DE102013015112A1

DE102013015112A1 - Spaltbare Polyethylenglykol-(PEG)-Makromoleküle zum Einschluss von (Glyko-) Proteinen/Antigenen/Allergenen in abbaubaren Polyethylenglykol-(PEG)-Nanopartikeln sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE102013015112A1
Application number: DE201310015112
Authority: DE
Inventors: Holger Frey; Hannah Sarah Köhring; Joachim Saloga
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2015-03-19
Anticipated expiration: 2033-09-14
Also published as: DE102013015112B4

Abstract

Da bisher noch kein Transportsystem für Allergene (oder andere Antigene) entwickelt wurde, das zusätzlich zur Abschirmung der Allergene (Antigene) diese spezifisch und schnell in den Lysosomen wieder freisetzt, zeigen die bisherigen in vitro-Ergebnisse der hergestellten PEG-Nanopartikel vielversprechende Eigenschaften. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die auf der Basis des neuen, säurespaltbaren PEG-Acetal-Dimethacrylats hergestellten PEG-Nanopartikel die Anforderungen für den Transport, die Abschirmung und die Freisetzung des Allergens in den antigenpräsentierenden Zellen erfüllen. Dies kann die Sicherheit (Vermeidung der Erkennung durch IgE oder andere Antikörper) und Effektivität (Verhinderung der Degradation) erhöhen, speziell bei der Hyposensibilisierungsbehandlung von Allergien, aber auch allgemein zur Immuntherapie, z. B. bei Impfungen gegen Infektionskrankheiten oder zur Modulation des Immunsystems bei Krebs oder Autoimmunkrankheiten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung spaltbarer Polyethylengykol-(PEG)-Makromoleküle sowie Verfahren zum Einschluss von Peptiden und Proteinen in abbaubare, aus den Makromolekülen synthetisierte Poly(ethylenglykol)(PEG) Nanopartikel für biomedizinische, pharmakologische und kosmetische Anwendungen. Ziel der pharmazeutischen Entwicklung war es, Allergene (oder andere Antigene) umschließende Nanopartikel herzustellen, die zur Erhöhung der Sicherheit der spezifischen immunologischen Therapie von Patienten eingesetzt werden können – speziell bei Allergien (Hyposensibilisierung), aber auch allgemeiner bei Impfungen gegen Infektionskrankheiten oder auch zur Immunmodulation bei Krebserkrankungen sowie Autoimmunerkrankungen.
In biomedizinischen Anwendungen werden Nanocarrier für den Schutz und aktiven Transport von Wirkstoffen, wie z. B. Medikamenten, speziell Proteinen, z. B. Insulin^[1] und Zytokinen,^[2] sowie lebenden Zellen^{[3; 4]} genutzt. Der entscheidende Nutzen der Nanocarrier liegt in dem Schutz vor Degradation, in dem Erreichen einer höheren lokalen Konzentration, dem gezielten Transport zum Zielort im Körper^[5] oder auch der Vermeidung von unerwünschten Wirkungen (z. B. durch Erkennung durch Antikörper).
Die meisten zurzeit für Wirkstoff-Transport in medizinischen Anwendungen verwendeten synthetischen Polymere sind nicht bioabbaubar, welches zu einer Limitation der Freisetzung des Wirkstoffs und der sicheren Ausscheidung von Polymer-Rückständen aus dem Körper führt. Die Freisetzung des eingeschlossenen Wirkstoffs hängt allein von der Diffusion, dem Quellungsgrad eines Hydrogels oder der biologischen Abbaubarkeit (Hydrolyse oder enzymatischer Abbau) ab.^[6-8] Abbaubare Nanocarrier vereinen die Vorteile einer physikalischen Barriere zwischen dem verkapselten Wirkstoff und der Umgebung sowie die Ansprechbarkeit durch verschiedene Stimuli und die darauffolgende Freisetzung der Fracht.^[2]
Um diese Abbaubarkeit in Polymer Nanopartikeln zu etablieren, können verschiedene labile Gruppen in das Polymer-Rückgrat eingefügt oder als Crosslinker verwendet werden. Es werden z. B. pH-, wärme-, redox-potential-, enzym- und photoresponsive Gruppen verwendet.^[9-11] Groll et al. stellten bioaktive, abbaubare Gerüste dar, die die extrazelluläre Matrix nachstellen (PLGA, die Esterbindungen werden einer Hydrolyse unterzogen) und die Adhäsion von Zellen auf biomedizinischen Implantaten ermöglichen.^[12]
pH-labile Polymere werden weithin als. Nanocarrier zur Verabreichung von Medikamenten verwendet,^{[9; 6; 13; 14]} zum Beispiel in Form eines säurelabilen Linkers (wie Acetale, Ketale, Imine oder Hydrazone) zwischen dem Wirkstoff-Molekül und dem Polymer,^[15] als Block-Copolymer-formende Mizellen^[16] oder als Polymersomen, welche den Wirkstoff umschließen.^[17] Broccini et al. synthetisierten ein säurelabiles Polyacetal-Doxorubicin-Konjugat (APEG-Dox), welches im Vergleich zum unkonjugierten Dox eine höhere Plasmahalbwertszeit, eine geringere Toxizität und eine erhöhte Tumor-Akkumulation aufweist.^[15]
Polyethylenglykol (PEG), oder auch Poly(ethylenoxid)(PEO) genannt, wird üblicherweise durch anionische, ringöffnende Polymerisation von Ethylenoxid mit einer geeigneten Base erhalten. Aufgrund seiner guten thermischen Stabilität und geringen Reaktivität und Toxizität gehört PEG zu den am häufigsten verwendeten, biokompatiblen und wasserlöslichen Polymeren. PEG hat sowohl klinische Studien als auch mehrere Jahrzehnte der Anwendung, z. B. im Medikamententransport, der Kosmetik, der Oberflächen-Modifikation und in industriellen Prozessen durchlaufen.^[18] Weiterführende Information über PEG und seine Anwendungen sind der Fachliteratur wie z. B.^[19] zu entnehmen.
Säurespaltbare PEG-Moleküle, die eine Acetalgruppe beinhalten, wie Block-Copolymere PEG-Acetat-PS,^[20] dendrimer-artige PEG,^[21] Polykondensationen von PEG mit Aldehyden,^[22] Polyacetale aus Diphenol-Monomeren und PEG^[23] oder PEG, die eine Halbacetal-Funktion besitzen,^[24] wurden in den letzten Jahren veröffentlicht.
Die spezifische Immuntherapie mit Allergenen (SIT, Hyposensibilisierung) stellt derzeit das einzige kausal an der immunologischen Fehlregulation allergischer Erkrankungen ansetzende Therapieverfahren dar. Diese Therapie wird heutzutage hauptsächlich bei IgE-vermittelten allergischen Krankheiten wie der allergischen Rhinokonjunktivitis (Heuschnupfen), dem allergischen Asthma bronchiale oder der Anaphylaxie auf Insektengift eingesetzt. Die Wirkung der SIT beruht auf einer immunologischen Toleranzinduktion, die unter anderem durch regulatorische T-Lymphozyten vermittelt wird. Die Allergenapplikation wird aber durch auftretende Nebenwirkungen wie allergische Reaktionen, die in seltenen Fällen bis hin zum anaphylaktischen Schock reichen können, limitiert. Die Nebenwirkungen werden hauptsächlich durch spezifische IgE-Antikörper vermittelt, die eine Degranulation von basophilen Granulozyten und Mastzellen und damit eine Freisetzung von Entzündungsmediatoren wie z. B. Histamin herbeiführen.
Um die auftretenden Nebenwirkungen zu reduzieren, wird seit längerer Zeit versucht, die Allergene so zu modifizieren, dass die Erkennbarkeit der Allergene durch Antikörper (B-Zellepitope) vermindert ist, dabei jedoch die Stimulationsfähigkeit von T-Zellen (T-Zellepitope) erhalten bleibt. Diese sogenannten Allergoide, die durch Behandlung des Allergens z. B. mit Formaldehyd und Glutaraldehyd synthetisiert werden, erfüllen diesen Ansatz aber noch nicht zufriedenstellend. Weiterhin werden Allergene und Allergoide meistens an Trägermaterial wie Aluminiumhydroxid adsorbiert, welches als Depotvermittler und gleichzeitig als Adjuvanz wirken kann.
Neuere Ansätze bestehen darin, das Allergen in Nanopartikel zu verpacken und somit vor den Zellen des Immunsystems abzuschirmen. Verwendete Nanopartikel können Allergene einschließen, sie allerdings nur durch Diffusion und über einen längeren Zeitraum wieder freisetzen. Gleichzeitig können die als Transporter verwendeten Nanopartikel als Adjuvantien wirken. Durch den Einsatz geeigneter Adjuvantien kann die für die SIT verwendete Allergenkonzentration bei gleichbleibender Immunantwort verringert werden, was eine verminderte anaphylaktische Reaktion zur Folge hat.
Bei der hier beschriebenen Erfindung wurden biologisch abbaubare PEG-Nanopartikel entwickelt, die in antigenpräsentierende Zellen wie dendritische Zellen aufgenommen (u. a. verstärkt durch ihre Partikelnatur) und im sauren Milieu zur Freisetzung ihres Inhalts gespalten werden.
Polymer-Nanopartikel (NP) könnten ein großes Potential für die Behandlung von allergischen Erkrankungen wie Asthma und Heuschnupfen besitzen. Durch den Einschluss der Allergene (Proteine und Peptide) in NP könnte der Transport des Allergens zu den antigenpräsentierenden Zellen (APC), speziell den dendritischen Zellen (DC), ohne die Aktivierung des Immunsystems und Erkennung durch Antikörper realisiert werden. Eine gezielte und kontrollierte Freisetzung des Allergens innerhalb der APC könnte ein wesentlicher Schritt für die Modulation der Immunantwort gegen harmlose Allergene in Richtung von Toleranz oder Anergie sein. Die Verwendung von Nanocarrriern in der spezifischen Immuntherapie (SIT, Desensibilisierung) könnte dies gewährleisten und die zurzeit einzige kausal orientierte Therapie gegen allergische Erkrankungen^{[25; 26]} erheblich verbessern. Die Beschränkung der SIT, dass hohe Allergendosen applizierten Allergens zu verschiedenen Reaktionen wie allergischen Symptomen oder sogar Anaphylaxie führen können, könnte durch das „Verstecken” der Allergene in den Polymer-Nanopartikeln auf ihrem Weg von der Applikation bis in die APC, aufgehoben werden.^{[27; 28]} Aufgrund eines signifikanten pH-Unterschieds zwischen dem Lysosom und anderen Zellkompartimenten (z. B. dem Zytosol) und der Extrazellulärflüssigkeit werden die synthetisierten säurelabilen NP selektiv innerhalb der Lysosomen gespalten (siehe ).
Die Aufnahme in andere Zellentypen stellt kein Problem dar, da APC ausgiebige Endozytose und Makropinozytose betreiben, andere Zellen wie z. B. Endothelzellen nicht. Sollten die NP trotzdem aufgenommen werden, so wird das freigesetzte Allergen innerhalb der Lysosomen von Enzymen komplett in die Aminosäurebestandteile zerlegt und kann nicht zur allergischen Reaktion führen.
Mittels der in der Literatur bekannten Synthesemethoden werden Nanocarrier erhalten, die einen oder mehrere der folgenden Nachteile aufweisen:

– Viele NP-Synthesen werden in organischen Lösemitteln durchgeführt, was immer einen zusätzlichen (Trocknungs-)Schritt für die Überführung in eine wässrige, applizierbare Phase bedeutet.
– Die Beladung der NP mit Proteinen/Peptiden in organischen Lösungsmitteln kann zu deren Denaturierung führen, wodurch Wirkstoffmoleküle ihre native Form verlieren und ihre Funktion nicht mehr erfüllen können. Dies ist z. B. bei dem Einschluss von Protein-Wirkstoffen wie Zytokinen oder lebenden Zellen ein Problem.
– Da PEG nicht von Natur aus bioabbaubar ist, kann die wässrige NP-Lösung bei neutralen oder leicht basischem pH länger gelagert werden als wässrige Lösungen von z. B. PLA-NP. Dies ist ein entscheidender Vorteil bei einer geplanten oralen Applikation, da es dem Patienten nicht zumutbar wäre, die lyophilisierten NP selbst vollständig zu lösen.
– Die Molekulargewichte/Größen der erhaltenen NP sind nicht steuerbar und/oder streuen über einen weiten Bereich; die hergestellten NP sind dadurch für einen Einsatz in der Medizin, Pharmazie oder Kosmetik ungeeignet.
– Die Verwendung für biologische und medizinische Anwendungen ist stark eingeschränkt oder nicht vertretbar, weil die erhaltenen NP Spuren von toxischen Substanzen wie z. B. Katalysatoren oder Tensiden enthalten können.
– Wasserunlösliche NP können nur als Suspension injiziert werden. Suspensionen erschweren durch die physikalische Instabilität eine genaue Dosierung des Wirkstoffs, da sich der Wirkstoff „absetzt”, also nicht homogen gelöst bleibt.
– In den meisten oben genannten NP wird der Wirkstoff durch eine kovalente Bindung an den NP verpackt. Dies erfordert für jedes neue Molekül, das verkapselt werden soll, einen vorhergehenden Funktionalisierungsschritt.
– Chitosan-Nanopartikel, die ebenfalls Wirkstoffe zum Transport einschließen können, zeigen ein pH-abhängiges Verhalten. Sie können im sauren Milieu und durch Enzyme degradiert werden. Im neutralen oder basischen Milieu sind sie jedoch nicht löslich, da der Nanopartikel für die Löslichkeit eine positive Ladung benötigt.^[29] Die positive Ladung führt zu einer für bestimmte Anwendungen gewünschten Fähigkeit, epitheliale Tight Junctions zu öffnen, aktiviert jedoch auch Makrophagen und die Lymphozyten Proliferation und kann die Zytokinsekretion inhibieren.^[30]

Das hier vorgestellte System weist folgende Vorteile gegenüber den oben genannten, bereits publizierten Systemen, auf:

– Polyethylenglykol wird durch modifizierte Methacrylatgruppen funktionalisiert, die gleichzeitig eine Vernetzung der PEG-Ketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk (dem Nanopartikel) ermöglichen und, in einem späteren Schritt, den Abbau des Nanopartikels durch Spaltung der pH-sensitiven Acetalgruppen erlauben.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine funktionalisierte Verbindung (siehe ), umfassend:

1) Die Vernetzung durch polymerisierbare Gruppen, in diesem Beispiel Methacrylatgruppen, die den Aufbau von stabilen dreidimensionalen Nanopartikeln ermöglichen.
2) Die spaltbaren Gruppen, hier beispielhaft Acetalgruppen, die den Abbau der Nanopartikel ermöglichen und damit die Freisetzung der nicht-kovalent eingeschlossenen Allergene durch einen spezifischen Abbaumechanismus der NP. Der spezifische Abbaumechanismus ist der Hydrolyse von PLA- und PLGA-NP durch erheblich kürzere Abbauzeiten überlegen, zusätzlich führt er zu einem kompartimentspezifischen Abbau.
3) Das PEG-Rückgrat, das die Wasser- bzw. Pufferlöslichkeit des PEG-Acetal-DMAs gewährleistet. Diese ist einerseits für die Herstellung der Partikel notwendig (da der Einschluss der Allergene in Pufferlösung stattfinden muss) und andererseits für die Löslichkeit des Nanopartikels in Wasser/Körperflüssigkeiten bei allen pH-Werten.
4) Ein Molekulargewicht von PEG zwischen 1000 und 50000 g/mol um die Wasserlöslichkeit der Makromoleküle zu gewährleisten (Die Verwendung von kürzeren PEG-Ketten (wie in ^[31]beschrieben) führt nicht zu dem gewünschten Ergebnis, da zwar Polyethylenglykol und auch Oligoethylenglykole jeder Kettenlänge in Wasser löslich sind, nicht jedoch die funktionalisierte Form davon (PEG-Acetal-DMA). Durch den Einbau der unpolaren Methacrylat-Gruppen nimmt die Wasserlöslichkeit bei Verwendung kürzerer PEG-Ketten stetig ab. In der oben genannten Publikation wird n = 7 verwendet, welches nicht wasserlöslich ist.
5) In der Patentanmeldung WO 2010/138193 A3 wird ausschließlich die Verwendung von klassisch bioabbaubaren Polymeren genannt (wie z. B. Polylactid, Polyglycolid oder deren Copolymere). Das von uns verwendete Polymer PEG ist ein Polyether und damit nicht bioabbaubar, jedoch trotzdem biokompatibel. Dass es für potentielle Einschlussanwendungen im Körper Verwendung finden kann, liegt an der Struktur unserer Nanopartikel: Diese werden zwar kovalent zu dreidimensionalen Nanopartikeln verknüpft (und könnten in dieser Form vom Körper weder abgebaut noch ausgeschieden werden), erst der Einbau der Acetal-Spaltgruppen ermöglicht den Abbau der Nanopartikel zurück zu PEG-Segmenten mit niedrigem Molekulargewicht, die renal ausgeschieden werden können (die Grenze für die renale Filtration für PEG liegt bei etwa 20.000–40.000 g/mol). Die kurzen PEG-Abbaufragmente (vorzugsweise ca. 2000 g/mol) können renal ausgeschieden werden, so dass eine Vakuolisierung ausgeschlossen werden kann.
6) Die in der Patentanmeldung WO 2010/138193 A3 hergestellten NP sind im physiologischen pH nicht wasserlöslich. Die hier beschriebenen NP sind wasserlöslich und können daher als Lösung gehandhabt werden. Dies ist von Vorteil da wasserunlösliche NP nur als Suspension injiziert werden können, Suspensionen erschweren durch die physikalische Instabilität eine genaue Dosierung des Wirkstoffs, da sich der Wirkstoff „absetzt”.
7) Die Beladung der hier synthetisierten Nanopartikel erfolgt nicht-kovalent und nicht-ionisch, sodass das Einschlusskonzept auf jede denkbare Beladung erweiterbar ist (Proteine, DNA, ...), ohne dass zusätzliche Modifikationen (Funktionalisierung des Cargo-Moleküls) notwendig wären (siehe ).
8) Der Einschluss eines Gemisches verschiedener Proteine/Peptide z. B. zur kombinierten Hyposensibilisierung verschiedener Allergien sowie eines Gemisches von Impfstoffen mit anderen Molekülen wie z. B. Adjuvantien zur verbesserten Impfwirkung sind denkbar und einfach realisierbar.
9) Die Herstellung der NP mittels DAC hat die Vorteile einer sterilen Synthese mit kleinen Volumina und hohen Einschlusseffizienzen (ca. 60%). Bisher wurde die DAC nicht zur Nanopartikel-Synthese verwendet, sondern nur zur Liposomensynthese.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung spaltbaren PEG-Nanopartikeln zum Einschluss von Proteinen und Peptiden bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, umfassend die Schritte:

a) Die Synthese eines wasserlöslichen, spaltbaren Polyethylenglykol-Makromoleküls mit der Möglichkeit zur radikalischen Polymerisation über (Meth-)Acrylatgruppen.
b) Mischen des abbaubaren Makromoleküls mit Radikal-Initiator, zu verkapselndem Protein/Peptid und Phosphatpuffer z. B. mit Lipiden in der Dualen Asymmetrischen Zentrifuge (DAC)^[32] zur Darstellung der NP.
c) Abtrennen von nicht in die Liposomen eingeschlossenen Bestandteilen, Photopolymerisation und anschließendem Entfernen des Liposomen-Templates.

Vorzugsweise wird in Schritt a) ein neuartiges, wasserlösliches Polyethylenglykol-Acetal-Dimethacrylat(PEG-Acetat-DMA)-Makromolekül, welches eine oder mehrere säurespaltbare Acetalgruppen mit der Möglichkeit zur radikalischen Polymerisation über die Methacrylatgruppen in einem Molekül vereint, hergestellt. Die Wahl des Polymers PEG war aus oben beschriebenen Gründen (gute Wasserlöslichkeit, FDA Zulassung, Biokompatibilität) naheliegend, das Resultat ist ein abbaubares und biokompatibles Polymer (siehe ).
Das synthetisierte spaltbare PEG enthält eine spaltbare Gruppe, die eine oder mehrere geeignete Funktionalitäten enthält. Geeignete Funktionalitäten sind z. B., jedoch nicht ausschließlich, Acetale, Ketale, Disulfide (siehe ), Protease-spaltbare Peptide, Amide, Ester oder eine Kombination aus diesen.
Eine ¹H-NMR-Kinetik ergab, dass das PEG-Acetat-DMA-Makromolekül innerhalb von 48 h bei pH 5 und 37°C zu 50% lysiert wird, wodurch eine Freisetzung des eingeschlossenen Wirkstoffs erreicht werden kann. Das PEG-Acetat-Makromolekül ist mit zwei Methacrylatgruppen funktionalisiert, die eine radikalische Polymerisation der Makromoleküle zu einem dreidimensional vernetzten PEG-Nanopartikel ermöglichen.
Vorzugsweise werden in b) zur Formgebung sowie zur Vorgabe der Nanopartikel-Größe Liposomen als Template verwendet. Die mit einer wässrigen Phase gefüllten Liposomen, die das PEG, den Photoinitiator und das Protein enthalten, werden mit der Dualen Asymmetrischen Zentrifugations(DAC)-Methode hergestellt. Die Liposomen können dabei aus einer Mischung von unterschiedlichen Lipiden (wie z. B. aber nicht ausschließlich Phosphatidylcholin, 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, oder ein Lipidgemisch) und Cholesterin hergestellt werden. Auch PEGylierte Lipide oder PEGyliertes Cholesterin und die dadurch hergestellten „Stealth-Liposomen” können als Template verwendet werden. Da die Liposomenpräparation bei der DAC in einem Schraubdeckel-Reaktionsgefäß stattfindet, können alle erforderlichen Herstellungsschritte sowie die Aufreinigung unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Es entstehen homogene Liposomen mit einem Durchmesser von 100–200 nm, die Proteine mit einer Effizienz von 40–60% einschließen können.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen des Verfahrens zeichnen sich dadurch aus, dass:

– die zu verkapselnde Ladung jedes medizinisch wirksame Molekül oder Effektmolekül wie z. B. ein Peptid, Protein, ein Wirkstoff oder Adjuvanz sein kann;
– die in a) beschriebenen spaltbaren PEG-Makromoleküle unterschiedliche labile Linker, wie z. B. aber nicht ausschließlich Acetale, Ketale, Disulfide, Protease-spaltbare Peptide, Amide, Ester sein können, jedoch stets wasserlöslich sein müssen;
– die in a) beschriebenen spaltbaren PEG-Makromoleküle mind. zwei polymerisierbare Gruppen enthalten. Diese können, müssen aber nicht ausschließlich Acrylate und Methacrylate sein;
– ein möglicher Schritt 4) durchgeführt wird um weitere funktionalisierende Moleküle an die NP anzubringen, z. B. Liganden für bestimmte Targetmoleküle auf antigenpräsentierenden Zellen (wie z. B. dendritischen Zellen, B-Zellen oder Makrophagen). Dies könnten z. B., aber nicht ausschließlich Liganden für Moleküle wie CD33, CCR7, DC-SIGN, DEC205, ILT7, Langerin, MHC class 1 H-2K^b, PDCA-1, CD314 und Siglec-H; B-Zell-Marker wie z. B. CD20cy, CD79a, bcl-2, CD5, CD10, CD15, CD23, CD30, CD43 und Makrophagen-Marker wie z. B. CD14, CD40, CD11b, CD64, F4/80 (Maus)/EMR1 (Human), Lysozym M, MAC-1/MAC-3 und CD68 sein.
– In einem möglichen Schritt 4 können zusätzlich oder statt den oben genannten Markern funktionelle Gruppen angebracht werden, die spezifisch an eine Einheit (z. B. ein Kohlenhydrat, Lipid, Protein, Toxine, ein kleines Molekül) einer APC oder deren Rezeptoren binden können wie z. B. Mannose, Folsäure oder weitere.

Es konnte gezeigt werden, dass die PEG-Nanopartikel in DCs aufgenommen und in deren Lysosomen die Allergene wieder freigesetzt werden. Durch konfokalmikroskopische Aufnahmen konnte die Endozytose der PEG-Nanopartikel nachgewiesen werden (siehe ). Die Lyse der abbaubaren PEG-Acetal-DMA-Nanopartikel konnte in vitro ebenfalls durch Konfokalmikroskopie-Aufnahmen gezeigt werden. Die polymerisierten PEG-Nanopartikel mit Liposomenhülle sind bei 4°C über mindestens vier Monate stabil.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, hoch-funktionalisierte NP mit einstellbaren, d. h. für eine bestimmte Anwendung angepassten Eigenschaften zu schaffen. Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Variation der eingesetzten PEG-Makromoleküle, umfassend:

– die Verwendung von unterschiedlichen Molmassen des Makromoleküls, wodurch die Vernetzungsdichte beeinflusst wird je nach Größe des zu verkapselndem Kargo.
– den Einbau von einer oder mehreren spaltbaren Gruppen in das Makromolekül um somit die Abbaugeschwindigkeit zu regulieren

Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen der NP sind dadurch gekennzeichnet, dass:

– vorzugsweise NP mit einer Größe von 100–200 nm erhalten werden (PdI ≤ 0,2)
– NP mit einer Größe von 5–5000 nm durch die Wahl geeigneter Synthesebedingungen herstellbar und zur Aufnahme in antigenpräsentierende Zellen wie z. B. aber nicht ausschließlich dendritische Zellen geeignet sind.

Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen des Verfahrens zeichnen sich dadurch aus, dass:

– zur NP Synthese eine große Bandbreite an bekannten Herstellungsmethoden angewandt werden können um die Größe der NP weitere sowie die Form der NP (Nanosphäre, Nanokapsel, ...) zu verändern. Die beschriebenen NP können z. B. durch Nanoprezipitation, durch einfache und doppelte Emulsions-Lösemittel-Verdampfungs-Technik, Mikroemulsionstechniken, sowie weitere in der Literatur beschriebene Herstellungsmethoden synthetisiert werden.

Die erfindungsgemäßen NP sind vorzugsweise nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 15 hergestellt.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Zeichnungen und Beispielen näher erläutert. Es zeigen:
: Schema der Allergenfreisetzung;
: Synthese von PEG-Acetal-DMA;
: Schematische Darstellung der dreidimensionalen Vernetzung;
: PEG-Acetal-DMA-Makromolekül;
: Mögliches Syntheseschema für die Darstellung von PEG-Disulfid-DMA;
: Konfokalmikroskopie-Aufnahme PEG-Nanopartikel in DCs;
: GPC-Elugramme PEG-Acteal-DMA;
zeigt eine schematische Darstellung der Aufnahme eines erfindungsgemäßen NP mit verkapseltem Allergen in eine antigenpräsentierende Zelle. Dargestellt ist der Abbau des Nanocarriers und die resultierende Freisetzung des Allergens im Endolysosom sowie die Prozessierung und Präsentation des freigesetzten Allergens auf MHC-Molekülen der antigenpräsentierenden Zellen.
zeigt das Syntheseschema des erfindungsgemäßen säure-labilen PEG-Acetal-DMA. Erfindungsgemäß ist ein Edukt selbst-synthetisiertes oder kommerzielles Polyethylenglykol mit verschiedensten Molekulargewichten. Als Reaktionspartner wird vorzugsweise ein Vinylether verwendet, der die polymerisierbare (Meth-)Acrylatgruppe enthält. Die Katalyse der Reaktion erfolgt mit para-Toluolsulfonsäure, ist jedoch auch mit anderen Katalysatoren möglich. Nach Quenchen der Reaktion erfolgt die Aufreinigung durch Fällung in eiskaltem Ether.
Die Synthese mit einem niedermolekularen Initiator, welcher die spaltbare Gruppe enthält, ist ebenfalls durchgeführt worden. Die Deprotonierung des spaltbaren Initiators erfolgt mittels starker Basen. Als Basen eignen sich Alkalimetalle, insbesondere Natrium, Kalium und Cäsium; Hydroxide wie Natrium-, Kalium- und Cäsiumhydroxid; Alkoxide wie Natriummethylat, Kaliummethylat, Natriumethoxid oder Kalium-tert-butylat, Natriumnaphthalid, Kaliumnaphthalid, Diphenylmethyl-Natrium oder Diphenylmethyl-Kalium. Die Polymerisation wird ausgeführt, indem der Initiator mit Ethylenoxid umgesetzt wird. Optional kann statt Ethylenoxid auch ein substituiertes Oxiran, wie z. B. Glycidylether oder Glycidylamine, zur Erhöhung der orthogonalen Funktionalitäten im Molekül verwendet werden.
Die radikalisch polymerisierbare Gruppe kann durch verschiedene Methoden eingeführt werden, z. B. aber nicht ausschließlich durch „Endcapping” mit Methacrylsäureanhydrid, Methacrylsäureclorid sowie weiteren in der Literatur verwendeten (Meth-)-Acrylsäurederivaten. Alternativ kann um die Polymerisation zu beenden ein protisches Reagenz zugeführt werden, und die gebildete OH-Funktionalität des PEG in der enzymatisch katalysierten Umesterung (CALB, (Novozym 435)) mit einem Vinylmethacrylat umgesetzt werden.
zeigt eine schematische Darstellung der dreidimensionalen Vernetzung der spaltbaren PEG-Makromoleküle zu den gewünschten Nanopartikeln. Bei der Vernetzung werden das freie Protein und der Photoinitiator eingeschlossen. Durch einen spezifischen Stimulus wird das eingeschlossene Protein durch den Abbau der Nanocarrier wieder freigesetzt.
zeigt die chemische Struktur des hergestellten PEG-Acetal-DMA-Moleküls.
zeigt eine konfokalmikroskopische Aufnahme von mit PEG-Nanopartikeln inkubierten DCs (A = Färbung des Zellkerns mit Hoechst 33342, B = Lysotracker^® green, C = in Nanopartikel eingeschlossenes fluoreszenzmarkiertes Allergen, D = Überlagerung A – C). Die Co-Lokalisierung von Nanopartikel und Lysosom ist als gelb-orangene Fluoreszenz sichtbar.
zeigt die Überlagerung von 4 GPC-Elugrammen (Eluent DMF, PEG Kalibrierung): in blau das unfunktionalisierte PEG 2000, in violett das funktionalisierte PEG-Acetal-DMA mit einem Molekulargewicht (Mn) von 2300 g/mol, in grün das in für 48 Stunden in PBS mit pH 7 gelöste PEG-Acetal-DMA und in rot das für 48 Stunden in PBS gelöste, auf pH 1 angesäuerte PEG-Acetal-DMA.

Die charakteristischen Parameter einiger erfindungsgemäßer PEG-Acetal-DMA sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1: Übersicht der synthetisierten PEG-Acetal-DMA-Moleküle mit Charakterisierung

Mn PEG (berechnet)	Mn (GPC)/g/mol	PdI (GPC)	Mn (NMR)/g/mol
1323	1277	1,31	1816
2323	2487	1,08	2557
3323	3450	1,15	3268
4323	4703	1,07	3707
6323	7118	1,2	6101
10323	10116	1,29	15500
20323	17680	1,29	45845

Die Abbaukinetik der erhaltenen Polymere wird mittels Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) analysiert. Im Fall von PEG-Acetal-DMA können mittels ¹H-NMR-Spektroskopie die Wasserstoffatome nach ihrer chemischen Bindung unterschieden werden. Die quantitative Auswertung der ¹H-NMR-Spektren gestattet es, die relative Anzahl verschiedener Wasserstoff enthaltender Gruppen zu ermitteln. Hierzu werden die Intensitäten bzw. Flächen der bei charakteristischen Frequenzen (bzw. Frequenzverschiebungen) auftretenden Resonanzlinien (bzw. Resonanzpeaks) integriert und miteinander verglichen. Üblicherweise erfolgt die Integration softwaregestützt numerisch, ggf. anhand einer durch nichtlineare Regression an die gemessenen Resonanzlinie angepassten Modellfunktion (non-linear least squares fit). Anhand der Peakintensitäten der ¹H-NMR-Spektren können verschiedene Verhältnisse zwischen ungespaltenem und gespaltenem Makromolekül sowie das Molekulargewicht bestimmt werden.
Die Größe der erfindungsgemäß hergesteliten Polymere wird mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) analysiert. Desweiteren wurde der Abbau des erhaltenen PEG-Acetal-DMA mittels GPC analysiert (siehe ).
Die anhand von Protonen-NMR bestimmten Molekulargewichte stimmen gut überein mit den durch GPC erhaltenen Werten.
Im Weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Modifikation der funktionellen Verbindungen gemäß den Ansprüchen 9 und 10. Diese Modifikationen dienen dazu, die Aufnahme in antigenpräsentierende Zellen zu erhöhen und die Aufnahme noch spezifischer auf einen Zelltyp zu begrenzen.
Im Folgenden werden beispielhafte Syntheseverfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wiedergegeben.
Beispiel 1
Herstellung von PEG-Acetal mit einem Molekulargewicht von 2300 g/mol
Es wurde wie folgt verfahren: 2 g (1 mmol) PEG₂₀₀₀, 781 μL (5 mmol) Vinyl-HEMA und 19 mg (0,1 mmol) para-Toluolsulfonsäure (pTSA) wurden in 5 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden noch 20 mg Hydrochinon als Radikalinhibitor zugegeben und alles zusammen 25 min bei Raumtemperatur gerührt. Der Reaktionsansatz erwärmte sich leicht. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion mit 27,7 μL (0,2 mmol) Triethylamin durch Erhöhung des pH-Wertes auf 9–10 gequencht. Die Aufarbeitung erfolgte durch Ausschütteln mit dem gleichen Volumen 1M NaOH. Die wässrige Phase wurde zweimal mit dem gleichen Volumen Dichlormethan gegengeschüttelt. Nach der Vereinigung der organischen Phasen und deren Trocknung mit Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Das Produkt wurde in kaltem Ether gefällt und abzentrifugiert. Es wurden weitere 20 mg Hydrochinon als Radikalinhibitor zugegeben und das Produkt zunächst am Rotationsverdampfer, anschließend zur vollständigen Trocknung über einen Zeitraum von 24 h am Hochvakuum getrocknet, um das erfindungsgemäße Polymer mit einer Ausbeute von 80 bis 90% des Reaktionsgemisches zu erhalten. Bei dem Produkt handelt es sich um einen farblosen Feststoff.
Beispiel 2
Herstellung von Nanopartikeln mittels DAC
Es wurde ein 60 mg Ansatz hergestellt, der aus 21 mg Lipidmischung (Egg-Phosphatidylcholin und Cholesterin im Verhältnis von 55 mol%:45 mol%) und 39 μL Flüssigkeitsmischung bestanden. Die Lipide wurden in Ethanol gelöst und über Nacht in einer Vakuumzentrifuge eingedampft. Die Schraubdeckeleppis wurden eine weitere Nacht an der Gefriertrocknung getrocknet, anschließend wurden zu den Lipiden 60 mg Glasbeads gegeben. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase betrug 19,5 mg PEG-Acetal-DMA, 28 μL PBS, 0,5 μL Photoinitiator (PI), 10 μL einer 15 mg/mL Proteinlösung. Der Reaktionsansatz wurde mind. 10 min inkubiert. Die Ansätze wurden 30 min bei 3500 rpm in der DAC zentrifugiert. Als letztes folgte ein Redispersionsschritt, in dem 120 μL PBS zugegeben wurden und der Ansatz zweimal 2 Minuten bei 3500 rpm in der DAC zentrifugiert wurde. Zwischen diesen beiden Zentrifugationsschritten wurden die Proben im Probenhalter jeweils um 180° gedreht, um eine vollständige Redispersion zu ermöglichen.
Die Liposomen wurden dreifach mit Centrisart I-Röhrchen mit einem MWCO von 100000 Da aufgereinigt. Die Probe wurde in das äußere Röhrchen pipettiert und anschließend der Schwimmer vorsichtig auf in das äußere Röhrchen gesetzt. Es wurde 60 min bei 3200 rpm und 5°C zentrifugiert. Die Photopolymerisierung erfolgte für 10 s bei 365 nm.
Um die Liposomen abzulösen, wurde Chloroform zugegeben, gevortext und nach der Phasentrennung die organische Phase mit den Lipiden mit einer Spritzenkanüle abgenommen. Dieser Schritt wurde noch ein weiteres Mal wiederholt, anschließend wurde verbleibendes Chloroform durch Trocknung unter leichtem Vakuum für mind. 1 h entfernt.
Beispiel 3
Herstellung von Nanopartikeln mittels DAC
Es wurde ein 50 mg Ansatz hergestellt, der aus 17,5 mg Lipidmischung (MPEG-DSPE, EPC3 und Cholesterin im Verhältnis von 5 mol%:57 mol%:38 mol%) und 32,5 μL Flüssigkeitsmischung bestanden. Die Lipide wurden in Ethanol gelöst und über Nacht in einer Vakuumzentrifuge eingedampft. Die Schraubdeckeleppis wurden eine weitere Nacht an der Gefriertrocknung getrocknet, anschließend wurden zu den Lipiden 300 mg Keramikbeads gegeben. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase betrug 10,5 mg PEG-Acetal-DMA in 16 μL PBS, 0,5 μL Photoinitiator (PI), 16 μL einer 15 mg/mL Proteinlösung. Der Reaktionsansatz wurde 10 min inkubiert. Die Ansätze wurden 20 min bei 2500 rpm in der DAC zentrifugiert. Als letztes folgte ein Redispersionsschritt, in dem 100 μL PBS zugegeben wurden und der Ansatz zweimal 2 Minuten bei 2500 rpm in der DAC zentrifugiert wurde. Zwischen diesen beiden Zentrifugationsschritten wurden die Proben im Probenhalter jeweils um 180° gedreht, um eine vollständige Redispersion zu ermöglichen.
Die Liposomen wurden dreifach mit Centrisart I-Röhrchen mit einem MWCO von 100000 Da aufgereinigt. Die Probe wurde in das äußere Röhrchen pipettiert und anschließend der Schwimmer vorsichtig auf in das äußere Röhrchen gesetzt. Es wurde 60 min bei 3200 rpm und 5°C zentrifugiert. Die Photopolymerisierung erfolgte für 10 s bei 365 nm.
Um die Liposomen abzulösen, wurde Chloroform zugegeben, gevortext und nach der Phasentrennung die organische Phase mit den Lipiden mit einer Spritzenkanüle abgenommen. Dieser Schritt wurde noch ein weiteres Mal wiederholt, anschließend wurde verbleibendes Chloroform durch Trocknung unter leichtem Vakuum für mind. 1 h entfernt.
Die Erfindung sieht als Anwendungsgebiet vor: Den Einschluss von Proteinen zur Abschirmung z. B. gegen die Erkennung durch Antikörper (z. B. der IgE-Klasse zur Vermeidung allergischer Reaktionen vom Soforttyp) aber auch Abschirmung gegen andere Einwirkungen, wie z. B. degradierenden Enzymen, Einschleusung in antigenpräsentierende Zellen (eventuell verstärkt durch weitere Funktionalisierung der Oberfläche), Abbau der Abschirmung im Zellinneren und Freisetzung der Proteine im endolysosomalen Kompartiment bei saurem pH-Wert, z. B. zur Antigenpräsentation an T-Zellen für die Immuntherapie (z. B. bei allergischen Krankheiten im Sinne einer Hyposensibilisierung). Branche: Pharma, z. B. Hersteller von Präparaten zur Hyposensibilisierung bei allergischen Krankheiten.
Als weitere Anwendungen sind andere Formen der Immuntherapie bei anderen Krankheiten mit überschießenden Immunreaktionen mit dem Ziel der Toleranzinduktion denkbar: Autoimmunkrankheiten wie Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis etc. Die dargestellten NP könnten auch zur Immuntherapie zur Verstärkung der Immunantwort bei Krebserkrankungen und Infekten (verbessertes Impfprinzip) genutzt werden, da die Abschirmung der Proteine deren Zerstörung verhindern kann (Elimination nach Antikörperbindung, proteolytischer Abbau etc.). Bei Impfungen wird ein Teil der unerwünschten Wirkungen (z. B. überschießende Reaktionen) durch Antikörper (z. B. IgG-Antikörper) gegen das Impfantigen vermittelt. Auch bei der Immuntherapie von Krebserkrankungen und Autoimmunerkrankungen kann die Abschirmung des Antigens hilfreich sein (Verhinderung von unerwünschten Wirkungen, Verhinderung des vorzeitigen Abbaus).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010/138193 A3 [0016, 0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Groll et al. [0004]

Claims

Verfahren zur Synthese von spaltbaren PEG-Verbindungen sowie zur Herstellung von Nanopartikeln aus den Makromolekülen, umfassend die Schritte: a) Die Synthese eines wasserlöslichen, spaltbaren Polyethylenglykol-Makromoleküls mit der Möglichkeit zur radikalischen Polymerisation über (Meth-)Acrylatgruppen. b) Mischen des abbaubaren Makromoleküls mit Radikal-Initiator, zu verkapselndem Protein/Peptid und Phosphatpuffer z. B. mit Lipiden in der Dualen Asymmetrischen Zentrifuge (DAC) zur Darstellung der NP. c) Abtrennen von nicht in die Liposomen eingeschlossenen Bestandteilen, Photopolymerisation und anschließendem Entfernen des Liposomen-Templates
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) ein neuartiges, wasserlösliches Polyethylenglykol-Acetal-Dimethacrylat (PEG-Acetal-DMA)-Makromolekül verwendet wird, welches eine oder mehrere spaltbare Gruppen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (a) verwendete Makromolekül mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, wobei die funktionelle Gruppe z. B., jedoch nicht ausschließlich, Acetale, Ketale, Disulfide, Proteasespaltbare Peptide, Amide, Ester oder eine Kombination aus diesen ist, jedoch stets wasserlöslich sein müssen. Dies wir durch die Wahl einer PEG-Kettenlänge von 1000–50000 g/mol gewährleistet.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Makromolekül mit einer oder mehreren polymerisierbaren Gruppen funktionalisiert ist, die eine radikalische Polymerisation zu einem dreidimensional vernetzten PEG-Nanopartikel ermöglichen.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Molmassen des Makromoleküls (Mn = 1000–50000 g/mol) verwendet werden, wodurch die Vernetzungsdichte beeinflusst wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der spaltbaren Gruppen variiert wird, um somit die Abbaugeschwindigkeit zu regulieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in b) vorzugsweise aber nicht ausschließlich Liposomen zur Formgebung sowie zur Vorgabe der Nanopartikel-Größe als Template verwendet werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu verkapselnde Fracht jedes medizinisch wirksame Molekül oder Effektmolekül wie z. B. ein Peptid, Protein, ein Wirkstoff oder Adjuvanz sein kann.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein möglicher Schritt 4) durchgeführt wird um Target-Moleküle an die NP anzubringen. Die Targetmoleküle sind auf antigenpräsentierenden Zellen vorhanden oder werden dauerhaft bzw. nach Aktivierung exprimiert. Dies könnten z. B., aber nicht ausschließlich DC-Marker, B-Zell-Marker und Makrophagen-Marker sein.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein möglicher Schritt 4) durchgeführt wird um zusätzlich oder statt den in Anspruch 7 genannten Markern funktionelle Gruppen angebracht werden, die spezifisch an eine Einheit (z. B. ein Kohlenhydrat, Lipid, Protein, Toxine, ein kleines Molekül) einer APC oder deren Rezeptoren binden können wie z. B. Mannose, Folsäure oder weitere.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise NP mit einer Größe von 5–5000 nm erhalten werden (PdI ≤ 0,2)
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zur NP Synthese eine große Bandbreite an bekannten Herstellungsmethoden angewandt werden kann um die Größe der NP weitere sowie die Integrität der NP (Nanosphäre, Nanokapsel, ...) zu verändern.
Verwendung eines funktionellen Nanopartikels nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung von Kosmetika, Shampoos, Lotionen und Hygieneartikeln.
Verwendung eines funktionellen Nanopartikels nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung von Arzneimitteln.
Verwendung eines funktionellen Nanopartikels nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung von Schmiermitteln, Klebstoffen und synthetischen Fasern.