DE102011075369A1

DE102011075369A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Objektabbildung

Info

Publication number: DE102011075369A1
Application number: DE102011075369A
Authority: DE
Inventors: Peter Westphal; Markus Sticker; Dr. Kramer Matthias; Wolfgang Grau
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2011-05-05
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2012-11-08
Anticipated expiration: 2031-05-06
Also published as: DE102011075369B4

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Hochgeschwindigkeitsaufnahme von Einzelbildern lateral nebeneinander liegender Bereiche eines Objektes und der Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Vorrichtung zur Ausübung dieses Verfahrens. Erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren der vorgenannten Art folgende Verfahrensschritte: – fortlaufende Verschieben des Objektes in Richtung X und/oder Y relativ zu einem im wesentlichen in der Ebene X, Y liegenden Objektfeld einer Bildaufnahmeeinrichtung, – Auslösen einer Folge von Bildaufnahmezyklen, wobei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt wird, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren, die aneinandergrenzen oder teilweise überlappen, – Beleuchten des Objektes zum Zeck der Bildaufnahme innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus mittels einer oder mehreren Halbleiter-Lichtquellen, wobei die Einschaltzeit jeder Lichtquelle kleiner ist als 10 μs und die Summe der Einschaltzeiten der Halbleiter-Lichtquellen kleiner ist als die Dauer des Bildaufnahmezyklus, – Speichern der während eines jeden Bildaufnahmezyklus aufgenommenen Bilddaten, und – Ermittlung des Gesamtbildes des Objektes aus den während aller Bildaufnahmezyklen gespeicherten Bilddaten.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Hochgeschwindigkeitsaufnahme von Einzelbildern lateral nebeneinander liegender Bereiche eines Objektes und der Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Vorrichtung zur Ausübung dieses Verfahrens.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Anwendung auf dem Gebiet der automatisierten Weitfeldmikroskopie von Proben geeignet, und zwar in den Fällen, in denen die laterale Ausdehnung der Probe wesentlich größer ist als das mit dem Mikroskopobjektiv von der Probe erfassbare Objektfeld. Um die Probe in ihrer Gesamtheit trotzdem schnell abzubilden, müssen mit möglichst hoher Geschwindigkeit zahlreiche lateral nebeneinander liegende Einzelbilder der Probe erfasst und zu einem Gesamtbild zusammengesetzt werden.
So besteht beispielsweise in der Pathologie die Forderung, Gewebeschnitte automatisiert und schnell im Durchlicht zu mikroskopieren. Die möglichst schnelle Aufnahme von Einzelbildern bei Auflichtbeleuchtung und deren Zusammensetzung wird zum Beispiel bei der automatisierten mikroskopischen Materialanalyse gefordert.
Im Stand der Technik sind diesbezügliche Verfahren und auch Vorrichtungen bekannt, bei denen verhältnismäßig große, fortdauernd mittels Halogen- oder Bogenlampen beleuchtete Proben mikroskopisch abgerastert werden. Dabei wird die Probe zunächst an eine Anfangsposition relativ zum Mikroskopobjektiv gefahren und aus dieser Position ein Einzelbild des dabei im Objektfeld befindlichen Bereiches der Probe aufgenommen. Die Objektfeldgröße sei hier und auch im Sinne der weiter unten folgenden Erfindungsbeschreibung bestimmt durch die optischen Eigenschaften des verwendeten Objektivs in Verbindung mit den Eigenschaften der Aufnahmekamera. Anschließend an die Aufnahme dieses ersten Probenbereiches erfolgt eine Verschiebung der Probe relativ zum Objektiv, und zwar zwecks Überlappung um einen Betrag, der etwas kleiner ist als die in der Verschieberichtung gemessene Objektfeldbreite. Nach der Verschiebung wird der nun im Objektfeld positionierte Probenbereich aufgenommen, wobei die Probe relativ zum Objektiv ruht. Diese Verfahrensweise wird fortgesetzt, bis die gesamte Probe mit leicht überlappenden Einzelbildern abgerastert ist. Die Überlappung der Bildbereiche ermöglicht es, die Einzelbilder zu korrelieren, um sie zu einem nahtlosen Gesamtbild zusammensetzen zu können. Diese Methode ist in der Fotografie unter der Bezeichnung Stitching bekannt.
Nachteilig hierbei ist, dass die Probe einschließlich des Probentisches sowie der beweglichen Teile der Verschiebeeinrichtung nach jeder Positionierung wieder beschleunigt und abgebremst werden muss, was relativ viel Zeit in Anspruch nimmt. Aufgrund dieser Beschleunigungen und Verzögerungen ist der für die Gewinnung des Gesamtbildes der Probe erforderliche Zeitaufwand stets größer als die Summe der für die einzelnen Probenbewegungen erforderlichen Zeiten. Selbst wenn die Zeiten für die eigentliche Bilderfassung sehr klein gehalten werden, ist die Dauer der Abläufe bis zur Verfügbarkeit des Gesamtbildes für viele Anwendungsfälle groß.
Bei einem weiteren bereits bekannten Verfahren wird die Probe kontinuierlich bewegt und zwecks Aufnahme der Einzelbilder mittels Stroboskop beleuchtet. Als Stroboskop wird dabei in der Regel ein Elektronenblitzgerät genutzt, wie es auch in Fotoapparaten verwendet wird. Die Zeitdauer des Ablaufs bis zur Vorlage des Gesamtbildes der Probe hängt hierbei von der Pulslänge des Elektronenblitzes ab und von der Geschwindigkeit, mit der die Probe verschoben wird. Eine Erhöhung der Verschiebegeschwindigkeit setzt die Verkürzung der Pulslänge voraus. Außerdem muss die Pulslänge hinreichend kurz im Verhältnis zur Geschwindigkeit der Probenverschiebung sein, um das Verschmieren der Einzelbilder zu vermeiden.
Nachteilig hierbei ist vor allem, dass Elektronenblitzgeräte nur unter verhältnismäßig großem technischem Aufwand Lichtpulse bereitstellen können, deren Pulslänge kleiner ist als 25 μs. Weiterhin ist bei Elektronenblitzgeräte nachteilig, dass die Pulsenergie proportional zur Pulslänge abnimmt, was dazu führt, dass die Aufnahmekamera bei sehr kurzen Pulsen nicht mehr betriebsfähig ausgesteuert werden kann.
In WO 1996/008106 A1 ist ein Verfahren zur schnellen Erfassung von fokussierten Mikroskopbildern beschrieben, bei dem eine Stroboskop-Beleuchtung der Probe mittels Lichtblitzen vorgesehen ist. Die Bilderfassung erfolgt mit einer Kamera, die eine Integrationszeit zwischen aufeinander folgenden Lichtblitzen aufweist. Die Aufnahme eines ersten Bildes erfolgt während dieser Integrationszeit, die Aufnahme eines zweiten Bildes erfolgt zeitlich nach der Aufnahme des ersten Bildes, jedoch vor Ablauf der Bildausleseperiode bzw. der Übertragung der Bilddaten an einen Datenspeicher.
In WO 2006/023675 A2 wird ein ”MICROSCOPY SYSTEM HAVING AUTOMATIC AND INTERACTIVE MODES FOR FORMING A MAGNIFIED MOSAIC IMAGE AND ASSOCIATED METHOD” vorgestellt, ausgebildet zur Aufnahme biologischer Proben bei manueller oder automatischer Betriebsweise. Der Objektträger wird kontinuierlich bewegt, und es ist eine Halogen- oder LED-Beleuchtungsquelle vorgesehen, um interessierende Objektdetails betrachten, gegebenenfalls zur Bilderfassung und -speicherung auswählen und bei Bedarf quantitativ auswerten zu können. Eine Beleuchtung des Objektes mittels gepulst geschalteter LED's zwecks fortlaufender Bilderfassung ist nicht vorgesehen.
Die Offenlegungsschrift DE 23 57 813 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Bildanalyse, insbesondere zur Untersuchung einer Fläche, die wenige, in großem Abstand voneinander liegende Bildpunkte enthält, wobei zwischen zwei Ableseabtastungen jeweils ein beleuchteter Objektbereich in Position gebracht wird. Die zur Ausübung des Verfahrens vorgeschlagene Vorrichtung umfasst ein Mikroskop, einen Objekttisch, eine Einrichtung zur Blitzbeleuchtung des Objektes, eine Fernsehkamera, welche Einzelbilder aufnimmt, und eine Steuereinrichtung, die den Bewegungsablauf und die Abtastfunktionen der Fernsehkamera koordiniert. Eine Objektbeleuchtung mit LED ist nicht vorgesehen.
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren vorzuschlagen, das die Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweist. Eine weitere Aufgabe besteht darin, mindestens eine Vorrichtung zur Ausübung des neuen Verfahrens anzugeben, vorzugsweise in Form eines Weitfeldmikroskops.
Erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren der eingangs genannten Art folgende Verfahrensschritte:

– fortlaufende Verschieben des Objektes in Richtung X und/oder Y relativ zu einem im wesentlichen in der Ebene X, Y liegenden Objektfeld einer Bildaufnahmeeinrichtung,
– Auslösen einer Folge von Bildaufnahmezyklen, wobei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt wird, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren, die aneinandergrenzen oder teilweise überlappen,
– Beleuchten des Objektes zum Zeck der Bildaufnahme innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus mittels einer oder mehreren Halbleiter-Lichtquellen, wobei die Einschaltzeit jeder Lichtquelle kleiner ist als 10 μs und die Summe der Einschaltzeiten der Halbleiter-Lichtquellen kleiner ist als die Dauer des Bildaufnahmezyklus,
– Speichern der während eines jeden Bildaufnahmezyklus aufgenommenen Bilddaten, und
– Ermittlung des Gesamtbildes des Objektes aus den während aller Bildaufnahmezyklen gespeicherten Bilddaten.

Vorzugsweise wird dabei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren und aufgenommen werden, die aneinander um einen vorgegebenen Betrag überlappen.
Als Halbleiter-Lichtquellen kommen hauptsächlich Hochleistungs-LED-Lichtquellen (Light Emitting Diodes) in Betracht, allerdings liegt auch die Verwendung von Halbleiterlasern im Rahmen der Erfindung. Die weitere Erfindungsbeschreibung bezieht sich beispielhaft auf die Objektbeleuchtung mittels Hochleistungs-LED-Lichtquellen.
Die Beleuchtungsdauer des Objektes bzw. die Einschaltdauer jeder LED-Lichtquelle wird bevorzugt kleiner ist als 1 μs gewählt. Weiterhin erfolgt die Beleuchtung des Objektes zum Zeck der Bildaufnahme innerhalb einer Zeitspanne T1, die Übertragung der Bilddaten zu einem Datenspeicher erfolgt innerhalb einer Zeitspanne T2.
Die Summe der Zeitspannen T1 und T2 ist gleich oder kleiner als die Dauer des Bildaufnahmezyklus. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens

– ist die Summe der Zeitspannen T1, T2 um eine Zeitspanne T3 kleiner als die Dauer des Bildaufnahmezyklus, wobei
– das Objekt mit konstanter Geschwindigkeit verschoben wird, und
– die Zeitspanne T3 als Zeitreserve zum Nachregeln der Geschwindigkeit der Objektverschiebung in Bezug auf die Position des Objektfeldes genutzt wird.

Optional können sich die Zeitspannen T1 und T2 innerhalb des Bildaufnahmezyklus um eine vorgegebene Zeitdauer überlappen, so dass die Zeitdauer zwischen dem Beginn der Zeitspanne T1 und dem Ende der Zeitspanne T2 um die Überlappung verringert ist.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung werden mehrere LED-Lichtquellen zur Objektbeleuchtung verwendet, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlen und während jedes Bildaufnahmezyklus simultan oder sequentiell eingeschaltet werden. So werden beispielsweise drei Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlende LED-Lichtquellen vorgesehen und sequentiell jeweils nach einer Verschiebung des Objektes um ein Drittel der Objektfeldgröße pulsartig eingeschaltet.
Von Vorteil ist es weiterhin, das Objekt während der kürzesten vorgesehenen Einschaltdauer einer jeden LED-Lichtquelle nur um einen Betrag zu verschieben, der kleiner ist als das laterale Auflösungsvermögens einer digitalen Bildaufnahmeeinrichtung, wie weiter unten anhand eines konkreten Beispiels näher erläutert ist.
Im Rahmen der Erfindung liegt es vor allem auch, das pulsartige Einschalten der LED-Lichtquellen durch Beaufschlagung mit einem höheren Betriebsstrom vorzunehmen als dem für Dauerbetrieb vorgegebenen Nennbetriebsstrom, um so die optische Ausgangsleistung der LED-Lichtquellen in Abhängigkeit vom Betriebsstrom zu erhöhen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zum Ausüben des vorbeschriebenen Verfahrens, und zwar in Form eines Mikroskops, das zur Aufnahme von Einzelbildern eines Objektes während aufeinander folgender Bildaufnahmezyklen und nachfolgender Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes ausgebildet ist. Dieses Mikroskop umfasst:

– eine Bildaufnahmeeinrichtung mit einem sich in einer Ebene X, Y erstreckenden Objektfeld,
– eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Verschieben des Objektes in Richtung X und/oder Y relativ zu dem Objektfeld, wobei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt ist, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren, die aneinandergrenzen,
– eine Einrichtung zur Beleuchtung des Objektes, die mindestens eine LED-Lichtquelle aufweist,
– eine mit der Bildaufnahmeeinrichtung und der LED-Lichtquelle und verbundene Steuerschaltung, ausgebildet zur Vorgabe der Bildaufnahmezyklen und zum Einschalten einer oder mehrerer LED-Lichtquellen innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus durch Beaufschlagung mit einem bestimmten Betriebsstrom,
– einen Datenspeicher für die während eines jeden Bildaufnahmezyklus aufgenommenen Einzelbilddaten, und
– eine Bildbearbeitungssoftware zum Zusammensetzen der gespeicherten Einzelbilddaten zu dem Gesamtbild des Objektes.

In einer ersten vorteilhaften Ausführungsform ist die Dauer der Bildaufnahmezyklen auf die Ausdehnung des Objektes und auf die Geschwindigkeit der Objektverschiebung so abgestimmt, dass innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus Einzelbilder von Objektbereichen aufgenommen und an den Datenspeicher übertragen werden, die sich überlappen.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die Beleuchtungseinrichtung eine Weißlicht-LED und/oder mehrere LED-Lichtquellen auf, wobei

– die mehreren LED-Lichtquellen bevorzugt Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlen,
– die Ansteuerung der LED-Lichtquellen simultan und/oder sequentiell vorgesehen ist,
– die Einschaltdauer jeder LED-Lichtquelle kleiner ist als 10 μs, bevorzugt kleiner ist als 1 μs, und
– das Objekt während der kürzesten vorgesehenen Einschaltdauer einer einzelnen LED-Lichtquelle um einen Betrag verschoben wird, der kleiner ist als das laterale Auflösungsvermögens der Bildaufnahmeeinrichtung.

Weiterhin vorteilhaft ist die Beaufschlagung der LED-Lichtquellen zum Zweck ihres Einschaltens mit einem höheren Betriebsstrom vorgesehen als dem für Dauerbetrieb vorgegebenen Nennbetriebsstrom, so dass die optische Ausgangsleistung der LED-Lichtquellen erhöht ist.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Mikroskop ausgestattet einer Messeinrichtung zum kontinuierlichen oder periodischen Messen der Objektposition relativ zum Objektfeld, und mit einer mit der Messeinrichtung verbundenen Regeleinrichtung zum Korrigieren der Verschiebegeschwindigkeit des Objektes in Relation zum Objektfeld.
Der zugrunde liegenden Aufgabe entsprechend sind damit ein Verfahren und eine Vorrichtung geschaffen, mit denen die Nachteile des Standes der Technik behoben sind, insbesondere werden die Nachteile einer Mikroskopiebeleuchtung mittels Stroboskop-Elektronenblitz vermieden.
Zusammenfassend betrachtet besteht der Erfindungsgedanke darin, eine oder mehrere Halbleiter-Strahlungsquellen für die Mikroskopie-Weitfeldbeleuchtung zu verwenden, wobei die Strahlungsquellen in Wirkverbindung mit einer zugehörigen Stromversorgung in der Lage sind, Strahlungspulse zu generieren, die kürzer sind als 10 μs, vorzugsweise kürzer als 1 μs. Bei den Halbleiter-Strahlungsquellen handelt es sich vorzugsweise um Hochleistungs-LED's. Wie bereits dargelegt, kann es sich alternativ jedoch auch um Halbleiterlaser handeln. Sofern Halbleiterlaser verwendet werden, sind Maßnahmen vorgesehen, um beispielsweise Speckle-Effekte bei der Weitfeldbeleuchtung zu minimieren, wozu eine rotierende Streuscheibe oder ein periodisch bewegter Flüssigkeitslichtleiter vorgesehen sein kann, der zwischen Halbleiterlaser und Objektiv angeordnet ist.
Soll die Beleuchtung mittels einer einzigen LED erfolgen, kann eine sogenannte Weißlicht-LED verwendet werden. Bei einer ersten Variante einer Weißlicht-LED ist ein lumineszierender Leuchtstoff auf eine blau emittierende LED aufgebracht. Die weiße Lichtfarbe ergibt sich dann aus der Lumineszenzstrahlung in Kombination mit der nicht absorbierten blauen Strahlung. Bei anderen Weißlicht-LED's erfolgt die Anregung der Lumineszenz durch UV-Strahlung. Hier ergibt sich das weiße Licht durch die Emission mehrerer Leuchtstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren. Eine dritte Variante von Weißlicht-LEDs zeichnet sich dadurch aus, dass mehrere LED-Chips unterschiedlicher Emissionswellenlänge, z. B. rot, grün und blau, sehr eng nebeneinander platziert werden. Nach einer optischen Homogenisierung über Mehrfachreflexionen entsteht auch hierbei weißes Licht.
Alternativ kann aber auch das von mehreren LED's mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen abgestrahlte Licht mittels dichroitischer Strahlvereiniger zusammengeführt werden. Diese Variante hat den Vorteil, dass damit das erfindungsgemäße Beleuchtungsverfahren auf einfache Art und Weise auch farbsequenziell durchgeführt werden kann.
Diese letztgenannte Verfahrensweise zur Erzeugung des Beleuchtungslichtes hat den Vorteil, dass die Bilderfassung mit nur einer Kamera, nämlich einer Monochromkamera möglich ist, welche die Daten mehrerer Bilder im μs-Bereich sehr kurz hintereinander aufnimmt und zwischenspeichert, während die Übertragung der Bilddaten zum Datenspeicher bzw. zur Bildverarbeitung komplett zeitlich nachgelagert ist. Während unmittelbar nach dem ersten Beleuchtungs-Puls mit einer ersten Emissionswellenlänge der Ausleseprozess für die Daten eines ersten Bildes startet, kann die Kamera schon zu Beginn dieses Ausleseprozesses wieder mit einem zweiten Beleuchtungs-Puls mit einer zweiten Emissionswellenlänge belichtet werden. So wird mit jedem Bildaufnahmezyklus ein Einzelbild eines mit mehreren, vorzugsweise drei oder mehr, Emissionswellenlängen beleuchteten Teilbereiches des sich kontinuierlich fortbewegenden Objektes gewonnen.
Statt beispielsweise einer verhältnismäßig teuren 3-Chip-Farbkamera lässt sich damit eine kostengünstigere 1-Chip-Monokamera verwenden. Weiterhin besteht dadurch der Vorteil, dass gegenüber einer Farbkamera die volle physikalische, nicht interpolierte Pixelauflösung genutzt und eine deutlich höhere Lichteffizienz insofern erzielt wird, als für jede Einzelfarbe die volle LED-Lichtleistung zur Verfügung steht, da keine spektrale Aufteilung der Weißlicht-LED-Leistung nötig ist. Außerdem können mehr Farbkanäle als bei einer Farbkamera realisiert werden.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur wie angegebenen, sondern auch in anderen Wirkungszusammenhängen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne dass dadurch der Erfindungsgedanke verlassen wird.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:
1 ein Blockdiagramm zur Veranschaulichung der wesentlichen Komponenten des erfindungsgemäßen Mikroskops zur Aufnahme von Einzelbildern eines Objektes während aufeinander folgender Bildaufnahmezyklen und nachfolgender Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes,
2 die schematische Darstellung eines Bildaufnahmezyklus, umfassend eine Zeitspanne T1, innerhalb der das Objekt für eine Pulsdauer P1 mittels einer LED-Lichtquelle beleuchtet wird, eine Zeitspanne T2 für das Auslesen der während der Zeitspanne T1 erfassten Bilddaten und deren Einlesen in einen Datenspeicher, und eine Zeitspanne T3, die als Zeitreserve zum Nachregeln der Geschwindigkeit der Objektverschiebung in Bezug auf die Position eines Objektfeldes genutzt wird,
3 die schematische Darstellung nach 2, bei der jedoch innerhalb der Zeitspanne T1 die Beleuchtung des Objektes mittels einer LED-Lichtquelle für eine von der Pulsdauer P1 abweichende Pulsdauer P2 mit ebenfalls abweichender Pulsenergie vorgesehen ist,
4 die schematische Darstellung nach 2, bei der jedoch innerhalb der Zeitspanne T1 die Beleuchtung des Objektes mittels dreier LED-Lichtquellen vorgesehen ist, die während des Bildaufnahmezyklus sequentiell mit Pulsdauern von P3, P4, P5 eingeschaltet werden und dabei Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlen,
5 die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels, bei dem die Objektbeleuchtung mit drei Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlenden LED-Lichtquellen vorgesehen ist, die in zeitlicher Folge eingeschaltet werden, und zwar jeweils nach einer Verschiebung des Objektes um ein Drittel der Objektfeldgröße.
Anhand des Blockdiagramms in 1 wird nachfolgend die prinzipielle Funktionsweise des mit der Erfindung möglichen automatisierten Mikroskopierverfahrens mittels eines Weitfeldmikroskops erläutert, das einen Mikroskoptisch aufweist, der mit einem motorisiertem Antrieb versehenen und mit einem Koordinatenmesssystem verbundenen ist, und das weiterhin ausgestattet ist mit einer Steuereinheit, einer Pulsstromquelle, mindestens einer LED-Lichtquelle, und mindestens einer Kamera. Eine Probe, beispielsweise ein Gewebeschnitt oder ein Materialstück, dessen Oberfläche untersucht werden soll, sei auf dem Mikroskoptisch abgelegt, der die Probe in zwei orthogonale Richtungen X, Y lateral zur optische Achse Z der Kamera bewegen kann.
Es wird davon ausgegangen, dass die Ausdehnung der Probe in lateraler Richtung größer ist als das erfassbare Objektfeld des Objektivs in Wirkverbindung mit der Kamera. Um die Probe vollständig mikroskopieren zu können, müssen daher zahlreiche Weitfeld-Aufnahmen von Einzelbildern zu einem wesentlich größeren Gesamtbild zusammengesetzt werden. Damit die Zusammensetzung nahtlos erfolgen kann, werden die Einzelbilder üblicherweise mit einer bestimmten Überlappung in Vorschubbewegung der Probe aufgenommen, wobei die korrekte Positionierung der Einzelbilder durch eine Bildanalyse und anschließende Korrelation der Bildinhalte erfolgt.
Um Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen der Einzelbilder zu erzielen, wird die Probe mit möglichst hoher und konstanter Geschwindigkeit unter dem Objektiv hindurch bewegt. Die Probe wird zeilenweise in Richtung X vollständig erfasst, wobei jede Zeile aus mehreren Weitfeld-Aufnahmen nebeneinander liegender Objektbereiche besteht. Nach jeder Zeilenfahrt wird die Position des Mikroskoptisches um etwa eine Objektfeldgröße in Richtung Y verändert. Es kann dann entweder die Vorschubrichtung gewechselt und der Mikroskoptisch entgegengesetzt zur ersten Zeilenfahrt bewegt werden oder mit der zweiten Zeilenfahrt wieder an der gleichen x-Position begonnen werden, an der auch mit der ersten Zeilenfahrt begonnen wurde.
Der Mikroskoptisch ist mit einem Messsystem ausgestattet, mit dem die x-y-Position der Probe zu jedem Zeitpunkt bestimmt wird. Das Messsystem liefert die Positionsinformation regelmäßig an die Steuereinheit, welche einen Bildaufnahmezyklus mit der Zeitspanne T1 zur Belichtung der Mikroskopkamera startet und mit minimaler Verzögerung auch den Strompuls für eine oder mehrere LED-Lichtquellen generiert, wobei die Strompulslängen P1, P2, P3, P4, P5 jeweils für sich als auch in Summe stets kürzer sind als die Belichtungszeit T1, so dass die Strompulse immer vollständig innerhalb der Zeitspanne T1 liegen (vgl. 2 bis 4).
Auf die Belichtungszeit T1 folgt innerhalb des Bildaufnahmezyklus eine Zeitspanne T2, in der das Kamerabild ausgelesen und an einen Datenspeicher übertragen wird. Eine anschließende Zeitspanne T3 ist optional als Pufferzeit vorgesehen, wenn der Mikroskoptisch in Relation zum Ablauf des Bildaufnahmezyklus nicht schnell genug verfahren wird. Die Summe der Zeitspannen T1, T2 und T3 ergibt die Zeitspanne T4 eines Bildaufnahmezyklus, in dem jeweils ein Einzelbild einer periodischen Folge von Einzelbildern gewonnen wird. Dabei wird die Zeitspanne T4 fortlaufend so mit der Tischgeschwindigkeit abgestimmt, dass die Einzelbilder um etwas weniger als eine Objektfeldbreite lateral auseinander liegen. Eine höhere Geschwindigkeit bei der Aufnahme der Einzelbilder kann durch Minimierung bzw. Optimierung der Zeitspanne T3 erzielt werden.
Entscheidend für die erreichbare Bildqualität bei hoher Aufnahmegeschwindigkeit sind hinreichend kurze Pulsdauern P1, P2, P3, P4, P5. Damit keine Verschmierungseffekte in den Bildern auftreten, wird die Probe um weniger als 1/3 des lateralen optischen Auflösungsvermögens der Kamera bewegt. Das Auflösungsvermögen kann dabei durch das Abbe-Kriterium definiert sein. Im Rahmen der Erfindung liegen aber auch Mikroskopverfahren, die das Abbe-Kriterium ggf. unterschreiten, beispielsweise PALM (Photoactivated Localization Microscopy), strukturierte Beleuchtung, SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) und Mikroskope mit rotierenden Nipkow-Scheiben.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für alle Arten der Durchlicht-Mikroskopie und für die Material-Mikroskopie, da in diesen beiden Fällen mit vergleichsweise kurzen Belichtungszeiten gearbeitet werden kann. Vorteilhaft kann die Erfindung vor allem dann eingesetzt werden, wenn das zu erfassende Objekt relativ groß ist, d. h. sehr viele Einzelaufnahmen erfordert, beispielsweise bei Wafern, Solarzellen und OLED's.
Weiterhin liegen aber auch mikroskopartige Vorrichtungen aus dem medizinischen Bereich, insbesondere Operationsmikroskope sowie Funduskameras für die Ophthalmologie, im Rahmen der Erfindung.
2 zeigt die schematische Darstellung eines Bildaufnahmezyklus, umfassend

– die Zeitspanne T1, innerhalb der das Objekt für eine Pulsdauer P1 mittels einer LED-Lichtquelle beleuchtet wird,
– die Zeitspanne T2 für das Auslesen der während der Zeitspanne T1 erfassten Bilddaten und deren Einlesen in einen Datenspeicher, und
– die Zeitspanne T3, die als Zeitreserve zum Nachregeln der Geschwindigkeit der Objektverschiebung in Bezug auf die Position eines Objektfeldes genutzt wird.

3, einer schematischen Darstellung in Anlehnung an 2, bei der jedoch innerhalb der Zeitspanne T1 die Beleuchtung des Objektes mittels einer LED-Lichtquelle für eine Pulsdauer P2 vorgesehen ist, verdeutlicht, dass das Abbe-Kriterium mit Hochleistungs-LED-Lichtquellen besser als mit einem Stroboskop-Elektronenblitz erreicht werden kann. Im Gegensatz zu Elektronenblitzgeräten können Hochleistungs-LED-Lichtquellen nämlich problemlos im sub-μs-Bereich gepulst werden, denn für Pulszeiten unter 10 μs ist eine deutliche Überstromung der LED-Lichtquellen möglich. Der Betriebsstrom für die LED-Lichtquellen kann bei diesen kurzen Pulszeiten um einen Faktor 3 bis 10 höher vorgegeben werden als es bei Dauerbetrieb zulässig ist. Ursache dafür ist, dass die in der LED-Lichtquelle entstehende Verlustwärme während der Zeitspanne T2 abgeführt werden kann und dadurch keine Überhitzung der LED-Lichtquelle auftritt. Eine LED, die beispielsweise im Dauerbetrieb 1A bis 2A verträgt, kann im μs-Bereich mit 3 A bis 10 A betrieben werden, wodurch auch die optische Ausgangsleistung weitgehend proportional zum Pulsstrom steigt.
Die Pulsdauer P2 in 3 ist nur halb so lang wie die Pulsdauer P1 in 2. Dadurch kann die Probe doppelt so schnell verfahren werden, ohne eine Verstärkung der Verschmierungseffekte befürchten zu müssen. Um allerdings die Kamera trotz der halbierten Pulsdauer noch optimal aussteuern zu können, ist eine auf die vorbeschriebene Weise erzielbare Verdopplung der optischen Leistung der LED-Lichtquellen vorgesehen, was durch Abtrag auf der Leistungsskala in 3 im Vergleich zur Leistungsskala in 2 angedeutet ist.
Optional können statt einer Weißlicht-LED mit der Pulsdauer P1 oder P2 auch mehrere simultan mit Pulsdauern P1 oder P2 angesteuerte LED-Lichtquellen verwendet werden, die Licht unterschiedlicher Schwerpunktwellenlängen abstrahlen. Zur Detektion des Abbildungslichtes können optional je nach Ausgestaltung der Erfindung eine Farbkamera oder, in Abhängigkeit von der Anzahl der verschiedenen Schwerpunktwellenlängen, mehrere Monochromkameras genutzt werden. Den Monochromkameras wird dabei eine spektrale Aufteilung der Strahlung mittels dichroitischer Strahlteiler vorgelagert.
Vom Erfindungsgedanken eingeschlossen ist ein optionaler Modus mit einer im ,Overlapping Mode' laufenden Kamera, wobei schon eine neue Belichtung läuft, während noch vorhergehend aufgenommene Bilddaten aus der Kamera ausgelesen werden. Dazu wird die Tischgeschwindigkeit der Kamera-Framerate angepasst um zu garantieren, dass stets nur einander überlappende Bilder aufgenommen werden. Die Puls-Steuerung wird hierbei von der Kamera getriggert, wobei im Triggermoment auch die Tischposition erfasst wird oder die Kamera auch die Korrelation beim Zusammenfügen der Bilder übernehmen kann.
Ein weiteres Ausgestaltungsbeispiel veranschaulicht 4. Während den bisherigen Beispielen der Gedanke einer Objektbeleuchtung mit einer LED-Lichtquelle oder mehreren simultan betriebenen verschiedenfarbigen LED-Lichtquellen und die Bilderfassung mittels Farbkamera oder mittels mehrerer Monochromkameras zugrunde liegt, wird anhand von 4 eine farbsequenzielle Aufnahme beschrieben, bei der die Objektbeleuchtung mit mehreren, hier beispielsweise drei verschiedenfarbigen LED-Lichtquellen sequentiell erfolgt. Die Bilderfassung erfolgt hierbei mit mehreren Monochromkameras, wobei deren Anzahl der Anzahl der verschiedenfarbigen LED's bzw. der Anzahl der Schwerpunktwellenlängen der Objektbeleuchtung entspricht.
Im Beispiel sollen die Schwerpunkwellenlängen der drei LED-Lichtquellen den Farben rot, grün und blau entsprechen. Selbstverständlich liegt es im Rahmen der Erfindung, zwecks besserer Abdeckung des sichtbaren Wellenlängenspektrums auch mehr oder andersfarbige LED-Lichtquellen zu verwenden.
Von diesen drei LED-Lichtquellen wird eine erste, beispielsweise Licht mit der Schwerpunkwellenlängen Rot abstrahlende LED innerhalb einer Zeitspanne T11, in der die Belichtungszeit einer ersten Monochromkamera liegt, mit einer Pulsdauer P3 angesteuert und von dem dabei beleuchteten Objektbereich ein Einzelbild mit einer ersten Monochromkamera erfasst. Eine zweite LED, beispielsweise mit Licht der Schwerpunkwellenlänge Grün, wird innerhalb einer Zeitspanne T12 mit einer Pulsdauer P4 angesteuert, und von dem dabei beleuchteten Objektbereich ein Einzelbild mit einer zweiten Monochromkamera erfasst. Die dritte LED (Schwerpunktwellenlänge Blau) wird mit der Pulsdauer P5 angesteuert, die innerhalb der Zeitspanne T13 liegt, und von dem dabei beleuchteten Objektbereich ein Einzelbild mit einer dritten Monochromkamera erfasst. Anschließend wird ein Farbbild des so in einem Einzelbild erfassten Objektbereichs aus den drei monochromen Aufnahmen erstellt.
Vorteilhaft werden die Zeitspannen T11, T12, T13, die jeweils die Belichtungszeit einer Monochromkamera einschließen, möglichst kurz gestaltet, damit auch die Zeitabstände zwischen den Pulsen P3, P4 und P5 möglichst kurz gehalten werden können und so ein zu großer lateraler Versatz der drei innerhalb der Zeitspanne T1 gewonnenen verschiedenfarbigen Bilder vermieden wird. Der Erfindungsgedanke schließt auch die Option ein, einen solchen Versatz rechnerisch mit Mitteln der Bildverarbeitung zu kompensieren, was unter Berücksichtigung bekannter Zeitabstände zwischen den Pulsen P3, P4, P5 in an sich bekannter Weise möglich ist.
Der Vorteil dieser farbsequenziellen Verfahrensweise gegenüber der simultanen Variante liegt zum einen darin, dass mit Monochromkameras eine höhere Empfindlichkeit, insbesondere ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erzielt wird als einer Farbkamera, zum anderen darin, dass die physikalische Pixelauflösung bei Monochromkameras höher ist als bei Farbkameras. Ursache für letzteres ist die Verwendung von vier physikalischen Pixeln zur Darstellung eines Farbbildpunktes und eine davon ausgehende höhere Pixelauflösung nur durch Interpolation erreichbar ist.
In einem weiteren Verfahrensschritt werden die drei Monochromkameras bevorzugt simultan ausgelesen, so dass ein höherer Datendurchsatz beim Abspeichern der Einzelbilddaten in einem Datenspeicher erzielt wird. Außerdem sind bei der farbsequenziellen Objektbeleuchtung detektionsseitig nicht zwingend dichroitischen Farbfilter oder Farbteiler erforderlich, da die Farbinformationen den einzelnen Kameras zeitlich zugeordnet werden können. Optional kann eine spektrale Aufteilung mittels dichroitischer Teiler jedoch trotzdem vorgesehen werden, um die Detektionsstrahlung effizienter zu ausnutzen.
5 ist ein Ausführungsbeispiel ersichtlich, bei dem die Objektbeleuchtung mit drei Licht unterschiedlicher Schwerpunktwellenlängen abstrahlenden LED-Lichtquellen vorgesehen ist, die in zeitlicher Folge eingeschaltet werden, und zwar jeweils nach einer Verschiebung eines Objektes 1 um ein Drittel der Objektfeldgröße. Die Figur zeigt das Objekt 1, gegeneinander verschobene Objektbereiche 2, 3, 4 und eine Sequenz von Objektbereichsaufnahmen 5, die über dem Objekt 1 dargestellt ist.
Für die optimierte dreikanalige Aufnahme wird das Objekt 1 vollständig mit jeder Schwerpunktwellenlänge an jedem Objektbereich aufgenommen. Wegen der Verschiebung der Einzelaufnahmen gegeneinander ist vorgesehen, dass die ersten beiden Aufnahmen teilweise ein Bild außerhalb des Objektes 1 aufnehmen, daher liegen bei den hier beabsichtigten drei Farbkanälen die ersten beiden Aufnahmen zu 2/3 bzw. 1/3 außerhalb des Objektrandes 6. Das gilt sinngemäß auch für die letzten beiden Aufnahmen jeder Sequenz.
Bei typischen Objektgrößen von beispielsweise etwa 10 mm und einer mit jedem Einzelbild erfassbaren Objektbereichsgröße von beispielsweise 50 um werden so pro Sequenz 600 + 4 Aufnahmen gemacht. Um das ganze Objekt 1 aufzunehmen, wird der Objekttisch nach jeweils einer Sequenz um eine Zeilenbreite versetzt, und die nächste Sequenz wird aufgenommen.
Auf diese Weise wird das Objekt 1 zyklisch mit (hier beispielsweise) drei verschiedenfarbigen LED-Lichtquellen abwechselnd beleuchtet. Dabei wird das Beleuchtungsintervall mit der Tischbewegung derart abgestimmt, dass der gleichmäßig fahrende Objekttisch innerhalb eines Beleuchtungszyklus um ungefähr eine erfassbare Objektbereichsgröße verfahren wird. Die mit einem Einzelbild erfassbare Objektbereichsgröße entspricht dabei dem Objektfeld, das durch die zu dem Mikroskopsystem gehörigen Kamera und dem darauf registrierten Ausschnitt des Objektes 1 bestimmt ist. Wegen des meist rechteckförmigen Kamerachips ist dabei die Objektbereichsgröße in Bewegungsrichtung maßgebend.
Die verschiedenfarbigen LED-Lichtquellen werden dann jeweils nach einer Verschiebung des Objekttisches um etwa 1/3 Objektbereichsgröße gepulst angeschaltet, und es wird mit der Mikroskopkamera ein Bild registriert. Die Pulslänge sollte auch hierbei so klein sein, dass sich das Objekt mit dem Tisch um weniger als ein Pixel der Kamera weiterbewegt. Um ein nachträgliches Aneinanderfügen der Bilder zu ermöglichen, sollte die Verschiebung unterhalb 1/3 Objektfeldgröße liegen.
Durch Wiederholung dieser Schritte entstehen drei Bildfolgen zu den drei verschiedenen Farben der LED-Lichtquellen. Durch Korrelationsanalyse kann jede Bildfolge-Sequenz für sich und auch mit den anderen Bildfolge-Sequenzen zusammengefügt werden zu einem dreifarbigen, zusammenhängenden Gesamtbild.
Die vorbeschriebene Methode ist für Hellfeld- und Fluoreszenzanregung geeignet. Besonderer Vorteil ist, dass durch die zeitlich sequentielle Registrierung der Bilder die Mikroskopkamera keine Farbkamera sein muss. Monochrom ist ausreichend, da die monochrome Beleuchtung das registrierte Farbband vorgibt. Im Fall der Fluoreszenzmikroskopie ist eine leichte Farbbandverschiebung gegenüber der Anregung zu berücksichtigen.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass durch die gleichmäßige Verteilung der Aufnahmezeitpunkte der Einzelbilder zwischen den einzelnen Bildaufnahmen Zeit bleibt, um das Bild von der Kamera in einen externen Speicher zu transferieren, z. B. zu einem Hauptspeicher oder einer Festplatte eines Computers. Dies ist bei den bisher bekannten Mikroskopsystemen häufig der Engpass. Eine Farbkamera müsste dabei mehr Bildpunkte haben, um ein vergleichbares Bild zu erzeugen. Da typische Farbkameras aber nur drei verschiedenfarbige Bias-Filter für jeweils vier Pixel haben, tritt hierbei ein Verlust an Auflösung auf. Eine Monochromkamera kann hingegen alle Farben mit einheitlicher Auflösung aufnehmen. Darüber hinaus erlaubt dieses Verfahren, die Intensität der verschiedenfarbigen LED-Lichtquellen auf die spektrale Empfindlichkeit der Mikroskopkamera abzustimmen, um so ein gut ausgesteuertes Gesamtfarbbild zu erhalten.
Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, zwei Farbkanäle während der Bildaufnahme zusammenzufassen.
In der Mikroskopie zur Bilderfassung verwendete Kameras haben beispielsweise eine Pixelgröße von 6 μm × 6 μm. Bei Verwendung etwa eines 40-fach vergrößernden Objektivs entspricht demzufolge ein Pixel einer Fläche von 6 μm/40 = 0,15 μm im Präparat. Um eine schlierenfreie Abbildung des Objektdetails zu erhalten, darf die Geschwindigkeit der Objektverschiebung maximal so groß sein, dass sich das Objekt innerhalb der Beleuchtungszeit um höchstens ein Pixel, also hier um 0,15 μm, verschiebt.
Bei einer Beleuchtungs- bzw. Pulsdauer von beispielsweise 2 μs ergibt sich somit eine maximale Geschwindigkeit für der Objektverschiebung von 0,15 μm/2 μs = 7,5 cm/s. Von Bedeutung sind solche Geschwindigkeiten insbesondere bei der Aufnahme von großen Objekten, wie Multiwellplatten, da die erforderliche Umkehrbewegung nicht zu häufig erfolgt. Bei einer Anzahl von zum Beispiel 1000 Pixeln in Bewegungsrichtung des Objekttisches hat das Objektfeld eine Größe von 0,15 μm × 1000 = 150 μm. Damit ergibt sich eine Triggerung für die Beleuchtung mit drei Farbkanälen mit jeweils 50 μm und einer Beleuchtungs- bzw. Pulsdauer von beispielsweise 2 μs. Die für die Aufnahme und Abspeicherung des Einzelbildes verfügbare Zeitspanne beträgt in diesem Fall 50 μm/7,5 cm/s = 66 μs. Mit modernen Monochromkameras wird bei einer Auflösung von beispielsweise 1300 × 1000 Pixeln eine Bildrate von 15 Hz erzielt, was etwa der Taktzeit von 66 μs entspricht.
Bezugszeichenliste

1: Objekt
2: Objektbereich
3: Objektbereich
4: Objektbereich
5: Objektbereichsaufnahmen
6: Objektrand
T1 bis T4: Zeitspannen
T11 bis T13: Zeitspannen
P1 bis P5: Pulsdauern

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 1996/008106 A1 [0008]
WO 2006/023675 A2 [0009]
DE 2357813 A [0010]

Claims

Verfahren zur Hochgeschwindigkeitsaufnahme von Einzelbildern lateral nebeneinander liegender Bereiche eines Objektes und der Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes, insbesondere bei der Weitfeldmikroskopie, umfassend folgende Verfahrensschritte: – fortlaufendes Verschieben des Objektes in Richtung X und/oder Y relativ zu einem im wesentlichen in der Ebene X, Y liegenden Objektfeld einer Bildaufnahmeeinrichtung, – Auslösen einer Folge von Bildaufnahmezyklen, wobei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt wird, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren, die aneinandergrenzen, – Beleuchten des Objektes zum Zeck der Bildaufnahme innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus mittels einer oder mehrerer LED-Lichtquellen, wobei die Einschaltzeit der Lichtquellen kleiner ist als 10 μs und die Summe der Einschaltzeiten der LED-Lichtquellen kleiner ist die Dauer des Bildaufnahmezyklus, – Speichern der während eines jeden Bildaufnahmezyklus aufgenommenen Bilddaten, und – Ermittlung des Gesamtbildes des Objektes aus den während aller Bildaufnahmezyklen gespeicherten Bilddaten.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt wird, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren und aufgenommen werden, die aneinander um einen vorgegebenen Betrag überlappen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Einschaltdauer mindestens einer der LED-Lichtquellen kleiner ist als 1 μs.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem – die Beleuchtung des Objektes und die Aufnahme der Bilddaten innerhalb einer Zeitspanne T1, und – die Übertragung der Bilddaten zu einem Datenspeicher innerhalb einer Zeitspanne T2 erfolgt, wobei – die Summe der Zeitspannen T1, T2 gleich oder kleiner ist als die Dauer des Bildaufnahmezyklus.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem – das Objekt mit konstanter Geschwindigkeit verschoben wird, – die Summe der Zeitspannen T1, T2 um eine Zeitspanne T3 kleiner ist als die Dauer des Bildaufnahmezyklus, und – die Zeitspanne T3 als Zeitreserve zum Nachregeln und Konstanthalten der Geschwindigkeit der Objektverschiebung in Bezug auf die Position des Objektfeldes genutzt wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem die Zeitspannen T1 und T2 innerhalb des Bildaufnahmezyklus einander um eine vorgegebene Zeitdauer überlappen.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem mehrere LED-Lichtquellen verwendet werden, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlen und die während jedes Bildaufnahmezyklus simultan oder sequentiell eingeschaltet werden.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem drei Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlende LED-Lichtquellen verwendet und sequentiell jeweils nach einer Verschiebung des Objektes um ein Drittel der Objektfeldgröße eingeschaltet werden.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem das Objekt während der kürzesten vorgesehenen Einschaltdauer einer jeden LED-Lichtquelle um einen Betrag verschoben wird, der kleiner ist als das laterale Auflösungsvermögens der Bildaufnahmeeinrichtung.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem das Einschalten der LED-Lichtquellen durch Beaufschlagung mit einem höheren Betriebsstrom erfolgt als dem für Dauerbetrieb vorgegebenen Nennbetriebsstrom, so dass die optische Ausgangsleistung der LED-Lichtquellen in Abhängigkeit von dem höheren Betriebsstrom erhöht ist.
Mikroskop, ausgebildet zur Aufnahme von Einzelbildern eines Objektes während aufeinander folgender Bildaufnahmezyklen und nachfolgender Zusammensetzung der Einzelbilder zu einem Gesamtbild des Objektes, insbesondere ausgebildet zur Ausübung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 11, umfassend: – eine Bildaufnahmeeinrichtung mit einem sich in einer Ebene X, Y erstreckenden Objektfeld, – eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Verschieben des Objektes in Richtung X und/oder Y relativ zu dem Objektfeld, wobei die Geschwindigkeit der Objektverschiebung auf die Ausdehnung des Objektes so abgestimmt ist, dass in unmittelbar aufeinander folgenden Bildaufnahmezyklen Objektbereiche das Objektfeld passieren, die aneinandergrenzen, – eine Einrichtung zur Beleuchtung des Objektes, die mindestens eine LED-Lichtquelle aufweist, – eine mit der Bildaufnahmeeinrichtung und der LED-Lichtquelle und verbundene Steuerschaltung, ausgebildet zur Vorgabe der Bildaufnahmezyklen und zum Einschalten einer oder mehrerer LED-Lichtquellen innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus durch Beaufschlagung mit einem bestimmten Betriebsstrom, – einen Datenspeicher für die während eines jeden Bildaufnahmezyklus aufgenommenen Einzelbilddaten, und – eine Bildbearbeitungssoftware, ausgebildet zum Zusammensetzen der gespeicherten Einzelbilddaten zu dem Gesamtbild des Objektes.
Mikroskop nach Anspruch 11, wobei die Dauer der Bildaufnahmezyklen auf die Ausdehnung des Objektes und auf die Geschwindigkeit der Objektverschiebung so abgestimmt ist, dass innerhalb eines jeden Bildaufnahmezyklus Einzelbilder von sich überlappenden Objektbereichen aufgenommen und an den Datenspeicher übertragen werden.
Mikroskop nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Beleuchtungseinrichtung eine Weißlicht-LED und/oder mehrere LED-Lichtquellen aufweist, die bevorzugt Licht unterschiedlicher Wellenlängen abstrahlen, wobei – die Ansteuerung mehrerer LED-Lichtquellen simultan und/oder sequentiell vorgesehen ist, – die Einschaltdauer jeder LED-Lichtquelle kleiner ist als 10 μs, bevorzugt kleiner ist als 1 μs, und – das Objekt während der kürzesten vorgesehenen Einschaltdauer einer der LED-Lichtquellen um einen Betrag verschoben wird, der kleiner ist als das laterale Auflösungsvermögens der Bildaufnahmeeinrichtung.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem die Beaufschlagung der LED-Lichtquellen zum Zweck des Einschaltens mit einem höheren Betriebsstrom vorgesehen ist als dem für Dauerbetrieb vorgegebenen Nennbetriebsstrom, so dass die optische Ausgangsleistung der LED-Lichtquellen erhöht ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 14, ausgestattet mit – einer Messeinrichtung zum kontinuierlichen oder periodischen Messen der Objektposition relativ zum Objektfeld, und – einer mit der Messeinrichtung verbundenen Regeleinrichtung zum Korrigieren der Verschiebegeschwindigkeit des Objektes in Relation zum Objektfeld.