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Die Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine Vorrichtung zur Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
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In einem zweiten Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 20.
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Eine gattungsgemäße Vorrichtung zur Mikroskopie weist folgende Komponenten auf: mindestens eine Lichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht, eine Detektionseinheit zum Nachweis von von einer Probe zurückgestrahltem Licht, eine Mikroskopoptik zum Leiten von Beleuchtungslicht auf die Probe und zum Leiten von von der Probe zurückgestrahltem Licht in Richtung der Detektionseinheit und eine in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Anregungsmaske zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung.
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Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zur Mikroskopie wird eine Probe mit Beleuchtungslicht beleuchtet, von der Probe zurückgestrahltes Licht wird nachgewiesen und das Beleuchtungslicht wird mit einer Anregungsmaske räumlich strukturiert.
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Eine gattungsgemäße Vorrichtung und ein gattungsgemäßes Verfahren sind beschrieben in
EP 0 882 247 B1 .
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Bei dem Verfahren der sogenannten korrelativen Apertur wird neben der konfokalen Information zusätzlich die Weitfeldinformation mikroskopisch beschafft und verwendet. Die erhaltenen Datensätze werden miteinander verrechnet, um insgesamt einen höheren Informationsgehalt aus der Probe zu erhalten. Dazu wird abwechselnd ein konfokales Bild und ein Weitfeldbild erzeugt. Hierzu wird in den meisten Fällen mit unterschiedlichen Beleuchtungen und einer getriggerten Datenerfassung gearbeitet.
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Dazu ist ein schnelles getriggertes Umschalten zwischen der Beleuchtung und der Bildaufnahme notwendig. Für die Erzeugung der Konfokalität wird zumeist eine Gitterstruktur verwendet. Die Gitterlöcher funktionieren dabei als Pinholes. Die Löcher müssen, um ein Übersprechen zwischen den einzelnen Pinholes zu vermeiden, von ausreichend breiten Stegen umgeben sein. Weil bei diesen Gitterstrukturen das Stegmaterial des Gitters einen großen Flächenanteil aufweist, muss diese Fläche nachträglich geschwärzt werden, um ein Überstrahlen der konfokalen Information zu verhindern. Die Schwärzung führt dazu, dass das Gitter das Licht absorbiert, was wiederum potenziell zu einer Überhitzung des Gitters und damit zu schlechteren Abbildungseigenschaften führen kann. Außerdem wird trotz allem ein größerer Lichtanteil reflektiert. Dieser Streulichtanteil verschlechtert die Signalqualität des konfokalen Bilds.
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Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Mikroskopie anzugeben, bei denen die Generierung der konfokalen Information und der Weitfeldinformation deutlich vereinfacht wird.
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Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 20 gelöst.
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Bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens und vorteilhafte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere mit den beigefügten Figuren, beschrieben.
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Die Vorrichtung der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass die Anregungsmaske ein räumlich strukturierter Filter ist, der für Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und der Licht mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt.
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Das Verfahren der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass der Filter für Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und dass der Filter Licht mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt.
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Als Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, abweichend vom und hinausgehend über den Stand der Technik, eine Anregungsmaske zu verwenden, die nur Licht mit einer bestimmten Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt und andererseits Licht, welches diese Eigenschaft nicht aufweist, weitgehend unverändert transmittiert und in diesem Sinn für dieses Licht transparent ist.
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Hierdurch wird als wesentlicher Vorteil der Erfindung erreicht, dass ein mikroskopisches Bild sowohl mit dem Licht, welches räumlich strukturiert ist, also die zweite physikalische Eigenschaft aufweist, und auch mit dem Licht, welches die erste physikalische Eigenschaft aufweist, prinzipiell gleichzeitig ein mikroskopisches Bild gewonnen werden kann.
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Hierdurch können im Prinzip mechanische Komponenten entfallen, was zunächst bei feinmechanischen Apparaturen immer wünschenswert ist. Außerdem kann ein erheblicher Zeitvorteil erzielt werden, weil die gewünschte mikroskopische Information schneller, nämlich parallel oder gleichzeitig, gewonnen werden kann.
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Im Hinblick auf die Anregungsmaske kommt es für die vorliegende Erfindung wesentlich darauf an, dass sie dem Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft eine geeignete räumliche Struktur aufprägt. Eine räumliche Struktur des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft ist dann als geeignet anzusehen, wenn sie ganz allgemein eine Auflösungssteigerung für das Mikroskopbild ermöglicht.
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Prinzipiell kann die Anregungsmaske hierzu ein- oder zweidimensionale Strukturierungen, beispielsweise also Pinholes oder linien- oder streifenförmige schmale Blenden, aufweisen. Diese können periodisch angeordnet oder auch statistisch verteilt angeordnet sein.
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Das erfindungsgemäße Prinzip kann sodann prinzipiell für Transmissionsgeometrien ebenso verwirklicht werden wie für Reflektionsgeometrien.
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Die Anregungsmaske kann hierzu chromatisch einstellbare Flüssigkomponenten aufweisen, wodurch als wesentlicher Vorteil erreicht wird, dass die gesamte Vorrichtung im Prinzip ohne bewegliche Komponenten auskommt.
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Für eine Reflexionsgeometrie kann dies auch verwirklicht werden, wenn die Anregungsmaske einen digitalen Mikrospiegel aufweist.
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Bei einer besonders bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste physikalische Eigenschaft eine erste Wellenlänge des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft ist eine von der ersten Wellenlänge verschiedene zweite Wellenlänge des Lichts. Prinzipiell ist auch möglich, dass die erste physikalische Eigenschaft ein erster Wellenlängenbereich des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft ein von dem ersten Wellenlängenbereich verschiedener zweiter Wellenlängenbereich des Lichts ist. Die Anregungsmaske ist dann ein räumlich strukturierter Farbfilter.
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Prinzipiell kommt es im Hinblick auf die erste physikalische Eigenschaft des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft des Lichts nur darauf an, dass diese physikalischen Eigenschaften eine adäquate Trennung des Lichts sowohl auf der Anregungs- als auch auf der Nachweisseite ermöglichen.
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Grundsätzlich kann das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aus separaten Lichtquellen bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind aber Ausführungsvarianten, bei denen genau eine Lichtquelle vorhanden ist, die sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aussendet.
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Die Konfokalität wird bei dieser Erfindung durch fein strukturierte Farbfilter erzeugt. Wie bei dem Verfahren der sogenannten korrelativen Apertur wird neben der konfokalen Information zusätzlich die Weitfeldinformation beschafft und verwendet. Im Gegensatz zum Verfahren der korrelativen Apertur werden bei der vorliegenden Erfindung die Weitfeldinformation und die konfokale Information insbesondere zeitgleich erzeugt. Je nach Auslegung des Gesamtsystems ist keine Triggerung notwendig. Dadurch besteht außerdem die Möglichkeit, die Aufnahmegeschwindigkeit gegenüber dem herkömmlichen Prinzip zu verdoppeln. Je nach gewählter Variante kann auch der Wärmeeintrag durch Lichtabsorption reduziert werden.
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Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste physikalische Eigenschaft eine erste Polarisation des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft eine von der ersten Polarisation verschiedene zweite Polarisation des Lichts. Beispielsweise kann es sich um linear oder zirkular polarisiertes Licht handeln.
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Die räumliche Strukturierung des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft, beispielsweise also von Licht mit einer bestimmten Wellenlänge oder einer bestimmten Polarisation, wird zweckmäßigerweise so gewählt, dass die Auflösung des mit diesem Licht aufgenommenen mikroskopischen Bilds gesteigert wird. Die Mechanismen, die hierbei wirksam werden können, sind im Prinzip bekannt.
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Bei einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die dem Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aufgeprägte räumliche Strukturierung so gewählt, dass die Extraktion eines konfokalen Bilds möglich ist.
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Weil die konfokale Auflösung wesentlich von der Wellenlänge abhängt, kann dabei zweckmäßig die Variante gewählt werden, bei welcher eine Diskriminierung durch verschiedene Wellenlängen erfolgt und die erste Wellenlänge größer ist als die zweite Wellenlänge. Das konfokale Bild wird also bevorzugt mit der kürzeren Wellenlänge aufgenommen, mit welcher die bessere Auflösung möglich ist.
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Grundsätzlich kann die Erfindung aber auch verwirklicht werden, wenn das konfokale Bild mit der größeren Wellenlänge und das Weitfeldbild mit der kleineren Wellenlänge aufgenommen wird.
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Prinzipiell kann das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und mit der zweiten physikalischen Eigenschaft von ein und derselben Lichtquelle bereitgestellt werden, so dass im Grundsatz eine einzige Lichtquelle zur Verwirklichung der Erfindung ausreichend sein kann. Die Vorteile der Erfindung werden in besonderer Weise erreicht, wenn Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft gleichzeitig eingestrahlt werden kann, weil dann das Weitfeldbild und das mit strukturierter Beleuchtung aufgenommene Bild, wobei es sich insbesondere um ein konfokales Bild handeln kann, gleichzeitig aufgenommen werden können.
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Prinzipiell ist auch möglich, Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aus separaten Lichtquellen bereitzustellen. Das kommt insbesondere in Betracht, wenn eine Diskriminierung über die Wellenlänge erfolgt. Bei dieser Variante kann es bevorzugt sein, wenn mindestens eine der Lichtquellen durchstimmbar ist. Insbesondere ist es zweckmäßig, die Lichtquelle, welche zum Gewinnen des Weitfeldbilds dient, durchstimmbar auszubilden, weil dann auch eine Farbinformation der Probe gewonnen werden kann.
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Prinzipiell ist es auch möglich, eine breitbandige Lichtquelle zu verwenden, die sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aussendet.
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Grundsätzlich kann es sich bei der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft auch um größere Wellenlängenbereiche handeln. Bei einer besonders einfachen und bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird beispielsweise als Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft Weißlicht verwendet, wobei aus diesem Licht das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft herausgefiltert ist. Dieses Herausfiltern des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft, also des Lichts, welches der räumlichen Strukturierung unterworfen wird, erfolgt dabei besonders bevorzugt mit der erfindungsgemäß vorhandenen Anregungsmaske.
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Wenn Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft gleichzeitig auf die Anregungsmaske gestrahlt wird und deshalb das Weitfeldbild und das Bild mit strukturierter Beleuchtung gleichzeitig gewonnen werden, müssen zum Auftrennen der jeweiligen Lichtanteile vor dem Detektor geeignete Maßnahmen getroffen werden.
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Zweckmäßig ist deshalb vor der Detektionseinheit ein Strahlteiler zum Auftrennen von Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft vorhanden. Je nach Eigenschaft, welche zur Unterscheidung dienen soll, kann es sich dabei um Farbstrahlteiler oder Polarisationsstrahlteiler handeln. Als Detektionseinheit kann grundsätzlich jede Art von zweidimensionalem Bilddetektor oder Sensor-Array eingesetzt werden.
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Prinzipiell können auch beispielsweise zwei oder mehrere Sensor-Arrays vorhanden sein, welche zum Nachweis der unterschiedlichen Lichtanteile des von der Probe kommenden Lichts dienen können. Beispielsweise kann mit einem ersten Sensor-Array das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und mit einem zweiten Sensor-Array das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft nachgewiesen werden. Hier müssen wieder geeignete Mittel zum Auftrennen der Lichtanteile vorhanden sein. Grundsätzlich ist es aber ausreichend, wenn ein einziges Sensor-Array vorhanden ist, mit dem sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft nachgewiesen werden kann. Wenn das von der Probe kommende Licht gleichzeitig beide Lichtanteile enthält, müssen vor dem Sensor-Array geeignete Mittel zum Herausfiltern des jeweils gewünschten Lichts vorhanden sein.
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Besonders vorteilhaft ist es deshalb, wenn vor der Detektoreinheit und/oder nach mindestens einer der Lichtquellen eine Filterwechseleinrichtung, insbesondere ein Filterrad oder ein Filterschieber, mit einer Mehrzahl von verschiedenen Filtern vorhanden ist. Bei diesem Filter oder gegebenenfalls bei einer Mehrzahl von Filtern handelt es sich zweckmäßigerweise um Farbfilter oder Polarisationsfilter.
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Alternativ zum Einsatz von mehreren Sensor-Arrays kann auch ein einziges Sensor-Array unterteilt werden und ein erster Bereich des Sensor-Arrays zum Nachweis von Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und ein zweiter Bereich des Sensor-Arrays zum Nachweis von Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft verwendet werden.
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Falls für bestimmte Untersuchungen auch eine Farbinformation des Weitfeldbilds gewünscht ist, kann die Detektionseinheit zweckmäßig auch ein mehrkanaliges Sensor-Array, also ein Sensor-Array, mit dem die Detektion verschiedener Farben möglich ist, umfassen.
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Bei weiteren bevorzugten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die mikroskopischen Aufnahmen kontinuierlich während eines z-Scans aufgenommen. Das bedeutet, dass der Abstand der Probe zur Mikroskopoptik kontinuierlich oder schrittweise zeitlich verändert wird. Weil die dabei generierten konfokalen Mikroskopdaten deutlich empfindlicher von der z-Position abhängen, als die Weitfelddaten, ist es von Vorteil, die konfokale Bildinformation möglichst mit hoher Frequenz auszulesen. Wenn beispielsweise außerdem noch eine spektrale Information für die Weitfeldaufnahmen aufgenommen werden soll und hierzu verschiedene Farbfilter vor der Detektionseinheit vorhanden sind, ist es zweckmäßig, die verschiedenen Farbfilter so, beispielsweise auf einem Filterrad anzuordnen, dass nach jedem zweiten Bild die konfokale Information ausgelesen wird.
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Zweckmäßig können zum Unterdrücken von Streulicht Polarisationsfilter vorhanden sein.
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Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben.
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Hierin zeigt
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1: ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und
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2: ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Gleiche und gleich wirkende Komponenten sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
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In 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Mikroskopie gezeigt, welche als wesentliche Komponenten eine erste Lichtquelle 10, eine zweite Lichtquelle 20, eine Mikroskopoptik 30, eine Anregungsmaske 40 und eine Detektionseinheit 50 aufweist.
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Im gezeigten Ausführungsbeispiel weist das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 eine erste Wellenlänge als erste physikalische Eigenschaft auf und das Licht der zweiten Lichtquelle 20 weist eine von der ersten Wellenlänge verschiedene zweite Wellenlänge als zweite physikalische Eigenschaft auf. Das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 wird über optische Mittel 12 und einen Strahlteile 26 in den Anregungsstrahlengang eingekoppelt und über die Mikroskopoptik 30 als Beleuchtungslicht auf eine Probe 32 geleitet. Mithilfe des Lichts 14 der ersten Lichtquelle 10 wird eine Weitfeldmessung durchgeführt. Von der Probe 32 zurückgestrahltes Licht 14 tritt im Wesentlichen ungehindert durch die Anregungsmaske 40 und auch durch einen Strahlteiler 16 hindurch und wird über einen Spiegel 70 in Richtung der Detektionseinheit 50 umgelenkt.
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Vor der Detektionseinheit 50 ist ein Filterrad 60 mit verschiedenen Farbfiltern 62, 64 angeordnet. Im gezeigten Beispiel soll der Farbfilter 64 für Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 transparent sein, so dass in der in 1 gezeigten Situation das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 ungehindert durch den Farbfilter 64 hindurchtritt und in der Detektionseinheit 50 nachgewiesen werden kann.
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Die Lichtquelle 20 liefert Licht 24 mit einer zweiten Wellenlänge, die bevorzugt kürzer ist als die Wellenlänge des Lichts der ersten Lichtquelle 10. Das Licht 24 der zweiten Lichtquelle 20 wird über optische Mittel 22 und einen Strahlteiler 16 in den Anregungsstrahlengang eingekoppelt. Im Unterschied zum Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 wird dem Licht 24 aber dann gemäß dem wesentlichen Gesichtspunkt der Erfindung durch die Anregungsmaske 40 eine räumliche Struktur aufgeprägt, welche beispielsweise geeignet ist, von der Probe 32 ein konfokales Bild zu erhalten. Hierzu wird die Anregungsmaske 40 in geeigneter Weise relativ zur optischen Achse des Systems bewegt. Dies kann einerseits erfolgen durch Rotation um eine Achse 42, wie durch den Pfeil 44 angedeutet. Prinzipiell ist aber auch eine Linearbewegung, angedeutet durch einen Doppelpfeil 46, möglich.
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Das Licht 24, dem durch die Anregungsmaske 40 eine räumliche Struktur aufgeprägt wurde, gelangt über den Strahlteiler 26 und die Mikroskopoptik 30 auf die Probe 32. Von dort zurückreflektiertes Licht 24 nimmt im Wesentlichen denselben Weg über die Mikroskopoptik, den Strahlteiler 26 und die Anregungsmaske 40 zurück und wird sodann wenigstens teilweise durch den Strahlteiler 16 transmittiert und wiederum über den Spiegel 70 in Richtung der Detektionseinheit 50 umgelenkt. Wenn der Farbfilter 62 des Filterrads 60 im Strahlteiler positioniert ist, tritt das Licht 24 der zweiten Lichtquelle durch diesen Farbfilter hindurch und kann in der Detektionseinheit nachgewiesen werden. Die Detektionseinheit 50 besteht im gezeigten Ausführungsbeispiel bevorzugt aus einem CCD-Sensor-Array.
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Eine Drehbewegung des Filterrads ist in 1 durch den Pfeil 68 angedeutet.
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Ein besonders einfaches Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 ist in 2 gezeigt. Im Unterschied zu der in 1 dargestellten Variante kommt dieses Ausführungsbeispiel mit nur einer Lichtquelle 10 aus. Diese Lichtquelle 10 liefert Licht sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten Wellenlänge, wobei prinzipiell hierzu eine breitbandige Lichtquelle 10 verwendet werden kann. Die übrige Funktion entspricht derjenigen, die mit Bezug auf 1 beschrieben wurde.
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Wesentlich für die Erfindung ist demgemäß eine Anregungsmaske, die auch als Gitterplatte bezeichnet werden kann, auf der die jeweiligen Filter mit einer genügend kleinen Strukturgröße aufgebracht werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Farbfilter und demgemäß um eine Farbfilterscheibe mit Farbgittern. Diese Farbfilter müssen, damit die mikroskopische Information im Weiteren geeignet und hinreichend gut getrennt werden können, außerdem eine hinreichend hohe Unterdrückung der jeweils anderen Lichtkomponente aufweisen. Beispielsweise müssen in dem Fall, dass die Wellenlänge zur Diskriminierung verwendet wird, die Filter eine genügend hohe Farbunterdrückung aufweisen.
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Anstelle eines Gitters werden fein strukturierte Farbfilter zur Erzeugung der Konfokalität verwendet. Dadurch kann die getriggerte Erzeugung und Detektion von konfokaler und Weitfeldinformation entfallen.
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Je nach Variante kann zusätzlich sehr einfach die Farbinformation ausgelesen werden.
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Durch einen geringen zusätzlichen konstruktiven Aufwand ist es außerdem möglich, die konfokale Information und die Weitfeldinformation zeitgleich auszulesen. Dadurch kann die Aufnahmegeschwindigkeit im Prinzip verdoppelt werden.
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Das kurzwellige Licht wird auf die Anregungsmaske 40, die auch als Gitterplatte bezeichnet wird, gelenkt. Sinnvollerweise wird für die konfokale Beleuchtung die kürzere Wellenlänge gewählt, weil die konfokale Auflösung empfindlich von der Wellenlänge abhängt und mit kürzeren Wellenlängen besser wird. Die Gitterplatte besteht aus fein strukturierten Farbfiltern, deren laterale Ausdehnung den Anforderungen der Konfokalität entspricht. Die Farbfilter sind wechselseitig für die kürzere Wellenlänge durchlässig und undurchlässig. Die durchlässigen Bereiche sind Kurzpassfilter, die den entsprechenden Spektralbereich durchlassen. Die nicht durchlässigen Bereiche sind entsprechend Langpässe, welche diesen Wellenlängenbereich blockieren.
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Das kurzwellige Licht trifft nach der Gitterplatte durch die weiteren abbildenden Optiken 30 auf die Probe 32 und wird von dort zurück zur Anregungsmaske 40 oder Gitterplatte reflektiert. Gemäß dem konfokalen Prinzip geht nur der Teil des Lichts durch die Kurzpassfilter, bei dem sich die Oberfläche der Probe 32 genau im Brennpunkt befindet.
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Das langwellige Licht fällt über die Abbildungsoptiken 30 direkt auf die Probe, wird dort reflektiert und tritt auf dem Rückweg ungehindert durch die Anregungsmaske 40 wieder hindurch.
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Das kurzwellige konfokale Licht und das langwellige Weitfeldlicht werden von der Anregungsmaske 40 aus zur Detektionseinheit 50 geleitet und dort detektiert. Im gezeigten Beispiel beinhaltet die Detektionseinheit 50 ein zweidimensionales Sensor-Array. in der Basisvariante befinden sich hier auf einem Filterrad 60 zwei Farbfilter 62, 64. Das Filterrad 60 lässt sich um eine mit dem Bezugszeichen 66 gekennzeichnete Achse drehen und lässt je nach Filterradstellung den konfokalen Anteil oder den Weitfeldanteil des Lichts hindurch. Das wird durch den Kerngedanken der Erfindung ermöglicht, dass die beiden mikroskopischen Informationen getrennt, nämlich durch die erste physikalische Eigenschaft und die davon verschiedene zweite physikalische Eigenschaft, insbesondere, wie im hier gezeigten Beispiel, chromatisch getrennt, vorliegen.
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Durch eine Synchronisierung von getriggertem Farbfilter und Bildaufnahme ist es möglich, nacheinander die Weitfeldinformation und die konfokale Information mit einem Sensor-Array zu detektieren.
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Das laterale Scannen oder Rastern über die Probe erfolgt durch Verfahren der Gitterplatte, also der Anregungsmaske 40, senkrecht zur optischen Achse, ähnlich wie bei einem herkömmlichen Spinning-Disc-System mit Nipkow-Scheibe.
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Gitterplatte und getriggerter Farbfilter sind in diesem Beispiel als rotierende Scheiben ausgeführt. Es ist aber auch möglich, die Farbfilter linear in einer Richtung zu bewegen.
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Ein Aufbau ganz ohne bewegliche Teile kann mit Flüssigkristall Arrays erreicht werden.
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Besonders vorteilhaft ist auch, wenn die Lichtquelle, welche zur strukturierten Beleuchtung verwendet wird, insbesondere also zur Generierung eines mikroskopischen Bilds eingesetzt wird, eine möglichst kurze Wellenlänge aufweisen, die in der Regel nicht kürzer sein sollte, als die Weitfeldwellenlänge.
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Zweckmäßig sind außerdem zusätzliche Farbfilter nach den Beleuchtungskörpern, um sauber getrennte Farbspektren der einzelnen Anregungswellenlängen zu ermöglichen.
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Möglich sind außerdem folgende Varianten:
Variante 1: Konfokale Anregung mit kurzwelligem monochromatischem schmalbandigem Licht. Je nach Auslegung der Optik gegenüber chromatischen Aberrationen sollte das langwelligere Licht ebenfalls schmalbandig sein und nur eine geringfügig höhere Wellenlänge haben oder es kann deutlich langwelliger und breitbandiger sein. Der Nachweis erfolgt mit einem einkanaligen Sensor-Array, beispielsweise einer CCD- oder CMOS-Kamera.
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Vor dem Detektor kann sich ein Farbfilter befinden, der je nach Stellung den kurzwelligen Anteil oder den langwelligen Anteil hindurchlassen kann.
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Variante 2: Bei einer Abwandlung der Variante 1 erfolgt die Detektion über einen Farbteiler, der das Licht auf zwei Sensor-Arrays lenkt. Hier ist vorteilhafterweise keine Triggerung notwendig.
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Variante 3: Anstelle von zwei separaten Sensor-Arrays wird ein und dasselbe Sensor-Array in zwei verschiedene Bereiche unterteilt und der Farbteiler lenkt das Licht auf den ersten beziehungsweise den zweiten Teil. Diese kostengünstige Lösung ermöglicht nur elf kleineres Bildfeld und deshalb eine kleinere Auflösung.
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Prinzipiell kann die Weitfeldbeleuchtung mit Weißlicht durchgeführt werden.
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Weitere Variationsmöglichkeiten erhält man durch Kombination der jeweils vorgeschlagenen Beleuchtungen.
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Variante 4: Anstelle des Farbfilters mit zwei Farbbereichen im Detektionsstrahlengang können weitere zusätzliche Bereiche mit Bandpässen verwendet werden, um eine chromatische Aufteilung des Weitfeldspektrums zu erlauben. Für ein komplettes Bild müssen dann nicht nur zwei Einzelbilder erzeugt werden, sondern für jeden Farbkanal ein Bild. Hierbei wird vorteilhafterweise die zusätzliche Erfassung der Farbinformation der Probe ermöglicht.
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Der Farbfilter kann prinzipiell auch so strukturiert sein, dass bei jedem zweiten Einzelbild die konfokale Information ausgelesen wird. Das Auslesen der Farbinformation erfolgt dabei über mehrere z-Schnitte hinweg. Weil die Weitfeldinformation im Vergleich zur konfokalen Information unempfindlicher gegenüber Änderungen des Brennpunkts ist, ist das ohne Qualitätseinbußen möglich und die mikroskopische Information kann bei dieser Variante sehr effektiv bereitgestellt werden.
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Alternativ oder zusätzlich kann auch ein Farbfilter mit mehreren unterschiedlichen Farbfeldern vor das Sensor-Array für die Weitfelddetektion positioniert werden. Die komplette Farbdetektion erfolgt dann für jeden z-Schnitt einzeln. Eine höhere Aufnahmegeschwindigkeit kann außerdem erzielt werden, wenn als Sensor-Array ein mehrkanaliges Sensor-Array, insbesondere ein dreikanaliges Sensor-Array mit den Farben gelb, rot und blau verwendet wird. Als Vorteil wird hier eine kostengünstige Detektion der Farben ohne Geschwindigkeitsverlust erreicht. Allerdings ist die Auflösung verringert, weil nur ein Bruchteil der Lichtsensoren im kurzwelligen konfokalen Bereich empfindlich ist.
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Dies kann prinzipiell vermieden werden, wenn für die konfokale mikroskopische Information eine separate Kamera verwendet wird.
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Anstelle der Weitfeldbeleuchtung kann insbesondere auch eine durchstimmbare Lichtquelle oder ein nach der Lichtquelle angeordneter Farbverlaufsfilter, welcher im Prinzip der zuvor erwähnten Filterwechseleinrichtung entspricht, zur Bestimmung der Farbinformation verwendet werden.
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Sodann kann anstelle von zwei Lichtquellen auch eine breitbandige Lichtquelle verwendet werden. Dies ist eine besonders einfache Variante der vorliegenden Erfindung. Diese breitbandige Lichtquelle wird anstelle der kurzwelligen Lichtquelle zur Erzeugung des konfokalen Bilds verwendet. Die Weitfeldbeleuchtung erfolgt dann ebenfalls mit dieser Lichtquelle und die zweite Lichtquelle kann dann entfallen. Weiße LEDs mit einem Peak im Spektrum im blauen oder violetten Bereich und einem breiten langwelligen Spektrum können beispielsweise hierzu verwendet werden. Zweckmäßigerweise ist bei dieser Variante auf eine gute Trennung der Farbinformation im Detektionsstrahlengang zu achten.
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Anstelle von Anregungsmasken, die im Wesentlichen strukturierte Farbfilter sind und die zum Generieren der mikroskopischen Information mit strukturierter Beleuchtung über den Strahlengang, insbesondere im Bereich eines Zwischenbilds, hinwegbewegt werden, können auch Durchlicht-LCDs, also Flüssigkristallkomponenten, verwendet werden. Diese Komponenten sind prinzipiell auch chromatisch einstellbar erhältlich. Als wesentlicher Vorteil dieser Varianten ist anzusehen, dass ein System völlig ohne bewegliche Teile aufgebaut werden kann. Diese Flüssigkristallkomponenten können insbesondere auch so angesteuert werden, dass die Strukturierung, bestehend aus ein- und/oder zweidimensionalen Elementen, statistisch verteilt ist.
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Das erfindungsgemäße Prinzip kann auch mithilfe von polarisiertem Licht und Polfiltern verwirklicht werden. Das ist insbesondere mit schnell schaltbaren Flüssigkristallkomponenten möglich. Polarisiertes Licht bietet außerdem die Möglichkeit, Streulicht mithilfe von weiteren Polfiltern zu unterdrücken. Zu berücksichtigen ist dabei, dass eine Mikrostruktur der zu untersuchenden Probe ebenfalls die Polarisation des Lichts beeinflussen kann.
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Außerdem ist es grundsätzlich möglich, das hier beschriebene Prinzip auch in Reflexion statt in Transmission umzusetzen. Das gilt insbesondere für die Variante mit einem DLP-Projektionssystem (Digital Light Processing = DLP). Mit diesen Komponenten kann eine sehr genaue und schnelle Erzeugung und ein rascher Wechsel der Anregungsmaske bewerkstelligt werden.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- erste Lichtquelle
- 12
- erste optische Mittel
- 14
- Licht der ersten Lichtquelle
- 20
- zweite Lichtquelle
- 22
- zweite optische Mittel
- 24
- Licht der zweiten Lichtquelle
- 30
- Mikroskopoptik
- 32
- Probe
- 40
- Anregungsmaske
- 42
- Drehachse der Anregungsmaske
- 44
- Drehpfeil
- 46
- Doppelpfeil
- 50
- Detektionseinheit
- 60
- Filterrad
- 62
- erster Farbfilter
- 64
- zweiter Farbfilter
- 66
- optische Achse
- 68
- Rotationspfeil
- 70
- Spiegel
- 100
- Vorrichtung
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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