenzlichtmikroskop.
7 zeigt (a) ein vorab aufgenommenes Konfokalbild einer Probe und (b) ein Teilbild der Probe, das erfindungsgemäß aufgenommen wurde, nachdem einzelne abzutastende Teilbereiche der Probe anhand des Konfokalbilds ausgewählt wurden.
8 zeigt die Abhängigkeit zwischen der Anzahl der aufnehmbaren Bilder und den Abmessungen eines abgetasteten Teilbereichs der Probe.
9 zeigt schematisch ein anderes Fluoreszenzmikroskop als in 6 als weiteres Beispiel für ein erfindungsgemäßes Rasterlumineszenzlichtmikroskop.
10 ist eine schematische Darstellung eines abzutastenden Teilbereichs einer Probe bei gleichzeitiger Darstellung eines angrenzenden Teilbereichs, in dem mit dem Rasterfluoreszenzmikroskop Ausschaltlicht auf die Probe gerichtet wird.
11 illustriert eine Anordnung mehrerer abzutastender Teilbereiche gemäß 10 in der Probe, um diese mit den abzutastenden Teilbereichen abzutasten; und
12 illustriert eine andere Anordnung abzutastender Teilbereiche in der Probe.
FIGURENBESCHREIBUNG
In 1 ist oben ein Schnitt durch eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht 1 gezeigt. Das Anregungslicht 1 weist an einem geometrischen Fokuspunkt F ein Intensitätsmaximum 27 mit maximaler Intensität I auf. Die Intensität I ist aber über einen sich allseits weit über den Fokuspunkt F hinaus erstreckenden Bereich verteilt, dessen Durchmesser der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge Lambda des Anregungslichts 1 und der numerischen Apertur NA des zum Fokussieren des Anregungslichts 1 in den Fokuspunkt F des verwendeten Objektivs gemäß Lambda/NA entspricht. Um die mit dem Anregungslicht 1 erreichte Anregung von Fluoreszenzmarkern in einer Probe auf einen kleineren Bereich als die Ausdehnung der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 1 zu beschränken, wird zusätzlich Fluoreszenzverhinderungslicht 2 auf die Probe gerichtet, das eine von Intensitätsmaxima 3 benachbarte Nullstelle 4 aufweist. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 2 verhindert die Emission von Fluoreszenzlicht durch von dem Anregungslicht 1 angeregte Fluoreszenzmarker beispielsweise dadurch, dass die Fluoreszenzmarker durch stimulierte Emission wieder abgeregt werden. Überall außerhalb des Bereichs 5 der Nullstelle 4 des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 ist die Intensität I des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 so groß, dass diese Abregung vollständig erfolgt, das heißt, dass die dort angeordneten Fluoreszenzmarker kein Fluoreszenzlicht emittieren. Umgekehrt ist hier mit "Nullstelle 4" der gesamte Bereich 5 gemeint, innerhalb dessen die Intensität I des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 so klein bleibt, dass sie die Emission von Fluoreszenzlicht durch darin angeordnete Fluoreszenzmarker nicht verhindert. 1 zeigt unten die räumliche Verteilung der effektiven Fluoreszenzanregung 6. Diese ist auf den Bereich 5 der Nullstelle 4 eingegrenzt. Wenn mit der Nullstelle 4 eine Probe abgetastet wird, stammt aus der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht immer nur aus dem Bereich 5 und kann entsprechend diesem Ort der Probe zugeordnet werden.
Wenn sich die Nullstelle 4 beim Abtasten einer Probe einer mit Fluoreszenzfarbstoff markierten interessierenden Struktur annähert, gelangen die Fluoreszenzmarker zunächst in den Bereich der Intensitätsmaxima 3 und der damit überlagerten Intensitäten des Anregungslichts 1, bevor sie in den Bereich 5 der Nullstelle 4 gelangen. Insbesondere beim zeilenweisen Abtasten der Probe erfolgt eine wiederholte Beaufschlagung der Fluoreszenzmarker mit hohen Lichtintensitäten, bevor erstmalig Fluoreszenzlicht von ihnen registriert wird. Dies kann dazu führen, dass die Fluoreszenzmarker bereits gebleicht sind, bevor sie erstmalig von der Nullstelle 4 erreicht werden. Auch ein wiederholtes Abtasten derselben Probe, um beispielsweise zeitliche Veränderungen der mit Fluoreszenzmarkern markierten interessierenden Struktur der Probe zu beobachten, ist durch diesen Effekt häufig unmöglich.
Wenn jedoch der mit der Nullstelle 4 abgetastete Bereich der Probe auf maximal 3/4 oder 75 % eines Abstands D₀ der Intensitätsmaxima 3, wie er in 2 eingezeichnet ist, begrenzt wird, sinkt bereits die mittlere Belastung der Fluoreszenzmarker in dem abgetasteten Bereich, die durch die hohen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 im Bereich der Intensitätsmaxima 3 insbesondere in Verbindung mit der Intensität des Anregungslichts 1 gemäß 1 auftritt. Diese Belastung sinkt weiter, wenn die Abmessungen des abzutastenden Bereichs auf die Hälfte des Abstands D₀ der Intensitätsmaxima 3 und weniger beschränkt werden. Bei einer Begrenzung der Abmessungen auf weniger als D₀/2 gelangt beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs der Probe kein Punkt dieses Teilbereichs mehr in den unmittelbaren Bereich der Intensitätsmaxima 3. Wenn die Abmessungen des abzutastenden Bereichs auf D₀/4 eingeschränkt werden, ist die maximale Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts 2, mit der die Probe innerhalb des abzutastenden Bereichs beaufschlagt wird, auf etwa I₀/2 beschränkt, wobei I₀ die maximale Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 in den Intensitätsmaxima 3 ist.
3 illustriert das Abtasten eines abzutastenden Teilbereichs 7 einer ausschnittsweise dargestellten Probe 8 mit dem Bereich 5 der Nullstelle 4 längs einer hier mäanderförmigen Bahn 9. Dabei ist der abzutastende Teilbereich 7 innerhalb der Intensitätsmaxima 3 dargestellt, wobei die Lage dieser Intensitätsmaxima 3 der Ausrichtung der Nullstelle 4 auf einen Mittelpunkt 10 des abzutastenden Teilbereichs 7 entspricht. Dementsprechend verlaufen die Intensitätsmaxima, besser gesagt verläuft das hier ringförmige Intensitätsmaximum 3 um die in 3 dargestellte Lage der Nullstelle 4 noch durch den abzutastenden Teilbereich 7, was durch eine gestrichelte Linie 11 angedeutet ist. Diese Überschneidung kann aber durch eine weitere Eingrenzung des abzutastenden Teilbereichs 7 auf weniger als D₀/2 verhindert werden. Aber auch durch die hier gegebene Begrenzung der Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs 7 auf etwa 2D₀/3 wird eine erhebliche Reduzierung der mittleren Beaufschlagung der Probe 8 in dem Teilbereich 7 mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht 2 erreicht.
4 illustriert einen auf D₀/2 begrenzten abzutastenden Teilbereich 7 der Probe 8. Hier erreicht der mit gestrichelter Linie 11 angedeutete Verlauf des ringförmigen Intensitätsmaximums 3 bei keiner Position der Nullstelle 4 in dem abzutastenden Teilbereich 7 mehr den Teilbereich 7. Weiterhin zeigt 4 eine Spiralbahn 12, längs der der abzutastende Teilbereich 7 ausgehend von dem Mittelpunkt 10 abgetastet wird. Unabhängig von der Form der Bahn, auf der die Nullstelle 4 beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs 7 bewegt wird, wird das aus der Probe 8 emittierte und registrierte Fluoreszenzlicht dem jeweiligen Ort der Nullstelle 4 in der Probe zugeordnet.
Die Ausführungsform der Erfindung, die in 5 skizziert ist, unterscheidet sich von den in den 3 und 4 skizzierten Ausführungsformen dadurch, dass der abzutastende Teilbereich 7 nicht auf einen Bruchteil dessen eingeschränkt ist, was von dem ringförmigen Maximums 3 um den Mittelpunkt 10 umspannt wird. Vielmehr wird mit einer Spiralbahn 12 ein Teilbereich der Probe 8 abgetastet, dessen Durchmesser größer als derjenige des ringförmigen Maximums 3 um den Mittelpunkt 10 ist. Dabei nimmt die vorherige Beaufschlagung der Bereiche des Teilbereichs 7, die später von der Spiralbahn 12 erfasst werden, durch das Fluoreszenzverhinderungslicht 2 immer mehr zu. In den Bereichen in der Nähe des Mittelpunkts 10 sind die vorherigen Belastungen mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht 2 jedoch minimal. Wenn der Mittelpunkt 2 des abzutastenden Teilbereichs 7 auf einen besonders interessierenden Punkt der Probe 8 gerichtet wird, wird hier eine maximale Ausbeute an Fluoreszenzlicht von der Probe 8 erzielt, die mit zunehmendem Abstand von dem Mittelpunkt 10 abnimmt, aber für eine Abbildung der Umgebung des besonders interessierenden Punkts der Probe 8 ausreichend bleibt.
6 illustriert ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 13, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignet ist. Das Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 13 weist eine Lichtquelle 14 für das Fluoreszenzverhinderungslicht 2 auf, dessen Querschnitt mit einer Aufweiteoptik 15 aufgeweitet wird und dessen Wellenfronten über seinen Querschnitt hinweg mithilfe einer Phasenplatte 16 so moduliert werden, dass es nach beim Fokussieren mit einem Objektiv 45 in die Probe 8 die Nullstelle 4 mit benachbarten Intensitätsmaxima 3 gemäß den 1 und 2 um den jeweiligen Fokuspunkt F ausbildet. Für das Anregungslicht 1 ist eine weitere Lichtquelle 17 mit einer Aufweiteoptik 18 vorgesehen. Mit einem dichroitischen Spiegel 19 werden das Anregungslicht 1 und das Fluoreszenzverhinderungslicht 2 zusammengeführt, so dass das Anregungslicht 1 im Bereich 5 der Nullstelle 4 des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 sein Intensitätsmaximum 27 gemäß 1 aufweist. Das aus der Probe, konkret den Bereich der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 emittierte Fluoreszenzlicht 20 wird mit einem dichroitischen Spiegel 26 ausgekoppelt und mit einem Punktdetektor 21 registriert und dem jeweiligen Ort der Nullstelle in der Probe zugeordnet. Zum Abtasten des jeweiligen Teilbereichs der Probe mit der Nullstelle sind Abtastmittel 22 und 23 für zwei zueinander orthogonale Abtastrichtungen vorgesehen, die aufeinander abgestimmt angesteuert werden. Die Abtastmittel 22 und 23 beeinflussen nur die Richtung des Anregungslichts 1 und des Fluoreszenzverhinderungslichts 2, sie könnten sogar ausschließlich im Strahlengang des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 angeordnet sein. Da der abzutastende Teilbereich 7 der Probe 8 Abmessungen unterhalb der Beugungsgrenze aufweist, gelangt auch bei ortsfester Anordnung des Punktdetektors 21 gegenüber der Probe 8 das aus dem Bereich der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 aus der Probe 8 emittierte Fluoreszenzlicht 20 immer in den Punktdetektor 21, d. h. trotz der Verlagerung der Nullstelle mithilfe der Abtastmittel 22 und 23. Für ein über den abzutastenden Teilbereich 7 der Probe 8, der erfindungsgemäß abgetastet wird, hinausgehendes Abtasten der Probe 8, um beispielsweise zunächst die Lage eines geeigneten abzutastenden Teilbereichs zu ermitteln, sind weitere Abtastmittel im Bereich einer Probenhalterung 24 vorgesehen, die hier nur durch entsprechende Verschiebungssymbole 25 angedeutet sind.
In der bisherigen Beschreibung wurde nicht explizit zum Ausdruck gebracht, dass die Nullstelle 4 der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 auch in einer z-Richtung, in der das Fluoreszenzverhinderungslicht 2 auf die Probe gerichtet wird, durch Intensitätsmaxima 3 begrenzt sein kann, um die Ortsauflösung beim Abbilden der interessierenden Struktur in der Probe 8 auch in dieser z-Richtung zu erhöhen. Entsprechend ist dann der abzutastende Teilbereich 7 auch in dieser z-Richtung auf maximal 75 %, vorzugsweise weniger als 50 % des Abstands der Intensitätsmaxima des Lichts in dieser Richtung zu begrenzen oder auch in der z-Richtung an seinem Mittelpunkt 10 beginnend und mit zunehmendem Abstand zu diesem Mittelpunkt 10 abzutasten. Eine erhöhte Ortsauflösung beim Abbilden der Struktur in z-Richtung kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aber auch durch andere Maßnahmen erreicht werden, beispielsweise durch eine 4Pi-Anordnung oder durch 2-Photonen-Anregung der Fluoreszenzmarker zur Emission des Fluoreszenzlichts oder durch andere auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie bekannte Maßnahmen. Auch grundsätzlich gilt, dass die hier beschriebenen Verfahren durch weitere auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie bekannte Maßnahmen ergänzt werden können. Hierzu zählt beispielsweise das Aufbringen des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 und/oder des Anregungslichts 1 in Pulsen, das gleichzeitige kontinuierliche Aufbringen des Anregungslichts 1 bzw. des Fluoreszenzverhinderungslichts 2, das gegatete Registrieren des Fluoreszenzlichts in einem definierten Zeitfenster nach den jeweiligen Pulsen usw.
Das Konfokalbild gemäß 7(a) wurde von einer Probe aufgenommen, bei der eine interessierende Struktur mit dem Lumineszenzmarker Nukleoporin gp210 markiert war. Das Konfokalbild gibt eine Übersicht über die interessierende Struktur. Aus dieser Übersicht wurden einzelne Teilbereiche der Probe ausgewählt, in denen STED-Bilder nach den erfindungsgemäßen Verfahren aufgenommen wurden. Diese Teilbereiche sind kleiner als der Fokus des Anregungslichts. In den Teilbereichen wird die interessierende Struktur mit hoher Ortsauflösung und zugleich hoher Lichtausbeute abgebildet. Zur Aufnahme des in 7(b) gezeigten, die abgetasteten Teilbereiche wiedergebenden Teilbilds der Probe wurde Anregungslicht einer Wellenlänge von 635 nm und einer Leistung von 5 µW in Pulsen mit einer Wiederholungsrate von 20 MHz auf die Probe gerichtet. STED-Licht mit einer Wellenlänge von 775 nm wurde in synchronisierten Pulsen einer Pulslänge von 1,2 ns mit einer Leistung von 150 mW auf die Probe gerichtet. Das Anregungslicht und das STED-Licht wurden mit einem 1,4 NA Ölinversions-Objektiv in die Probe fokussiert. Das Fluoreszenzlicht wurde mit dem Ölinversions-Objektiv und einer weiteren Linse auf einen Punktdetektor fokussiert.
8 zeigt das Bleichverhalten in Abhängigkeit von den Abmessungen des abgetasteten Teilbereichs einer Probe am Beispiel von gefärbten Kernporenproteinen bei der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie. τ1/2 bezeichnet die Anzahl der Bilder, die aufgenommen werden können, bis das Fluoreszenzsignal durch Bleichen auf die Hälfte des ursprünglichen Werts abgefallen ist. Aufgetragen ist τ1/2 über den Abmessungen des abgetasteten Teilbereichs der Probe in Nanometern. Die STED-Leistung betrug 160 mW, die Anregungsleistung 2 µW. Ansonsten entsprachen die STED-Bedingungen denjenigen gemäß 7. Bei Abmessungen des abgetasteten Teilbereichs von 100 × 100 nm² ist das Bleichen gegenüber Abmessungen von 800 × 800 nm² um einen Faktor 100 reduziert. Entsprechend können von demselben Teilbereich 100 mal mehr Bilder mehr aufgenommen werden, um beispielsweise einen dynamischen Vorgang zu beobachten.
Das in 9 illustrierte Rasterfluoreszenzmikroskop 13 weist folgende Unterschiede zu dem in 6 dargestellten Rasterfluoreszenzmikroskop auf. Der Punktdetektor 21 ist von der Probe 8 aus gesehen hinter den Abtastmitteln 22 und 23 angeordnet, so dass die Abtastmittel das von der Probe 8 kommende Fluoreszenzlicht 20 zu dem Punktdetektor 21 hin entscannen. Dabei sind die Abtastmittel 22 und 23 sowohl zum Abtasten des jeweils mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 abzutastenden Teilbereichs als auch zum grundsätzlichen Anordnen oder Verlagern des abzutastenden Teilbereichs in der Probe 8 vorgesehen. 9 zeigt auch einen von der Probe aus 8 vor den Abtastmitteln 22 und 23 angeordneten Detektor 28 für Fluoreszenzlicht. Hierbei handelt es sich jedoch um keinen Punktdetektor, sondern um eine Kamera 29, d. h. einen flächigen Detektor. Dieser Detektor 28 kann zusätzlich zu dem Punktdetektor 21 oder statt des Punktdetektors 21 vorgesehen sein, wobei ein das Fluoreszenzlicht 20 zu dem Detektor 28 ablenkender dichroitischer Spiegel 30 entweder vorübergehend oder dauerhaft zwischen dem Objektiv 45 und den Abtastmitteln 22 und 23 angeordnet ist.
Weiterhin ist bei dem Rasterfluoreszenzmikroskop 13 gemäß 9 eine Ausschaltlichtquelle 31 vorgesehen, der eine Aufweiteoptik 32 zugeordnet sind, um vor dem Abtasten des jeweiligen abzutastenden Teilbereichs mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 Ausschaltlicht 34 bereitzustellen. Das Ausschaltlicht 34 wird mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels 43 eingekoppelt, und mit Strahlformungsmittel 33 wird seine Intensitätsverteilung in der Probe 8 so geformt, dass es in einem an den abzutastenden Teilbereich angrenzenden Teilbereich der Probe 8 in der Probe 8 enthaltene schaltbare Lumineszenzmarker in einen inaktiven Zustand schaltet. In diesem inaktiven Zustand sind die schaltbaren Lumineszenzmarker in der Probe 8 mit dem Anregungslicht 1 nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht 20 anregbar. Entsprechend geht für die Lumineszenzmarker in ihrem inaktiven Zustand keine relevante Gefahr des Bleichens von dem Fluoreszenzverhinderungslicht 2 in Form von Stimulationslicht aus. So ist es mit dem Rasterfluoreszenzmikroskop 13 gemäß 9 möglich, einen an einen schon abgetasteten abzutastenden Teilbereich angrenzenden Teilbereich der Probe 8 mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 abzutasten und dabei Fluoreszenzlicht 20 aus der Probe 8 zu registrieren, weil die dort befindlichen Lumineszenzmarker beim Abtasten des zuvor abgetasteten abzutastenden Teilbereichs nicht weggeblichen wurden, da sie sich in ihrem vor dem Bleichen schützenden inaktiven Zustand befanden.
Um die Lumineszenzmarker in dem angrenzenden abzutastenden Teilbereich mit dem Anregungslicht 1 zur Emission von Fluoreszenzlicht 20 anregen zu können, müssen sie wieder in ihrem aktiven Zustand vorliegen. Hierzu kann eine spontane Rückkehr der Lumineszenzmarker aus ihrem inaktiven Zustand in ihren aktiven Zustand abgewartet werden. Das Rasterfluoreszenzmikroskop 13 gemäß 9 weist aber auch eine zusätzliche Einschaltlichtquelle 35 mit einer Aufweiteoptik 36 auf, um Einschaltlicht 37 über einen dichroitischen Spiegel 44 auf die Probe 8 zu richten, mit der die Lumineszenzmarker in dem nächsten abzutastenden Teilbereich zunächst in ihren aktiven Zustand geschaltet werden. Dabei kann der von dem Einschaltlicht 37 erfasste Teilbereich der Probe 8 größer als der als nächstes abzutastende Teilbereich sein, weil anschließend mit dem Ausschaltlicht 34 die Lumineszenzmarker außerhalb des als nächstes abzutastenden Teilbereichs in ihren inaktiven Zustand überführt werden. Mit dem Rasterfluoreszenzmikroskop 13 kann die Probe 8 demnach zweistufig abgetastet werden, und zwar in großen Schritten mit dem abzutastenden Teilbereich und in kleinen Schritten mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 innerhalb jedes abzutastenden Teilbereichs.
Beim Ein- und/oder Ausschalten der Lumineszenzmarker in der Probe 8 mit dem Einschaltlicht 37 bzw. dem Ausschaltlicht 34 werden verschiedene schaltbare Lumineszenzmarker auch zur Emission von Fluoreszenzlicht 20 angeregt. Dieses Fluoreszenzlicht 20 gibt damit bereits Auskunft über die Konzentration der Lumineszenzmarker in dem jeweiligen Teilbereich der Probe 8. Diese Information kann entsprechend ausgewertet und für eine Entscheidung genutzt werden, ob es sich überhaupt lohnt, den nächsten abzutastenden Teilbereich mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 abzutasten oder nicht. Wenn es sich nicht lohnt, wird ein solches Abtasten auch nicht durchgeführt, um die Probe 8 nicht unnötig mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht 2 zu beaufschlagen. Darüber hinaus kann das beim Ein- bzw. Ausschalten der Lumineszenzmarker registrierte Fluoreszenzlicht 20 auch genutzt werden, um einen oberen und/oder unteren Grenzwert für das an dem jeweiligen Ort der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 2 in dem abzutastenden Teilbereich registrierte Fluoreszenzlicht festzulegen, bei dessen Erreichen bzw. Nichterreichen die Beaufschlagung der Probe 8 mit dem Lumineszenzverhinderungslicht 2 und dem Anregungslicht 1 im Sinne eines RESCue-Verfahrens abgebrochen wird.
Letztlich zeigt 9 eine Steuerung 38 für die Lichtquellen 14 und 17, die Einschaltlichtquelle 35, die Ausschaltlichtquelle 31 und die Abtastmittel 22 und 23 des Rasterfluoreszenzmikroskops 13, um diese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren anzusteuern.
10 zeigt einen abzutastenden Teilbereich 7 und das darum verlaufende Intensitätsmaximum 3 des Fluoreszenzverhinderungslichts, wenn sich die Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts im Mittelpunkt 10 des abzutastenden Teilbereichs 7 befindet. In 10 ist darüber hinaus ein ringförmiger angrenzender Teilbereich 39 eingezeichnet, in dem die Probe 8 vor dem Abtasten des Teilbereichs 7 mit dem Ausschaltlicht 34 beaufschlagt wird, um die hier befindlichen schaltbaren Lumineszenzmarkern in ihren inaktiven Zustand zu überführen. Der Teilbereich 39 spart den Teilbereich 7 aus, d. h. in dem Teilbereich 7 ist die Intensität des Ausschaltlichts 34 null oder zumindest so klein, dass sie zum Ausschalten der Lumineszenzmarker innerhalb der Zeit, für die das Ausschaltlicht 34 auf die Probe 8 gerichtet wird, nicht ausreicht. Um sicherzustellen, dass sich die schaltbaren Lumineszenzmarker zumindest in dem abzutastenden Teilbereich 7 der Probe 8 in ihrem aktiven Zustand befinden, wird vor und/oder zeitlich überlappend mit dem Ausschaltlicht 34 das Einschaltlicht 37 über einen kreisförmigen Teilbereich 40, der den abzutastenden Teilbereich 7 umfasst, auf die Probe 8 gerichtet.
11 illustriert, wie mit dem abzutastenden Teilbereich 7 die Probe 8 abgetastet werden kann. Dabei zeigt 11(a) mehrere aufeinanderfolgende Lagen des kreisförmigen Teilbereichs 7 gemäß 10 in der Probe 8 und bei einem dieser Teilbereiche 7 die Bahn 9, längs derer innerhalb des Teilbereichs 7 ein quadratischer Bereich der Probe 8 abgetastet wird. 11(b) zeigt, wie mit derartigen quadratischen Teilbereichen 41 die Probe 8 vollständig abgedeckt und entsprechend vollständig abgebildet werden kann.
12 illustriert eine andere Form des Abtastens der Probe 8 mit dem Teilbereich 7. Hier sind die aufeinanderfolgenden Lagen des kreisförmigen Teilbereichs 7 in einer hexagonalen Anordnung in der Probe 8 vorgesehen. Dabei erstreckt sich die Bahn 9, längs derer jeder Teilbereich 7 mit der Nullstelle des Lumineszenzverhinderungslichts abgetastet wird, über ein regelmäßiges Sechseck. 12(b) zeigt, wie mit diesen regelmäßigen Sechsecken 42 die gesamte Probe 8 erfasst und entsprechend abgebildet wird.
Bezugszeichenliste

1: Anregungslicht
2: Fluoreszenzverhinderungslicht
3: Intensitätsmaximum
4: Nullstelle
5: Bereich
6: Anregung
7: abzutastender Teilbereich
8: Probe
9: Bahn
10: Mittelpunkt
11: gestrichelte Linie
12: Spiralbahn
13: Rasterfluoreszenzmikroskop
14: Lichtquelle
15: Aufweiteoptik
16: Phasenplatte
17: weitere Lichtquelle
18: Aufweiteoptik
19: dichroitischer Spiegel
20: Fluoreszenzlicht
21: Punktdetektor
22: Abtastmittel
23: Abtastmittel
24: Probenhalterung
25: Verschiebungssymbol
26: dichroitischer Spiegel
27: Intensitätsmaximum
28: Detektor
29: Kamera
30: dichroitischer Spiegel
31: Ausschaltlichtquelle
32: Aufweiteoptik
33: Strahlformungsmittel
34: Ausschaltlicht
35: Einschaltlichtquelle
36: Aufweiteoptik
37: Einschaltlicht
38: Steuerung
39: angrenzender Teilbereich
40: Teilbereich
41: Quadrat
42: Sechseck
43: dichroitischer Spiegel
44: dichroitischer Spiegel
45: Objektiv
F: Fokuspunkt
I: Intensität
D₀: Abstand

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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DE 102013100147 A1 [0016]
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Claims

Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe (8), – wobei Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe (8) gerichtet wird, die eine von Intensitätsmaxima (3) benachbarte Nullstelle (4) aufweist, – wobei ein abzutastender Teilbereich (7) der Probe (8) mit der Nullstelle (4) abgetastet wird und – wobei aus dem Bereich der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlicht registriert und dem Ort der Nullstelle (4) in der Probe (8) zugeordnet wird, dadurch gekennzeichnet, – dass Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) in mindestens einer Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) in der Probe benachbart sind, nicht größer sind als 75 % eines Abstands (D₀) der Intensitätsmaxima (3) in dieser Richtung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) in der Probe benachbart sind, nicht größer sind als 50 %, 45 %, 25 % oder 10 % des Abstands (D₀) der Intensitätsmaxima (3) in dieser Richtung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessungen des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) in der Probe benachbart sind, nicht größer sind als eine Strecke, über die die Intensität (I) des Lichts ausgehend von der Nullstelle (4) in dieser Richtung auf 50 %, 25 %, 10 % oder 5 % der Intensität (I) des Lichts in den benachbarten Intensitätsmaxima (3) ansteigt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der abzutastende Teilbereich (7) der Probe (8) wiederholt mit der Nullstelle (4) abgetastet wird.
Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer mit Lumineszenzmarkern markierten Struktur in einer Probe (8), – wobei Licht, das sich auf die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker auswirkt, mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe (8) gerichtet wird, die eine von Intensitätsmaxima (3) begrenzte Nullstelle (4) aufweist, – wobei ein abzutastender Teilbereich (7) der Probe (8) mit der Nullstelle (4) abgetastet wird und – wobei aus dem Bereich (5) der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlicht registriert und dem Ort der Nullstelle (4) in der Probe (8) zugeordnet wird, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der abzutastende Teilbereich (7) der Probe (8) beginnend an einem Mittelpunkt (10) und mit zunehmendem Abstand zu seinem Mittelpunkt (10) mit der Nullstelle (4) abgetastet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der abzutastende Teilbereich (7) der Probe (8) auf einer Spiralbahn (12) um seinem Mittelpunkt (10) abgetastet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) die Struktur in der Probe (8) auf andere Weise abgebildet wird, um die Lage des abzutastenden Teilbereichs (7) in der Probe (8) festzulegen, wobei optional dass vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) ein größerer Teilbereich der Probe (8) mit der Nullstelle (4) mit einer um mindestens 50 % geringeren Intensität des Lichts und/oder mit einer um mindestens 50 % höheren Abtastgeschwindigkeit abgetastet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe (8) andere Abtastmittel verwendet werden als zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8).
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe (8) in mindestens einer Richtung eine Probenhalterung (24) relativ zu einem Objektiv (17) bewegt wird, mit dem das Licht auf die Probe (8) gerichtet wird, und/oder dass zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) in mindestens einer Richtung ein elektro-optischer Scanner, ein akusto-optischer Deflektor oder ein Galvospiegel verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht Lumineszenzverhinderungslicht ist, das die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker außerhalb der Nullstelle (4) verhindert.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzverhinderungslicht Stimulationslicht ist, das die Emission von Lumineszenzlicht durch die Lumineszenzmarker außerhalb der Nullstelle (4) durch stimulierte Emission verhindert, wobei das Stimulationslicht zusammen mit Anregungslicht (1) auf die Probe (8) gerichtet wird, das die Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht anregt und das eine Intensitätsverteilung mit einem Maximum (27) im Bereich der Nullstelle (4) des Lumineszenzverhinderungslichts aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) mit der Nullstelle (4) zusätzlich Ausschaltlicht (34) mit einer solchen Intensitätsverteilung auf die Probe (8) gerichtet wird, dass es die als schaltbare Lumineszenzmarker ausgebildeten Lumineszenzmarker in einem an den abzutastenden Teilbereich (7) angrenzenden Teilbereich (39) der Probe (8) in einen inaktiven Zustand ausschaltet, wobei der angrenzende Teilbereich (39) in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) des Stimulationslichts in der Probe benachbart sind, an den abzutastenden Teilbereich (7) angrenzt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit dem abzutastende Teilbereich (7) abgetastet wird, wobei der abzutastende Teilbereich (7) an allen oder ausgewählten Positionen des abzutastenden Teilbereichs (7) mit der Nullstelle (4) abgetastet wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des Ausschaltlichts (34) in dem abzutastenden Teilbereich (7) ein durch destruktive Interferenz ausgebildetes lokales Intensitätsminimum aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor und/oder zeitlich überlappend mit dem Richten des Ausschaltlichts (34) auf die Probe (8) Einschaltlicht (37) auf den abzutastenden Teilbereich (7) der Probe (8) gerichtet wird, das die schaltbaren Lumineszenzmarker in ihren aktiven Zustand einschaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass beim Einschalten und/oder Ausschalten von den schaltbaren Lumineszenzmarker emittiertes Lumineszenzlicht (20) registriert und ausgewertet wird, wobei das Ergebnis des Auswertens optional ist, – ob der von dem angrenzenden Teilbereich (39) begrenzte abzutastende Teilbereich (7) mit der Nullstelle (4) abgetastet wird und/oder – ob das Anregungslicht (1) in den von dem angrenzenden Teilbereich (39) begrenzten abzutastende Teilbereich (7) auf die Probe (8) gerichtet wird und/oder – unter welchen Bedingungen das Richten des Stimulationslicht auf die Probe (8) in jeder Position der Nullstelle (4) in dem von dem angrenzenden Teilbereich (39) begrenzten abzutastenden Teilbereich (7) und das Registrieren des aus dem Bereich der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlichts (20) abgebrochen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Bereich der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlicht mit einem Punktsensor (21) registriert wird, dessen Lage gegenüber der Probe (8) beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) nicht verändert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere abzutastende Teilbereiche (7) der Probe (8) gleichzeitig abgetastet werden.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Exemplare eines interessierenden Objekts überschneidend mit den mehreren abzutastenden Teilbereichen (7) der Probe (8) angeordnet werden, wobei optional ein Abbild des interessierenden Objekts aus Teilbildern des Objekts zusammengesetzt wird, die beim Abtasten der mehreren Teilbereiche (7) der Probe (8) erhalten werden.
Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit – einer Lichtquelle (14) für Licht, – Lichtformungsmitteln, die das Licht mit einer Intensitätsverteilung auf eine Probe (8) richten, welche eine von Intensitätsmaxima (3) benachbarte Nullstelle (4) aufweist, – Abtastmitteln (22, 23), um einen abzutastenden Teilbereich (7) der Probe (8) mit der Nullstelle (4) abzutasten, und – einem Detektor (28), der aus dem Bereich der Nullstelle (4) emittiertes Lumineszenzlicht registriert, gekennzeichnet durch eine Steuerung (38) zu Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Rasterlumineszenzlichtmikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abtasten eines größeren Bereichs der Probe (8) andere Abtastmittel vorhanden sind als die Abtastmittel (22, 23) zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) und dass der Detektor ein Punktdetektor (21) ist, dessen Lage gegenüber der Probe (8) beim Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) fest ist.
Rasterlumineszenzlichtmikroskop nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abtasten des größeren Bereichs der Probe (8) in mindestens einer Richtung eine relativ zu einem Objektiv (17) der Lichtformungsmittel bewegliche Probenhalterung (24) vorhanden ist und/oder dass zum Abtasten des abzutastenden Teilbereichs (7) der Probe (8) in mindestens einer Richtung ein elektro-optischer Scanner, ein akusto-optischer Deflektor oder ein Galvospiegel vorhanden ist.
Rasterlumineszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, – dass das Licht Stimulationslicht ist, – dass eine weitere Lichtquelle (17) für Anregungslicht (1) vorgesehen ist, wobei die Lichtformungsmittel das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe (8) richten, die ein Maximum (27) im Bereich der Nullstelle (4) des Stimulationslichts aufweist, und – dass eine Ausschaltlichtquelle (31) für Ausschaltlicht (34) vorgesehen ist, wobei die Lichtformungsmittel das Ausschaltlicht (34) mit einer solchen Intensitätsverteilung auf die Probe (8) richten, dass es die als schaltbare Lumineszenzmarker ausgebildeten Lumineszenzmarker in einem an den abzutastenden Teilbereich (7) angrenzenden Teilbereich (39) der Probe (8) in einen inaktiven Zustand ausschaltet, wobei der angrenzende Teilbereich (39) in der mindestens einen Richtung, in der die Intensitätsmaxima (3) der Nullstelle (4) des Stimulationslichts in der Probe (8) benachbart sind, an den abzutastenden Teilbereich (7) angrenzt.
Rasterlumineszenzlichtmikroskop nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, noch eine Einschaltlichtquelle (35) für Einschaltlicht (37) vorgesehen ist, das die schaltbaren Lumineszenzmarker in ihren aktiven Zustand einschaltet, wobei die Lichtformungsmittel das Einschaltlicht (37) vor und/oder zeitlich überlappend mit dem Richten des Ausschaltlichts (34) auf die Probe (8) auf den abzutastenden Teilbereich (7) der Probe (8) richten.