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Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Bestimmen von Proben in einer Probenmatrix mit mehreren Probevolumen, zum Beispiel in einer Mikrotiterplatte, sowie eine Probenmatrix.
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Hintergrund
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Derartige Technologien dienen zum Bestimmen von zu untersuchenden Substanzen, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wobei die zu untersuchenden Substanzen für die Analyse in einer Anordnung eingebracht werden, die mehrere Probevolumen zur Aufnahme der zu bestimmenden Substanzen aufweist, beispielsweise in Form von Näpfchen, die auch als sogenannte Wells bezeichnet werden. Die in der Probenmatrix aufgenommenen Substanzproben können dann mit verschiedenen Analyseverfahren bestimmt werden, beispielsweise zu medizindiagnostischen Zwecken.
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Eine bekannte Form solcher Probenmatrizen ist die Mikrotiterplatte, zum Beispiel mit 96 oder 384 Probenvolumina. Diese besteht regelmäßig aus einem Kunststoffmaterial. Es ist eine matrizenartige Anordnung von Probevolumen oder Näpfchen gebildet, die jeweils geeignet sind, separat eine Substanzprobe aufzunehmen. Hierbei können mehrere Proben ein und derselben zu bestimmenden Substanz oder auch Proben unterschiedlicher Substanzen in einer Mikrotiterplatte aufgenommen werden.
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Die Probenmatrix wird dann mit Hilfe von Analyseeinrichtungen untersucht. Aus dem Dokument
DE 20 2008 009 859 U1 ist eine Vorrichtung bekannt, die dazu dient, eine solche Probenmatrix spektroskopisch zu untersuchen. Als Messgrößen können die Lumineszenz- und/oder die Fluoreszenzstrahlung gemessen werden. Auch im Dokument
WO 01/04608 A1 werden Probenmatrizen optisch untersucht.
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Weiterhin betrifft das Dokument
DE 37 36 632 C2 eine Vorrichtung zur Analyse von Proben in einer Probenmatrix. In einer Ausgestaltung der Vorrichtung weist diese zwei Bearbeitungslinien auf, was es ermöglicht, zwei verschiedene Messungen gleichzeitig durchzuführen.
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Die Probenvolumen oder Näpfchen können eine sogenannte Spotarray-Ausführung aufweisen. Hierbei sind in dem Probevolumen, üblicherweise am Boden, mehrere Messfelder (Messspots) in einer Array- oder Matrixanordnung gebildet. Die Messfelder dienen zum Bestimmen eines Analyten in der in dem Probevolumen einzubringenden Probe, beispielweise mittels Farbänderung. Zur Probenbestimmung werden danach die Messfelder optisch ausgewertet, indem eine oder mehrere Bildaufnahmen erfasst und digitalisiert werden, um sie dann mittels Bildbearbeitung auszuwerten.
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Es sind Ausführungen von Probenmatrizen oder -anordnungen (Probenträgern) bekannt, bei denen die Probenvolumen einzeln herausgenommen und wieder eingesetzt werden können. Zum Beispiel kann ein Probenvolumen zu Messzwecken herausgenommen werden, um es dann wieder einzusetzen, so dass dann beispielweise die optische Bestimmung der Messfelder durchgeführt werden kann, während das Probevolumen in der Probenmatrize (Reaktionsträger) angeordnet ist.
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Zusammenfassung
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Zur Vermeidung von hierdurch auftretenden Fehlern bei der messtechnischen Auswertung der Probevolumen (Reaktionsträger) in einer Probeanalysevorrichtung (zum Beispiel Arrayscanner) ist ein Verfahren nach Anspruch 1 vorgeschlagen. Weiterhin ist eine Probenmatrix (Probenträger) nach Anspruch 4 geschaffen.
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Zur wirtschaftlichen Nutzung von Spotarrays auf der Basis von Reaktionsträgern verschiedener Geometrie, zum Beispiel runden Wells von Mikrotiterplatten oder eckigen Reaktionsträgern, ist es notwendig, Einzelproben auf Anwesenheit entsprechender Analyten zu untersuchen. Die Auswertung erfordert sowohl eine Charakterisierung der Reaktionsträger (Parameteridentifikation im Layout des Spotarrays) als auch eine Identifikation der Lage des Spotarrays (Grid-Identifizierung).
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Dieses Problem kann mittels Anwenden von Markierungsverfahren an der Innen- oder Außenseite der Reaktionsträger (Probevolumen) erreicht werden, wobei die angebrachte Markierung durch die Messeinrichtung erkannt wird, ohne mit der Messung der gebildeten Produkte, zum Beispiel farbliche Niederschläge in Punktform, als Folge der Abarbeitung eines Spotarrays (Messfeld- oder Testfeldanordnung) zu interferieren.
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Die Markierung der Reaktionsträger kann durch Oberflächenveränderungen, zum Beispiel mittels Lasergravur, oder Einfärbungen, beispielweise Tintenstrahl- oder Mikrotampondruck, erfolgen, und punkt- oder strichförmige, geometrische oder Barcode-ähnliche Muster erzeugen, und wird entweder im Rahmen der Arrayherstellung oder unabhängig davon durchgeführt.
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Nach Durchführung eines an sich bekannten Spotarrays, welche beispielsweise in farblichen Niederschlägen in Punktform, die dem Layout des Spotarrays entsprechen, enden, erfolgt über einen bildgebenden Prozess zunächst die Erzeugung eines optischen Bildes mittels der Messe- oder Analyseeinrichtung. Solche Messeinrichtungen werden in einer Ausführung auch als Arrayscanner bezeichnet.
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Die sich anschließende softwaregestützte Weiterverarbeitung des digitalisierten Bildes startet mit der Suche nach dem Spotarray zugeordneten Markierungen in dem Bild, welche die relative Lage des Spotarrays anzeigen, insbesondere in Relation zum Reaktionsträger (Probenmatrix – Probevolumenträger, Näpfchenträger). Dem schließt sich eine Auswertung des Bildes hinsichtlich der Parameteridentifikation im Layout des Spotarrays an, also die eigentliche das oder die Bilder auswertende Untersuchung der Test- oder Messfelder (Spots), zum Beispiel zur Farbbestimmung der Test- oder Messfelder. Hierbei wird zum Beispiel mittels automatischer Bildauswertung eine Färbung für einen oder mehrere der Messfelder (Messspots) bestimmt.
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Es kann vorgesehen sein, dass sowohl das Bestimmen der Relativlage unter Einbeziehung der Markierungen am Probevolumen als auch die optische Auswertung des Spotarrays, zum Beispiel mittels einer Farbbestimmung, ausgehend von ein und derselben optischen Bildaufnahme erfolgen. Alternativ können mehrere Bildaufnahmen erfasst werden und anschließend zur softwaretechnischen Bildauswertung herangezogen werden.
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Besonders vorteilhaft ist diese Vorgehensweise bei der Abarbeitung einzelner Reaktionsträger einzelner Proben oder der Zusammenstellung einzelner Reaktionsträger in einer Halterung, beispielsweise einem Rahmen einer 96well Mikrotiterplatte. Bei beiden Vorgehensweisen können die relativen Lagen der Reaktionsträger zueinander unterschiedlich bzw. gegeneinander verdreht sein. Dies erschwert die Parameteridentifikation im Layout des Spotarrays bzw. macht diese unmöglich.
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Beschreibung von weiteren Ausführungsbeispielen
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1a zeigt schematisch einen 16-Parameter-Spotarray in einem runden Reaktionsgefäß (Probenvolumen).
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1b zeigt schematisch den 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays. Einzelne Zonen (Parameter) weisen eine zum Untergrund sich abhebende Färbung in verschiedenen Intensitäten auf.
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1a zeigt beispielhaft ein zur Charakterisierung der Reaktionsträger (Parameteridentifikation im Layout des Spotarrays) durch die softwaregestützte Weiterverarbeitung des erhaltenen Images benötigtes Template. Das Template weist 16 Analysefelder auf. Zur zweidimensionalen Orientierung des Templates auf dem 16-Parameter-Spotarray und der damit in Zusammenhang stehenden Parameteridentifikation wird beispielhaft der Spot Nr. 1 verwendet. Die relative Lage aller weiteren Analysefelder zu Spot Nr. 1 definiert die im Spotarray erhaltenen Parameter.
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2a zeigt schematisch einen Riegel einer 96well Mikrotiterplatte, der acht Reaktionsträger enthält, die fest miteinander verbunden sind, und in denen jeweils ein 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays abgebildet ist. Die relativen Positionen der 16-Parameter-Spotarrays in den acht Reaktionsträgern unterscheiden sich nicht.
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2b zeigt schematisch die Darstellung einer 96well Mikrotiterplatte. Die beispielhafte Mikrotiterplatte kann durch einen Rahmen gebildet werden, in den bis zu 12 Riegel mit acht fest verbundenen Reaktionsträgern eingebracht sind. Es besteht allerdings auch die Möglichkeit, einzelne Positionen des Rahmens der Mikrotiterplatte mit einzelnen, nicht in Verbindung stehenden Reaktionsgefäßen zu bestücken. Beispielsweise könnte der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Positionen A1 und B1 mit jeweils einem Reaktionsgefäß bestückt werden.
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2c zeigt schematisch den Bereich des Rahmens einer 96well Mikrotiterplatte, der mit acht nicht miteinander verbunden Reaktionsträger bestückt ist, und in denen jeweils ein 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays abgebildet ist. Die relativen Positionen der 16-Parameter-Spotarrays in den acht Reaktionsträgern unterscheiden sich.
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3a zeigt schematisch einen Reaktionsträger (Probenvolumen) mit einem 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays, der mit einer strichförmigen Markierung versehen ist.
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3b zeigt schematisch einen Reaktionsträger mit einem 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays, der mit zwei strichförmigen Markierungen versehen ist.
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3c zeigt schematisch einen Reaktionsträger mit einem 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays, der mit einer punktförmigen Markierung versehen ist.
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3d zeigt schematisch einen Reaktionsträger mit einem 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays, der mit zwei punktförmigen Markierungen versehen ist.
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3e zeigt schematisch den Bereich des Rahmens einer 96well Mikrotiterplatte, der mit acht nicht miteinander verbunden Reaktionsträger bestückt ist, und in denen jeweils ein 16-Parameter-Spotarray nach Beendigung des Assays abgebildet ist. Die relativen Positionen der 16-Parameter-Spotarrays in den acht Reaktionsträgern unterscheiden sich. Jeder der Reaktionsträger ist mit einer strichförmigen Markierung versehen. Diese Markierung ermöglicht die Ausrichtung (Drehung) des für die softwaregestützte Weiterverarbeitung benötigten Templates.
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Die Markierungen 30, 31 sind in ihrer Relativlage zur Anordnung der Messfelder (Spotarray) festgelegt. Mithilfe dieser Markierungen 30, 31 kann dann bei der digitalen Bildverarbeitung der zuvor erfassten Bildaufnahmen die Lage der Probenvolumen in der Probenmatrix (vgl. zum Beispiel 2c) bestimmt werden.
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Bei der digitalen Bildauswertung wird zunächst nach den Markierungen 30, 31 gesucht. Im Anschluss daran erfolgt dann in Kenntnis der Relativlage der Markierungen 30, 31 die digitale Bildauswertung zur Bestimmung der Messfelder (Spots im Array). Auf diese Weise sind Messfehler vermieden, die bei der optischen Auswertung der Spotarrays entstehen können, wenn der zugehörige Reaktionsträger nicht korrekt ausgerichtet ist, zum Beispiel aufgrund einer Drehung des Reaktionsträgers.
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Aufgrund der vorab in elektronischer Form hinterlegten Information bezüglich der Relativlage der Markierung 30, 31 einerseits und des zugeordneten Spotarrays andererseits können nach dem Bestimmen der Markierungen 30, 31 die Messfelder des Spotarrays korrekt ausgewertet werden, beispielsweise indem eine Färbung des jeweiligen Messfeldes bestimmt wird. Die Information bezüglich der Lage der Markierungen 30, 31 kann auch genutzt werden, um die Darstellung des Messergebnisses auf einem Display der Messvorrichtung zum Beispiel der Darstellung in 1 entsprechend zu zeigen, also ohne eine Verdrehung.
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Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 202008009859 U1 [0004]
- WO 01/04608 A1 [0004]
- DE 3736632 C2 [0005]
