DE102015222277A1

DE102015222277A1 - Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Zellkulturmodells der Schweißdrüse, insbesondere der humanen Schweißdrüse

Info

Publication number: DE102015222277A1
Application number: DE102015222277.2A
Authority: DE
Inventors: Melanie Giesen; Patricia Klaka; Sabine Grüdl
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: DE102015222277B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells unter Verwendung einer speziellen Polymeroberfläche sowie die Verwendung dieses Äquivalents als in-vitro Modell, in Screening-Verfahren sowie zur in-vitro Bewertung von des Einflusses kosmetischer Wirkstoffe auf die Hemmung der Schweißsekretion sowie den Körpergeruch.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, bei welchem zunächst isolierte Schweißdrüsen bereitgestellt, aus diesen anschließend eine Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen erzeugt und diese Zellpräparation auf einer bestimmten Polymeroberfläche kultiviert wird. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weisen tubuläre Strukturen sowie unterschiedlich differenzierte Zellen auf und zeigen ein Reaktionsvermögen sowohl auf Genexpressionsebene als auch auf Ebene der Proteinexpression auf einen externen Stimulus, beispielsweise einen cholinergenen Stimulus durch Acetylcholin (auch als ACh bezeichnet).
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines mittels des erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents als in-vitro-Modell in der Kosmetik und der Körperpflege, in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe sowie zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, welches ein durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent umfasst.
Das Waschen, Reinigen und Pflegen des eigenen Körpers stellt ein menschliches Grundbedürfnis dar und die moderne Industrie versucht fortlaufend, diesen Bedürfnissen des Menschen in viel-fältiger Weise gerecht zu werden. Besonders wichtig für die tägliche Hygiene ist die anhaltende Beseitigung oder zumindest Reduzierung des Körpergeruchs und der Achselnässe. Achselnässe und Körpergeruch entstehen durch die Sekretion aus ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen in der humanen Achselhöhle. Während die ekkrinen Drüsen der Thermoregulation des Körpers dienen und für die Entstehung der Achselnässe verantwortlich sind, scheiden die apokrinen Drüsen ein viskoses Sekret in Reaktion auf Stress ab, aus welchem durch bakterielle Zersetzung unangenehmer Körpergeruch entsteht.
Erste Forschungsarbeiten an nativen ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen wurden bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt, um diese zur Gruppe der exokrinen Drüsen gehörenden Hautanhangsgebilde zu klassifizieren. Schweißdrüsen lassen sich hiernach in apokrine und ekkrine Schweißdrüsen sowie eine Mischform aus apokrinen und ekkrinen Schweißdrüsen (auch als apoekkrine Schweißdrüse bezeichnet) einteilen. Die zuvor genannten Formen können anhand morphologischer und charakteristischer Merkmale unterschieden werden.
Die ekkrine Schweißdrüse, insbesondere die humane ekkrine Schweißdrüse, gehört zu den unverzweigten gewunden tubulären Drüsen und lässt sich in das sekretorische Endstück (auch als Coil bezeichnet), den dermalen Ausführgang (auch als Dukt bezeichnet) sowie den epidermalen Ausführgang (auch als Acrosyringium bezeichnet) unterteilen. Die in diesen Drüsenabschnitten vorhanden Zellen weisen unterschiedliche Aufgaben und Funktionen auf, wie beispielsweise die Sekretion im Coil, Rückresorption von Ionen im Dukt sowie Abgabe des Sekrets, insbesondere des Schweißes, an die umliegende Haut durch das Acrosyringium. Die ekkrinen Schweißdrüsen werden durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) stimuliert.
Im Hinblick auf die Vermeidung von Achselnässe und/oder Körpergeruch ist es daher wünschenswert, die Sekretion aus ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen zu vermindern und/oder zu vermeiden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Ausführungsgänge der ekkrinen Schweißdrüsen mittels sogenannter Plugs verstopft. Hierzu werden im Stand der Technik schweißhemmende Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze eingesetzt, welche jedoch vom Verbraucher als kritisch empfunden werden. Weiterhin werden im Stand der Technik antibakterielle Mittel eingesetzt, welche den bakteriellen Abbau des Schweißes durch verhindern. Derartige Mittel können jedoch die natürliche Mikroflora der Haut unter der Achselhöhle negativ beeinflussen. Es ist daher wünschenswert, kosmetische Mittel bereitzustellen, welche in der Lage sind, die Achselnässe und/oder den Körpergeruch zuverlässig zu verhindern und welche keine Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze sowie antibakteriellen Mittel enthalten. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung derartiger Mittel besteht in dem Einsatz von Substanzen, welche die Stimulierung der Schweißdrüsen effektiv hemmen und somit die Schweißsekretion vermindern bzw. vermeiden. Um derartige Substanzen identifizieren zu können, können in-vivo Tests mit Versuchsteilnehmern durchgeführt werden. Solche Tests sind jedoch aufwändig und erlauben keine Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten. Zum anderen können Zellmodelle von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann. Derartige Modelle müssen die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden, standardisierbar und kostengünstig sein sowie Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten ermöglichen.
Ein zweidimensionales Zellmodell zur Untersuchung von Wirksubstanzen ist beispielsweise die von Lee und Dessi (Lee et, al.; „NCL-SG3: a human eccrine sweat gland cell line that retains the capacity for transepithelial ion transport"; Journal of Cell Science, 1989, 92, Seiten 241 bis 249) entwickelte zweidimensionale Zellkultur der Zellline „NCL-SG3“ aus ekkrinen Schweißdrüsen, welche über die Kapazität des transepidermalen Ionentransports verfügt. In diesem Zellmodell konnten funktionelle Markerproteine der folgenden Ionenkanäle nachgewiesen werden: Wassertransportkanal Aquaporin 5 (auch als AQP5 bezeichnet), Natrium-Kalium-Cotransporter 1 (auch als NKCC1 bezeichnet) sowie der Calcium-abhängige Chloridkanal (auch als TMEM16A bezeichnet). Jedoch besitzt dieses zweidimensionale Zellkulturmodell keine ausreichende physiologische Nähe zur nativen Schweißdrüse, da die Schweißdrüsenzellen nach Entnahme aus der natürlichen dreidimensionalen Umgebung ein verändertes Verhalten aufweisen. Folglich können solche Modelle die in-vivo Situation nur unzureichend wiedergeben und eignen sich daher nur bedingt für die Vorhersage der in-vivo Wirksamkeit von Testsubstanzen.
Um die natürliche Physiologie der Schweißdrüse möglichst genau nachzustellen, sind daher dreidimensionale Zellmodelle erforderlich. Ein derartiges dreidimensionales Schweißdrüsenmodell ist beispielsweise durch Li (Li et. al.; „Matrigel basement membrane matrix induces eccrine sweat gland cells to reconstitute sweat gland-like structures in nude mice"; Experimental Cell Research, 2015, 332, Seiten 67 bis 77) beschrieben. Dieses Schweißdrüsenmodell wird durch Kultivierung von primären Schweißdrüsenzellen in einer gelartigen Substanz (Matrigel^®) mit Wachstumsfaktoren und anschließendes Implantieren dieser Gele in Mäuse erzeugt. Nach Implantierung in den Körper der Maus bilden sich Sphäroid-Strukturen aus, welche Schweißdrüsenspezifische Markerproteine aufweisen. Da zur Ausbildung der differenzierten Strukturen der Einsatz von Mäusen erforderlich ist, kann dieses Modell nicht in der kosmetischen und pharmazeutischen Forschung, wo der Einsatz von Versuchstieren verboten ist, verwendet werden.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenmodellen, welche eine ähnliche, vorzugsweise identische, Zellstruktur mit unterschiedlich differenzierten Schweißdrüsenzellen aufweisen wie native Schweißdrüsen. Weiterhin sollen diese Verfahren ausschließlich unter Einsatz von in-vitro Methoden durchführbar sind. Zudem sollen diese Verfahren eine hohe Standardisierbarkeit sowie eine kostengünstige Herstellung der Schweißdrüsenmodelle ermöglichen.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells (im Folgenden als Schweißdrüsenäquivalent bezeichnet) bereitzustellen, welches ausschließlich unter Einsatz von in-vitro Methoden durchführbar ist. Die Zellstruktur der aus diesem Verfahren resultierenden dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente soll eine hohe Ähnlichkeit zu der Zellstruktur von nativen Schweißdrüsen aufweisen. Weiterhin sollen das Verfahren eine hohe Standardisierbarkeit und eine kostengünstige Herstellung der Schweißdrüsenäquivalente ermöglichen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente durch ausschließlichen Einsatz von in-vitro Methoden erhalten werden können, wenn primäre Schweißdrüsenzellen auf einer hydrophilen neutralen Polymeroberfläche kultiviert werden. Bei der auf diese Weise durchgeführten Kultivierung bilden die primären Schweißdrüsenzellen eine tubuläre Struktur aus und nehmen Ordnung an. Weiterhin bilden die primären Schweißdrüsenzellen dieses Äquivalents die gleichen Charakteristika aus wie native Schweißdrüsen, insbesondere Eigenschaften aus Coil sowie aus Dukt, und liegen differenziert vor. Durch die Einstellung von bestimmten Zellzahlen vor Kultivierung auf der Polymeroberfläche resultiert eine hohe Standardisierbarkeit. Weiterhin ist das Verfahren sehr kostengünstig durchführbar. Daher eignen sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Äquivalente zum Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen zur Testung von schweißhemmenden Substanzen zum Einsatz in der Kosmetik und der Pharmazie.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche beträgt, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

Unter einem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent wird erfindungsgemäß ein Zellmodell aus Schweißdrüsenzellen verstanden, welches eine Ausdehnung in alle drei Raumrichtungen aufweist und in welchem die Zellen eine ähnliche Funktion, insbesondere eine identische Funktion, wie Zellen einer nativen Schweißdrüse zeigen.
Unter den in Verfahrensschritt a) eingesetzten isolierten Schweißdrüsen werden nicht kultivierte Schweißdrüsen verstanden, welche aus Hautbiopsien oder dergleichen erhalten werden können und welche aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wurden. Diese isolierten Schweißdrüsen werden anschließend kultiviert, um eine Zellkultur zu erhalten.
Unter der in Verfahrensschritt b) eingesetzten Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ist eine Suspension von Schweißdrüsenzellen der kultivierten isolierten Schweißdrüsen in einer Lösung, insbesondere in einem Nährmedium, zu verstehen.
In Verfahrensschritt c) wird die in Verfahrensschritt b) bereitgestellte Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen auf eine spezielle Polymeroberfläche aufgetragen. Um eine ausreichende Standardisierbarkeit zu erreichen, muss vor Kultivierung der Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen auf der Polymeroberfläche eine bestimmte Zellzahl eingestellt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse handelt. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Gegenstands sind daher dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse handelt. Die Herstellung derartiger Äquivalente ist insbesondere bevorzugt, wenn die schweißhemmende Wirkung von Substanzen auf die humanen Schweißdrüsen ermittelt werden soll.
Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt wird. Folglich weisen Verfahren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform keine Verfahrensschritte auf, bei welchen in-vivo Methoden eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt werden in Verfahrensschritt a) native Schweißdrüsen eingesetzt, welche aus dem menschlichen Körper isoliert wurden. Unter nativen Schweißdrüsen sind hierbei Schweißdrüsen zu verstehen, welche aus der Haut des Menschen, insbesondere aus Hautbiopsien des Menschen, isoliert wurden. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn in Verfahrensschritt a) native isolierte Schweißdrüsen vom Menschen, insbesondere ekkrine und/oder apokrine Schweißdrüsen vom Menschen, verwendet werden.
In Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden isolierte Schweißdrüsen bereitgestellt. Hierzu ist es bevorzugt, wenn die Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut isoliert und anschließend die erhaltenen isolierten nativen Schweißdrüsen kultiviert werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es daher, wenn die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer Schweißdrüsen, insbesondere nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen, aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden.
In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn die Isolierung der nativen Schweißdrüsen durch enzymatischen Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgt. Die hierfür verwendete menschliche Haut ist bevorzugt eine Hautbiopsie, welche beispielsweise in der Schönheitschirurgie als Abfallprodukt anfällt.
Weiterhin hat es sich in diesem Zusammenhang als vorteilhaft erwiesen, wenn zur Suspendierung der isolierten Schweißdrüsen ein bestimmtes Nährmedium verwendet wird. Es hat sich gezeigt, dass sich bei Verwendung dieses Nährmediums die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt c) besonders gut kultivieren lassen. Erfindungsgemäß bevorzugt wird daher zur Suspendierung der isolierten Schweißdrüsen eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als Nährmedium verwendet.
In Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den isolierten nativen Schweißdrüsen bereitgestellt. Diese Zellpräparation kann beispielsweise nach Kultivierung der isolierten nativen Schweißdrüsen, Ablösung der aus den nativen Schweißdrüsen auswachsenden Monolayer-Kulturen und Kultivierung dieser abgelösten primären Schweißdrüsenzellen durch Suspendierung in einem geeigneten Medium unter Einstellung der oben angegebenen Zellzahl erfolgen. Erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsformen sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt b) durch Kultivierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, Ablösung von Schweißdrüsenzellen aus dieser Kultur, insbesondere durch schonende Trypsinierung, Kultivierung dieser abgelösten Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen sowie Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen in einem Nährmedium hergestellt wird.
In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn zur Kultivierung der isolierten Schweißdrüsen, zur Kultivierung der abgelösten primären Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen sowie zur Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen ein bestimmtes Nährmedium eingesetzt wird. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn zur Kultivierung der abgelösten primären Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen sowie zur Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als Nährmedium verwendet wird.
Weiterhin ist es in diesem Zusammenhang von Vorteil, wenn die Kultivierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen unter bestimmten Bedingungen erfolgt. Es ist daher vorteilhaft, wenn die Kultivierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen für 7 bis 28 Tage, insbesondere für 14 Tage, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
Zudem ist es in diesem Zusammenhang vorteilhaft, wenn die Kultivierung der abgelösten primären Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen unter bestimmten Bedingungen erfolgt. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Kultivierung der isolierten primären Schweißdrüsenzellen bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt. Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass eine Kultivierung dieser Zellen bis zur Konfluenz erfolgt. Hierunter wird die größtenteils lückenlose, insbesondere vollständige, Bedeckung der Oberfläche eines Kulturgefäßes mit primären Schweißdrüsenzellen verstanden.
Um die Ausbildung von unterschiedlichen Charakteristika sowie die Differenzierung der primären Schweißdrüsenzellen in unterschiedliche Funktionalitäten in dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zu ermöglichen, enthält die in Verfahrensschritt c) auf die Polymeroberfläche aufgetragene Zellpräparation bestimmte Zellzahlen an primären Schweißdrüsenzellen. Die Verwendung von genau definierten Zellzahlen erlaubt weiterhin eine Standardisierung der Schweißdrüsenäquivalente, da alle Äquivalente ähnliche, insbesondere identische, Zellzahlen aufweisen und somit voneinander abweichende Ergebnisse bzw. eine aufwändige Standardisierung vermeidbar sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind daher dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 230.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, vorzugsweise 5.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, bevorzugt 5.000 bis 170.000 pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, weiter bevorzugt 5.000 bis 140.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, insbesondere 5.000 bis 132.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, beträgt. Die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen kann beispielsweise unter Verwendung einer klassischen Zählkammer sowie Trypanblau bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von kultivierten primären Schweißdrüsenzellen unverdünnt mit einer Trypanblau-Lösung versetzt und die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Eckquadraten bestimmt. Aus diesen Werten wird das arithmetische Mittel gebildet. Unter Berücksichtigung des Volumens der Zählkammer, dem Verdünnungsfaktor und dem Kammerfaktor wird aus diesem Mittelwert die Zellzahl pro ml bzw. µl bestimmt. Die in Verfahrensschritt c) verwendete Zellzahl bezieht sich hierbei auf die Zahl der lebenden Zellen (Lebendzahl). Durch Verwendung eines entsprechenden Volumens kann dann die beanspruchte Zellzahl auf die Polymeroberfläche aufgetragen werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die in Verfahrensschritt c) eingesetzte Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein bestimmtes Volumen aufweist. Dies erleichtert ein Kultivieren dieser Zellpräparation auf der Polymeroberfläche. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn in Verfahrensschritt c) die auf die Zelloberfläche aufzutragende Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 400 bis 4.000 µL, vorzugsweise von 450 bis 3.000 µL, bevorzugt von 480 bis 2.500 µL, insbesondere von 490 bis 2.100 µL, aufweist. Die Auftragung der zuvor genannten Volumina auf die Polymeroberfläche stellt ein ausreichendes Wachstum der in dieser Zellpräparation befindlichen primären Schweißdrüsenzellen sicher.
In Verfahrensschritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der Zellpräparation der primären Schweißdrüsenzellen auf einer speziellen Polymeroberfläche. Diese Polymeroberfläche verhindert die Adhäsion der Zellen auf dieser Oberfläche und unterstützt daher die Bildung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist. Derartige Polymeroberflächen sind beispielsweise kommerziell von der Firma Corning Incorporated als Ultra Low Attachment Zellkulturprodukte mit kovalent gebundenen Hydrogel-Oberflächen erhältlich.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Zellpräparation mit den primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt c) für einen bestimmten Zeitraum unter bestimmten Bedingungen auf der Polymeroberfläche kultiviert wird. Es ist daher bevorzugt, wenn die Kultivierung der Zellpräparation in Verfahrensschritt c) für einen Zeitraum von 1 bis 25 Tagen, insbesondere von 2 bis 7 Tagen, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es weiterhin vorgesehen sein, dass während der Kultivierung der primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt c) das zur Auftragung der Zellpräparation verwendete Nährmedium durch frisches Nährmedium ersetzt wird. Unter frischem Nährmedium ist hierbei ein Nährmedium zu verstehen, welches keinerlei Zellen enthält. Der Volumenanteil bezieht sich hierbei auf das Gesamtvolumen der in Verfahrensschritt b) hergestellten Zellpräparation. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt c), insbesondere nach 1 bis 3 Tagen, das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird.
In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn als frisches Nährmedium für den Volumenaustausch ein bestimmtes Nährmedium verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es daher vorteilhaft, wenn eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als frisches Nährmedium verwendet wird.
In Verfahrensschritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Isolierung des gebildeten, dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Entnahme des Nährmediums. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents in Verfahrensschritt d) durch Entnahme des Nährmediums erfolgt.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weisen bevorzugt einen bestimmten Durchmesser auf. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn das in Verfahrensschritt d) isolierte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 100 bis 4.000 µm, vorzugsweise von 100 bis 2.000 µm, insbesondere von 200 bis 2.500 µm, aufweist. Der Durchmesser der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen kugelförmigen Schweißdrüsenäquivalente kann beispielsweise durch mikroskopische Vermessung unter Verwendung der Software „CellSens“ ermittelt werden.
Darüber hinaus kann es in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, die in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente nach der Ablösung weiter zu kultivieren, insbesondere unter bestimmten Bedingungen. Diese Kultivierung kann bevorzugt in Vertiefungen einer Platte erfolgen, welche zum Auffangen der Äquivalente nach deren Ablösung dient. Derartige Verfahren weisen daher die Verfahrensschritte a) bis e) auf. Es ist daher bevorzugt, wenn die Kultivierung des isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells in Verfahrensschritt e) für einen Zeitraum von 1 bis 6 Tagen bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
Im Folgenden sind besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt wird und die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents,
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt wird und die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist und wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts b) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents,
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt c) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt und wobei die auf die aufgetragene Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 490 bis 2.100 µL aufweist, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents,
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt und wobei die auf die aufgetragene Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 490 bis 2.100 µL aufweist, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche, wobei während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt c) das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents,
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt und wobei die auf die aufgetragene Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 490 bis 2.100 µL aufweist, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche, wobei während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt c) das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei die Isolierung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents in Verfahrensschritt d) durch Entnahme des Nährmediums erfolgt,
e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

Schließlich ist eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt wird und die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, wobei die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung dieser isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden,
b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 250.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt und wobei die auf die aufgetragene Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 490 bis 2.100 µL aufweist, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche, wobei während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt c) das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird,
d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei die Isolierung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents in Verfahrensschritt d) durch Entnahme des Nährmediums erfolgt,
e) Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.

Die zuvor beschriebenen Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sind bevorzugt Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse.
Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen den Vorteil auf, dass keinerlei Verwendung von in-vivo Methoden erforderlich sind, um die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente herzustellen. Folglich können diese Äquivalente auch zur Testung von Substanzen verwendet werden, welche zur kosmetischen Anwendung vorgesehen sind. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine kostengünstige Herstellung von standardisierten Äquivalenten, welche in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten eingesetzt werden können. Zudem resultiert dieses Herstellverfahren in dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, welche tubuläre Strukturen ausbilden, unterschiedlich differenzierte Zellen aufweisen und Schweißdrüsenspezifische Marker exprimieren, so dass eine gute Übertragbarkeit von in-vitro Daten auf die in-vivo-Situation ermöglicht wird.
Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent, welches erhältlich ist durch ein erfindungsgemäßes Verfahren.
Diese dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente bilden eine tubuläre Struktur auf und weisen differenzierte Zellen mit den gleichen Charakteristika auf wie native Schweißdrüsen. Zudem werden Schweißdrüsenspezifische Proteine signifikant stärker exprimiert als in zweidimensionalen Zellmodellen aus dem Stand der Technik. Weiterhin zeigen die erfindungsgemäßen Äquivalente eine Reaktion auf Genexpressions- als auch auf Proteinexpressionsebene auf einen Stimulus durch Acetylcholin (ACh). Durch Verwendung von kultivierten primären Schweißdrüsenzellen kann eine hohe Standardisierung erreicht werden, da aus den kultivierten Zellen eine Vielzahl von Äquivalenten mit gleichen Eigenschaft erzeugt werden können. Weiterhin können durch den Einsatz von kultivierten primären Schweißdrüsenzellen Äquivalente mit annährend gleichen Zahlen an Schweißdrüsenzellen erzeugt werden, was ebenfalls eine hohe Standardisierbarkeit sicherstellt.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten handelt es sich um in-vitro Methoden, so dass die aus diesen Verfahrensschritten erhältlichen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente zur Testung von kosmetischen Wirkstoffen verwendet werden können.
Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents als in-vitro-Modell in der Kosmetik und der Körperpflege. Die erfindungsgemäßen Äquivalente können als in-vitro Modell zur Ermittlung des Einflusses von Testsubstanzen auf die Schweißdrüsen im Bereich der Kosmetik und insbesondere der Körperpflege eingesetzt werden. Aufgrund der hohen Standardisierbarkeit sowie der guten Simulation der in-vivo-Situation können die erfindungsgemäßen Äquivalente insbesondere zur Auffindung neuer schweißhemmender Wirkstoffe verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Gegenstands ist daher eine Verwendung zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, insbesondere bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Gegenstands ist die Verwendung des erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents bei der Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe auf ihre Wirksamkeit im Hinblick auf die Hemmung der Schweißsekretion, insbesondere der menschlichen Schweißsekretion.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Verwendungen der erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe sowie zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
Schließlich ist ein letzter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, umfassend ein erfindungsgemäßes dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Systems gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, zu dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie zu den erfindungsgemäßen Verwendungen Gesagte.
Zusammenfassend wird die vorliegende Erfindung insbesondere durch nachfolgende Punkte charakterisiert:

1. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst: a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche beträgt, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche, d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse handelt.
3. Verfahren nach einem der Punkte 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt a) native isolierte Schweißdrüsen vom Menschen, insbesondere native ekkrine und/oder apokrine Schweißdrüsen vom Menschen, verwendet werden.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Schweißdrüsen in Verfahrensschritt a) durch Isolierung nativer Schweißdrüsen,
insbesondere nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen, aus der menschlichen Haut und anschließender Suspendierung der isolierten Schweißdrüsen in Nährmedium erhalten werden.
6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der nativen Schweißdrüsen durch enzymatischen Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Punkte 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Suspendierung der isolierten Schweißdrüsen eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als Nährmedium verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt b) durch Kultivierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, Ablösung von Schweißdrüsenzellen aus dieser Kultur, insbesondere durch schonende Trypsinierung, Kultivierung dieser abgelösten Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen sowie Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen in einem Nährmedium hergestellt wird.
9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kultivierung der abgelösten primären Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen sowie zur Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als Nährmedium verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Punkte 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen für 7 bis 28 Tage, insbesondere für 14 Tage, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Punkte 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der isolierten primären Schweißdrüsenzellen bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 230.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, vorzugsweise 5.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, bevorzugt 5.000 bis 170.000 pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, weiter bevorzugt 5.000 bis 140.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, insbesondere 5.000 bis 132.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, beträgt.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die auf die Zelloberfläche aufzutragende Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 400 bis 4.000 µL, vorzugsweise von 450 bis 3.000 µL, bevorzugt von 480 bis 2.500 µL, insbesondere von 490 bis 2.100 µL, aufweist.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Zellpräparation in Verfahrensschritt c) für einen Zeitraum von 1 bis 25 Tagen, insbesondere von 2 bis 7 Tagen, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt c), insbesondere nach 1 bis 3 Tagen, das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird.
17. Verfahren nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung aus DMEM und Ham´s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als frisches Nährmedium verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents in Verfahrensschritt d) durch Entnahme des Nährmediums erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt d) isolierte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 100 bis 4.000 µm, vorzugsweise von 100 bis 3.000 µm, insbesondere von 200 bis 2.500 µm, aufweist.
20. Verfahren nach einem vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells in Verfahrensschritt e) für einen Zeitraum von 1 bis 6 Tagen bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
21. Dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 18.
22. Verwendung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents nach Punkt 19 als in-vitro-Modell in der Kosmetik und der Körperpflege.
23. Verwendung nach Punkt 22 zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, insbesondere bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
24. Verwendung nach einem der Punkte 22 oder 23 bei der Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe auf ihre Wirksamkeit im Hinblick auf die Hemmung der Schweißsekretion, insbesondere der menschlichen Schweißsekretion.
25. Verwendung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells nach Punkt 19 in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe.
26. Verwendung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents nach Punkt 19 zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
27. System, insbesondere Testsystem, umfassend ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent nach Punkt 19.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiele:
1.1 Isolation der Schweißdrüsen
Die nativen Schweißdrüsen wurden aus humanen Gewebeproben, sogenannten Biopsien gewonnen, welche aus plastischen Operationen von Patienten stammen, die der Verwendung des Materials zu Forschungszwecken zugestimmt haben. Das verwendete Gewebe wurde bei Oberarmstraffungen und Gesichtsstraffungen entnommen. Hieraus wurden die ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen aus dem Achselbereich isoliert.
Hierzu wurde die jeweilige Biopsie in kleine Stücke zerteilt und danach in Stücke von maximal ca. 1 cm × 1 cm geschnitten wurde. Anschließend erfolgte der Verdau der Haut mit einem Gemisch aus gleichen Teilen Collagenase II (5 mg/ml) und Thermolysin (0,25 mg/ml) bei 37 °C im Brutschrank für ca. 3,5 bis 5 Stunden, bis das Bindegewebe fast vollständig verdaut war. Diese Mischung wurde anschließend bei 1200 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen, um die Enzymlösung sowie das überschüssige Fett zu entfernen. Das entstandene Pellet wurde in DMEM-Lösung aufgenommen und die Lösung in eine Petrischale überführt. Anhand einer Mikrokapillare wurden intakte Schweißdrüsen unter einem Binokular isoliert und in frisches DMEM-Medium überführt.
1.2 Kultivieren der isolierten nativen Schweißdrüsen
Die in Schritt 1.1 isolierten Schweißdrüsen wurden in Collagen-I beschichtete Kulturflaschen gegeben und anschließend 25 ml Nährmedium hinzugefügt. Nach Kultivierung für 7 bis 21 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden die auswachsenden Schweißdrüsenzellen abgelöst und auf Collagen-I beschichteten Kulturflaschen erneut bis zur Konfluenz kultiviert (Monolayer-Kultur der primären Schweißdrüsenzellen).

Die Zusammensetzung des eingesetzten Nährmediums ist wie folgt:

Bestandteile des Mediums
DMEM/ Ham´s F12 Nutrient Mix	3:1
Fätales Kälber Serum (FCS)	10 %
EGF	10 ng/ml
Hydrocortison	0,4 µg/ml
Insulin	0,12 UI/ml
Choleratoxin	10^–10 M
Adenin	2,43 g/ml
Gntamicin	25 µg/ml
Penicillin G	100 UI/ml
Triiodothyronin	2·10^–9 M
Ascorbyl-2-phosphat	1 mM

1.3 Herstellung der Zellpräparation und der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente
Die Zellpräparation der primären Schweißdrüsenzellen wird jeweils auf hydrophile neutrale Polymeroberflächen (Ultra Low Attachment Oberfläche der Firma Corning Incorporated, USA) aufgebracht, wobei pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche eine Zellzahl von 5.000 bis 132.000 Zellen sowie ein Volumen der Zellpräparation von jeweils 500 µl (24 well Platte/1,9 cm² pro well) bzw. von jeweils 2.000 µl (6 well Platte/9,5 cm² pro well) pro Well verwendet werden. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt wie zuvor erläutert.
Nach Aufbringung auf die Polymeroberfläche erfolgt die Kultivierung bei 36 bis 38 °C und einem CO₂-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre. Nach 1 bis 3 Tagen wird das Nährmedium in den Wells durch frisches Nährmedium ersetzt. Nach 2 bis 7 Tagen Kultivierung werden die 3D-Schweißdrüsenäquivalente durch Entfernen des Nährmediums isoliert. Ein Teil der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente wurde analysiert, wohingegen ein weiterer Teil für weitere 1 bis 6 Tage in den Vertiefungen der Ernteplatte bei 37 °C und 5 Gew.-% CO₂, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, kultiviert wurde.
1.4 Analyse der dreidimensionalen Schweißdrüsenmodelle

a) Nachweis der tubulären Struktur der dreidimensionalen Schweißdrüsenmodelle sowie der Proteinexpression Zum Nachweis der tubulären Morphologie sowie der Proteinexpression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen wurden Immunfluoreszenzfärbungen an histologischen Schnitten und dem gesamten Objekt („Whole mount“) des 3D-Schweißdrüsenäquivalents durchgeführt. Diese werden nach den Hersteller-Protokollen („Technical Protocols“) mit dem Titel „Microtissue processing for histology“ (No. 006), „Whole mount microtissue staining in GravityTRAP^TM plates“ (No. 008) bzw. einem Standard-Fluoreszenz Protokoll für histologische Schnitte (z.B. vom Hersteller Abcam, Cambridge/UK) durchgeführt. Anschließend wurden die Proben im Fluoreszenz-Mikroskop oder einem Konfokalen Laser Scanning Mikroskop analysiert.
b) Nachweis der Genexpression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen Zum Nachweis der Genexpression Schweißdrüsen-spezifischer Markerproteine wird zunächst die mRNA mithilfe des „RNeasy Micro Kits“ (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert und mittels quantitativer Real-Time-PCR analysiert (Bellas et. al.: „In Vitro 3D Full-Thickness Skin-Equivalent Tissue Model Using Silk and Collagen Biomaterials"; Macromolecular Bioscience, 2012, 12, Seiten 1627–1636).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Lee et, al.; „NCL-SG3: a human eccrine sweat gland cell line that retains the capacity for transepithelial ion transport“; Journal of Cell Science, 1989, 92, Seiten 241 bis 249 [0008]
Li et. al.; „Matrigel basement membrane matrix induces eccrine sweat gland cells to reconstitute sweat gland-like structures in nude mice“; Experimental Cell Research, 2015, 332, Seiten 67 bis 77 [0009]
Bellas et. al.: „In Vitro 3D Full-Thickness Skin-Equivalent Tissue Model Using Silk and Collagen Biomaterials“; Macromolecular Bioscience, 2012, 12, Seiten 1627–1636) [0064]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst: a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf eine hydrophile neutrale Polymeroberfläche, wobei die Zellzahl der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 10.000 bis 500.000 Zellen pro Polymeroberfläche beträgt, und Kultivierung der aufgetragenen Zellpräparation auf dieser Polymeroberfläche, d) Isolierung des in Verfahrensschritts c) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents e) gegebenenfalls Kultivierung des in Verfahrensschritt d) isolierten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse handelt.
Verfahren nach einem der der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 230.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, vorzugsweise 5.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, bevorzugt 5.000 bis 170.000 pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, weiter bevorzugt 5.000 bis 140.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, insbesondere 5.000 bis 132.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die auf die Zelloberfläche aufzutragende Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 400 bis 4.000 µL, vorzugsweise von 450 bis 3.000 µL, bevorzugt von 480 bis 2.500 µL, insbesondere von 490 bis 2.100 µL, aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt d) isolierte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 100 bis 4.000 µm, vorzugsweise von 100 bis 3.000 µm, insbesondere von 200 bis 2.500 µm, aufweist.
Dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verwendung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenmodells nach Anspruch 7 in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe.
Verwendung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents nach Anspruch 7 zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
System, insbesondere Testsystem, umfassend ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent nach Anspruch 7.