CN102389572A - 一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。该纳米球具有多孔且孔径可控的结构，从而控制药物较快、稳定地释放。该纳米球表面偶联有PEG链及靶向肿瘤的特异性分子，能够有效延长药物在体内的循环周期，改善纳米球对肿瘤细胞的亲和能力，提高药物生物利用度。另外，该纳米球有较低的毒副作用和更好的抑瘤效果。本发明还提供了一种制备装载(或联合装载)难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的方法，即利用壳聚糖/羧化壳聚糖的氨基交联成球，羧化壳聚糖上的羧基偶联PEG链并嫁接靶向分子，能够控制药物以原位结晶的形式均匀分散在壳聚糖及其衍生物纳米球中，极大的提高药物的装载率，稳定药物的释放速率。

Description

一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及纳米载体在生物技术领域的应用，具体公开了一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球、制备方法及其应用，装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球经静脉注射后到达病变部位，发挥药效。此发明具有潜在的临床治疗应用价值。 

背景技术

恶性肿瘤已经成为严重危害全球人类健康的常见致命性疾病之一，其近年来发病率和死亡率都呈增加的趋势。据WHO统计，2002年全世界因恶性肿瘤死亡人数达710.6万。我国2000年癌症发病人数180～200万，死亡140～150万。由于肿瘤形成的机制还不十分清楚，因此肿瘤的早期诊断、临床治疗及预后评估等都存在着非常多的困难。目前，临床上恶性肿瘤的治疗主要是采用手术、放疗、化疗、生物治疗(包括免疫治疗)等综合治疗手段，其中化疗已经成为各种晚期恶性肿瘤有效治疗的基础。然而，临床上常用较为有效的抗肿瘤药物(如紫杉醇、喜树碱等)多为难溶性药物，给其应用带来巨大的挑战。另外，抗肿瘤药物在体内呈全身性分布，肿瘤组织内很难达到有效药物浓度，由于其对肿瘤部位的靶向性不明显，进而对其他实质性器官造成不可逆转的损害，造成全身毒性反应，常常导致化疗失败。 

在众多的难溶性抗肿瘤药物中，紫杉醇(PTX)是红豆杉属植物中一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的广谱抗癌药物，对肺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌等都具有良好的治疗作用，是一种非常典型的难溶性抗肿瘤药物。为了解决其难溶问题，临床使用的注射制剂是将药物溶于聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的混合溶媒中，经葡萄糖或氯化钠稀释后进行静脉注射。这不仅会引起血管炎症，而且聚氧乙烯蓖麻油在体内降会释放组胺，从而导致严重的副反应。因此，病人在给药前不得不先注射抗过敏药物，导致整个治疗过程繁琐和不便，而且还需谨慎监测用药过程。O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇(AGM 1470)是近年来刚开发的一种烟曲霉素的活性类似物，对新生血管具有很好的抑制作用。然而，由于其本身的难溶性，临床上不得不加入助溶剂等以增加血液中药物浓度。II期临床试验证明，其血药清除率高，副作用非常大，主要表现为恶心、呕吐、腹泻、神经毒性、疲乏、胃炎、皮疹等。很多患者也因此放弃治疗。 

尽管科学家们为此做了很多的研究，例如转向新型制剂的研究，包括将药物装载在脂质体、聚合物胶束、聚乳酸(PLA)和固体脂质体纳米球内等。如专利CN 102166189A公开了一种靶向和荧光双功能的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体。该难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，由固态脂质、液态脂质、 表面活性剂和难溶性抗肿瘤药物形成内部包载药物的脂质载体，脂质载体表面经过化学修饰，共价连接上具有肿瘤靶向的配体，可以延长难溶性抗肿瘤药物的体内循环时间，提高难溶性抗肿瘤药物的生物利用度，还可通过荧光成像用于肿瘤的定位诊断。然而，脂质体在体内容易被酶类氧化，稳定性差，释放药物缓慢，突释现象严重。而聚合物胶束由于在血液中会被稀释到临界胶束浓度以下，也存在着稳定性差的问题。PLA、固体脂质体等纳米球疏水性强，虽然对难溶性药物可能有较高的包埋率，但由于材料疏水性强，造成释药速率缓慢、血内清除率高和生物利用度低等问题。另外，这些方法还存在着规模化制备困难、产品批次间差异性大的问题。为了提高难溶性药物的水溶性、解决目前注射制剂严重毒副作用及现行研发制剂存在的问题，急需开发一种亲水性好、载药率高、稳定性好、生物利用度高的靶向给药体系。可生物降解聚合物纳米球在难溶性药物包埋和传输方面具有潜在优势，通过对纳米球制备材料筛选和制备过程控制，能够使难溶性药物以微晶或细小颗粒形式被包裹于内部，可大大改善难溶性药物溶出。纳米球可以通过EPR效应(实体瘤组织的高通透性和滞留效应)到达肿瘤部位，实现药物的被动传输。另外，纳米球可以在表面修饰一具有隐形效果的PEG链和肿瘤靶向分子，延长药物在体内的循环周期，提高药物的靶向性，进一步提高药效。如专利CN 102083742A公开了一种制造尺寸均匀的、含难溶性药物的聚合物纳米颗粒的方法，具体地，所述方法包括：第一步，将生物可降解的聚合物溶解在非挥发性的极性有机溶剂中；第二步，将难溶性药物添加到水和所述生物可降解的聚合物的溶液中以生成分散液；第三步，在低机械能水平搅拌条件下，将所述分散液批量添加到乳化剂溶液中。该发明的聚合物纳米颗粒能通过使用非挥发性的极性溶剂尤其是与水具有相似极性的溶剂作为生物可降解的聚合物与难溶物质的混合溶液的溶剂、并在乳化过程中采用低机械能条件和批量添加分散液的简便方法制造纳米尺寸的、小而均匀的聚合物纳米颗粒。该聚合物纳米颗粒的优点为：包含在聚合物颗粒中的难溶性药物的溶出度得到显著提高，且所述难溶性药物逐渐且稳定地得以释放，并长期保持在恒定浓度。但到目前为止，还未成功开发出兼具隐形和靶向的应用于体内难溶性药物传输的有效纳米球载体，严重限制了难溶性抗肿瘤药物的临床应用。 

壳聚糖是一种天然的阳离子生物高聚物，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物可降解性等优点，是制备难溶性药物纳米载体的理想材料。CN1760213A公开了一类季铵化壳聚糖衍生物，尤其是能形成两亲性聚合物分子的季铵化壳聚糖衍生物，其能对难溶性药物具有增溶作用，并且载药后形成的胶束粒径小，约为50nm。此外，还公开了这类衍生物的制备方法、其作为难溶性药物增溶剂的作用以及含其的药物组合物。CN 1698899A公开了一类以壳聚糖或其衍生物作为药物载体的新型药物组合物，能被载体负载的药物主要包括抗肿瘤药物、难溶于水的非抗肿瘤药物和DNA，方法是通过在壳聚糖分子上接枝疏水性侧链基团，而获得水溶性的壳聚糖衍生物再以它为载体负载抗肿瘤药物或难溶于水的非抗肿瘤药物或DNA，以及直接将抗肿瘤药分子或其它药物通过 化学键与壳聚糖分子相连接，制备具有新型载体的高分子药物。 

目前作为难溶性药物载体的壳聚糖及其衍生物存在以下难题：(1)亲水性的壳聚糖纳米球无法实现对难溶性药物的直接装载，本发明采用O/W/O复乳法实现对难溶性药物的装载，复乳液进一步固化即可制得装载难溶性药物的纳米球。复乳液特别是纳米复乳液滴在制备过程中的稳定性是一个极大的挑战。(2)难溶性药物如紫杉醇通常在制备过程中很容易析晶形成大的晶体颗粒而破坏乳液，造成药物泄漏甚至包埋失败。(3)纯的壳聚糖纳米球具有实心结构，释放液很难进入纳米球，导致药物释放速率缓慢。(4)壳聚糖制备的纳米球大多采用化学交联法，经化学交联固化后，壳聚糖纳米球表面的功能基团氨基由于交联时被占用，无法进一步连接PEG链或嫁接靶向分子。(5)制备方法非常有限，主要采用机械搅拌法，采用这种方法在制备乳液时，由于粒径不均一，小的乳滴会被大的乳滴吸收，同时大的乳滴又会因剪切力的作用而破坏，这导致所制得的壳聚糖纳米球粒径很不均一。而且，由于乳滴的粒径不均一，在交联过程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，从而会形成很多交联凝聚物。同时，在液滴的合并和破裂过程中，内包药物容易逃逸到液滴外面，导致药物的包埋率降低。纳米球粒径的不均一还会为壳聚糖及其衍生物纳米球的实际应用带来诸多困难。(6)大多数纳米球经静脉注射给药后会被网状内皮系统识别并迅速清除，使药物无法达到治疗浓度。(7)简单的纳米球载体由于缺乏靶向性，给正常机体组织带来不可恢复的毒副作用。 

发明内容

针对现有技术中装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。 

所述装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球粒径均一，多分散指数在0.2以内，对难溶性药物的载药率高达10-50％。通过在纳米球基质中改变壳聚糖与羧化壳聚糖的比例，实现纳米球多孔结构的构建，孔径可控制在50纳米以内，保证药物稳定快速释放，释放速率可控。 

该纳米球由于偶联有隐形效果的聚乙二醇PEG链，减少血液相关蛋白与纳米球之间的相互作用，有效地延长药物在体内的循环时间长达20小时。 

该纳米球由于嫁接有肿瘤靶向分子，增加了其在肿瘤部位的亲和力，增加了肿瘤细胞的内吞，有良好的肿瘤靶向特性。该纳米球其相对于传统的注射制剂相比，有较低的毒副作用。目前临床上为了克服药物的难溶问题，常选用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶剂作为助溶剂，再行静脉注射给药。该注射剂型所用的助溶剂引起严重的毒副作用，如严重的致敏反应、恶心、呼吸困难等。由于壳聚糖-羧化壳聚糖天然的亲水性及纳米球本身在EPR效应的作用下被动靶向肿瘤的优势，因此该纳米球无需使用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶剂。另外，传统抗肿瘤药物注射制剂给药后药物在体内呈全身性分布，肿瘤组织内很难达到有效药物浓度，由于其对肿瘤部位的靶向性不明显，进而对其他实质性器官造成不可逆转的损害，造成全身毒性反应，常常导致化疗失败。 

本发明所提供的难溶抗肿瘤药物注射制剂产品兼具隐形和靶向效果(如图1所示)，延长药物在体内的循环周期，提高药物的靶向性，降低了药物对机体正常组织所产生的毒副作用，提高药物的生物利用度。难溶性药物纳米晶以原位结晶的形式均匀分布在壳聚糖及其衍生物纳米球中，极大的提高了亲水性材料载体对难溶性药物的载药率，克服了亲水性材料无法实现对难溶性药物的有效包埋等困难。避免了难溶性药物以大的晶体形式存在于载体中而导致的突释现象。该纳米球装载的难溶性药物能够稳定快速释放，还可以通过改变载体孔径控制释药速率。 

所述载药率按下式计算： 

所述装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，具有多孔结构，含有PEG链及可以偶联肿瘤靶向配体的官能团。 

优选所述难溶性药物纳米晶在纳米球内均匀分布，纳米晶可以增加其在水中的溶解度，提高生物利用度，进一步提高药效。 

优选所述难溶性药物纳米晶的粒径优选在20纳米以下，进一步优选在15纳米以下，更优选在10纳米以下，特别优选为3纳米以下。 

优选所述的装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其多孔孔径优选在50纳米以内，进一步优选在40纳米以内，更优选在30纳米以内，特别优选在20纳米以内。 

优选所述的装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其释药速率可控。 

优选所述的装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其平均粒径在2000纳米以下，优选为1500纳米以下，进一步优选为20-1500纳米，更优选为50-350纳米。 

优选所述的一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，粒径多分散指数＜0.2，优选＜0.15，特别优选＜0.1。其粒径多分散指数由具有粒径分析功能的Zeta电位仪ZetaPlus(Brookhaven Instruments Cooperation，USA)测得。 

优选所述PEG链的相对分子量范围优选为1000-7000，进一步优选为2000-6000，特别优选为2000-5000。 

优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团优选位于PEG链的末端。 

优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团可以为Arg-Gly-Asp(RGD)。 

PEG链能够降低血液相关蛋白与纳米球之间的相互作用，有效延长了药物在血液的循环时间，给载药纳米球提供更多的机会到达肿瘤部位释放药物。肿瘤靶向分子如RGD肽能够与肿瘤细胞表面过表达的整合素(α_vβ₃)相结合，极 大提高了该产品的肿瘤靶向效果，进一步提高了药物疗效。 

所述的一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，优选偶联肿瘤靶向配体指的是能够与肿瘤细胞表面特异性表达的受体相结合的物质，包括单克隆抗体和靶向小分子，特别优选为RGD肽、叶酸。 

所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物。 

本发明所述装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，可用于治疗肿瘤的一种注射制剂、口服药剂，优选用于注射制剂，具有良好的生物利用度。 

本发明的目的之一还在于提供一种制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的方法，包括如下步骤： 

(1)提供溶解了难溶性药物的与水不互溶的溶液作为内油相I(O_I)； 

(2)提供含有水相乳化剂且溶解有壳聚糖-羧化壳聚糖的酸性溶液作为水相(W)； 

(3)提供含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为外油相II(O _II)； 

(4)将内油相I与水相混合得到O_I/W型初乳液； 

(5)将上述制得的O_I/W型初乳液与外油相II混合得到O_I/W/O_II型预复乳液； 

(6)将上述预复乳液过微孔膜，得到粒径均一的复乳液滴； 

(7)向复乳液中加入交联剂与壳聚糖和/或羧化壳聚糖上的氨基反应，使乳滴交联固化得到装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球； 

(8)将制备的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球悬浮于含有EDC和NHS的PBS中； 

(9)向上述悬浊液中加入具有异端双官能团的PEG，与壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球上的羧基偶联反应； 

(10)将上述制备的装载难溶性药物的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球重悬于溶解有靶向配体的水溶液中反应。 

所述的一种装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备方法，其特征在于，该方法适用于亲水性材料对水不溶而脂溶性药物的包埋。 

所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物。 

优选步骤(1)中所述的溶剂为有机溶剂，进一步优选为卤代烷烃、酯类或其混合物，再一步优选为C₁-C₅烷烃的卤代物、酯类或其混合物，更优选为C₁-C₃烷烃的氯代物、酯类或其混合物，特别优选二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物。 

优选步骤(2)中所述的壳聚糖和羧化壳聚糖的粘均分子量为1000000以下，进一步优选为5000-980000，特别优选为10000-100000。 

优选步骤(2)中所述壳聚糖与羧化壳聚糖混合物中，羧化壳聚糖含量为5％-100％，特别优选为10％-100％。 

优选步骤(2)中所述的水相乳化剂为水溶性乳化剂，优选 

35、吐温-20、吐温-40、吐温-60、Triton-X405及其混合物。 

步骤(2)中所述的水相乳化剂添加浓度为所述领域已知技术，所属领域技术人员可根据其掌握的知识选择添加浓度，一般为0.5％-10％。 

优选步骤(3)中所述油性物质为石蜡、醚类、植物油、其他烷类碳氢化合物或其混合物，特别优选为液体石蜡、石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物或其混合物。 

优选步骤(3)中所述油溶性乳化剂其亲水亲油平衡值HLB在3-6之间，具体的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、亲油-亲水嵌段共聚物，PO-500、PO-310或其混合物。 

优选步骤(3)中所述外油相中油溶性乳化剂的浓度，基于外油相的质量，为约20wt％以下。 

优选步骤(4)中的初乳液经乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到。 

优选步骤(4)中内油相(OI)与水相(W)的比例范围为1∶2-1∶30，特别优选为1∶3-1∶20。 

优选步骤(5)中预复乳液通过乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到。 

优选步骤(5)中初乳液与外油相(OII)的比例范围为1∶2-1∶80，特别优选为1∶3-1∶60。 

优选步骤(6)中所述预复乳液在压力作用下通过微孔膜。 

优选步骤(6)中所述微孔膜孔径均一。 

优选步骤(6)中所述微孔膜孔径范围为15微米以下，进一步优选为9.0微米以下，特别优选为0.2-9.0微米。 

优选步骤(6)中乳液过膜次数1次以上(包括1次)，即通过同一微孔膜至少1次得到所述O/W/O型乳液，优选为2次以上，特别优选为2-5次。例如，所述预复乳液可以连续或间歇地在相同压力条件下通过两个或更多个微孔膜，这些微孔膜可具有相同或不同的孔径。通过选择具有合适孔径的微孔膜，将预复乳液通过所述孔径均一的微孔膜一次或多次后，所得乳液中的水相液滴的粒径分布多分散指数值会逐渐变小，因此在步骤(7)中交联固化后即可得到本发明的平均粒径为约几十纳米至约1微米的装载难溶性药物壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。 

优选步骤(6)中所述过膜压力为基本恒定的压力，其与所用膜孔径、内外油相粘度和水相中壳聚糖含量有关。所述基本恒定的压力范围优选为0.5MPa以上，特别优选0.5-5.0MPa。例如以孔径为0.5微米的膜、壳聚糖-羧化壳聚糖的醋酸水溶液浓度为0.5％制备纳微球，内油相∶水相∶外油相(V/V/V)＝1∶5∶200时，所用压力可以为2.0MPa；在25℃下，以孔径为0.8微米的膜、其他条件相同时，所用压力可以为1.5MPa，乳化过程在均在瞬间完成。 

优选所述基本恒定的压力是指压力的波动不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％。 

优选步骤(7)中使用的交联剂为醛类，特别优选为戊二醛、甲醛或其混合物。 

步骤(7)中所述交联剂添加浓度为所述领域已知技术，所属领域技术人员可根据其掌握的知识选择添加浓度，一般为总体积的0.1％-10％。 

优选步骤(7)中所述乳滴交联分为以下两个阶段： 

第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。固化温度优选为5-30℃，特别优选为10-25℃，固化时间优选0.5小时以上，特别优选为0.5-3.5小时； 

第二阶段缓慢加热至较高温度固化。较高温度优选为40-85℃，进一步优选为40-75℃，特别优选为40-65℃，加热速率优选1℃/分钟以上，特别优选为1℃/分钟-5℃/分钟，再次交联固化时间优选4小时以上，进一步优选为5小时以上，特别优选为5-12小时。 

第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。固化温度优选为5-30℃，固化时间优选0.5小时以上。该阶段保证纳米球已初步成型，有效地避免了因内油 相挥发过快，而导致的破乳、药物包埋率降低甚至失败的结果。第二阶段缓慢加热至较高温度固化。较高温度优选为40-85℃，加热速率优选1℃/分钟以上，再次交联固化时间优选4小时以上。该阶段控制纳米晶的形成，随着温度的升高，内油相逐渐挥发，纳米晶缓慢原位结晶出来。由于第一阶段的固化限制了药物的结晶空间，从而控制了药物析出晶体的形状和大小。另外，后期的加热加快了乳液滴的固化速率，避免了乳滴之间发生聚并，从而大大提高了纳米球对疏水性药物的装载率，同时也可以改善最终纳米球的分散性。 

优选步骤(7)中O/W/O型乳液中通过加入化学交联剂饱和的甲苯溶液固化得到装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。 

优选所述的一种装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备方法，其中步骤(6)中使用微孔膜的孔径范围为0.2-9.0微米，压力范围为1.2-2.5MPa。步骤(7)中使用的交联剂选自戊二醛、甲醛或其混合物。 

优选步骤(8)中所述EDC和NHS浓度大于1mMol/L即可。 

优选步骤(9)中所述PEG的异端双官能团，即其一端官能团可与壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球上的羧基反应，另一端官能团可与靶向配体反应。 

优选步骤(9)中所述具有异端双官能团的PEG的浓度范围为1-5mg/mL。 

优选步骤(10)中所述靶向配体的加入量为20-500μg/mL。 

在本发明方法的一些实施方案中，所述微孔膜为表面亲水或疏水的微孔膜。一般来说，微孔膜孔径较小时，所需操作压力较大，微孔膜的表面亲、疏水性对所制备得到的壳聚糖纳米球粒径和粒径均一性影响不大；当微孔膜孔径较大时，所需操作压力较小时，疏水性微孔膜较亲水性微孔膜所制备得到的壳聚糖纳微球粒径小且粒径均一性好。所述孔径均一的微孔膜的表面疏水性可以通过本领域中已知的方法实现。 

优选步骤(1)中所述内油相I中，难溶性药物的浓度可根据需要配制，优选为10-100mg/mL。 

优选步骤(2)中水相中，壳聚糖、羧化壳聚糖或其混合物的浓度可根据需要配制，通常情况下，其浓度优选为0.5-2.0wt％。 

除非特别说明，在本发明中使用的术语具有以下含义： 

在本发明中使用的术语“壳聚糖”是指现有技术中命名为“壳聚糖”(Chitosan)的产品，包括天然壳聚糖、改性壳聚糖及其衍生物。 

在本发明中使用的术语“壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球”是指以壳聚糖与羧化壳聚糖的混合物为基质制备的装载难溶性药物的纳米球。 

在本发明中使用的术语“均匀乳液”或“均一乳液”是指粒径均一的O/W/O型复乳液。 

在本发明中使用的术语“粒径”是指由具有粒径分析功能的Zeta电位仪ZetaPlus(Brookhaven Instruments Cooperation，USA)测得的体积平均粒径。 

在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。 

所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，是个可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取。使用时的pH范围为4.0-6.0。 

所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，分子量：115.09，为白色或类白色结晶粉末，用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。分子式为 

本发明的具体特点： 

本发明利用复乳法并结合程序升温固化法制备出了装载有难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，在此基础上利用其表面的羧基偶联PEG化的肿瘤靶向配体。 

(1)壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球是一种难溶性抗肿瘤药物良好的亲水性载体，具有很好的生物相容性。也可用于联合装载其他难溶性抗肿瘤药物。 

(2)装载有难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，表面留有的羧基可用于PEG链的“隐形”修饰，继而利用活性基嫁接靶向肿瘤的分子。 

(3)装载有难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球经“隐形”和靶向修饰后，可提高纳米球导入细胞的效率和导入细胞后的功效。可延长纳米载体在体内的循环周期，给纳米球提供更多的机会达到肿瘤部位释放药物，提高药物在肿瘤部位的靶向性。 

(4)本发明所发明的装载有难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球产品，由于该产品兼具“隐形”和靶向效果，提高了药物的生物利用度及治疗效果，避免了传统制剂所产生的毒副作用问题，有潜在的临床应用价值。 

(5)本发明所发明的方法可以通过控制难溶性药物在纳米球中的结晶过程，大大提高纳米球对难溶性药物的载药量，同时也提高了难溶性药物的溶解度。在难溶性药物的注射给药方面有着潜在的临床应用价值。 

附图说明

图1是装载难溶性抗肿瘤药物的且偶联有靶向肿瘤分子RGD肽的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的示意图。 

图2是制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的原理及流程示意图。 

图3是制备用于形成包埋有难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的均一乳液的装置及原理示意图。 

图4是实施例1制备的装载难溶性抗肿瘤药物药物的壳聚糖-羧化壳聚糖米球的扫描及透射电镜照片。 

图5是实施例2制备装载难溶性抗肿瘤药物药物的不同孔径的壳聚糖-羧化壳聚糖米球的扫描及透射电镜照片。 

图6是实施例4制备的不同分子量的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球的扫描及透射电镜照片。 

图7是比较实施例1恒温固化法制备的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球的透射电镜照片。 

图8是巨噬细胞对实施例8和实施例9中所制备的CNP、PEG-CNP、RGD-PEG-CNP隐形效果的检测。A、流式细胞技术检测J774.A1细胞对纳米球的内吞；B、小动物活体成像荧光检测J774.A1细胞对纳米球的内吞；C、激光共聚焦技术检测J774.A1细胞对纳米球的内吞。 

图9是肿瘤细胞对实施例8和实施例9中所制备的CNP、PEG-CNP、RGD-PEG-CNP隐形效果的检测。A、流式细胞技术检测LLC细胞对纳米球的 内吞；B、小动物活体成像荧光检测LLC细胞对纳米球的内吞；C、激光共聚焦技术检测LLC细胞对纳米球的内吞。 

图10体外评价实施例8和实施例9中所制备的CNP、PEG-CNP、RGD-PEG-CNP及CNP:PTX、PEG-CNP:PTX、RGD-PEG-CNP:PTX对癌细胞的杀伤毒性。A、空白球与 

的溶剂比较；B、载药纳米球与 

比较。 

图11体内评价实施例8和实施例9中所制备的装载难溶性抗肿瘤药物紫杉醇的CNP:PTX、PEG-CNP:PTX、RGD-PEG-CNP:PTX给药后的药物分布及血液中纳米球浓度随时间变化情况。A、给药后药物在各组织中的分布情况；B血液中纳米球浓度随时间的变化情况。 

图12是实施例8和实施例9中所制备的不同空白纳米球经尾静脉注射后在肝脏和脾脏的分布情况，A肝脏；B、脾脏。 

图13是实施例8和实施例9中所制备的三种不同装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球经静脉给药后对肿瘤生长的抑制效果的考察，A、荷瘤小鼠肿瘤生长情况；B、荷瘤小鼠生存周期情况。 

具体实施方式

如果没有特别指明，本发明中所有浓度单位均为wt％。 

壳聚糖-羧化壳聚糖指壳聚糖与羧化壳聚糖的混合物。 

本发明附图中，所述附图标记表示如下： 

1-肿瘤细胞；2-PEG；3-RGD；4-难溶药物； 

22-壳聚糖-羧化壳聚糖；23-内油相；24-油相(O_I)； 

25-酸性水溶液；26-水相(W)；27-初乳液(O_I/W)； 

28-外油相(O_II)；29-粗复乳液(O_I/W/O_II)；30-微孔膜； 

31-复乳液；32-放气阀；33-放气阀；34-压力表； 

35-氮气入口；36-容器；37-微孔膜；38-乳液； 

311-预乳液；312-分散相；313-连续相；315-均一乳液； 

316-氮气。 

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。有必要再次指出的是本发明所列举实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范 围的限制，本领域的技术人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。 

装载难溶性药物的壳聚糖及其衍生物纳米球的制备按图2所示的步骤制备，具体方法步骤如下： 

(1)O_I/W/O_II型复乳液的制备 

称取难溶性药物粉末溶解于挥发性且与水不互溶的有机溶剂中作为内油相(O_I)备用；再将壳聚糖(CS)及其衍生物羧化壳聚糖、水相乳化剂以及其它添加剂加入到醋酸或柠檬酸等酸性水溶液中，并在磁力搅拌条件下充分溶解作为水相(W)备用；将一种以上的油溶性乳化剂溶于油性液体作为外油相(O_II)备用。首先将内油相(O_I)和水相(W)混合后，通过均质乳化或超声方法制备O_I/W型初乳液；将初乳液与外油相(O_II)通过均质乳化制备预乳液，然后将此预乳液在压力作用下反复压过的微孔膜，得到粒径均一的O_I/W/O_II型乳液；该过程在图3所示的装置中完成。 

内油相为溶解有难溶性抗肿瘤药物的二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物的溶液，难溶性药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，难溶性药物的浓度可根据需要配制，优选为10-100mg/mL。壳聚糖、羧化壳聚糖或其混合物的浓度可根据需要配制，通常情况下，其浓度优选为0.5-2.0wt％。水相乳化剂包括Tween-60、Tween-20、Triton X-405及 

35。外油相为在常温下呈液体、且与水不互溶的油性物质，可选择使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物等，也可使用其混合物。一般所选择的油相沸点要比较高，挥发性较弱。油性乳化剂要溶解于所使用的油相中，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、 甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物等。油相中乳化剂的浓度为20wt％以下，内油相∶水相∶外油相＝1∶3∶30-1∶10∶600(体积比)。 

(2)O_I/W/O_II型复乳液的固化、洗涤 

向上述步骤(1)所得到的复乳液中缓慢滴加交联剂或沉淀剂，如戊二醛饱和的甲苯溶液或甘油磷酸钠，对乳滴进行固化。固化过程分两个阶段进行，第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。固化温度优选为5-30℃，固化时间优选0.5小时以上。第二阶段缓慢加热至较高温度固化。较高温度优选为40-85℃，加热速率优选1℃/分钟以上，再次交联固化时间优选4小时以上。 

实施例1：装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备 

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型。首先将孔径为0.5微米的亲水性膜置于橄榄油与棉子油的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相乙酸乙酯中，浓度为40mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与羧化壳聚糖的混合物(质量比1∶5)溶于1％醋酸水溶液中，得到壳聚糖与羧化壳聚糖混合物的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt％，同时添加8％的水相乳化剂 

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班80加入到120mL的橄榄油与棉子油的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇乙酸乙酯溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器下乳化5分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，在 2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入200μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在低温10℃下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，5℃/min)至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。纳米球的平均粒径和粒径分布采用具有粒径分析功能的Zeta电位分析仪ZetaPlus测试，在水中纳米球的平均直径为125.37纳米，多分散指数为0.062。扫描电镜照片及透射电镜照片如图4所示，结果表明壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球能够成功包埋难溶性药物紫杉醇，难溶性药物纳米晶能以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中，紫杉醇纳米晶在3纳米以下。经测定，纳米球对紫杉醇的载药率为36.9％，说明采用复乳法及程序升温固化法可以成功利用亲水性载体装载难溶性药物。 

实施例2：装载难溶性药物的不同孔径的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备 

本实施例选取O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇作为难溶性药物模型。将孔径为0.5微米的亲水性膜置于液橄榄油与石油醚按体积比1∶4的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为25mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖和羧化壳聚糖，分别按质量比为1∶9、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1溶于5份1％醋酸水溶液中，得到羧化壳聚糖醋酸水溶液，其浓度均为2.0wt％，同时添加10％的水相乳化剂Triton X-405。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液 作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-310加入到150mL的橄榄油和石油醚的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇二氯甲烷溶液与水相羧化壳聚糖醋酸水溶液(1∶10，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合(1∶10，V/V)，在均质乳化器在30000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入500μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温(15℃)下交联固化2小时，并缓慢加热(程序升温，3℃/min)至45℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。纳米球的平均粒径和粒径分布采用具有粒径分析功能的Zeta电位分析仪ZetaPlus测量，在水中纳米球的平均直径分别为138.0、142.7、135.4、141.6、135.2纳米，多分散指数分别为0.049、0.052、0.034、0.063、0.047。扫描电镜照片及透射电镜照片均如图5所示(壳聚糖∶羧化壳聚糖＝1∶1)，结果表明所制备的羧化壳聚糖纳米球粒径均一，难溶性药物紫杉醇纳米晶以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中，紫杉醇纳米晶大小均在3纳米以内。将制备好的纳米球置换至乙醇中，然后利用临界点干燥仪对制得的纳米球进行干燥，干燥后的纳米球的平均孔径采用BET全自动比表面和孔隙度分析仪测量。测得的纳米球的平均孔径分别为3.19、6.57、10.17、15.96和19.83纳米。结果表明通过可以改变基质中壳聚糖与羧化壳聚糖的比例制备不同孔径的壳聚糖-壳聚糖 衍生物纳米球。经测定上述5中纳米球对难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇的载药率分别为24.9％、23.7％、21.7％、20.1％、22.8％。 

实施例3：装载不同难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备 

本实施例选取O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇作为另外一种难溶性药物模型。首先将孔径为0.5微米的亲水性膜置于葵花子油与石油醚按体积比4∶1的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇粉末溶解于内油相三氯甲烷中，浓度为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与羧化壳聚糖的混合物(质量比1∶1)溶于1％柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖醋酸水溶液，其浓度为2.0wt％，同时添加8％的水相乳化剂Tween-20。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班65加入到200mL的葵花子油和石油醚的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇三氯甲烷溶液与水相壳聚糖醋酸水溶液(1∶10，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，用均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入500μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温(20℃)下交联固化1.5小时，并缓慢加热(程序升温，2℃/min)至55℃。再恒温交联反应12小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳 聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。扫描电镜照片及透射电镜照片与实施例1中的结果相似，结果表明难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇同紫杉醇一样，均能被成功包埋于壳聚糖纳米球中，难溶性药物纳米晶也都能以原位结晶的方式均匀分布于纳米球中，纳米晶的大小均在3纳米以内。经HPLC测定，壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球对难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇的载药率为18.5％。 

实施例4：不同分子量的壳聚糖-羧化壳聚糖制备装载难溶性药物的纳米球 

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型，不同分子量的壳聚糖及壳聚糖-羧化壳聚糖作为载体材料。首先将孔径分别为0.5微米的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚(体积比4∶1)的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为20mg/mL，作为内油相备用。分别称取不同分子量(5000，50000，200000，980000)的壳聚糖与羧化壳聚糖(质量比1∶2)溶于1％醋酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt％，同时添加10％的水相乳化剂Tween-40。室温下磁力搅拌3小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂司班80加入到150mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇二氯甲烷溶液与水相(1∶5，V/V)混合并用超声乳化10分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再 次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入600μL戊二醛饱和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1。首先在20℃下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，4℃/min)至55℃。再恒温交联反应8小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤，并将其保存在水中。然后利用zeta电位及粒径分析仪测定各组纳米球的粒径。测得的纳米球的平均粒径大小分别为137.3，125.0、100.5和90.8纳米，多分散指数分别为0.037、0.029、0.054和0.043。扫描电镜及透射电镜结果与实施例1结果相似。如图6所示(分子量＝980000)，其他分子量制备的装载难溶性抗肿瘤药物的羧化壳聚糖纳米球结果与图6相似。难溶性药物纳米晶均在3纳米以内，经测定四种纳米球对紫杉醇的载药率分别为21.7％、19.6％、18、3％、22.7％，表明不同分子量的壳聚糖及其衍生物均可作为装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球载体材料。 

实施例5：不同内油相制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球 

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型。首先将孔径为5微米的亲水性膜置于橄榄油与棉子油(体积比3∶1)的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。分别称取四份相同量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于不同的内油相中(二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷和乙酸乙酯)中，浓度均为30mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖及壳聚糖-羧化壳聚糖溶于1％柠檬酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt％，同时添加10％的水相乳化剂Tween-60。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油 溶性乳化剂司班80加入到300mL的橄榄油与棉子油的混合物中，其浓度为8wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合(1∶50，V/V)，在均质乳化器在40000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入700μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在15℃下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，3℃/min)至60℃。再恒温交联反应12小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用zeta电位及粒径分析仪测定制得的四种装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球粒径。结果分别为892.7、913.4、894.2、902.3纳米，粒径多分散指数分别为0.053、0.049、0.057、0.072。扫描电镜与透射电镜结果与实施例1中结果相似，难溶性药物纳米晶在5纳米以内，经测定四种纳米球对难溶性药物的载药率分别为34.7％、35、6％、32.8％、35.1％。结果表明，选用不同的内油相都可以成功制得装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。 

实施例6：选用不同水相乳化剂制备装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球 

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型。首先将孔径分别为9微米的亲水性膜置于橄榄油与棉子油(体积比1∶2)的混合油相中浸泡过夜或超声1小时 使膜孔充分被油相湿润。称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相二氯乙烷中，浓度均为50mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖及壳聚糖-羧化壳聚糖的混合物(质量比1∶5)溶于1％醋酸水溶液中，得到壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为2.0wt％，同时添加8％的不同水相乳化剂(吐温-20，吐温-40，吐温-60，Triton-X405， 

35)。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到150mL的橄榄油与棉子油的混合物中，其浓度为8wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化15分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，用均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在0.2MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入800μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温(25℃)下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，4℃/min)至50℃。再恒温交联反应5小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用扫描电镜与透射电镜对制得的四种装载难溶性药物的纳米球进行观察，结果与实施例1中结果相似。平均粒径分别为1219.7、1347.3、1417.2、1398.7纳米，粒径多分散指数分别为0.043、0.039、0.056、0.069。难溶性药物纳米晶能够原位分布在纳米球中，纳米晶体的大小在10纳米以内。经测定，四种纳米球对难溶性药物的载药率分别为49.5％、47.2、44.7％、48.6％。 结果表明，选用不同的水相乳化剂都可以成功制得装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球。 

实施例7：装载难溶性药物的不同粒径的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备 

本实施例选取O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇为难溶性药物模型。首先将孔径分别为0.2、1.4、5.2和9.0微米的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚(体积比4∶1)的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖溶于1％醋酸水溶液中，得到浓度为1.0wt％水溶液，同时添加8％的水相乳化剂 

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂Arlacel83加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇二氯甲烷溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，分别在2.5、1.0、0.5、0.2MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入1000μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在低温20℃下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，2℃/min)至55℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤，并将 其保存在水中。然后利用利用zeta电位及粒径分析仪测得的纳米球的平均粒径大小分别为57.0、340.5和843.7、1246.8纳米，多分散指数分别为0.049、0.038、0.056和0.103。扫描及透射电镜与实施例1结果相似，难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇纳米晶能够均匀分散在纳米球中，纳米晶的大小分别在2纳米、3纳米、和8纳米以内。经测定，四种纳米球对难溶性药物载药率分别为19.7％、18、5％、21.7％、20、9％。结果表明，可以通过改变膜孔径及相应的操作压力制得尺寸均一、可控的装载难溶性药物的壳聚糖及其衍生物纳米球。 

比较实施例1：恒温固化法制备装载难溶性药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球 

本实施例选取O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇为难溶性药物模型。首先将孔径分别为0.5微米的亲水性膜置于液体石蜡与石油醚(体积比4∶1)的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。称取一定量的难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度均为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与羧化壳聚糖混合物溶于1％醋酸水溶液中，得到壳聚糖-羧化壳聚糖的醋酸水溶液，其浓度为1.0wt％，同时添加8％的水相乳化剂 

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到100mL的液体石蜡和石油醚的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气 压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，将乳液分为4批，加入1000μL戊二醛饱和的甲苯溶液并固定在恒定的温度固化(15、25、40、60℃)，恒温交联反应时间均为12小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。再交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤。然后利用透射电镜对制得的四种装载难溶性药物的纳米球进行观察，结果均如图6所示。结果显示，难溶性药物O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇纳米晶未分散在纳米球中，表明恒温固化法不能将难溶性药物成功包埋于壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球中。 

实施例8：装载难溶性药物的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的制备 

本实施例选取紫杉醇为难溶性药物模型。首先将孔径分别为0.5微米的亲水性膜置于液体豆油与葵花子油的混合油相中浸泡过夜或超声1小时使膜孔充分被油相湿润。准确称取一定量的难溶性药物紫杉醇粉末溶解于内油相二氯甲烷中，浓度为20mg/mL，作为内油相备用。称取一定量的壳聚糖与壳聚糖-羧化壳聚糖的混合物溶于1％醋酸水溶液中，得到壳聚糖与壳聚糖-羧化壳聚糖的混合溶液(质量比5∶1)，其浓度为1.0wt％，同时添加8％的水相乳化剂 

35。室温下磁力搅拌2小时使乳化剂充分溶解，最后将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到100mL的豆油与葵花子油的混合物中，其浓度为10wt％，搅拌至完全溶解作为外油相。将1mL的上述紫杉醇二氯甲烷溶液与水相(1∶3，V/V)混合并用超声乳化5分钟，形成初乳液。再将初乳液与配制好的外油相混合，在均质乳化器在24000rpm下乳化1分钟，形成预复乳液。然后，将所得预复乳液迅速倒入如图3所示的膜乳化装置中，操作压力根据膜孔径的不同而不同，在2.0MPa的氮气 压力下，使其快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的O/W/O型复乳液，将所得复乳液作为预复乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过微孔膜，反复乳化3次，最终得到粒径均一的O/W/O型复乳液。乳化完毕后，向乳液中加入1000μL戊二醛饱和的甲苯溶液。首先在室温(25℃)下交联固化1小时，并缓慢加热(程序升温，1℃/min)至50℃。再恒温交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在14000rpm下离心，倾去上清液将壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球从油相中分离出来，依次用石油醚和水洗涤既得壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球(CNP:PTX)。 

将上述制得的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球悬浮于含有5mL的pH 6.5的PBS的玻璃瓶中，称取一定量的EDC和NHS加入玻璃瓶中，震荡，使粉末溶解。待完全溶解后，将玻璃瓶置于磁力搅拌器上，室温下，搅拌反应15-30分钟。然后，称取一定量具有异端双官能团的PEG，室温下，置于磁力搅拌器上反应6-10小时后，用蒸馏水冲洗纳米球三遍即可得PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球(PEG-CNP:PTX)。 

实施例9：偶联有RGD肽的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球的制备 

将实施例8中制备的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球悬浮于含有5mL的pH7.2的PBS的玻璃瓶中，称取一定量的RGD加入玻璃瓶中，浓度为100μg/mL室温下，置于磁力搅拌器上反应2-10小时，最后，用蒸馏水冲洗纳米球即得偶联有肿瘤靶向配体RGD肽的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球(RGD-PEG-CNP:PTX)。实施例8和实施例9中制得的三种载药纳米球(CNP:PTX、PEG-CNP:PTX、RGD-PEG-CNP:PTX)进行粒径及粒径分布测定，结果分别为125、140和146纳米，Zeta电位分别为-32.7、+2.19和+1.97mV。 

实施例10：偶联有RGD肽的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载药纳米球作为抗肿 瘤注射制剂的应用 

本实施例分别选取现有的临床紫杉醇注射制剂 实施例8中制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球(CNP:PTX)、实施例9中PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载难溶性抗肿瘤药物纳米球(PEG-CNP:PTX)和偶联有肿瘤靶向配体RGD肽的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖载难溶性抗肿瘤药物的纳米球(RGD-PEG-CNP:PTX)作为注射制剂模型。 

(1)三种空白纳米球的制备 

采用与实施例8和实施例9的配方，但不加入内油相制备三种空白纳米球。分别表示为：CNP、PEG-CNP、RGD-PEG-CNP。 

(2)三种装载难溶性抗肿瘤药物纳米球注射制剂的制备 

采用与实施例8和实施例9的配方，制备装载难溶性抗肿瘤药物紫杉醇的纳米球。分别表示为：CNP:PTX、PEG-CNP:PTX、RGD-PEG-CNP:PTX。 

(3)PEG链隐形效果的检测 

1)巨噬细胞模型 

以J774.1细胞为巨噬细胞模型，用含100IU/mL青霉素和1001U/mL链霉素及10％新生牛血清的DMEM培养基为培养液，于37℃，5％CO₂培养箱内培养；细胞贴壁大于80％时进行传代。 

2)巨噬细胞对三种空白纳米球载体内吞的检测 

J774A.1细胞按1×10⁵/孔接种于24孔板中，培养24h后将培养液更换为含有一定浓度(100μg/mL)空白纳米球的培养液，37℃下孵育，孵育不同时间后，吸除上层培养液，用PBS洗掉未被吞噬的空白纳米球。随后洗脱细胞、重悬、固定后用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度值，根据荧光强度即可计算出细胞随时间的延长对纳米球吞噬速率的变化，结果如图8A所示，巨噬细胞J774A.1 对偶联有未偶联PEG链的CNP纳米球内吞速率较其他两种空白纳米球快，证明PEG链的隐形效果。利用相同的方法将J774A.1接种于35毫米的小皿中，并与各组空白纳米球孵育24小时，洗涤去未被内吞的纳米球，再用小动物活体成像系统测定各小皿中纳米球的荧光，如图8B所示，巨噬细胞J774A.1对偶联有PEG链的纳米球敏感度较低，内吞效果差。 

J774A.1细胞按1×10⁵/cm²接种于Petri皿中，24h后将培养液更换为含有一定浓度的空白纳米球培养液(100μg/mL)，37℃下孵育24h。细胞经洗涤，固定后染色。细胞膜用Alexa 

635 phalloidin染色，细胞核用DAPI标记。最后用激光共聚焦观察细胞对纳米球的内吞情况，结果如图8C所示，巨噬细胞J774A.1对未被PEG隐形修饰的空白纳米球内吞量明显高于其他两种空白纳米球，说明PEG链修饰后的纳米球能够逃避巨噬细胞J774.1的识别与吞噬，展示出较强的隐形效果。 

(4)肿瘤细胞对三种空白纳米球内吞速率的检测 

1)肿瘤细胞模型 

以Lewis lung carcinoma(LLC)细胞为肿瘤细胞模型，用含100IU/mL青霉素和1001U/mL链霉素及10％新生牛血清的DMEM培养基为培养液，于37℃，5％CO₂培养箱内培养；细胞贴壁大于80％时进行传代。 

2)肿瘤细胞对三种空白纳米球载体内吞的检测 

LLC细胞按1×10⁵/孔接种于24孔板中，培养24h后将培养液更换为含有一定浓度(100μg/mL)空白纳米球的培养液，37℃下孵育，孵育不同时间后，吸除上层培养液，用PBS洗掉未被吞噬的空白纳米球。随后洗脱细胞，垂悬固定后用流式细胞仪测定细胞的平均荧光强度值，根据荧光强度即可计算出细胞随时间的延长对纳米球吞噬速率的变化，结果如图9A所示，肿瘤细胞LLC对 偶联有RGD肽的RGD-PEG-CNP内吞速率较其他两种空白纳米球快，证明RGD肽对肿瘤细胞高度的亲和能力，展示出该产品作为难溶性抗肿瘤药物注射制剂载体的临床应用价值。利用相同的方法将LLC接种于35毫米的小皿中，并与各组空白纳米球孵育24小时，洗涤去未被内吞的纳米球，再用小动物活体成像系统测定各小皿中纳米球的荧光，如图9B所示，肿瘤细胞LLC对嫁接有RGD肽的纳米球的内吞量最大，展示出RGD肽的肿瘤靶向能力。 

LLC细胞按1×10⁵/cm²接种于Petri皿中，24h后将培养液更换为含有一定浓度的空白纳米球培养液(100μg/mL)，37℃下孵育24h。细胞经洗涤，固定后染色。细胞膜用Alexa 

635phalloidin染色，细胞核用DAPI标记。最后用激光共聚焦观察细胞对纳米球的内吞情况，结果如图9C所示，肿瘤细胞对偶联有RGD肽的RGD-PEG-CNP内吞量明显高于其他两种空白纳米球，说明RGD肽增加了纳米载体与肿瘤细胞的亲和力，使纳米球更容易进入肿瘤细胞。 

(5)三种空白纳米球及载药纳米球对肿瘤细胞生长抑制能力的检测 

LLC细胞按5×10⁴个/孔接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，将本实施例中制得三种空白纳米球(CNP、PEG-CNP和RGD-PEG-CNP)及装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球(CNP:PTX、PEG-CNP:PTX和RGD-PEG-CNP:PTX)稀释成不同浓度，添加至平行孔中。48h后，用MTT测定不同给药浓度对细胞杀伤毒性的影响，结果如图10A所示，与现有注射制剂 

所用溶剂相比(聚氧乙烯蓖麻油：无水乙醇)，空白球对细胞无明显的杀伤毒性，展示出该纳米球载体良好生物相容性。而一旦装载抗肿瘤药物紫杉醇后，RGD-PEG-CNP:PTX对肿瘤细胞有明显的杀伤效果(图10B)，RGD肽能够促进羧化纳米球更容易进入并杀死肿瘤细胞。 

(6)三种装载难溶性药物纳米球注射制剂经静脉给药后药物分布检测 

1)肿瘤模型小鼠的建立 

将100μL(1×10⁷个/mL)的LLC细胞接种于C57BL/6小鼠的左腋下，20-25天后肿瘤生长至直径约为15mm。 

2)药物分布测定 

将制得的三种装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球制剂(CNP:PTX、PEG-CNP:PTX和RGD-PEG-CNP:PTX)进行小鼠尾静脉给药。以临床制剂 为对照组，给药量剂量均按1.0mg/kg的PTX给药。24h后处死小鼠，并摘取小鼠的心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织。再用研磨机研磨各组织成匀浆。用二氯甲烷萃取各组织中的药物PTX。二氯甲烷层挥发后，采用HPLC测定各个组织中的药物含量。结果显示如图11A所示，偶联有RGD肽的RGD-PEG-CNP:PTX给药组小鼠肿瘤部位药物浓度明显高于其他给药组，证明肿瘤靶向分子RGD肽提高了该纳米球注射制剂产品的靶向性。另外，从肝脏和脾脏的药物分布结果可以看出，PEG化的纳米球注射制剂给药后，药物在该组织的分布较少，展示出PEG链良好的隐形效果。 

选择三种空白纳米载体，给荷瘤小鼠静脉注射给药。给药后在不同的时间点尾静脉取血30微升滴到血液稀释液中，用酶标仪对纳米球在体内的分布进行观察。结果如图11B所示，PEG化的纳米球载体在血液中的荧光强度随时间减弱得较慢，说明PEG链的修饰延长了纳米载体在血液内的循环周期，展示出其良好的隐形效果，各组小鼠血液中纳米球荧光值的半衰期分别为8、29、26小时，说明PEG链的接入延长药物在体内的循环时间长达20小时。对不同给药组小鼠的肝肾做切片组织观察，如图12所示，PEG化的纳米球载体在肝肾组织累计的较少，也同样证明了PEG链良好的隐形效果。 

(7)三种装载难溶性抗肿瘤药物的纳米球注射制剂给药后抑瘤效果观察 

1)按照步骤(6)中的方法构建小鼠肿瘤模型共50只，随机分为五组，PBS、 

CNP:PTX、PEG-CNP:PTX和RGD-PEG-CNP:PTX。各组均按100μL/只尾静脉给药， CNP:PTX、PEG-CNP:PTX和RGD-PEG-CNP:PTX按1mg/kg PTX尾静脉给药。 

2)相对肿瘤生长速率观察 

选取接种后第10天为治疗期第0天，每天给药后用游标卡尺测量肿瘤的长(a)和宽(b)，并根据公式V＝a×b²/2计算肿瘤体积。肿瘤生长速率＝第n天实际肿瘤体积/第0天实际肿瘤体积。并以时间(天)为横坐标，肿瘤生长速率为纵坐标作图，结果如图13A所示，RGD-PEG-CNP:PTX经尾静脉给药后展示出明显的抑瘤效果。 

4)小鼠生存曲线的绘制 

量取每组小鼠肿瘤体积时，当小鼠肿瘤体积达到3000mm³时视为死亡，计算出小鼠在第n天的死亡率，然后以(1-死亡率)为纵坐标，以时间为横坐标作图，结果如图13B所示，RGD-PEG-CNP:PTX能够有效地延长小鼠生命周期，展示出该注射制剂产品潜在的临床应用前景。 

本发明所述装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，采用壳聚糖和羧化壳聚糖纳米球作为难溶性药物的载体，提供一种低毒高效的靶向纳米注射给药系统。其特点是：(1)利用复乳、两阶段的壳聚糖分步交联技术，使难溶性药物以纳米晶的形式均匀分散在纳米球中，实现高的装载率。(2)利用膜乳化技术制备粒径均一的纳米球，实现好的批次重复性，有利于临床报批和高的生物利用度。(3)利用壳聚糖及羧化壳聚糖的亲水性，实现难溶性药物较快稳定释放。(4)利用壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球留有的羧基偶联一具有隐形效果的PEG链，达到延长药物在体内循环周期的目的。克服因纯壳聚糖纳米球的 活性基团氨基被利用而无法进一步偶联PEG链及嫁接靶向分子的问题。(5)利用活性基团嫁接靶向肿瘤的小分子，如RGD肽或叶酸分子，实现壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的靶向给药，减少药物对机体正常组织的毒副作用。以紫杉醇为难溶性抗肿瘤药物模型，证明经过靶向和“隐形”修饰的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球能有效的装载难溶性抗肿瘤药物、提高药物的溶解度、延长药物在内体的循环周期、提高药物靶向性、降低毒副作用。构建Lewis肺癌作为肿瘤模型进一步验证该注射制剂的抑瘤效果。该产品可以克服现有难溶性抗肿瘤药物载体毒性高，载体亲水性差，载体血内清除率高，载体靶向性差，药物生物利用度低且释药速率难以控制，不具备临床应用价值等方面的不足。 

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 

Claims (10)

1.一种装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，具有多孔结构，含有PEG链及可以偶联肿瘤靶向配体的官能团。

2.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，所述难溶性药物纳米晶在纳米球内均匀分布；

优选所述难溶性药物纳米晶的粒径在20纳米以下，进一步优选在15纳米以下，更优选在10纳米以下，特别优选为3纳米以下；

优选所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物。

3.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，其多孔孔径优选在50纳米以内，进一步优选在40纳米以内，更优选在30纳米以内，特别优选在20纳米以内；

优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其释药速率可控；

优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其平均粒径在2000纳米以下，优选为1500纳米以下，进一步优选为20-1500纳米，更优选为50-350纳米；

优选所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，粒径多分散指数＜0.2，优选＜0.15，特别优选＜0.1。

4.如权利要求1所述的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球，其特征在于，所述PEG链的相对分子量范围优选为1000-7000，进一步优选为2000-6000，特别优选为2000-5000；

优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团位于PEG链的末端。

优选所述可以偶联肿瘤靶向配体的官能团为Arg-Gly-Asp(RGD)。

5.如权利要求1-4任一项所述的装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的用途，其特征在于，可用于治疗肿瘤的一种注射制剂、口服药剂，优选用于注射制剂。

6.一种制备装载难溶性抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球的方法，包括如下步骤：

(1)提供溶解了难溶性药物的与水不互溶的溶液作为内油相I(O_I)；

(2)提供含有水相乳化剂且溶解有壳聚糖-羧化壳聚糖的酸性溶液作为水相(W)；

(3)提供含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为外油相II(O_II)；

(4)将内油相I与水相混合得到O_I/W型初乳液；

(5)将上述制得的O_I/W型初乳液与外油相II混合得到O_I/W/O_II型预复乳液；

(6)将上述预复乳液过微孔膜，得到粒径均一的复乳液滴；

(7)向复乳液中加入交联剂与壳聚糖和/或羧化壳聚糖上的氨基反应，使乳滴交联固化得到装载难溶抗肿瘤药物的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球；

(8)将制备的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球悬浮于含有EDC和NHS的PBS中；

(9)向上述悬浊液中加入具有异端双官能团的PEG，与壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球上的羧基偶联反应；

(10)将上述制备的装载难溶性药物的PEG化的壳聚糖-羧化壳聚糖纳米球重悬于溶解有靶向配体的水溶液中反应。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述乳滴交联优选分为以下两个阶段：

第一阶段，将乳液在低温下固化一段时间。固化温度优选为5-30℃，特别优选为10-25℃，固化时间优选0.5小时以上，特别优选为0.5-3.5小时；

第二阶段缓慢加热至较高温度固化。较高温度优选为40-85℃，进一步优选为40-75℃，特别优选为40-65℃，加热速率优选1℃/分钟以上，特别优选为1℃/分钟-5℃/分钟，再次交联固化时间优选4小时以上，进一步优选为5小时以上，特别优选为5-12小时。

8.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，该方法适用于亲水性材料对水不溶而脂溶性药物的包埋；

优选所述难溶性药物为脂溶性而水不溶性的抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物，特别优选为紫杉醇、O-(氯乙酰氨甲酰基)烟曲霉素醇或其混合物；

优选步骤(1)中所述的溶剂为有机溶剂，进一步优选为卤代烷烃、酯类或其混合物，再一步优选为C₁-C₅烷烃的卤代物、酯类或其混合物，更优选为C₁-C₃烷烃的氯代物、酯类或其混合物，特别优选二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物；

优选步骤(2)中所述的壳聚糖和羧化壳聚糖的粘均分子量为1000000以下，进一步优选为5000-980000，特别优选为10000-100000；

优选步骤(2)中所述壳聚糖与羧化壳聚糖混合物中，羧化壳聚糖含量为5％-100％，特别优选为10％-100％；

优选步骤(2)中所述的水相乳化剂为水溶性乳化剂，为35、吐温-20、吐温-40、吐温-60、Triton-X405及其混合物；

9.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述油性物质优选为石蜡、醚类、植物油、其他烷类碳氢化合物或其混合物，特别优选为液体石蜡、石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物或其混合物；

优选步骤(3)中所述油溶性乳化剂其亲水亲油平衡值HLB在3-6之间，具体的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、亲油-亲水嵌段共聚物，PO-500、PO-310或其混合物；

优选步骤(3)中所述外油相中油溶性乳化剂的浓度，基于外油相的质量，为20wt％以下，优选为0.5wt％-10wt％；

优选步骤(4)中的初乳液优选经乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到；

优选步骤(4)中内油相(O_I)与水相(W)的比例范围为1∶2-1∶30，特别优选为1∶3-1∶20；

优选步骤(5)中预复乳液通过乳化得到，进一步优选经高速均质乳化或超声乳化得到；

优选步骤(5)中初乳液与外油相(O_II)的比例范围为1∶2-1∶80，特别优选为1∶3-1∶60。

10.如权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述预复乳液优选在压力作用下通过微孔膜；

优选步骤(6)中所述微孔膜孔径均一；

优选步骤(6)中所述微孔膜孔径范围为15微米以下，进一步优选为9.0微米以下，特别优选为0.2-9.0微米；

优选步骤(6)中乳液过膜次数1次以上(包括1次)，即通过同一微孔膜至少1次得到所述O/W/O型乳液，优选为2次以上，特别优选为2-5次；

优选步骤(6)中所述过膜压力为基本恒定的压力，其与所用膜孔径、内外油相粘度和水相中壳聚糖含量有关。所述基本恒定的压力范围优选为0.5MPa以上，特别优选0.5-5.0MPa；

优选所述基本恒定的压力是指压力的波动不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％；

优选步骤(7)中所述交联剂为醛类，特别优选为戊二醛、甲醛或其混合物；

优选步骤(9)中所述具有异端双官能团的PEG的浓度范围为1-5mg/mL。

优选步骤(10)中所述靶向配体的加入量为20-500μg/mL。

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