DE102013215666A1 - Verfahren zum Sequenzieren von Biopolymeren - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine entsprechende Anordnung zum Sequenzieren mindestens zweier Biopolymere (6), wobei zu jedem Biopolymer (6) ein Sequenzsignal durch einen jeweiligen Messgrößenaufnehmer in Abhängigkeit von der Sequenz des Biopolymers (6) aufgenommen wird, die Sequenzsignale in ein Schieberegister (16) übertragen und dort zwischengespeichert werden, die zwischengespeicherten Sequenzsignale aus dem Schieberegister (16) sequentiell in eine Auswerteeinrichtung (26) übertragen und dort ausgewertet werden. Jedes Sequenzsignal wird dabei bevorzugt mittels einer Nanoporenanordnung (10) erzeugt. In einer entsprechenden Sequenzieranordnung (11) sind die Messgrößenaufnehmer und das Schieberegister (16) vorzugsweise in eine elektrische Schaltung, also z.B. auf einem Sensor-Array, integriert. Jedes Sequenzsignal kann dabei vor dem Übertragen in das Schieberegister (16) von einem Vorverstärker (14) verstärkt werden. Das Übertragen des Ausgangssignals (A) an die Auswerteeinrichtung (24) kann das Verstärken des Signals durch einen Ausgangsverstärker (24) und/oder mindestens einer EMCCD-Stufe (32) umfassen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens zweier Biopolymere.
  • Bei der Sequenzierung eines Biopolymers, z.B. einer Nukleinsäure oder eines Proteins, kann die Sequenz der einzelnen Bausteine des Biopolymers, also die Nukleotidsequenz (oder Basensequenz) oder die Aminosäurensequenz analysiert werden.
  • Bei der Seqeunzierung z.B. mithilfe von Nanoporen passiert das Biopolymer eine biologische oder künstliche Nanopore. Einzelne Bausteine des Biopolymers können durch eine Veränderung des Porenwiderstands beim Passieren mittels der Nanopore analysiert werden. Beim Passieren der Nanopore von unterschiedlichen Bausteinen ändert sich z.B. ein Strom, der durch die Nanopore geleitet wird. Diese Änderung ist abhängig von dem Baustein, welche die Pore passiert, so dass z.B. ein einzelnes Nukleotid detektiert und z.B. die Sequenz der Nukleinsäure ermittelt werden kann.
  • Alternativ kann ein Tunnelstrom in der Nanopore, der nur bei Passieren des Biopolymers auftritt, gemessen werden, wobei die Stromstärke des Tunnelstroms abhängig ist von z.B. dem Nukleotid oder der Aminosäure, welche sich in der Nanopore befindet.
  • Die Schwierigkeit z.B. bei der Messung dieses Tunnelstromes ergibt sich aus seiner geringen Stärke im Nanoampere-Bereich, sowie der relativ hohen Kapazität der Tunnelelektroden. Diese Kapazität entsteht durch parasitäre Kapazitäten zum Silizium eines Siliziumwafers, auf welchem die Nanoporenstruktur angeordnet sein kann, sowie zur umgebenden Flüssigkeit, die in direktem Kontakt zu den Elektroden steht. Zur Messung des Tunnelstroms sind somit Vorverstärker mit Stromeingang vonnöten, die eine relativ hohe Eingangskapazität vertragen (M. Carminati, G. Ferrari, M. Sampietro, A. P. Ivanov, T. Albrecht: „Low-Noise Dual-Channel Current Amplifier for DNA Sensing with Solid-State Nanopores",19th IEEE International Conference Electronics, Circuits and Systems (ICECS) 2012, 817–820).
  • In dem Artikel von Carminati et al. sind geeignete diskrete Schaltungen für die Messung an einzelnen Mikroporen beschrieben. In der Veröffentlichung von Rosenstein et al. (J. K. Rosenstein, M. Wanunu, C. A. Merchant, M. Drndic, K. Shepard: „Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution", Nature methods, 9, 2012, 487–492) ist die Verwendung eines Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS)-Sensors zum Detektieren eines Tunnelstroms beschrieben.
  • Mit den im Stand der Technik beschriebenen Methoden ist der Durchsatz an Sequenzierungen mehrerer Proben jedoch nicht so hoch wie erwünscht. Weiterhin weisen Sequenzsignale, also Signale, die von einem Messgrößenaufnehmer in Abhängigkeit eines detektierten Bausteins eines Biopolymers erfasst werden, eine geringe Stromstärke und eine kleine Ladungsmenge auf und werden häufig von Rauschen überlagert. Dieses Problem stellt sich auch bei anderen Sequenzierverfahren, z.B. bei Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystemen.
  • Eine von der Erfindung zu lösende Aufgabe ist die Erhöhung der Effizienz von Sequenzierungen von Biopolymeren.
  • Die Aufgabe wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Weiterhin wird die Aufgabe von einer erfindungsgemäßen Sequenzieranordnung gemäß dem Patentanspruch 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
  • Die Erfindung basiert auf der Idee, eine Anordnung zum Sequenzieren, z.B. eine Nanoporenanordnung, mit Prinzipien aus der Bildsensorik zu kombinieren. Dadurch können parallel eine Vielzahl von Biopolymeren mit einem geringem Schaltungsaufwand gleichzeitig sequenziert werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren dient entsprechend zum Sequenzieren mindestens zweier Biopolymere, beispielsweise mehrerer gleicher oder unterschiedlicher Nukleinsäuren oder Proteine, umfassend die Schritte:
    • – zu jedem Biopolymer Aufnehmen eines Sequenzsignals durch einen jeweiligen Messgrößenaufnehmer in Abhängigkeit von der Sequenz des Biopolymers,
    • – paralleles Übertragen jedes Sequenzsignals in ein Schieberegister und hierdurch Zwischenspeichern jedes Sequenzsignals,
    • – sequentielles Übertragen der zwischengespeicherten Sequenzsignale aus dem Schieberegister in eine Auswerteeinrichtung, z.B. einen Mikroprozessor eines Computers, und
    • – Auswerten der Sequenzsignale durch die Auswerteeinrichtung.
  • Unter einem Schieberegister wird dabei ein analoger Eimerkettenspeicher, also ein Schaltwerk verstanden, bei dem mehrere in Reihe geschaltete Kippglieder ihren Speicherinhalt bei jedem Arbeitstakt um ein Kippglied nach dem Eimerkettenprinzip weiterschieben. Ein Beispiel für ein Schieberegister ist ein CCD-Bildsensor.
  • Das sequenzielle Übertragen jedes ausgehenden Sequenzsignals eines Messgrößenaufnehmers umfasst das Übertragen in jeweils ein Kippglied eines Schieberegisters. Dadurch kann das Schieberegister über seine Kippglieder Sequenzsignale von parallel vorgeschalteten Messgrößenaufnehmern empfangen. Dies ermöglicht eine Vervielfältigung der Anzahl der zeitgleich verwendbaren Anordnungen zum Sequenzieren, also eine Vervielfältigung der Anzahl der zeitgleichen Sequenzierungen.
  • Ein Sequenzsignal kann dabei eine Stromstärke oder einen Spannungswert beschreiben. Die Verwendung eines Schieberegisters gewährleistet einen rauschfreien und verlustarmen Ladungstransport. Zusätzlich können mehrere Biopolymere zeitgleich sequenziert und die Sequenzsignale der verschiedenen Biopolymere können parallel oder zeitgleich „gesammelt“, also an den unterschiedlichen Messaufnehmern erfasst, werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Übertragen eines jeden Sequenzsignals in ein Schieberegister, das mit dem Messgrößenaufnehmer eine integrierte elektrische Schaltung bildet, z.B. auf einem Sensor-Array als Mikrochip. Dies ermöglicht das zeitgleiche Sequenzieren der Biopolymere und das zeitgleiche Auslesen der Signale für eine Vielzahl gleicher oder unterschiedlicher Biopolymere. Das Aufnehmen des Sequenzsignals des ersten Biopolymers kann dabei vorzugsweise zeitgleich zu dem Aufnehmen des Sequenzsignals des weiteren Biopolymers erfolgen. Dadurch wird das gleichzeitige Auslesen der Signale ermöglicht.
  • Hierdurch wird ein sehr schnelles Sequenzieren ermöglicht. Eine Sequenzierung kann durch die integrierte Anordnung beispielsweise in weniger als einer Stunde erfolgen.
  • Das Aufnehmen des Sequenzsignals mithilfe einer Nanoporenanordnung, die jeweils eine Nanopore zum Sequenzieren eines der Biopolymere umfasst, stellt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Ein Sequenzierverfahren mithilfe einer Nanoporenanordnung ermöglicht eine bessere Auflösung gegenüber anderen Verfahren. Das jeweilige Sequenzsignal kann dann z.B. einen Tunnelstrom beschreiben, der in der Nanopore fließt, wenn das Biopolymer die Nanopore passiert. Tunnelstromverfahren haben eine bessere Auflösung im Vergleich zur z.B. Messung eines Porenwiderstands aufgrund hoher elektrischer Feldstärken innerhalb der Nanopore.
  • Ein zusätzliches Verstärken eines jeden Sequenzsignals kann gemäß einer weiteren Ausführungsform durch jeweils einen Vorverstärker vor dem Übertragen des Sequenzsignals in das Schieberegister erreicht werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das sequentielle Übertragen der zwischengespeicherten Sequenzsignale das einmalige oder mehrfache Verstärken jedes Sequenzsignals durch einen oder mehrere Ausgangsverstärker. Ein solcher Ausgangsverstärker kann in einer weiteren Ausführungsform eine oder mehrere EMCCD-Stufen („electron multiplying charge-coupled device“, bei dem eine Verstärkerstrecke zwischen einem Schieberegister und einem Ausgangsverstärker implementiert ist), umfassen. Diese zeichnen sich durch eine nahezu verlustfreie Signalübertragung und eine Vervielfältigung der Signalstärke aus, sodass die Sequenzsignale kaum abgeschwächt oder verfälscht werden.
  • Das Übertragen jedes Sequenzsignals in das Schieberegister kann z.B. mit einer Frequenz zwischen 0,5 Kilohertz bis 10 Kilohertz, insbesondere bei 1 Kilohertz, erfolgen. Dieser Übertragungsfrequenzbereich berücksichtigt die charakteristische Geschwindigkeit z.B. einer Base eines Nukleinstrangs beim z.B. Passieren einer Nanopore von einer Millisekunde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden das ausgehende Signal des Schieberegisters und ein ausgehendes Signal eines weiteren Schieberegisters derselben Art parallel an ein Sammel-Schieberegister übertragen, welches die Signale sequentiell an die Auswerteeinheit überträgt. Die Schieberegister sind also in einer Kammstruktur angeordnet, wobei die Schieberegister, die von den Messaufnehmern jeweils ein Sequenzsignal empfangen, wie Zinken an das Sammel-Schieberegister geschaltet sind. Dabei sammelt das Sammel-Schieberegister in seinen Kippgliedern die von den Schieberegistern ausgehenden Signale.
  • Die oben gestellte Aufgabe wird ebenfalls gelöst von einer Sequenzieranordnung zum Detektieren und/oder Sequenzieren mehrerer Biopolymere, umfassend mindestens einen Messgrößenaufnehmer zum Aufnehmen eines Sequenzsignals eines der Biopolymere und ein mit jedem Messgrößenaufnehmer elektrisch verbundenes Schieberegister. Die jeweiligen Vorteile der genannten Ausführungsformen ergeben sich jeweils aus obiger Beschreibung zu dem erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Die Messgrößenaufnehmer und das Schieberegister bilden dabei vorzugsweise als eine integrierte elektrische Schaltung ausgebildet, d.h. z.B. auf einem gemeinsamen Mikrochip oder Siliziumwafer angeordnet.
  • Die erfindungsgemäße Sequenzieranordnung gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst weiterhin eine Mehrzahl an Nanoporenanordnungen mit jeweils einer Nanopore und jeweils einem Messgrößenaufnehmer zum Sequenzieren eines der Biopolymere, wobei der jeweilige Messgrößenaufnehmer dazu ausgelegt sein kann, einen Tunnelstrom bei Vorliegen des Biopolymers in der Nanopore aufzunehmen.
  • Weiterhin kann eine Ausführungsform der Sequenzieranordnung jeweils einen Vorverstärker zwischen jedem Messgrößenaufnehmer und dem Schieberegister, umfassen.
  • Die Sequenzieranordnung kann in einer weiteren Ausführungsform mindestens einen Ausgangsverstärker zum Verstärken eines Sequenzsignals, der dem Schieberegister nachgeschaltet ist, umfassen. Dies kann z.B. auch eine oder mehrere EMCCD-Stufen umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Sequenzieranordnung zumindest ein weiteres Schieberegister der genannten Art, wobei die Schieberegister über ein Sammel-Schieberegister mit der Auswerteeinrichtung gekoppelt sind.
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die gezeigten Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Es zeigt:
  • 1 eine schematische Darstellung eines aus dem Stand der Technik bekannten Sequenziergeräts im Längsschnitt,
  • 2 eine schematische Darstellung eines aus dem Stand der Technik bekannten Sequenziergeräts im Querschnitt,
  • 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel,
  • 4 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel,
  • 5 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel, und
  • 6 einen Schaltplan zu einem Vorverstärkers gemäß einem Ausführungsbeispiel.
  • Ein typischer Aufbau eines Nanopore-Sequenzierers 1 aus dem Stand der Technik ist in der 1 im Längsschnitt gezeigt. Die Sequenziereinrichtung 1 umfasst eine Nanopore 2, die beispielsweise auf einem Silizium-Trägerwafer 3 hergestellt wird.
  • Die 2 zeigt eine typische Nanoporen-Anordnung 10 von oben. Schematisch wird hier eine Nanopore 2 zwischen den Elektroden 4 im Querschnitt angedeutet. Die Nanopore 2 ist z.B. Teil einer Membran (in der 1 nicht gezeigt) zwischen den beiden Elektroden 4. Direkt an der Nanopore 2 sind zwei Tunnelelektroden 4 angebracht. Die Tunnelelektroden sind im Beispiel der 1 zwischen isolierenden Schichten 5 angeordnet. Wird nun ein Biopolymer 6, z.B. ein DNA-Molekül, über eine angelegte Spannung vom in der 1 oberen Reservoir ins untere Reservoir durch die Nanopore 2 gezogen, so wird ein zwischen den beiden Tunnelelektroden 4 fließender Tunnelstrom moduliert.
  • Die 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Sequenzieranordnung 11, anhand derer ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert wird. Darin sind beispielhaft vier Nanoporenanordnungen 10, die ihrerseits z.B. eine Membran mit z.B. einer Nanopore und zwei die Nanopore flankierenden Elektroden aufweisen kann, wie sie z.B. in der 1 und der 2 beschrieben sind.
  • An einer ersten Tunnelelektrode wird über eine elektrische Verbindung 12 eine Tunnelspannung („VT“) angelegt. Bei dem Passieren eines Biopolymers 6 wie z.B. einer Nukleinsäure entsteht in jeder Nanopore wird ein zwischen den beiden Tunnelelektroden 4 fließender Tunnelstrom als Sequenzsignal moduliert, der von einem Messgrößenaufnehmer aufgenommen und über eine elektrische Verbindung 18 in jeweils ein Kippglied 20 eines Schieberegisters 16 übertragen wird.
  • Das Schieberegister 16 ist bevorzugt als analoges „Charge Coupled Device“ (CCD) ausgebildet. Ein Schieberegister 16 ist dem Fachmann bisher als analoges Schieberegister oder auch als Bildsensor bekannt. Es zeichnet sich durch eine nahezu verlustfreie Übertragung von Ladungspaketen entlang des Schieberegisters aus. Der Ladungstransport aus einzelnen Kippgliedern funktioniert dabei nach dem Eimerkettenprinzip. Dem Schieberegister 16 kann vor jedem Kippglied 20 eine integrierte Speichereinrichtung 22 vorgeschaltet sein, das ein Sequenzsignal zwischenspeichert und optional verstärkt. Idealerweise umfasst die jeweilige Speichereinrichtung 22 einen Kondensator. In der 3 deuten die Pfeile innerhalb jeder Speichereinrichtung 22 an, dass die Speichereinrichtung 22 das verstärkte Signal in das ihr jeweils nachgeschaltete Kippglied 20 überträgt. Der optional verstärkte Tunnelstrom als Sequenzsignal kann also in einer Eingangsstufe (also in der Speichereinrichtung 22) des Schieberegisters 16 integriert und in periodischen Abständen parallel in das Schieberegister 16 durch Aktivieren eines „Load“-Signals („L“) übernommen (Verfahrensschritt S1). Das Übertragen eines Sequenzsignals in das Schieberegister 16 kann dabei bevorzugt mit einer mit einer Frequenz zwischen 0,5 Kilohertz bis Kilohertz, insbesondere bei 1 Kilohertz, erfolgen.
  • Danach kann der Inhalt einer jeden Speichereinrichtung 22 in bekannter Weise mithilfe nicht überlappenden Steuersignale „φ0“, „φ1“ und „φ2“ für das Schieberegister 16 seriell aus dem Schieberegister 16 geschoben werden. Ein Ausgangsverstärker 24 kann das dadurch entstehende serielle AOUT-Signal („A“) zusätzlich verstärken und zur Weiterverarbeitung zur Verfügung stellen, d.h. an eine Auswerteeinrichtung 26, z.B. einen Mikroprozessor eines Computers, übertragen. Das Ausgangssignal A kann jedoch auch direkt von dem Schieberegister 16 an die Auswerteeinrichtung 26 übertragen werden. Es werden also die Sequenzsignale abgetastet und die Abtastwerte durch das Schieberegister 16 gesammelt an eine einzelne Auswerteeinrichtung 26 übertragen.
  • Im Beispiel der 3 sind vier Nanoporenanordnungen gezeigt, jedoch ist generell eine beliebige Mehrzahl parallel geschalteter Nanoporenanordnungen 10 vorgesehen. Alternativ zu einer Mehrzahl von Nanoporenanordnungen 10 kann auch eine Mehrzahl von anderen Anordnungen 10 zum Generieren eines Sequenzsignals in dem erfindungsgemäßen Verfahren und in der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sein, z.B. Anordnungen 10 zum Generieren eines Sequenzsignals umfassend jeweils ein Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem. Die Mehrzahl an Nanoporenanordnungen 10 kann z.B. in einem Sequenziergerät 1 angeordnet sein und umfasst einen Messgrößenaufnehmer zum Aufnehmen eines Tunnelstroms der Nanopore. Das Sequenziergerät 1 kann ebenfalls, wie in der 3 gezeigt, den oder die Vorverstärker 14 und/oder das Schieberegister 16 umfassen. Bevorzugt ist hierbei, dass das Schieberegister 16 und die Mehrzahl an Nanoporenanordnungen 10 innerhalb derselben Schaltung integriert sind, also z.B. auf einem Mikrochip und/oder in einem Sequenziergerät integriert sind. Der Vorteil einer solchen integrierten Schaltung liegt in der nahezu verlustfreien Übertragung eines jeden Sequenzsignals. Alternativ können die genannten Komponenten jedoch auch in verschiedenen Geräten angeordnet sein und diese Geräte miteinander durch elektrische Verbindungen gekoppelt sein.
  • Eine erfindungsgemäße Sequenzieranordnung 11 kann in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Sequenzieranordnung 11 auch zu z.B. einem Sensor-Array erweitert werden oder innerhalb des gleichen Geräts integriert sein. Dies ist in der 4 gezeigt. Die in der 4 gezeigte Sequenzieranordnung 11 ist aus der spaltenförmigen Anordnung aus der 3 abgeleitet. Der Übersicht wegen sind nur eines der parallel geschalteten Schieberegister 16 sowie nur einige der Nanoporenanordnungen 10, Vorverstärker 14, Eingangsstufen 22 und Kippglieder 20 mit Bezugszeichen gekennzeichnet. Der Aufbau eines jeweiligen Schieberegisters 16 und der jeweiligen vorgeschalteten Anordnung ergibt sich aus der 3 und der dazugehörigen Beschreibung.
  • Die einzelnen Spalten der Anordnungen (jeweils umfassend mehrere Nanoporenanordnungen 10 und ein Schieberegister 16) sind durch ein weiteres Schieberegister 16’ gekoppelt, das die AOUT-Informationen der einzelnen Spalten wiederum parallel in eigene Kippglieder 20’ übernimmt und seriell am Ausgang 34 zur Verfügung stellt. Eine gekoppelte Anordnung, die die Kopplung zweier Schieberegister untereinander beschreibt, ist in dem Fachmann aus der EP 0 303 846 B1 bekannt.
  • Ein Messzyklus kann wie folgt ablaufen: Zunächst werden die Sequenzsignale durch Aktivieren eines „LoadV“-Signals („LV“) in die Spalten-Schieberegister 16 übernommen. Danach wird die elektrische Ladung der Ausgangszelle in das Zeilen-Schieberegister 16’ durch Aktivieren des Steuersignals „LoadH“ („LH“) übernommen. Als nächster Schritt wird das Zeilen-Schieberegister 16’ z.B. über die Steuersignale φ0H, φ1H und φ2H für das Schieberegister 16’ herausgeschoben. Danach werden die Daten in den Spalten-Schieberegister 16 z.B. durch die Steuersignale φ0V, φ1V und φ2V um eine Position verschoben und der Auslesevorgang am Zeilen-Schieberegister 16’ kann wiederholt werden, bis alle Sequenzsignale ausgelesen sind.
  • Die erfindungsgemäße Sequenzieranordnung 11 kann in einem weiteren Ausführungsbeispiel, das hier in der 5 gezeigt ist, mit einem weiteren Ausgangsverstärker 24’, z.B. einer sogenannten “Electron multiplying CCD-Stufe“ (EMCCD) kombiniert werden. EMCCD-Stufen sind aus der Kameratechnik bekannt, sie werden hauptsächlich bei besonders empfindlichen Kamerasystemen eingesetzt. In jeder Stufe 32 des weiteren Ausgangsverstärkers 24’ wird durch Stoßionisation die Anzahl der Elektronen von Stufe zu Stufe erhöht. Im Übrigen kann die in der 5 gezeigte Sequenzieranordnung 11 eine Sequenzieranordnung 11 gemäß der 3 und der dazugehörigen Beschreibung umfassen.
  • Als Vorverstärker 14 ist z.B. eine Tranzimpedanz-Anordnung, wie sie beispielsweise aus Rosenstein et al. bekannt ist, prinzipiell geeignet. Die relativ hohe Streukapazität der Tunnelkontakte kann jedoch zu Stabilitätsproblemen der Vorverstärker führen und zum Erhöhen des Rauschens führen. Ein Schaltplan für einen Vorverstärker 14 bei hohen Eingangskapazitäten ist beispielsweise ein Vorverstärker 14, der in 6 skizziert ist. Es kann sich dabei z.B. um eine dem Fachmann bekannte Schaltung mit einer „Common-Base“-Eingangsstufe handeln, die einen niedrigen Eingangswiderstand und zum Ausgang einen Stromspiegel 30 umfasst. Die Funktionsweise an sich ist aus dem Schaltplan ersichtlich. Beispielsweise formen die beiden Transistoren Qin und Qer die Eingangsstufe. Das Signal kann über die beiden Stromspiegeltransistoren Mp1 und Mp2 zum Ausgang gebracht werden. Ib ist dem Beispiel der Bias-Strom, Rf ein Feedback-Widerstand und Ro ein Ausgangswiderstand. Iin stellt dabei einen Eingangsstrom dar, Vout die Ausgangsspannung.
  • Die oben aufgeführten Ausführungsbeispiele veranschaulichen das Prinzip der Erfindung, eine Anordnung zum Sequenzieren, wie z.B. eine Nanoporenanordnung, mit Prinzipien aus der Bildsensorik zu kombinieren.
  • Dadurch wird eine integrierte Anordnung angegeben, bei der z.B. ein Array aus Nanoporen 4 mit z.B. Verstärkern 14, 24 und einer Ausleseeinheit 26 kombiniert wird, sodass der mögliche Durchsatz einer oder mehrerer Anordnungen zum Sequenzieren deutlich erhöht wird.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 0303846 B1 [0043]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • M. Carminati, G. Ferrari, M. Sampietro, A. P. Ivanov, T. Albrecht: „Low-Noise Dual-Channel Current Amplifier for DNA Sensing with Solid-State Nanopores“,19th IEEE International Conference Electronics, Circuits and Systems (ICECS) 2012, 817–820 [0005]
    • J. K. Rosenstein, M. Wanunu, C. A. Merchant, M. Drndic, K. Shepard: „Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution“, Nature methods, 9, 2012, 487–492 [0006]

Claims (15)

  1. Verfahren zum Sequenzieren mindestens zweier Biopolymere (6), umfassend die Schritte: – zu jedem Biopolymer (6) Aufnehmen eines Sequenzsignals durch einen jeweiligen Messgrößenaufnehmer in Abhängigkeit von der Sequenz des Biopolymers (6), – Übertragen jedes Sequenzsignals in ein Schieberegister (16) und hierdurch Zwischenspeichern jedes Sequenzsignals, – Sequentielles Übertragen der zwischengespeicherten Sequenzsignale aus dem Schieberegister (16) in eine Auswerteeinrichtung (26), – Auswerten der Sequenzsignale durch die Auswerteeinrichtung (26).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Übertragen eines jeden Sequenzsignals in das Schieberegister (16) innerhalb einer von dem Schieberegister (16) und dem Messgrößenaufnehmer gebildeten integrierten elektrischen Schaltung erfolgt.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Aufnehmen des Sequenzsignals des ersten Biopolymers (6) zeitgleich zu dem Aufnehmen des Sequenzsignals eines weiteren Biopolymers (6) erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Aufnehmen des Sequenzsignals mithilfe einer Nanoporenanordnung (10), die jeweils eine Nanopore (4) zum Sequenzieren eines der Biopolymere (6) umfasst, erfolgt und/oder wobei das jeweilige Sequenzsignal einen Tunnelstrom in der Nanopore beschreibt.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Sequenzsignal vor dem Übertragen in das Schieberegister (16) durch jeweils einen Vorverstärker (14) verstärkt wird.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sequentielle Übertragen der zwischengespeicherten Sequenzsignale das einmalige oder mehrfache Verstärken jedes Sequenzsignals durch einen oder mehrere Ausgangsverstärker (24) umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Übertragen jedes Sequenzsignals in das Schieberegister (16) mit einer Frequenz zwischen 0,5 Kilohertz bis 10 Kilohertz, insbesondere bei 1 Kilohertz, erfolgt.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verstärken der Sequenzsignale durch mindestens eine EMCCD-Stufe (32) als Ausgangsverstärker erfolgt.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ausgehende Signal des Schieberegisters (16) und ein ausgehendes Signal eines weiteren Schieberegisters (16) derselben Art parallel an ein Sammel-Schieberegister (16’) übertragen werden, welches die Signale sequentiell an die Auswerteeinheit (26) überträgt.
  10. Sequenzieranordnung (11) zum Detektieren und/oder Sequenzieren mehrerer Biopolymere (6), umfassend mindestens einen Messgrößenaufnehmer zum Aufnehmen jeweils eines Sequenzsignals eines jeden Biopolymers (6) und ein mit jedem Messgrößenaufnehmer elektrisch verbundenes Schieberegister (16).
  11. Sequenzieranordnung (11) nach Anspruch 10, wobei der mindestens eine Messgrößenaufnehmer und das Schieberegister (16) als eine integrierte elektrische Schaltung ausgebildet sind.
  12. Sequenzieranordnung (11) nach Anspruch 10 oder 11, weiterhin umfassend eine Mehrzahl an Nanoporenanordnungen (10) mit jeweils einer Nanopore (4) und jeweils einem Messgrößenaufnehmer zum Sequenzieren der Biopolymere (6), wobei der jeweilige Messgrößenaufnehmer dazu ausgelegt ist, einen Tunnelstrom bei Vorliegen des Biopolymers (6) in der jeweiligen Nanopore (4) aufzunehmen.
  13. Sequenzieranordnung (11) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, weiterhin umfassend jeweils einen Vorverstärker (14), der zwischen jeden Messgrößenaufnehmer und das Schieberegister (16) geschaltet ist.
  14. Sequenzieranordnung (11) nach einem der Ansprüche 10 bis 13, weiterhin umfassend mindestens einen Ausgangsverstärker (24) zum Verstärken eines Sequenzsignals, der dem Schieberegister (16, 16’) nachgeschaltet ist.
  15. Sequenzieranordnung (11) nach einem der Ansprüche 10 bis 14, mit zumindest einem weiteren Schieberegister (16) der genannten Art, wobei die Schieberegister über ein Sammel-Schieberegister (16’) mit der Auswerteeinrichtung (26) gekoppelt sind.
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