CN105659086A - 用于对生物聚合物测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于对至少两种生物聚合物（6）测序的方法和相应的装置，其中对于每种生物聚合物（6），通过各自的测量参量接收器根据生物聚合物（6）的序列接收序列信号，所述序列信号被传输到移位寄存器（16）中，并且在那里被缓存，缓存的序列信号从移位寄存器（16）顺序地被传输到评估设备（26）中，并且在那里被评估。每个序列信号在此优选地借助于纳米孔装置（10）被产生。在相应的测序装置（11）中，测量参量接收器和移位寄存器（16）优选地集成到电路中、也即例如集成到传感器阵列上。每个序列信号可以在此在传输到移位寄存器（16）中之前由前置放大器（14）放大。将输出信号（A）输出给评估设备（24）可以包括通过输出放大器（24）和/或至少一个EMCCD级（32）对信号进行放大。

Description

用于对生物聚合物测序的方法

技术领域

本发明涉及用于对至少两种生物聚合物测序的方法。

背景技术

在对生物聚合物、例如核酸或者蛋白质测序时，生物聚合物的各个基本粒子的序列、也即核苷酸序列（或者碱基序列）或者氨基酸序列可以被分析。

在例如借助于纳米孔测序时，所述生物聚合物经过生物的或者人造的纳米孔。生物聚合物的各个基本粒子可以通过在经过时孔电阻的变化借助于纳米孔被分析。在经过不同的基本粒子的纳米孔时，例如通过纳米孔传导的电流改变。所述变化取决于经过孔的基本粒子，使得例如单个核苷酸可以被探测，并且例如核酸的序列可以被测定。

可替代地，仅在经过生物聚合物时出现的、在纳米孔中的隧道电流可以被测量，其中隧道电流的电流强度取决于例如位于纳米孔中的核苷酸或者氨基酸。

例如在测量该隧道电流时的困难由在纳安范围中的所述隧道电流的小强度以及隧道电极的相对高的容量得出。所述容量通过对于硅晶片的硅以及对于周围的液体的寄生容量形成，其中纳米孔结构可以被布置在所述硅晶片上，所述液体与电极直接接触。为了测量隧道电流，因此具有电流输入端的前置放大器是必要的，所述前置放大器承受相对高的输入容量（M.Carminati,G.Ferrari,M.Sampietro,A.P.Ivanov,T.Albrecht:"Low-NoiseDual-ChannelCurrentAmplifierforDNASensingwithSolid-StateNanopores",19thIEEEInternationalConferenceElectronics,CircuitsandSystems(ICECS)2012,817-820）。

在Carminati等人的文章中，用于在各个微孔处进行测量的适当的分立电路被描述。在Rosenstein等人的出版物（J.K.Rosenstein,M.Wanunu,C.A.Merchant,M.Drndic,K.Shepard:"Integratednanoporesensigplatformwithsub-microsecondtemporalresolution",Naturemethods,9,2012,487-492）中，用于探测隧道电流的互补金属氧化物半导体（CMOS）传感器的应用被描述。

利用在现有技术中描述的方法，多个试样的测序的性能然而不如期望的那样高。此外，序列信号、也即由测量参量接收器（Messgr??enaufnehmer）根据生物聚合物的探测到的基本粒子检测的信号具有小的电流强度和小的电荷量，并且经常由噪声叠加。所述问题在其他测序方法、例如在离子半导体DNA测序系统中也出现。

发明内容

由本发明要解决的任务是提高生物聚合物的测序的效率。

所述任务由按照专利权利要求1所述的按照本发明的方法解决。此外所述任务由按照专利权利要求10所述的按照本发明的测序装置解决。本发明的有利的改进方案通过从属权利要求给出。

本发明基于以下思想：将用于测序的装置、例如纳米孔装置与来自图像传感技术的原理组合。由此多种生物聚合物可以并行地以小的电路损耗同时被测序。

按照本发明的方法相应地用于对至少两种生物聚合物、例如多种相同的或者不同的核酸或者蛋白质测序，包括步骤：

-对每种生物聚合物，通过各自的测量参量接收器根据生物聚合物的序列接收序列信号，

-并行地将每个序列信号传输到移位寄存器中，并且由此缓存每个序列信号，

-顺序地将缓存的序列信号从移位寄存器传输到评估设备、例如计算机的微处理器中，并且

-通过评估设备评估序列信号。

移位寄存器在此被理解为模拟斗链式存储器、也即顺序逻辑系统（Schaltwerk），其中，多个串联连接的触发元件在每个工作循环（Arbeitstakt）时按照斗链式原理将其存储内容继续推移一个触发元件。移位寄存器的示例是CCD图像传感器。

测量参量接收器的每个发出的序列信号的顺序传输包括到移位寄存器的各一个触发元件中的传输。由此，移位寄存器可以通过其触发元件从并行前置的测量参量接收器接收序列信号。这使得能够增多用于测序的同时能使用的装置的数量，也即增多同时测序的数量。

所述序列信号在此可以描述电流强度或者电压值。移位寄存器的使用保证无噪声的和低损失的电荷输送。附加地，多种生物聚合物可以同时被测序，并且不同的生物聚合物的序列信号可以并行地或者同时被“收集”，也即在不同的测量接收器处被检测。

在按照本发明的方法的优选的实施方式中，将每个序列信号传输到移位寄存器中，所述移位寄存器与测量参量接收器一起构成集成电路，例如在传感器阵列上作为微芯片。这使得能够同时对生物聚合物测序，并且同时读出用于多个相同的或者不同的生物聚合物的信号。第一生物聚合物的序列信号的接收在此可以优选地与其他生物聚合物的序列信号的接收同时进行。由此能够实现信号的同时读出。

由此使得能够非常快速地测序。测序可以通过集成装置例如在少于一个小时内进行。

序列信号借助于纳米孔装置的接收是按照本发明的方法的优选的实施方式，所述纳米孔装置分别包括用于对生物聚合物之一测序的纳米孔。借助于纳米孔装置的测序方法相对于其他方法能够实现更好的分辨率。于是各自的序列信号可以描述例如隧道电流，其中如果所述生物聚合物经过纳米孔，那么所述隧道电流在纳米孔中流动。隧道电流方法与例如孔电阻的测量相比由于在纳米孔内高的电场强而具有较好的分辨率。

按照另一实施方式，每个序列信号的附加的放大可以分别通过前置放大器在将序列信号传输到移位寄存器中之前实现。

在按照本发明的方法的另一实施方式中，缓存的序列信号的顺序传输包括通过一个或多个输出放大器对每个序列信号的一次或多次放大。在另一实施方式中，这样的输出放大器可以包括一个或多个EMCCD级（"electronmultiplyingcharge-coupleddevice"（电子倍增电荷耦合器件），其中实现在移位寄存器和输出放大器之间的放大器区段）。这些以几乎无损失的信号传输和信号强度的增多而突出，使得序列信号几乎不被减弱或者失真。

每个序列信号到移位寄存器中的传输可以例如以0.5千赫兹至10千赫兹之间的、尤其1千赫兹的频率进行。该传输频率范围考虑在例如经过纳米孔1毫秒（voneinerMillisekunde）时例如核素链的碱基的特征速度。

在优选的实施方式中，移位寄存器的发出的信号和相同类型的另一移位寄存器的发出的信号并行地被传输给总移位寄存器，所述总移位寄存器将信号顺序地传输给评估单元。所述移位寄存器因此以梳状结构布置，其中从测量接收器分别接收序列信号的移位寄存器如齿那样被接到总移位寄存器上。在此总移位寄存器在其触发元件中收集从移位寄存器发出的信号。

上面提出的任务同样地由用于对多种生物聚合物探测和/或测序的测序装置解决，所述测序装置包括至少一个用于接收生物聚合物之一的序列信号的测量参量接收器和与每个测量参量接收器电连接的移位寄存器。提及的实施方式的各自的优点分别由上面对按照本发明的方法的描述得出。

所述测量参量接收器和移位寄存器在此优选地被构造为集成电路，也即例如布置在共同的微芯片或者硅晶片上。

按照另一实施方式的按照本发明的测序装置此外包括多个用于对生物聚合物之一测序的、具有各自纳米孔和各自测量参量接收器的纳米孔装置，其中各自的测量参量接收器可以被设计用于，当在纳米孔中存在生物聚合物时接收隧道电流。

此外，测序装置的实施方式可以分别包括在每个测量参量接收器和移位寄存器之间的前置放大器。

在另一实施方式中，所述测序装置可以包括至少一个用于放大序列信号的输出放大器，所述输出放大器置于移位寄存器之后。这例如也可以包括一个或多个EMCCD级。

在优选的实施方式中，按照本发明的测序装置包括已知类型的至少一个其他移位寄存器，其中所述移位寄存器通过总移位寄存器与评估设备耦合。

附图说明

本发明以下根据附图再次通过具体的实施例进一步被阐述。所示的示例是本发明的优选的实施方式。功能相同的元件在图中具有相同的附图标记。其中：

图1以纵截面示出由现有技术已知的测序设备的示意图，

图2以横截面示出由现有技术已知的测序设备的示意图，

图3示出按照一个实施例的按照本发明的设备的示意图，

图4示出按照另一实施例的按照本发明的设备的示意图，

图5示出按照另一实施例的按照本发明的设备的示意图，和

图6示出按照一个实施例的前置放大器的电路图。

具体实施方式

来自现有技术的纳米孔测序器1的典型构造在图1中以纵截面示出。测序设备1包括纳米孔2，所述纳米孔2例如在硅载体晶片3上被制造。

图2从上示出典型的纳米孔装置10。这里，电极4之间的纳米孔2以横截面示意性地被表明。所述纳米孔2例如是两个电极4之间的隔膜（在图1中未示出）的部分。两个隧道电极4直接地被安置在纳米孔2处。所述隧道电极在图1的示例中被布置在绝缘层5之间。如果现在生物聚合物6、例如DNA分子通过所施加的电压从在图1中上面的储层通过纳米孔2被拉到下面的储层中，则在两个隧道电极4之间流动的隧道电流被调制。

图3示出按照本发明的测序装置11的实施例，根据所述测序装置来阐述按照本发明的方法的实施例。其中示例性地有四个纳米孔装置10，所述纳米孔装置10在其侧可以例如具有带有例如一个纳米孔的隔膜和两个置于纳米孔两侧的电极，如例如在图1和图2中所描述的。

隧道电压（“V_T”）通过电连接12被施加在第一隧道电极上。在生物聚合物6诸如核酸经过时，在两个隧道电极4之间流动的隧道电流在每个纳米孔中形成，被调制成序列信号，所述隧道电流被测量参量接收器接收，并且通过电连接18分别被传输到移位寄存器16的触发元件20中。

所述移位寄存器16优选地被构造为模拟（analog）“电荷耦合器件（ChargeCoupledDevice）”（CCD）。移位寄存器16对于专业人员迄今作为模拟移位寄存器或者也作为图像传感器是已知的。所述移位寄存器以电荷包沿着移位寄存器的几乎无损失的传输而突出。从各个触发元件的电荷输送在此按照斗链原理起作用。对于移位寄存器16，集成存储设备22可以被前置在每个触发元件20之前，其缓存并且可选择地放大序列信号。理想地，各自的存储设备22包括电容器。在图3中每个存储设备22之内的箭头表明：所述存储设备22将放大的信号传输到其分别后置的触发元件20中。作为序列信号的可选择地放大的隧道电流因此可以在移位寄存器16的输入级中（也即在存储设备22中）被整合（integrieren），并且以周期性间隔通过激活“Load”信号（“L”）而并行地被接管到移位寄存器16中（方法步骤S1）。序列信号到移位寄存器16中的传输在此可以优选地以在0.5千赫兹至千赫兹之间的、尤其1千赫兹的频率进行。

之后，每个存储设备22的内容可以以已知的方式借助于用于移位寄存器16的不重叠的控制信号“0”、“1”和“2”串行地从移位寄存器16中被推移。输出放大器24可以附加地放大由此形成的串行AOUT信号（“A”），并且为了进一步处理用以提供，也即传输给评估设备26、例如计算机的微处理器。然而所述输出信号A也可以直接地由移位寄存器16被传输给评估设备26。也即序列信号被采样，并且采样值通过移位寄存器16收集地被传输给单个评估设备26。

在图3的示例中示出四个纳米孔装置，然而通常设置任意多个并联连接的纳米孔装置10。替代于多个纳米孔装置10，也可以设置多个用于在按照本发明的方法中和在按照本发明的设备中生成序列信号的其他装置10，例如分别包括离子半导体DNA测序系统的用于生成序列信号的装置10。多个纳米孔装置10可以例如被布置在测序设备1中，并且包括用于接收纳米孔的隧道电流的测量参量接收器。所述测序设备1可以同样地如在图3中示出的那样包括所述一个或多个前置放大器14和/或移位寄存器16。在此情况下优选的是，所述移位寄存器16和多个纳米孔装置10集成在相同的电路内，也即例如集成在微芯片上和/或集成在测序设备中。这样的集成电路的优点在于几乎无损失地传输每个序列信号。然而可替代地，已知的组件也可以被布置在不同的设备中，并且所述设备可以彼此通过电连接耦合。

在按照本发明的方法的或者按照本发明的测序装置11的实施方式中，按照本发明的测序装置11也可以被扩展为例如传感器阵列，或者集成在相同的设备之内。这在图4中示出。在图4中示出的测序装置11从来自图3的列状装置导出。出于总览，仅并联连接的移位寄存器16之一以及仅纳米孔装置10、前置放大器14、输入级22和触发元件20中的一些用附图标记标出。各自的移位寄存器16和各自的前置装置的构造由图3和与之相关的描述得出。

装置的各个列（分别包括多个纳米孔装置10和移位寄存器16）通过另一移位寄存器16'耦合，所述另一移位寄存器16'将各个列的AOUT信息再次并行地接管到自身的触发元件20'中，并且串行地在输出端24处提供。描述两个移位寄存器彼此耦合的耦合的装置对于专业人员由EP0303846B1已知。

测量周期可以如下进行：首先序列信号通过激活“LoadV”信号（“LV”）被接管到列寄存器中。之后，输出单元的电荷通过激活控制信号“LoadH”（“LH”）被接管到行移位寄存器16'中。作为下一个步骤，行移位寄存器16'例如通过用于所述移位寄存器16'的控制信号0H、1H、2H被推移出。之后，在列移位寄存器16中的数据例如通过控制信号0V、1V、2V被推移一个位置，并且在行移位寄存器16'处的读出过程可以被重复，直到所有的序列信号被读出。

在另一实施例中，所述实施例这里在图5中示出，按照本发明的测序装置11可以与另一输出放大器24'、例如所谓的“电子倍增（Electronmultiplying）CCD级”（EMCCD）组合。EMCCD级由相机技术是已知的，它们主要地在特别灵敏的相机系统中被使用。在另一输出放大器24'的每个级32中，电子的数量通过碰撞电离逐级被提高。此外，在图5中示出的测序装置11可以包括按照图3和与之相关的描述的测序装置11。

例如跨阻抗（Tranzimpedanz）装置（如例如由Rosenstein等人中已知的）原则上适合作为前置放大器14。然而隧道接触部的相对高的杂散电容可能导致前置放大器的稳定性问题，并且导致噪声的提高。在高的输入容量的情况下用于前置放大器14的电路图例如是在图6中简示的前置放大器14。在此例如可以是具有“共基极”输入级的对于专业人员已知的电路，所述电路包括低的输入电阻并且相对于输出包括电流镜30。工作原理本身从电路图可以看出。例如两个晶体管Q_in和Q_er形成输入级。所述信号可以通过两个电流镜晶体管M_p1和M_p2被引到输出端。在该示例中，I_b是偏置电流，R_f是反馈电阻以及R_O是输出电阻。I_in在此表示输入电流，V_out表示输出电压。

上面实施的实施例阐明本发明的原理：将用于测序的装置、诸如纳米孔装置与来自图像传感技术的原理组合。

由此说明集成装置，其中例如将由纳米孔4组成的阵列与例如放大器14、24和读出单元26组合，使得用于测序的一个或多个装置的可能的性能被明显地提高。

Claims (15)

1.用于对至少两种生物聚合物（6）测序的方法，包括步骤：

-对于每种生物聚合物（6），通过各自的测量参量接收器根据生物聚合物（6）的序列接收序列信号，

-将每个序列信号传输到移位寄存器（16）中，并且因此缓存每个序列信号，

-顺序地将缓存的序列信号从移位寄存器（16）传输到评估设备（26）中，

-通过评估设备（26）评估序列信号。

2.按照权利要求1所述的方法，其中每个序列信号到移位寄存器（16）中的传输在由移位寄存器（16）和测量参量接收器构成的集成电路之内进行。

3.按照上述权利要求之一所述的方法，其中第一生物聚合物（6）的序列信号的接收与另一生物聚合物（6）的序列信号的接收同时进行。

4.按照上述权利要求之一所述的方法，其中序列信号的接收借助于纳米孔装置（10）进行，所述纳米孔装置（10）分别包括用于对生物聚合物（6）之一测序的纳米孔（4），和/或其中各自的序列信号描述在纳米孔中的隧道电流。

5.按照上述权利要求之一所述的方法，其中每个序列信号在传输到移位寄存器（16）之前分别通过前置放大器（14）放大。

6.按照上述权利要求之一所述的方法，其中缓存的序列信号的顺序传输包括通过一个或多个输出放大器（24）对每个序列信号的一次或多次放大。

7.按照上述权利要求之一所述的方法，其中每个序列信号到移位寄存器（16）中的传输以0.5千赫兹至10千赫兹之间的、尤其1千赫兹的频率进行。

8.按照上述权利要求之一所述的方法，其中通过作为输出放大器的至少一个EMCCD级（32）放大序列信号。

9.按照上述权利要求之一所述的方法，其中移位寄存器（16）的发出的信号和相同类型的另一移位寄存器（16）的发出的信号并行地被传输给总移位寄存器（16'），所述总移位寄存器（16'）顺序地将所述信号传输给评估单元（26）。

10.用于对多种生物聚合物（6）探测和/或测序的测序装置（11），包括至少一个用于接收每种生物聚合物（6）的各自序列信号的测量参量接收器和与每个测量参量接收器电连接的移位寄存器（16）。

11.按照权利要求10所述的测序装置（11），其中所述至少一个测量参量接收器和所述移位寄存器（16）被构造为集成电路。

12.按照权利要求10或11所述的测序装置（11），此外包括多个用于对生物聚合物（6）测序的、具有各自纳米孔（4）和各自测量参量接收器的纳米孔装置（10），其中各自的测量参量接收器被设计用于，当在各自的纳米孔（4）中存在生物聚合物（6）时接收隧道电流。

13.按照权利要求10至12之一所述的测序装置（11），此外分别包括前置放大器（14），所述前置放大器（14）接在每个测量参量接收器和所述移位寄存器（16）之间。

14.按照权利要求10至13之一所述的测序装置（11），此外包括至少一个用于放大序列信号的输出放大器（24），所述输出放大器（24）接在移位寄存器（16、16'）之后。

15.按照权利要求10至14之一所述的测序装置（11），具有所述类型的至少一个另一移位寄存器（16），其中所述移位寄存器通过总移位寄存器（16'）与评估设备（26）耦合。