JP6730895B2 - 高空間解像度でサンプル中の構造を局所的に画像化すること - Google Patents
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Description
本出願は、2015年9月22日に出願されたドイツ特許出願第10 2015 116 023.4号明細書、及び2016年3月7日に出願されたドイツ特許出願第10 2016 104 100.9号明細書の優先権を主張する。
Claims (26)
- サンプル中の構造を高解像度画像化する方法であって、前記構造はルミネセンスマーカーでマークされ、前記方法は、
零点と少なくとも1つの方向において前記零点に近接する強度最大値とを有する強度分布で、前記ルミネセンスマーカーによってルミネセンス光の放出に影響を及ぼす光を前記サンプル上に導くことと;
前記零点で走査エリアを走査することであって、前記走査エリアが前記サンプルの一部である、ことと;
前記走査エリアを走査している間に、前記サンプル中に前記零点を含む局所エリアから放出されるルミネセンス光を登録することと;
前記登録されたルミネセンス光を前記サンプル中の前記零点のそれぞれのロケーションに割り当てることと;
を含み、
前記強度最大値が前記サンプル中の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアの寸法は、前記少なくとも1つの方向において前記強度最大値の距離の75%よりも大きくない、
方法。 - 前記強度最大値が前記サンプル中の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアの前記寸法は、前記少なくとも1つの方向において前記強度最大値の前記距離の25%よりも大きくない、請求項1に記載の方法。
- 前記強度最大値が前記サンプル中の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアの前記寸法は、前記少なくとも1つの方向における前記光の強度が、前記零点において開始して、それにわたって、前記近接する強度最大値における前記光の前記強度の25%まで増加する距離よりも大きくない、請求項1に記載の方法。
- 前記走査エリアは、前記零点で繰り返し走査される、請求項1に記載の方法。
- 前記走査エリアを走査することより前に、前記サンプル中の前記構造は、前記サンプル中の前記走査エリアの位置を決定するための別の方法における画像である、請求項1に記載の方法。
- 前記走査エリアを走査することより前に、前記サンプルのより大きい部分エリアは、
前記光の少なくともより50%低い強度と、
少なくともより50%高い走査速度と
のうちの少なくとも1つにおいて前記零点で走査される、請求項5に記載の方法。 - 前記走査エリアを走査するためにスキャナが使用され、前記サンプルの前記より大きいエリアを走査するために別のスキャナが使用される、請求項5に記載の方法。
- サンプルホルダーは、前記サンプルの前記より大きいエリアを走査するために前記光がそれによって前記サンプル上に導かれる対物レンズに対して移動され、
電気光学スキャナ、
音響光学ディフレクタ、
ガルボスキャナ、及び
ガルボミラー
のうちの少なくとも1つが、前記少なくとも1つの方向において前記走査エリアを走査するために使用される、
請求項5に記載の方法。 - 前記光は、前記零点の外側で前記ルミネセンスマーカーによってルミネセンス光の前記放出を抑制するように波長が選択されるルミネセンス抑制光である、請求項1に記載の方法。
- 前記ルミネセンス抑制光は、誘導放出によって前記零点の外側で前記ルミネセンスマーカーによってルミネセンス光の前記放出を抑制するように波長が選択される誘導光であり、前記誘導光は、ルミネセンス光の放出のために前記ルミネセンスマーカーを励起するように波長が選択される励起光であって、前記ルミネセンス抑制光の前記零点の前記エリア中に最大値を含む強度分布を有する励起光とともに、前記サンプル上に導かれる、請求項9に記載の方法。
- 前記零点で前記走査エリアを走査することより前に、追加のスイッチオフ光は、前記スイッチオフ光が、近接するエリアにおいて、前記ルミネセンスマーカーを非アクティブ状態に切り替えるような強度分布で前記サンプル上に導かれ、前記近接するエリアは、前記強度最大値が前記サンプル中の前記誘導光の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアに近接する、請求項10に記載の方法。
- 前記サンプルは前記走査エリアで走査され、前記サンプル中の前記走査エリアのすべての位置又は選択された位置における前記走査エリアが前記零点で走査される、請求項11に記載の方法。
- 前記スイッチオフ光の前記強度分布は、前記走査エリア中の弱め合う干渉によって形成される局所強度最小値を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記スイッチオフ光を前記サンプルに導くことより前に又はそれと一時的に重複して、スイッチオン光は、前記ルミネセンスマーカーをそれらのアクティブ状態に切り替える前記サンプルの前記走査エリア上に導かれる、請求項11に記載の方法。
- スイッチオン又はスイッチオフされると前記切替え可能ルミネセンスマーカーによって放出されるルミネセンス光が登録され評価される、請求項14に記載の方法。
- 評価する前記ステップの結果は:
前記近接するエリアによって画定される前記走査エリアが前記零点で走査されることになるかどうか;
前記励起光が、前記近接する部分エリアによって画定される前記走査エリア中の前記サンプル上に導かれることになるかどうか;及び
どんな条件下で、前記誘導光を、前記近接するエリアによって画定される前記走査エリア中の前記零点の各位置における前記サンプル上に導くことと、前記零点の前記エリアから放出される前記ルミネセンス光を登録することとが中断されることになるか
のうちの少なくとも1つである、請求項15に記載の方法。 - 前記零点の前記エリアから放出される前記ルミネセンス光は、前記走査エリアを走査している間に前記サンプルに対する位置が不変のままである点センサで登録される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルのいくつかの走査エリアが同時に走査される、請求項1に記載の方法。
- サンプル中の構造を高空間解像度画像化する方法であって、前記構造はルミネセンスマーカーでマークされ、前記方法は、
零点と少なくとも1つの方向において前記零点に近接する強度最大値とを有する強度分布で、前記ルミネセンスマーカーによってルミネセンス光の放出に影響を及ぼす光を前記サンプル上に導くことと;
前記零点で走査エリアを走査することであって、前記走査エリアが前記サンプルの一部である、ことと;
前記走査エリアを走査している間に、前記サンプル中に前記零点を含む局所エリアから放出されるルミネセンス光を登録することと;
前記登録されたルミネセンス光を前記サンプル中の前記零点のそれぞれのロケーションに割り当てることと;
を含み、
前記走査エリアは、中心点において開始する前記零点で、及び前記少なくとも1つの方向における前記中心点までの距離の増加とともに走査される、
方法。 - 前記走査エリアは、前記中心点の周りのスパイラルコースに沿って走査される、請求項19に記載の方法。
- 走査型ルミネセンス光学顕微鏡であって、
光を提供するように構成された光源と;
零点と前記零点に近接する強度最大値とを有する強度分布で前記光をサンプル上に導くように構成された光整形器と;
前記零点で走査エリアを走査するように構成されたスキャナであって、前記走査エリアが前記サンプルの部分エリアである、スキャナと;
前記零点の前記エリアから放出されるルミネセンス光を登録するように構成された検出器と;
サンプル中の構造を高解像度画像化する方法を実装するソフトウェアを用いてプログラムされたコントローラとであって、前記構造がルミネセンスマーカーでマークされる、コントローラと、を備え、前記方法は、
零点と少なくとも1つの方向において前記零点に近接する強度最大値とを有する強度分布で、前記ルミネセンスマーカーによってルミネセンス光の放出に影響を及ぼす光を前記サンプル上に導くことと;
前記零点で走査エリアを走査することであって、前記走査エリアが前記サンプルの一部である、ことと;
前記走査エリアを走査している間に、前記サンプル中に前記零点を含む局所エリアから放出されるルミネセンス光を登録することと;
前記登録されたルミネセンス光を前記サンプル中の前記零点のそれぞれのロケーションに割り当てることと;
を含み、
前記強度最大値が前記サンプル中の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアの寸法は、前記少なくとも1つの方向において前記強度最大値の距離の75%よりも大きくないか、又は前記走査エリアは、中心点において開始する前記零点で、及び前記少なくとも1つの方向における前記中心点までの距離の増加とともに走査される、
走査型ルミネセンス光学顕微鏡。 - 前記サンプルのより大きいエリアを走査するように構成されたさらなるスキャナをさらに備え、前記検出器は、前記走査エリアを走査している間に前記サンプルに対する位置が固定である点検出器である、請求項21に記載の走査型ルミネセンス光学顕微鏡。
- 前記さらなるスキャナは、前記光整形器の対物レンズに対して移動可能なサンプルホルダーを備える、請求項22に記載の走査型ルミネセンス光学顕微鏡。
- 前記スキャナは、電気光学スキャナ、音響光学ディフレクタ、ガルボスキャナ又はガルボミラーのうちの少なくとも1つを備える、請求項21に記載の走査型ルミネセンス光学顕微鏡。
- 前記光源によって提供される前記光は誘導光であり、前記走査型ルミネセンス光学顕微鏡は:
励起光を提供するように構成されたさらなる光源であって、前記光整形器が、前記誘導光の前記零点の前記エリア中で最大値を有する強度分布で前記誘導光をサンプル上に導くように構成された、光源と、
スイッチオフ光を提供するように構成されたスイッチオフ光源であって、前記光整形器は、前記光整形器が、近接する部分エリア中の切替え可能ルミネセンスマーカーを非アクティブ状態にスイッチオフするような強度分布で前記スイッチオフ光を前記サンプル上に導くように構成され、前記近接する部分エリアは、前記強度最大値が前記誘導光の前記零点に近接する前記少なくとも1つの方向における前記走査エリアに近接する、スイッチオフ光源と
をさらに備える、請求項22に記載の走査型ルミネセンス光学顕微鏡。 - 前記切替え可能ルミネセンスマーカーをそれらのアクティブ状態に切り替えるスイッチオン光を提供するように構成されたスイッチオン光源をさらに備え、前記光整形器は、前記スイッチオフ光を前記サンプル上に導くことより前に又はそれと一時的に重複して、前記スイッチオン光を前記走査エリア上に導くように構成された、請求項25に記載の走査型ルミネセンス光学顕微鏡。
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