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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kontrollpräparat, umfassend in einem Polymerkörper eingeschlossene Zielsequenzen für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Sonden, sowie Verfahren zu deren Gebrauch in der mikrobiologischen Pathologie.
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Hintergrund
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Bakterielle Infektionen zählen zu den zehn häufigsten Todesursachen. Eine schnelle Diagnose und gezielte Therapie sind lebensrettend. Die meisten Infektionen nehmen ihren Ausgang von Biofilmen, sesshaften Lebensgemeinschaften von Mikroorganismen in und auf unserem Körper. Die Genexpression der Biofilme ist deutlich von denen planktonischer oder frei schwimmender Zellen unterscheidbar. Biofilme sind an zahlreichen infektiologischen Krankheitsbildern sowohl als Monospezies-Biofilme (Endokarditis, Protheseninfektionen, Katheterinfektionen) oder Multispezies-Biofilme (orale Biofilme, chronische Wunden, Otitis media) beteiligt. Diese Lebensform bietet den Mikroorganismen entscheidende Vorteile, wie Nahrungsketten innerhalb des Biofilms, erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Antibiotika und Schutz vor Angriffen des Immunsystems. Während Biofilme in vitro extensiv studiert wurden, sind unsere Kenntnisse über in vivo gewachsene, medizinisch relevante Biofilme noch sehr begrenzt, weil Modelle nur unzulänglich die komplexen ökologischen Verhältnisse des menschlichen Körpers darstellen können. In der Routinediagnostik fehlen noch gänzlich Methoden, um diese Biofilme nachzuweisen.
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Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine molekularbiologische Methode, die kulturunabhängig die Visualisierung und Identifikation von Mikroorganismen erlaubt. Das Prinzip der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) beruht auf Oligonukleotidsonden, welche mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind. Diese Sonden binden sequenzabhängig z.B. an die ribosomale RNA der Bakterien. So können die Bakterien nicht nur in ihrem natürlichen Habitat visualisiert, sondern auch identifiziert werden. Durch die Kombination spezifischer Sonden mit verschiedenen Fluoreszenz-Markierungen sind auch mehrere Populationen simultan darstellbar (Multiplex-FISH). Durch Einbettung von Gewebsproben in Kunstharz konnte die FISH von Gewebsschnitten etabliert werden. Dies ermöglicht es, die Anzahl, räumliche Verteilung und Bakterium-Wirt Interaktionen auch nicht kultivierbarer Bakterien in ihrem natürlichen Habitat zu analysieren. FISH ist ein ideales Instrument für die Analyse von Biofilmen.
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Durch Entwicklung geeigneter Sonden-Panels können Infektionen mittels FISH diagnostiziert werden. Hierfür sind aufeinander abgestimmte Fixier-, Einbettungs- und Hybridisierungsverfahren notwendig.
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Da die Spezifität der Oligonukleotidsonden unabdingbare Voraussetzung für den Einsatz der FISH für die Diagnostik ist, und zum Teil Sequenzen mit nur einer Mismatch-Position an der Sondenbindungsstelle diskriminiert werden müssen, sind Positiv- und Negativ-Kontrollen zwingend bei jeder Hybridisierung mitzuführen.
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Solche Kontrollen werden gewöhnlich in Fixierlösung fixiert und dann bei –20°C gelagert. Dieses Vorgehen steht allerdings der kommerziellen Verbreitung von standardisierten Kontrollpräparaten mit der für Routineanwendungen vorauszusetzenden, kontrollierten Qualität entgegen.
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Zurzeit muss der Anwender die entsprechenden Kontrollstämme kulturell vorhalten. Dies ist insbesondere für Anwender in der Pathologie kaum oder gar nicht realisierbar, ganz besonders, wenn die Kontrollen FISH-Sonden für die schwer kultivierbare orale Flora betreffen, die langsam wachsen (Anaerobier) und auch in gut ausgestatteten mikrobiologischen Laboren unmöglich routinemäßig vorgehalten werden können. Weiterhin ist der rRNA Gehalt der verwendeten Proben oft unbestimmt und nicht standardisiert (unterschiedliche Kulturbedingungen), was die Interpretation der Ergebnisse zwischen einzelnen Labors erschwert.
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Darüber hinaus sind so gewonnene Kontrollpräparate wegen der Instabilität der rRNA nicht lange einsatzfähig und müssen immer wieder generiert werden, was wiederum die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt. Beim Versand solcher Kontrollpräparate muss die Kühlkette eingehalten werden.
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Ausgehend vom vorstehend geschilderten Stand der Technik ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustellen, welche die routinemäßige Durchführung und insbesondere die Kontrolle der durchgeführten Untersuchungen durch geeignete Kontrollpräparate ermöglichen. Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst.
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Erfindungsgemäß wird gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung ein Kontrollpräparat zur Verwendung in einem Verfahren zur Detektion eines Ziel-Mikroorganismus in der mikrobiologischen Pathologie zur Verfügung gestellt. Das Kontrollpräparat umfasst eine Mehrzahl von durch ein Verbundpolymer verbundenen Schnittkörpern, wobei jeder Schnittkörper ein Matrixpolymer umfasst, und wobei ein erster Schnittkörper eine erste Nukleinsäuresequenz umfasst, welche 100% identisch mit einer Nukleinsäuresequenz des Ziel-Mikroorganismus ist. Die erste Nukleinsäuresequenz ist also zu 100% revers komplementär identisch zu einer Nukleinsäuresequenz, die zur Detektion des Ziel-Mikroorganismus verwendbar ist (z.B. einer FISH-Sonde), und kann unter stringenten Bedingungen an diese FISH-Sonde binden, während eine nur an ein, zwei, drei oder maximal vier Positionen nicht identische Sonde nicht gebunden werden würde.
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Ein zweiter, ebenfalls in dem Kontrollpräparat umfasster Schnittkörper enthält eine zweite Nukleinsäuresequenz, welche fast, aber nicht zu 100% identisch mit einer Nukleinsäuresequenz des Ziel-Mikroorganismus ist. Typischerweise beträgt die Differenz zur revers-komplementären Nukleinsäuresequenz des Ziel-Mikroorganismus (bzw. zur ersten Nukleinsäuresequenz des ersten Schnittkörpers) eine, zwei, drei oder maximal vier Positionen, an denen die zweite Nukleinsäuresequenz eine Deletion, eine zusätzliche oder eine unterschiedliche Base aufweist. Die zweite Nukleinsäuresequenz ist also bis auf ein zwei, drei oder maximal vier nicht hybridisierende Positionen revers komplementär identisch zu einer Nukleinsäuresequenz, die zur Detektion des Ziel-Mikroorganismus verwendbar ist (der im vorherigen Absatz genannten FISH-Sonde).
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Der erste Schnittkörper dient somit als „Positivkontrolle“, während der zweite Schnittkörper als Negativ- oder Spezifitätskontrolle dient. Die verwendete Sonde, welche spezifisch für eine in dem Mikroorganismus vorkommende DNA- oder RNA-Sequenz ist, sollte eine Bindung an den ersten Schnittkörper zeigen, aber nicht an den zweiten (sonst wären die Bindungsbedingungen unspezifisch gewesen).
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Nukleinsäuresequenzen werden in der vorliegenden Anmeldung, soweit nicht anders angegeben, in der konventionellen Schreibweise der Biologen von 5’ (links) nach 3’ (rechts) angegeben. Wenn eine Sequenz A als „revers komplementär“ zu einer Sequenz B bezeichnet wird, bedeutet dies, dass sie perfekt hybridisieren können, dass also jede Basenposition von A vom 5’ Ende die komplementär gepaarte Base (A paart mit T bzw. U und G paart mit C) der Sequenz B vom 3’ Ende entspricht.
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Beispiele für revers komplementäre Sequenzen sind ATC und GAT. Die direkt (nicht revers!) komplementäre Sequenz zu ATC ist TAG.
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In der vorliegenden Anmeldung wird der Begriff Identität oder Sequenzidentität bzw. Prozent Sequenzidentität als Maß des mathematischen Sequenzvergleichs („Alignment“) zweier Sequenzen. Verfahren zum Sequenzvergleich sind der Fachwelt gut bekannt und können zum Beispiel mit dem lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Watermann durchgeführt werden (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)). Ebenso kann der globale Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)) oder das Verfahren von Pearson und Lipman (Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988)) verwendet werden. Beispielhafte computerbasierte Implementierungen dieser Verfahren sind CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA.
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Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich Identitätswerte in der vorliegenden Beschreibung auf Werte, welche mit dem BLAST Programmpaket unter Verwendung der Standardparameter erhalten wurden (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990)). Dieses Programm ist öffentlich erhältlich (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung weisen die erste und zweite Nukleinsäuresequenz jeweils unabhängig voneinander eine Länge von 12–30 Nukleotiden auf. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen sind die erste und zweite Nukleinsäuresequenz jeweils unabhängig voneinander in einer längeren Sequenz umfasst.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung sind die erste und zweite Nukleinsäuresequenz jeweils unabhängig voneinander DNA oder RNA-Oligonukleotide oder RNA-Analoga (z.B. 2’-O-Methyl-RNA; LNA („locked“ nucleic acids, in denen das 2’-O und das 4’-C über eine kovalente Bindung verbrückt sind); PNA („peptide nucleic acids“, durch eine Peptidkette verbundene Basenbausteine); BNA (durch eine Aminoethylengruppe zwischen 2’-O und 4’-C verbrückte Riboseanaloga); Morpholino-RNA und dem Fachmann bekannte Äquivalente dieser Bausteine, sowie Mischungen davon).
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung umfassen die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sonden jeweils unabhängig voneinander DNA oder RNA-Oligonukleotide oder RNA-Analoga (z.B. 2’-O-Methyl-RNA; LNA („locked“ nucleic acids, in denen das 2’-O und das 4’-C über eine kovalente Bindung verbrückt sind); PNA („peptide nucleic acids“, durch eine Peptidkette verbundene Basenbausteine); BNA (durch eine Aminoethylengruppe zwischen 2’-O und 4’-C verbrückte Riboseanaloga); Morpholino-RNA und dem Fachmann bekannte Äquivalente dieser Bausteine, sowie Mischungen davon).
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung ist die erste Nukleinsäuresequenz eine für den zu detektierenden Mikroorganismus spezifische RNA-Sequenz; typischerweise eine 16S rRNA-, 23S rRNA-, 18S rRNA-, ISR(Intergenic spacer region)-Region- oder mRNA-Sequenz oder ein Teil davon.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung liegen die Nukleinsäuresequenzen auf Partikeln oder in Kompartimenten von 0,1 µm bis 30 µm Größe vor. Dies führt dazu, dass die bei Hybridisierung einer FISH-Sonde erzeugten Fluoreszenzsignale an einzelnen Orten räumlich gebündelt vorliegen und leichter detektierbar sind. Bevorzugt sind Partikel oder Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind Zellen des Mikroorganismus selbst, also Zellen, in denen die Nukleotidsequenz z.B. als Ribosomen vorliegt.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung umfasst jeder Schnittkörper eine Vielzahl von in das Matrixpolymer eingebetteten Individuen genau eines Mikroorganismus, wobei die erste Nukleinsäuresequenz in dem Mikroorganismus des ersten Schnittkörpers und die zweite Nukleinsäuresequenz in dem Mikroorganismus des zweiten Schnittkörpers umfasst ist. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Nukleinsäuresequenzen als Teil von in das Matrixpolymer eingebetteten Mikroorganismen vor, insbesondere als ribosomale RNA der Mikroorganismen. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Ausführungsformen, in welchen die erste (NAS1) bzw. zweite Nukleinsäuresequenz (NAS2) aus folgender Tabelle entnommen sind:
Tabelle 1
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen umfasst eine Zusammenstellung von Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens (Kit) die folgenden Sequenzen:
- a. eine erste Nukleotidsequenz umfassend eine in Tabelle 1 als NAS 1 bezeichnete Sequenz (Positivkontrolle)
- b. eine zweite Nukleotidsequenz umfassend die in Tabelle 1 der im vorhergehenden Absatz genannten NAS1 zugeordnete, als NAS 2 bezeichnete Sequenz (Negativ/Spezifitätskontrolle)
- c. eine zu der in a. bezeichneten ersten Nukleotidsequenz vollkommen revers komplementäre fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde.
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In bestimmten Ausführungsformen sind die unter a. und b. genannten Sequenzen als Teil einer bakteriellen RNA umfasst. In bestimmten Ausführungsformen sind die unter a. und b. genannten Sequenzen DNA oder Analoga, dann können die als U (Uracil) bezeichneten Positionen als T (Thymidin) ausgebildet sein.
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In bestimmten Ausführungsformen ist die unter c. genannte Sonde ein DNA-Oligomer oder ein Oligomer umfassend oder bestehend aus DNA-Basenanaloga.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung weisen das Verbundpolymer und das Matrixpolymer einen gemeinsamen Monomerbaustein auf. Dies erhöht die chemische Verbindung der beiden und erleichtert den letztlich gemeinsamen Schnitt als Präparat.
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Gemäß verschiedener bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung werden das Verbundpolymer und das Matrixpolymer aus im Wesentlichen denselben Monomerbausteinen hergestellt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen sowohl Verbundpolymer als auch das Matrixpolymer Polymethacrylsäurealkylester (oder bestehen im Wesentlichen daraus), insbesondere Polymethylmethacrylat. Dieses Polymer ist in der Histologie wohl bekannt und von trainiertem Personal ohne weiteres zur Anfertigung von Schnittpräparaten verwendbar. Es eignet sich gut für die Verwendung mit FISH-Sonden.
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Gemäß verschiedener bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung ist das Kontrollpräparat auf einem mikroskopischen Probenhalter angeordnet, und jeder Schnittkörper innerhalb des Kontrollpräparates ist so angeordnet, dass die Identität des Schnittkörpers durch seine Position relativ
- a. zur Form des Kontrollpräparats
- b. zur Form des Probenhalters und/oder
- c. zu einem auf dem Probenhalter angeordneten Bezugspunkt eindeutig bestimmt werden kann.
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Diese Anordnung erleichtert es, Fehler in der Positionierung zu vermeiden, welche letztlich zu einer irrtümlichen Zuordnung des Messergebnisses führen könnten.
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Besonders bevorzugt sind Quader, die an einer Seite spitz zulaufen, um das Schneiden am Mikrotom zu erleichtern.
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Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion eines Ziel-Mikroorganismus in einem Gewebepräparat zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
Das Gewebepräparat wird mit einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht. Die Oligonukleotidsonde ist für den Ziel-Mikroorganismus spezifisch und hybridisiert an eine darin umfasste Nukleotidsequenz unter Bedingungen, welche eine Bindung der Oligonukleotidsonde an eine auf allen Positionen revers komplementäre Zielsequenz erlaubt, aber die Bindung der Oligonukleotidsonde an eine auf ein, zwei, drei oder maximal vier Positionen von ihrer revers komplementären Sequenz abweichenden Sequenz verhindert.
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Die im vorherigen Schritt verwendete, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotidsonde wird in einem weiteren Schritt zur (Positiv-)Kontrolle mit einem Kontrollpräparat gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bzw. einer seiner genannten Ausführungsformen in Kontakt gebracht. Die erste Nukleotidsequenz des ersten Schnittkörpers des Kontrollpräparates ist dabei zu 100% revers komplementär identisch mit der Sequenz der Oligonukleotidsonde, d.h. die Nukleotidsequenz der Sonde ist so gewählt, dass sie genau mit der Nukleotidsequenz des zu detektierenden Mikroorganismus hybridisiert. Die zweite Nukleotidsequenz des zweiten Schnittkörpers ist so gewählt, dass sie gegenüber der revers komplementären Sequenz der Oligonukleotidsonde an ein bis vier Positionen eine Deletion, eine zusätzliche oder eine unterschiedliche Base aufweist. Sie passt also nicht perfekt und wird unter Bedingungen, die zur Bindung eine Hybridisierung ohne Mismatches verlangen, keine Bindung der Oligonukleotidsonde an das Kontrollpräparat zeigen (Negativ- bzw. Spezifitätskontrolle).
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Nach Durchführung der genannten Schritte erfolgt eine optische Auswertung. Dabei wird die Anwesenheit des Ziel-Mikroorganismus in der Probe detektiert, wenn eine Bindung der Oligonukleotidsonde an die Zielsequenz im ersten Schritt und eine Bindung der Oligonukleotidsonde an die erste Nukleotidsequenz (Positivkontrolle) und die Abwesenheit von Bindung an die zweite Nukleotidsequenz (Negativkontrolle) im zweiten Schritt erfolgt.
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Durch die Mischung von Oligonukleotidsonden, welche mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, lassen sich gleichzeitig mehrere Spezies oder Genera von Mikroorganismen detektieren.
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Folgende Fluoreszenzfarbstoffe werden bevorzugt benutzt:
FITC, Cyanin 3 und Cyanin 5. Je nach Ausstattung des Mikroskops mit passenden Fluoreszenz-Filtersätzen können 2 oder 3 Oligonukleotidsonden und zusätzlich der Nukleinsäurefarbstoff DAPI kombiniert werden.
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Gemäß verschiedener bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Auswertung automatisiert.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung wird das vorstehend beschriebene Verfahren dazu verwendet, um die Anwesenheit eines ersten und eines zweiten Ziel-Mikroorganismus verschiedener Spezies der selben Gattung in einem Gewebepräparat zu detektieren bzw. zu diskriminieren. Dabei werden jeweils für jeden ersten und zweiten (und ggf. dritten, vierten u.s.f.) Mikroorganismus eine spezifische Oligonukleotidsonde verwendet, die für den jeweiligen Erreger spezifisch ist, und idealerweise wird im Kontrollpräparat die jeweilige Positivkontrolle mit einer Negativkontrolle so gepaart, dass sich für jeweils zwei nah verwandte Erreger die Positivkontrolle und die Negativkontrolle gegenseitig komplementieren. Somit wird eine erste Oligonukleotidsonde verwendet, welche für den ersten Ziel-Mikroorganismus spezifisch ist, und welche mit der ersten Nukleotidsequenz des ersten Schnittkörpers zu 100% revers komplementär identisch ist, und es wird eine zweite Oligonukleotidsonde verwendet, welche für den zweiten Ziel-Mikroorganismus spezifisch ist, und welche mit der zweiten Nukleotidsequenz des ersten Schnittkörpers zu 100% revers komplementär identisch ist.
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Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden dabei folgende Paarungen: Tabelle 2: Exemplarisches Beispiel:
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Die revers-komplementären Sequenzen der vorstehend gegebenen Sondensequenzen werden jeweils als erste und zweite Nukleinsäuresequenz des Kontrollpräparates verwendet, ganz besonders bevorzugt als Teil der in den jeweiligen Spezies enthaltenen 16S-RNA, wobei Zellen der Spezies im Kontrollpräparat eingegossen und fixiert werden.
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Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine Reagenzienzusammenstellung (Kit) zur Anwendung in einem Verfahren zur Detektion eines Ziel-Mikroorganismus in einem Gewebepräparat zur Verfügung gestellt. Dieses Kit umfasst die folgenden Komponenten:
- – Eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde gemäß den in den vorstehenden Aspekten bereits erläuterten Spezifikationen. Die Oligonukleotidsonde bindet spezifisch an den Ziel-Mikroorganismus unter Bedingungen, welche eine Bindung der Oligonukleotidsonde an eine auf allen Positionen revers komplementäre Zielsequenz erlaubt, aber die Bindung der Oligonukleotidsonde an eine auf ein bis vier Positionen von ihrer revers komplementären Sequenz abweichenden Sequenz verhindert. Mit anderen Worten ist dies eine zur Detektion des Ziel-Mikroorganismus verwendbare FISH-Sonde einer Länge von 12 bis 30 Nukleotiden, welche zu 100% revers komplementär identisch zur ersten Nukleinsäuresequenz des Kontrollpräparats ist.
- – Eine fluoreszenzmarkierten nonsense-Oligonukleotidsonde, welche unter den im vorstehenden Absatz genannten Bedingungen nicht an die DNA oder RNA(irgend-)eines bekannten Mikroorganismus bindet. Diese nonsense-Sonde dient zur Kontrolle, ob die Bedingungen oder die Natur des Präparates zu einer unspezifischen Bindung von Polynukleotiden an das Präparat führen. Bevorzugt werden hier Kontrollen verwendet, welche die selbe Basenzusammensetzung aufweisen wie die eigentliche Sonde. Diese Zusammensetzung wird z.B. dadurch erreicht, dass als nonsense-Sonde die in 5’ nach 3’ komplementäre (nicht revers komplementäre) Sequenz verwendet wird. Dies wäre z.B. für eine Sonde ATG die Sequenz TAC (die Sonden der Erfindung sind länger, aber das Prinzip ist bereits an dieser Sequenz demonstrierbar).
- – Ein Kontrollpräparat gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder einer seiner bevorzugten Ausführungsformen. Dieses umfasst eine erste Nukleotidsequenz des ersten Schnittkörpers, welche mit der Oligonukleotidsonde unter den in a genannten Bedingungen hybridisiert (100% revers komplementär identisch ist) und eine zweite Nukleotidsequenz des zweiten Schnittkörpers, welche mit der Oligonukleotidsonde unter den in a genannten Bedingungen nicht hybridisiert.
- – Optional enthält das Kit weitere Kontrollen; insbesondere ist dabei von Bedeutung:
– ein unspezifisch Polynukleotide bindender Fluoreszenzfarbstoff, bevorzugt 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI);
– eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde, welche eine 16S-RNA Konsensussequenz detektiert, welche in der überwiegenden Mehrheit aller Bakterien enthalten ist („panbakterielle Sonde“) und dazu dient, die Anwesenheit von Bakterien ohne weitere Gattungs- oder Speziesspezifität zu detektieren;
– eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde, welche eine 16S-RNA Konsensussequenz detektiert, welche in allen Spezies einer Gattung enthalten ist und dazu dient, die Anwesenheit von Bakterien einer Gattung ohne Speziesspezifität zu detektieren.
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Gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung ist das Kit zur Anwendung in einem Verfahren zur Detektion und Diskriminierung eines ersten und eines zweiten Ziel-Mikroorganismus verschiedener Spezies der selben Gattung in einem Gewebepräparat konzipiert. Es umfasst dabei eine erste fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde (im Weiteren: „erste Sonde“), wobei die erste Sonde für den ersten Ziel-Mikroorganismus unter Bedingungen spezifisch ist, welche eine Bindung der Sonde an eine auf allen Positionen revers komplementäre Zielsequenz erlaubt, aber die Bindung der Sonde an eine auf ein, zwei, drei oder vier Positionen von ihrer revers komplementären Sequenz abweichenden Sequenz verhindert. Weiterhin ist eine fluoreszenzmarkierte zweite Oligonukleotidsonde (im Weiteren: „zweite Sonde“) enthalten, wobei die zweite Sonde für den zweiten Ziel-Mikroorganismus unter den unter genannten Bedingungen spezifisch ist.
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Optional ist wiederum eine fluoreszenzmarkierte nonsense-Oligonukleotidsonde oder panbakterielle Sonde enthalten.
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Ebenfalls ist im erfindungsgemäßen Kit ein erfindungsgemäßes Kontrollpräparat umfasst, welches die folgenden Elemente enthält:
- i. eine erste Nukleotidsequenz des ersten Schnittkörpers, welche mit der ersten Oligonukleotidsonde unter den in a. i. genannten Bedingungen hybridisiert (100% revers komplementär identisch ist) und welche mit der zweiten Oligonukleotidsonde unter den in a. i. genannten Bedingungen nicht hybridisiert;
- ii. eine zweite Nukleotidsequenz des zweiten Schnittkörpers, welche nicht mit der ersten Oligonukleotidsonde, aber mit der zweiten Oligonukleotidsonde unter den in a. i. genannten Bedingungen hybridisiert;
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Gemäß besonders bevorzugter Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Kit die folgenden Sequenzen:
- a. eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonde:
- b. eine erste Nukleotidsequenz (Positivkontrolle)
- c. eine zweite Nukleotidsequenz (Negativ/Spezifitätskontrolle)
- d. eine Eubakteriensonde (S1)
- e. gattungsspezifische Sonden (S4, S8, S10, S16, S17 und/oder S18)
- f. spezies-Spezifische Sonden (S5, S6, S7, S9, S11, S12, S13, S14 und/oder S15)
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Die Kontrollpräparate und FISH-Kits der vorliegenden Erfindung machen Biofilme erstmals routinemäßig mikroskopisch sicht- und nachweisbar. Die an der Infektion beteiligten Bakterien können damit aufgespürt und identifiziert werden, was die Einleitung einer schnellen, spezifischen Therapie ermöglicht.
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Vorteile der erfindungsgemäßen Lösung gegenüber dem Stand der Technik sind unter anderem, dass die Kontrollpräparate als Objektträger in Standardmaßen mit einer kommerziellen, auf die jeweilige Anwendung optimierten Zusammenstellung von Reagenzien (Kit) geliefert werden können. Die Kontrollpräparate sind Temperatur- und lagerungsstabil (bis zu 3 Jahre), benötigen keine Kühlung und vermeiden ein aufwändiges Kultivieren von Bakterienstämmen beim Anwender.
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Auf Verfahrensebene machen die erfindungsgemäßen Kontrollpräparate die Signalintensität in der FISH kontrollierbar und vermeiden die Abhängigkeit der Arbeitsqualität von der ausführenden Person. Sie erlauben darüber hinaus einen rationelleren Einsatz von Reagenzien, da in einem Schnitt mehrere Bakterienspezies gleichzeitig hybridisiert werden, und führen zu einer Zeitersparnis bei der Auswertung, z.B. beim Mikroskopieren, da auf einem Objektträger alle Kontrollen Platz finden. Auch erleichtern sie eine Automatisierung des Hybridisierungs- und Auswertungsvorgangs.
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Die erfindungsgemäßen Kontrollpräparate verhindern Fehler des Anwenders beim Mikroskopieren durch eindeutige Zuordnung der Bakterienspezies im asymmetrischen Schnitt (keine Verwechslung beim Pipettieren möglich).
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Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele und Figuren illustriert. Diese sollen die Erfindung nicht beschränken.
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Kurze Figurenbeschreibung
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1 zeigt schematisch den Aufbau des Kontrollpräparates
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2 zeigt schematisch die Aufsicht auf einen Schnitt des Kontrollpräparates
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3 zeigt einen möglichen Verfahrensablauf zur Detektion von kardiologisch relevanten Mikroorganismen
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4 zeigt einen möglichen Verfahrensablauf zur Detektion von Mikroorganismen mit Relevanz im Oralbereich
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Beispiele
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Die vorliegende Erfindung zeigt beispielhaft FISH Kits für die Diagnostik der Endokarditis und Peri-Implantitis.
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Herz-Kit
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Das beispielhafte „Herz-Kit“ ermöglicht die Diagnose von lebensbedrohlichen Herzinfektionen wie z. B. der Endokarditis und die Empfehlung einer spezifischen Antibiotikatherapie bei Herzklappenoperationen.
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Das FISH-Sonden-Panel des Beispiels detektiert entsprechend den aktuellen ESC Guidelines 95% der typischen Endokarditis-Erreger auch in Kultur-negativen Herzklappen (Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken und Candida). Tabelle 3; Sondensequenzen des Herz-Kits
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Folgende Kombinationen von zwei oder drei Sonden werden bevorzugt eingesetzt: Tabelle 4, Herz Kit Zusammenstellung
| | Sequenz ID | 5‘-Fluoreszenzfarbstoff | Zum Nachweis von |
| Cardio Mix 1 | S1
S3 | Cy3
FITC | Bakterien |
| | | | |
| Cardio Mix 2 | S6
S7 | Cy3
FITC | Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium |
| | | | |
| Cardio Mix 3 | S4
S8 | Cy3
FITC | Staphylococcus spp.
Streptococcus spp. |
| | | | |
| Cardio Mix 4 | S9
S10 | Cy3
FITC | Tropheryma whipplei
Candida spp. |
| | | | |
| Cardio Mix 5 | S5
S4 | Cy3
FITC | Staphylococcus aureus
Staphylococcus spp. |
| | | | |
| Cardio Mix 6 | S4
S8
S1 | Cy3
FITC
Cy5 | Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Bakterien |
| | | | |
| Cardio Mix 7 | S6
S7
S1 | Cy3
FITC
Cy5 | Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Bakterien |
| | | | |
| Cardio Mix 8 | S1
S10
S3 | Cy3
FITC
Cy5 | Bakterien
Candida spp. |
| | | | |
| Cardio Mix 9 | S5
S4
S1 | Cy3
FITC
Cy5 | Staphylococcus aureus
Staphylococcus spp.
Bakterien |
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Das Konzept des Endokarditis-Kits für ein Mikroskop mit Filtersätzen für FITC, Cy3 und DAPI ist in 3 schematisch gezeigt.
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Kit: Seltene Erreger im Herzen
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Daneben haben wir ein FISH-Sonden-Panel für seltene Endokarditiserreger entwickelt, wie Tropheryma whipplei, Bartonella spp., Propionibacterium spp., Lactobacillus spp. und Aerococcus spp.. Eine weitere Komponente der Kits ist das Reagenz zum Aufschluss der Mikroorganismen und zur Gewebegängigkeit der FISH-Sonden. Beides ist eine Voraussetzung für die erfolgreiche FISH auf Herzklappen.
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Oral-Kit
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Das beispielhafte „Oral-Kit“ ermöglicht die Erkennung von Erregern bei der Volkskrankheit Parodontitis und Periimplantitis (Infektion von Zahnimplantaten).
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Der Schwerpunkt des beispielhaften Kits liegt auf dem Nachweis von schwer oder nicht kultivierbaren Erregern oraler Biofilme. Das Panel an Sonden für die typischen Parodontitis-Erreger wird in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle 5; Sondensequenzen des Oral-Kits
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Folgende Kombinationen werden bevorzugt eingesetzt: Tabelle 6, Oral Kit Zusammenstellung
| | Sequenz ID | 5‘-Fluoreszenzfarbstoff | Zum Nachweis von |
| Oral Mix 1 | S1
S3 | Cy3
FITC | Bakterien
--- |
| | | | |
| Oral Mix 2 | S17
S10 | Cy3
FITC | Actinomyces spp.
Candida spp. |
| | | | |
| Oral Mix 3 | S11
S8 | Cy3
FITC | Filifactor alocis
Streptococcus spp. |
| | | | |
| Oral Mix 4 | S16
S12 | Cy3
FITC | Fusobacterium spp.
Tannerella forsythia. |
| | | | |
| Oral Mix 5 | S13
S14 | Cy3
FITC | Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia |
| | | | |
| Oral Mix 6 | S15
S18 | Cy3
FITC | Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Treponema spp. |
| Oral Mix 7 | S1
S8
S3 | Cy3
FITC
Cy5 | Bakterien
Streptococcus spp.
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| Oral Mix 8 | S17
S10
S3 | Cy3
FITC
Cy5 | Actinomyces spp.
Candida spp.
-- |
| | | | |
| Oral Mix 9 | S16
S13
S12 | Cy3
FITC
Cy5 | Fusobacterium spp.
Porphyromonas gingivalis
Tannerella forsythia. |
| | | | |
| Oral Mix 10 | S11
S4
S1 | Cy3
FITC
Cy5 | Filifactor alocis
Staphylococcus spp.
Bakterien |
| | | | |
| Oral Mix 11 | S18
S14
S15 | Cy3
FITC
Cy5 | Treponema spp.
Prevotella intermedia
Aggregatibacter actinomycetemcomitans |
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Die Tabelle umfasst insbesondere Erreger, die durch PCR bei Parodontitis nachgewiesen werden und deren Detektion in Zahnarztpraxen etabliert ist, so z. B. Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, A. actinomycetemcomitans, Filifactor alocis und Treponema spp.. Dabei kann der Diagnostiker im Biofilm die Anteile der Bakterienspezies und deren räumliche Verteilung beurteilen und so die Leitkeime identifizieren, sowie den bisherigen Therapieerfolg beurteilen.
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Das Oral-Kit ist sowohl auf histologischen Gewebsschnitten als auch auf Zahnplaque anwendbar. Das Kit weist die klassischen Parodontitis-Keime nach, ebenso wie Candida und Actinomyceten, die eine therapieentscheidende Rolle bei der Periimplantitis haben. Auch hier muss ein Mix eine Nonsense-Sonde enthalten zur Erleichterung der Interpretation der Ergebnisse. Sondenbindungseigenschaften, Hybridisierungspuffer und die Fluoreszenz-Farbstoffmarkierungen der einzelnen Sonden bedingen verschiedene Sondenkombinationen in mehreren Mixen.
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Das Konzept des Oral-Kits für ein Mikroskop mit Filtersätzen für FITC, Cy3 und DAPI ist in 4 schematisch gezeigt.
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Herstellung der Kontrollpräparate
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Für die Kontrollen werden die entsprechenden Bakterienkulturen in Kunstharz eingegossen und Schnitte hergestellt.
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Das Kunstharz ist für die Einbettung deshalb geeignet, weil der Hybridisierungs-Mix (inkl. FISH-Sonden) ungehindert in das Material eindringt und die Hybridisierungsbedingungen so gewählt werden können, dass eine problemlose Anlagerung der Sonden an die bakterielle rRNA gewährleistet ist.
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Um Material, Reagenzien und Zeit zu sparen, werden mehrere kleine Blöckchen mit Bakterienspezies hergestellt, die dann ich einem gemeinsamen Blöckchen zusammengestellt und eingegossen werden, so dass pro Schnitt mehrere Kontrollen gleichzeitig untersucht werden können.
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Arbeitsschritte
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Die Bakterienkulturen werden in der exponentiellen Phase abzentrifugiert und laut Protokoll durch die einzelnen Einbettungsschritte von Technovit 8100 (Heraeus Kulzer GmbH, 61273 Wehrheim) geführt, wobei bei jedem Lösungswechsel das Bakterienpellet weitergeführt wird.
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Im letzten Schritt wird die Methacrylatlösung mit dem Härter in kleine, ca 0,5 × 0,5 × 0,4 cm große Einbettformen gegossen.
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Die ausgehärteten Zylinder mit Bakterien werden danach gemeinsam wieder in ein größeres (1,0 × 0,8 × 0,4 cm) Blöckchen eingegossen und geschnitten. Arbeitsschritte und -Reagenzien
| | | T | Dauer |
| Fixierung des Materials | Formaldehyd (37%) 1:10 in PBS pH 7.4 | 4°C | 1h–3 Tage, je nach Größe der Probe |
| Vorbereitung des Objektträgers | Auftropfen der Probe oder Aufziehen eines Gewebsschnittes | | |
| Trocknen | | 30°C | |
| Entwässerung | nur für getropfte Proben:
Aufsteigende Ethanolreihe 50%, 80%, 100% | RT | je 3min |
| Zellaufschluss 1 | Lysozym
1mg/ml in Aqua dest
20 µl auftropfen | 30°C | 10 min |
| Zellaufschluss 2 | Lysostaphin 1 mg/ml in 0,01M Tris-HCl,
pH 8,0
10 µl zugeben | 30°C | 5 min |
| Abspülen | Aqua dest | | 5 s |
| Trocknen | | 30°C | |
| Hybridisierung | Objektträger
+ FISH Sondenmixe
1M Tris HCl
5M NaCl
Formamid
SDS
H2O
DAPI
FISH Sonde 1, 1 pmol/ml
FISH Sonde 2, 1 pmol/ml
Hybridisierung in dunkler, feuchter
Kammer | 50°C 50°C 52°C | 1,5h |
| Abspülen | Aqua dest | | 5s |
| Trocknen | | 30°C | |
| Eindecken | 1 Tropfen des Eindeckmediums
(Vectashield)
Auflegen des Deckgläschens | | Lagerung bis zur Auswertung 4°C |
| Mikroskopie | Epifluoreszenzmikroskopie mit Schmalband Filtersätzen für
DAPI, FITC, Cy3, Cy5 | | |
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) [0015]
- J. Mol. Biol. 48:443 (1970) [0015]
- Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) [0015]
- Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990) [0016]
- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ [0016]
