DE102011055945A1

DE102011055945A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe

Info

Publication number: DE102011055945A1
Application number: DE102011055945A
Authority: DE
Inventors: Bernd Widzgowski
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2013-06-06
Also published as: JP2013117529A; US9476766B2; US20130140437A1; DE102011055945A9; JP6286120B2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe. Die Vorrichtung weist eine Lichtquelle zum Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet, zum Beleuchten eines Probenbereichs mit dem Anregungslichtpuls und einen Detektor zum Detektieren des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichts auf. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen erzeugt, und dass ein Analog-Digital-Wandler vorgesehen ist, der eine digitale Datenfolge durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit einer Abtastrate erzeugt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe, sowie eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe mit einer Lichtquelle zum Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet, zum Beleuchten eines Probenbereichs mit dem Anregungslichtpuls und mit einem Detektor zum Detektieren des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichts.
Zum Untersuchen der Eigenschaften oder des dynamischen Verhaltens von biologischen Proben werden diese bei vielen Anwendungen mit Beleuchtungslicht beaufschlagt, um anschließend das von der Probe ausgehende Detektionslicht auszuwerten. Oft werden beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe mit Anregungslicht optisch angeregt, um anschließend Eigenschaften des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichts zu untersuchen. Bei einigen Untersuchungsmethoden wird die Probe nicht mit einem kontinuierlichen Lichtstrahl beleuchtet, sondern mit gepulstem Licht. Diese beispielsweise um die Lebensdauer eines Anregungszustandes zu messen. Es ist nämlich beispielsweise möglich, Fluoreszenzfarbstoffe mit kurzen Lichtpulsen anzuregen, um elektronisch den zeitlichen Versatz der Emissionslichtpulse zu messen. Beispielsweise ist aus DE 10 2004 017 956 A1 ein Mikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe mit mindestens einer Lichtquelle, die Anregungslicht erzeugt, und mit mindestens einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt, bekannt. Das Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle einen Halbleiterlaser beinhaltet, der gepulstes Anregungslicht emittiert, wobei eine Einstellvorrichtung zur Einstellung der Pulsrepetitionsrate auf die spezifischen Lebensdauereigenschaften der Probe vorgesehen ist.
Durch Untersuchen der Lebensdauer der angeregten Zustände einer mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markierten Probe können wichtige Erkenntnisse über die Eigenschaften der Probe gewonnen werden. Insbesondere bei der Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe können mithilfe der Fluorecence Liftime Imaging Microscopy (FLIM) beispielsweise Erkenntnisse über einen untersuchten Probenbereich, wie die Zusammensetzung oder dessen Umgebung, gewonnen werden. So kann beispielsweise in der Zellbiologie durch Messung der Lebensdauer der Fluoreszenzfarbstoffe indirekt auf die Kalziumkonzentration in einem Probenbereich geschlossen werden.
Bei vielen Anwendungen ist es nötig, einzelne Photonen zu detektieren und hierbei je nach Einzelfall die Anzahl der detektieren Photonen oder einen Zeitabstand zwischen einem Anregungslichtpuls und einem der Detektions-Photon zu bestimmen.
Detektoren, die zum Zählen von Fotonen verwendet werden, geben für jedes detektierte Photon einen elektrischen Impuls ab. Die zur Auswertung dieser elektrischen Impulse erforderliche Elektronik wird – oft in Form von PC-Einsteckkarten, die beispielsweise als Zeitmesskarte ausgebildet sein kann – kommerziell angeboten. Eine solche Zeitmesskarte hat jedoch – abgesehen von dem hohen Preis – den Nachteil einer sehr langen Totzeit, so dass sie nach dem Anregen der Probe nur das Eintreffen des ersten Detektionslichtpulses (erstes Detektionsphoton) erfassen kann und danach für einen erheblichen Zeitraum „blind“ ist. Letztlich bleibt ein wesentlicher Teil der Informationen, die das von der Probe ausgehende Detektionslicht beinhaltet, dem Anwender verborgen. Um dennoch messen zu können bleibt dem Anwender nichts weiter übrig, als die Anregung Lichtleistung so weit zu verringern, dass die Wahrscheinlichkeit von kurz hintereinander eintreffenden Photonen gering ist. Allerdings muss dann sehr lange gemessen werden, um ein brauchbares Ergebnis zu erzielen.
Selbst wenn der Detektor zum Erfassen kurz hintereinander eintreffender Photonen grundsätzlich geeignet ist, so ähnelt die Kurvenform des von ihm erzeugten elektrischen Signals einer Überlagerung der Einzelimpulse, was die bislang bekannten elektronischen Vorrichtungen zur Auswertung zumeist überfordert.
Darüber hinaus ist eine hohe Repetitionsrate von Anregungslichtpulsen und damit ein häufiges Messen innerhalb eines Messzeitraumes nicht möglich. Tatsächlich liegt die erzielbare Messrate weit unter den üblichen Repetitionsraten von kommerziell erwerbbaren Pulslasern. Aus diesem Grund dauert es üblicherweise sehr lange, bis ausreichend viele Daten aufgenommen worden sind, um beispielsweise eine FLIM-Abbildung zu erzeugen.
Außerdem sind für unterschiedliche Anwendungen, wie beispielsweise Photon-Counting oder FLIM-Anwendungen unterschiedliche Auswärtselektroniken notwendig.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, das es erlaubt, genauere Messergebnisse in kürzerer Zeit zu erzielen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a. Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet,
b. Beleuchten eines Probenbereichs mit dem Anregungslicht,
c. Detektieren des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichts mit einem Detektor, der für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen erzeugt, und
d. Erzeugen einer digitalen Datenfolge, durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit einem Analog-Digital-Wandler mit einer Abtastrate.

Es ist die weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, die es erlaubt, genauere Messergebnisse in kürzerer Zeit zu erzielen.
Die weitere Aufgabe wird durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Detektor für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen erzeugt, und dass ein Analog-Digital-Wandler vorgesehen ist, der eine digitale Datenfolge durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit einer Abtastrate erzeugt
Erfindungsgemäß wurde unter anderem erkannt, dass über den Zeitpunkt des Eintreffens eines ersten Photons hinausgehende Informationen nur dann erhältlich sind, wenn die die Signale verarbeitende Steuerungsvorrichtung in der Lage ist, auch die Photonenereignisse zu erfassen, die zeitlich nach dem Eintreffen des ersten Photons auftreten, jedoch demselben Anregungslichtpuls zuzuordnen sind. Weiter wurde erkannt, dass dies dadurch erreicht werden kann, dass die analogen Messsignale sofort in digitale Zahlenfolgen übersetzt werden.
Die Erfindung ermöglicht in vorteilhafter Weise insbesondere zyklisch sich wiederholende Messungen mit einer Repetitionsfrequenz von 80 MHz und mehr, wie sie handelsübliche Pulslaser aufweisen. Darüber hinaus können genauere Informationen beispielsweise über das Lebensdauerverhalten der Probe gewonnen werden, weil – insbesondere aufgrund der Schnelligkeit der Informationsverarbeitung – nicht lediglich jeweils nur der Zeitpunkt des Eintreffens des jeweils ersten Photons ermittelt wird, sondern – geeignete Anregungslichtleistung vorausgesetzt – nahezu auch jedes Photonenereignis. Dies selbst dann, wenn die Photonen in kurzem zeitlichen Abstand am Detektor eintreffen.
Um eine befriedigende Genauigkeit und eine befriedigende zeitliche Auflösung zu erzielen ist bei einer besonderen Ausführung vorgesehen, dass die Abtastrate – vorzugsweise sehr deutlich – höher ist, als die Anregungspulsfrequenz. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Abtastrate mehr als 50 mal höher ist, als die Anregungspulsfrequenz. Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass die Abtastrate größer als 1 Gigasample pro Sekunde ist, insbesondere größer als 3 Gigasample pro Sekunde, insbesondere größer als 5 Gigasample pro Sekunde ist.
Bei einer praxisrelevanten Ausführung beträgt die Abtastrate ca. 5 Gigasample pro Sekunde. Das Abtasten kann vorteilhaft beispielsweise mit einer Auflösung von 8 Bit oder mit einer Auflösung von 10 Bit erfolgen. Natürlich sind auch noch höhere Abtastrate und/oder Abtast-Auflösungen möglich. Die hierfür erforderlichen Analog Digital-Wandler weisen jedoch einen sehr hohen Energieverbrauch und zumeist einen hohen Preis auf.
Bei einer besonderen Ausführung ist vorgesehen, dass die Anregungspulsfrequenz größer als 50 MHz ist, insbesondere ca. 80 MHz beträgt und/oder dass die Dauer eines Anregungslichtpulses kürzer als 10 ps, insbesondere kürzer als 1 ps, insbesondere kürzer als 100 fs ist. Mit dieser Ausführung erlaubt die vollständige Ausnutzung jedes Lichtimpulses bei der Anregungspulsfrequenz üblicher kommerziell erhältliche Laser.
Es hat sich gezeigt, dass für die meisten Anwendungen die Verwendung einer Pulslichtquelle mit einer Anregungspulsfrequenz von ca. 80 MHz, sowie die Verwendung eines Analog-Digital-Wanders mit einer Abtastrate von 5 Gigasample pro Sekunde bei einer Auflösung von 8 Bit zu sehr befriedigenden Messresultaten führt.
Bei einer besonderen Ausführung des Verfahrens ist vorgesehen, dass das Anregungslicht aus Primärlicht (beispielsweise eines Pulslasers) abgespalten wird und dass ein vom Anregungslicht verschiedener Teil des Primärlichtes mit einem Anregungsdetektor detektiert wird, der für jeden detektierten Puls einen weiteren elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von weiteren elektrischen Impulsen erzeugt. Die von dem Anregungsdetektor erzeugten weiteren elektrischen Impulse können insbesondere als Lichtleistungs- oder Zeitreferenz für die weitere Messung herangezogen werden.
Hierzu kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse – insbesondere mit umgekehrtem Vorzeichen – überlagert werden und das Überlagerungssignal zur Erzeugung der digitalen Datenfolge mit dem Analog-Digital-Wandler abgetastet wird. Zum Überlagern kann beispielsweise eine Überlagerungsvorrichtung, insbesondere ein Power-Combiner verwendet werden. Grundsätzlich ist es jedoch auch möglich, die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse zur Erzeugung der digitalen Datenfolge auf andere Weise mit demselben Analog-Digital-Wandler abzutasten. Grundsätzlich geht bei der Verwendung eines einzigen Analog-Digital-Wandlers zwar in der Regel etwas an Auflösung hinsichtlich der Amplitude verloren, allerdings wird ein zeitlicher Jitter vermieden, der bei der grundsätzlich möglichen Verwendung von zwei unterschiedlichen Analog-Digital-Wandern für die elektrischen Impulse einerseits und die weiteren elektrischen Impulse andererseits, auftreten kann.
Allerdings ist es dennoch bei einigen Anwendungen, bei denen es insbesondere um eine gute Auflösung hinsichtlich der Signalhöhe geht, von Vorteil, wenn die weitere digitale Datenfolge, durch Abtasten der weiteren Folge von weiteren elektrischen Impulsen nicht mit dem Analog-Digital-Wandler, der die auf das Detektionslicht zurückgehende Folge von elektrischen Impulsen abtastet, sondern mit einem weiteren Analog-Digital-Wandler mit einer weiteren Abtastrate erzeugt wird. Die weitere Abtastrate kann genauso groß sein wie die Abtastrate. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass sich die Abtastrate in der unterschiedlichen Analog-Digital-Wandler voneinander unterscheiden. Insbesondere kann für den weiteren Analog-Digital-Wandler eine kostengünstigere Variante eingesetzt werden, weil in der Regel die abzutastende weitere Folge voneinander deutlich voneinander beanstandete elektrische Impulse beinhaltet.
Vorzugsweise erfolgt die Verarbeitung der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitalen Datenfolge mit einer Auswertelektronik. Bei einer ganz besonders zuverlässig und schnell arbeitenden Ausführung, erfolgt die Verarbeitung der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge mit einer Auswertelektronik, die wenigstens teilweise auf der Basis eines programmierbaren integrierten Schaltkreises, insbesondere eines Field Programmable Gate Array (kurz: FPGA), aufgebaut ist.
Insbesondere um eine parallele Verarbeitung der Daten zu ermöglichen, ist bei einer vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt werden.
In besonders vorteilhafter Weise kann die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge beispielsweise in Datenpakete zerteilt werden, die jeweils einen Messzeitraum repräsentieren, der mindestens so lang ist, insbesondere genauso lang ist, wie der zeitliche Abstand aufeinanderfolgender Anregungslichtpulse. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass jedem Anregungslichtpuls auf einfache Weise genau die Messdaten zugeordnet werden können, die auf das durch seine optische Anregung verursachte Detektionslicht zurückgehen.
Aufgrund der großen anfallenden Datenmenge kann eine Auswertung der Daten, oft nur mit großem Aufwand in Echtzeit erfolgen. Eine zur Datenaufnahme zeitlich asynchrone Auswertung ist grundsätzlich möglich. Insbesondere hierzu bietet es sich in vorteilhafter Weise an, die Daten parallel auszuwerten und den Datenpaketen, in die die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge zerteilt wird, zusätzliche weitere Daten beispielsweise hinsichtlich des jeweiligen Probenortes, insbesondere Pixel, oder ein zusätzlicher Zeitstempel zuzuordnen und/oder hinzuzufügen.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass den Datenpaketen weitere Daten bezüglich der Position des jeweils untersuchten Probenortes und/oder bezüglich des zugehörigen Bildpunktes und/oder ein Zeitstempel und/oder eine fortlaufende Nummer und/oder jeweils unterschiedliche Nummern hinzugefügt werden. Insbesondere um eine Auswertung einfacher und zuverlässiger zu machen, kann jedem Datenpaket noch das Ende eines vorhergehenden Datenpaketes und/oder der Anfang des nachfolgenden Datenpaketes angehängt werden.
Eine zeitlich asynchrone Auswertung kann insbesondere in parallelen Strukturen, insbesondere in Auswerteelektroniken erfolgen, die beispielsweise auf der Basis von programmierbaren integrierten Schaltkreisen, insbesondere Field Programmable Gate Arrays (kurz: FPGA), aufgebaut sind, in FPGA-Netzen aber auch in angeschlossenen PC-Systemen, Clustern von Auswerteprozessoren erfolgen. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Auswertung in den Recheneinheiten von Grafikkarten stattfindet. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge und oder die Datenpakete vor der Auswertung zwischengespeichert werden.
Beispielsweise zum Erzeugen einer FLIM-Abbildung kann vorgesehen sein, dass aus jedem Datenpaket die Anzahl der Anregungslichtpulse und/oder die Anzahl der detektierten Photonen ermittelt werden und/oder dass die Anzahl der Anregungslichtpulse pro Zeiteinheit und/oder die Anzahl der detektierten Photonen pro Zeiteinheit aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt wird.
Bei einer besonderen Ausführung werden die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus den Datenpaketen ermittelt. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt werden. Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Bereich der FLIM-Technologie ist es von Vorteil, wenn jedem Detektionslicht Puls einen möglichst genaue Redaktion Zeitpunkt zugeordnet wird. Zu diesem Zweck wird bei einer vorteilhaften Ausführung der Zeitpunkt des Schwerpunktes der aufgenommenen Messkurve oder ein Extremrum der Messkurve ermittelt und zur weiteren Auswertung herangezogen. Hierbei kann beispielsweise eine Approximation an ein Polynom höherer Ordnung oder eine Spline-Interpolation erfolgen. Auch die Verwendung von neuronalen Netzen oder eine ähnlich geeignete Klassifikation kommt zur Auswertung infrage.
Bei einer besonders exakten Ausführung werden die elektrischen Signale und/oder die Datenfolge und/oder die weitere Datenfolge und/oder die Datenpakete, insbesondere zur Kompensation der Frequenzabhängigkeiten von Detektor und/oder der Analogelektronik des Impulsverstärkers, gefiltert. Insbesondere kann eine digitale Filterung der Datenfolge und/oder der weiteren Datenfolge und/oder der Datenpakete erfolgen. Auf diese Weise kann kompensiert werden, dass Impulsverstärker oft wechselspannungsgekoppelt eingesetzt werden, so dass auf das Ausgangssignal eine langsame Ausgleichsdrift auf geprägt wird, wenn ein schneller Impuls auftritt.
Besonders flexibel ist eine Ausführungsform, bei der wenigstens ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter verwendet wird. Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass wenigstens ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter verwendet wird, der Alterungseffekte und/oder thermische Effekte des Detektors und/oder der analogen Elektronik kompensiert.
Ebenfalls insbesondere im Hinblick auf einer FLIM-Auswertung kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass jeweils eine Zweitdifferenz zwischen dem Eintreffen eines Anregungslichtpulses an dem Probenbereich und dem Ausgehen eines Detektionsphotons von dem beleuchteten Probenbereich ermittelt wird. Insbesondere zur Erzielung einer besonderen Genauigkeit kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass eine Häufigkeitsverteilung mehrerer errechneter zeitlicher Differenzen berechnet wird.
Besonders vorteilhaft ist eine Vorrichtung, die gezielt zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet ist.
Ein vorteilhaftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes auf unterschiedliche Probenorte und/oder zum Abrastern einer Probe auf. Insbesondere kann eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes auf unterschiedliche Probenorte und/oder zum Abrastern einer Probe vorgesehen sein, wobei eine Steuerungsvorrichtung Daten und/oder Signale bereitstellt, die Ortsinformationen bezüglich der jeweiligen Stellung der Scaneinrichtung beinhalten. Diese Daten können einerseits dazu dienen, einen Anregungslichtstrahl relativ zur Probe zu positionieren und andererseits dazu, an die erzeugten Datenfolgen und/oder Datenpakete, insbesondere zu deren späterer Identifikation und/oder Auswertung, ob angefügt zu werden.
Bei einer vorteilhaften Ausführung ist die erfindungsgemäße Vorrichtung Teil eines Scanmikroskops, insbesondere eines konfokalen Scanmikroskops. Von besonderem Vorteil ist auch ein Scanmikroskop mit einer – gegebenenfalls auch nachgerüsteten oder nachträglich hinzugefügten – erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Weitere Ziele, Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles anhand der Zeichnung. Dabei bilden alle beschriebenen und/oder bildlich dargestellten Merkmale für sich oder in beliebiger sinnvoller Kombination den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, auch unabhängig von ihrer Zusammenfassung in den Ansprüchen oder deren Rückbeziehung.
Es zeigen:
1 ein Ausführungsbeispiel eines Scanmikroskops, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung aufweist,
2 eine Darstellung des zeitlichen Leistungsverlaufs des Anregungslichts und des Detektionslichts bei sehr niedriger Anregungslichtleistung und bei hoher Anregungslichtleistung,
3 eine Darstellung des zeitlichen Leistungsverlaufs des Anregungslichts und des Detektionslichts bei schnell aufeinander folgenden Photonenereignissen,
4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispieles und
5 eine schematische Darstellung eines anderen Ausführungsbeispieles.
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Scanmikroskops 1, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung aufweist. Das Scanmikroskop 1 ist als konfokales Scanmikroskop ausgeführt.
Das Scanmikroskop 1 weist eine Lichtquelle 2 auf, die als Pulslaser 3 zum Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet. Konkret erzeugt der Pulslaser 3 einen Primärlichtstrahl 4 der auf einen ersten Strahlteiler 5 trifft. Dort wird der Primärlichtstrahl 4 in einen Messstrahl 6 und einen Anregungslichtstrahl 8 aufgespalten.
Der Anregungslichtstrahl 8 passiert ein Beleuchtungspinhole 10 und gelangt dann zu dem Hauptstrahlteiler 11. Dieser lenkt den Anregungslichtstrahl 8 zu einer Scanvorrichtung 12, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13 beinhaltet. Anschließend gelangt der Anregungslichtstrahl 8 durch die Scanoptik 14 und die Tubusoptik 15 und durch das Mikroskopobjektiv 16 zu der Probe 17. Dort wird ein Probenbereich mit dem Anregungslicht beaufschlagt und so die dort vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffe optisch angeregt.
Das von der Probe 17 ausgehende Detektionslicht 18 gelangt auf dem Lichtweg, auf dem der Anregungslichtstrahl 8 von dem Hauptstrahlteiler 11 zu der Probe 17 gelangt ist, in umgekehrter Richtung folgend zum Hauptstrahlteiler 11, passiert diesen und das nachfolgende Detektionspinhole 19 und gelangt schließlich zu einem Detektor 20, der für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes 18 einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen. Diese werden an eine Auswertungs- und Steuerungsvorrichtung 9 übergeben, die eine elektronische Auswerteschaltung mit einem in diese Figur nicht dargestellten Analog-Digital-Wandler beinhaltet und die eine digitale Datenfolge durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit dem Analog-Digital-Wandler erzeugt, wobei die Abtastrate höher ist, als die Anregungspulsfrequenz.
Der Messstrahl 6 wird auf einen Anregungsdetektor 7 gelenkt. Der Anregungsdetektor 7 detektiert den vom Anregungslichtstrahl 8 verschiedenen Teil des Primärlichtstrahles 4 und erzeugt für jeden detektierten Puls des verschiedenen Teils des Primärlichtes 4 einen weiteren elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von weiteren elektrischen Impulsen. Diese werden ebenfalls an die Auswertungs- und Steuerungsvorrichtung 9 übergeben, die eine aus den weiteren elektrischen Impulsen weitere digitale Datenfolge durch Abtasten mit einem weiteren Analog-Digital-Wandler mit einer Abtastrate, die höher ist, als die Anregungspulsfrequenz, erzeugt.
Die Scaneinrichtung 12 übergibt der Auswertungs- und Steuerungsvorrichtung 9 in Form von Daten Informationen bezüglich der jeweiligen Stellung des Scanspiegels 13, die die Steuerungsvorrichtung 9 jeweils den aus dem ersten analogen Signal und dem zweiten analogen Signal gewonnenen Daten derart zuordnet, dass zurückgeschlossen werden kann, zu welchem Probenort die jeweiligen Datenfolgen und/oder Datenpakte gehören.
2 zeigt in der oberen Bildhälfte eine Darstellung einer Folge von weiteren elektrischen Impulsen 24, deren Lichtleistung zur Lichtleistung des Anregungslichts 8 proportional ist, und eine Folge von elektrischen Impulsen 23, die jeweils durch ein detektiertes Photon erzeugt sind, bei sehr niedriger Anregungslichtleistung. Es ist zu erkennen, dass lediglich wenige elektrischen Impulse 23 – also wenige Photonenereignisse – zu erfassen sind und detektiert werden, weil die Emissionswahrscheinlichkeit aufgrund der geringen Leistung des Anregungslichts gering ist. Eine solche Messsituation können auch die aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen in der Regel bewältigen. Dies trifft jedoch nicht ohne weiteres auf die in der unteren Bildhälfte dargestellte Situation (hohe Anregungslichtleistung) zu.
Bei einer hohen Anregungslichtleistung ist die Emissionswahrscheinlichkeit so groß, dass ein Anregungslichtpuls 24 auch mehrere Detektionslicht-Photonen und damit mehrere elektrische Impulse 23 auslösen kann. In der unteren Bildhälfte ist der Verlauf der Messkurven dargestellt, wenn die aufeinanderfolgenden, elektrischen Impulse 23 einen zeitlichen Abstand voneinander aufweisen, der größer ist, als deren Pulsdauer.
Es kann jedoch auch vorkommen, dass zwei zeitlich eng benachbarte Detektionslichtpulse detektiert werden. Die Kurvenform der Messkurven ergibt sich dann im Wesentlichen aus der Superposition der Einzelsignale. Dies ist in 3 dargestellt. Die Erfindung hat den Vorteil, dass auch solche Ereignisse erfasst und ausgewertet werden können.
Die Auswertung- und Steuerungsvorrichtung 9 erfasst die Zeitpunkte 27 der weiteren elektrischen Impulse 24, die im Wesentlichen synchron zu den Anregungslichtpulsen generiert sind, und die Zeitpunkte 29 der der elektrischen Impulse 23, die auf die der detektierten Photonen zurückzuführen sind. Dies kann beispielsweise durch Ermittlung der Schwerpunkte der aufgenommenen Kurvenform oder durch Approximation eines Polynoms höherer Ordnung erfolgen.
4 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispieles, in der die einzelnen Komponenten übersichtlich als Kästchen dargestellt sind. Eine Probe 17 wird mit Anregungslicht 8, das mit einer Anregungspulsfrequenz vom 80 MHz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet, einer Lichtquelle 2 beleuchtet, die als Pulslaser 3 ausgebildet ist. Das von der Probe 17 ausgehende Detektionslicht 18 wird mit einem Detektor 20 detektiert. Der Detektor 20 erzeugt für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes 18 einen elektrischen Impuls 23 und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen 23. Die Folge von elektrischen Impulsen 23 wird an einen ersten Verstärker 21 übergeben, verstärkt und anschließend an einen ersten Analog-Digital-Wandler 31 geleitet, der eine digitale Datenfolge durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen 23 mit einer Abtastrate erzeugt, die 5 Gigasample pro Sekunde beträgt.
Das Anregungslicht 8 ist aus Primärlicht abgespalten. Ein vom Anregungslicht 8 verschiedener Teil 22 des Primärlichtes mit einem Anregungsdetektor detektiert wird, der für jeden detektierten Puls des verschiedenen Teils des Primärlichtes einen weiteren elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von weiteren elektrischen Impulsen 24 erzeugt. Die Folge von elektrischen Impulsen 24 wird an einen weiteren Verstärker 30 übergeben, verstärkt und anschließend an einen weiteren Analog-Digital-Wandler 32 geleitet, der eine weitere digitale Datenfolge durch Abtasten der weiteren Folge von elektrischen Impulsen 24 mit einer Abtastrate erzeugt, die 5 Gigasample pro Sekunde beträgt.
Die erste digitale Datenfolge und die weitere Digitale Datenfolge werden anschließend einer Zuordnungseinheit 33 übergeben, die die digitale Datenfolge und die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt, die jeweils einen Messzeitraum repräsentieren, der genauso lang ist, wie der zeitliche Abstand aufeinanderfolgender Anregungslichtpulse. Dies hat den besonderen Vorteil, dass jedem Anregungslichtpuls auf einfache Weise genau die Messdaten zugeordnet werden, die auf das durch seine optische Anregung verursachte Detektionslicht zurückgehen. Außerdem werden in der Zuordnungseinheit 33 den einzelnen Datenpaketen weitere Daten, die von einer Steuerungseinheit 34 zur Verfügung gestellt werden, bezüglich der Position des jeweils untersuchten Probenortes, ein Zeitstempel, sowie eine fortlaufende Nummer hinzugefügt. Insbesondere kann zusätzlich das Ende eines vorhergehenden Datenpaketes und/oder der Anfang des folgenden Datenpaketes hinzugefügt werden. Dies hat den besonderen Vorteil, dass dadurch die zeitliche Reihenfolge der Datenpakete jederzeit nachvollzogen werden kann.
Anschließend werden in einer Analyseeinheit 35 die Anzahl der jeweiligen Pulse und deren Zeitpunkte 27, 29 sowie deren zeitliche Abstände ermittelt. Schließlich erfolgte das Ablegen der Auswertungsergebnisse, wie beispielsweise der jeweiligen Anzahl der Pulse pro Datenpaket, deren Häufigkeitsverteilungen und die Pulszahlen, in einer Speichereinheit 25.
5 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispieles, in der die einzelnen Komponenten ebenfalls übersichtlich als Kästchen dargestellt sind. Diese Ausführung unterscheidet sich von der in 4 dargestellten Ausführung dadurch, dass die Folge von elektrischen Impulsen 24 und die weitere Folge von elektrischen Impulsen 23 nicht jeweils mit einem eigenen Analog-Digital-Wandler abgetastet wird, sondern zunächst – der besseren Zuordenbarkeit wegen mit umgekehrtem Vorzeichen – mittels einer Überlagerungsvorrichtung 28 miteinander überlagert werden und anschließend das Überlagerungssignal zur Erzeugung einer digitalen Datenfolge einem Analog-Digital-Wandler 38 zugeleitet wird. Die Überlagerungsvorrichtung 28 ist als Power-Combiner ausgebildet. In der Regel geht hierbei im Vergleich zu der in 4 gezeigten Vorrichtung zwar etwas an Auflösung hinsichtlich der Amplitude verloren, allerdings wird ein zeitlicher Jitter vermieden, der bei der grundsätzlich möglichen Verwendung von zwei unterschiedlichen Analog-Digital-Wandern für die elektrischen Impulse einerseits und die weiteren elektrischen Impulse andererseits, auftreten kann.
Die digitale Datenfolge wird – analog wie bei der in 4 gezeigten Vorrichtung – anschließend einer Zuordnungseinheit 33 übergeben, die die digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt, die jeweils einen Messzeitraum repräsentieren, der genauso lang ist, wie der zeitliche Abstand aufeinanderfolgender Anregungslichtpulse. Dort werden den einzelnen Datenpaketen weitere Daten, die von einer Steuerungseinheit 34 zur Verfügung gestellt werden, bezüglich der Position des jeweils untersuchten Probenortes, ein Zeitstempel, sowie eine fortlaufende Nummer hinzugefügt. Anschließend wird in einer Analyseeinheit 35 die Anzahl der jeweiligen Pulse und deren Zeitpunkte 27, 29 sowie deren zeitliche Abstände ermittelt. Schließlich erfolgte das Ablegen der Auswertungsergebnisse, wie beispielsweise der jeweiligen Anzahl der Pulse pro Datenpaket, deren Häufigkeitsverteilungen und die Pulszahlen, in einer Speichereinheit 25.
Bezugszeichenliste

1: Scanmikroskop
2: Lichtquelle
3: Pulslaser
4: Primärlichtstrahl
5: erster Strahlteiler
6: Messstrahl
7: Anregungsdetektor
8: Anregungslichtstrahl
9: Auswertungs- und Steuerungsvorrichtung
10: Beleuchtungspinhole
11: Hauptstrahlteiler
12: Scanvorrichtung
13: Scanspiegel
14: Scanoptik
15: Tubusoptik
16: Mikroskopobjektiv
17: Probe
18: Detektionslicht
19: Detektionspinhole
20: Detektor
21: erster Verstärker
22: verschiedener Teil des Primärlichtstrahls 4
23: elektrische Impulse
24: weitere elektrische Impulse
25: Speichereinheit
26: Analog-Digital-Wandler
27: Zeitpunkte der weiteren elektrischen Impulse 24
28: Überlagerungsvorrichtung
29: Zeitpunkte 29 der der elektrischen Impulse 23
30: weiterer Verstärker
31: erster Analog-Digital-Wandler
32: weiterer Analog-Digital-Wandler
33: Zuordnungseinheit
34: Steuerungseinheit
35: Analyseeinheit

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102004017956 A1 [0003]

Claims

Verfahren zum Untersuchen einer Probe gekennzeichnet durch folgende Schritte: a. Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet, b. Beleuchten eines Probenbereichs mit dem Anregungslicht, c. Detektieren des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichts mit einem Detektor, der für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen erzeugt, und d. Erzeugen einer digitalen Datenfolge, durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit einem Analog-Digital-Wandler mit einer Abtastrate.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Abtastrate höher ist, als die Anregungspulsfrequenz und/oder dass b. die Abtastrate mehr als 50 mal höher ist, als die Anregungspulsfrequenz und/oder dass c. die Abtastrate größer als 1 Gigasample pro Sekunde ist, insbesondere größer als 3 Gigasample pro Sekunde ist, insbesondere ca. 5 Gigasample pro Sekunde beträgt, insbesondere größer als 5 Gigasample pro Sekunde ist. d. Das Abtasten mit einer Auflösung von 8 Bit erfolgt oder dass das Abtasten mit einer Auflösung von 10 Bit erfolgt. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungspulsfrequenz größer als 50 MHz ist, insbesondere ca. 80 MHz beträgt und/oder dass die Dauer eines Anregungslichtpulses kürzer als 10 ps (Picosekunden), insbesondere kürzer als 1 ps, insbesondere kürzer als 100 fs (Femtosekunden) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht aus Primärlicht abgespalten wird und dass ein vom Anregungslicht verschiedener Teil des Primärlichtes mit einem Anregungsdetektor detektiert wird, der für jeden detektierten Puls des verschiedenen Teils des Primärlichtes einen weiteren elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von weiteren elektrischen Impulsen erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass a. die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse – insbesondere mit umgekehrtem Vorzeichen – überlagert werden und das Überlagerungssignal zur Erzeugung der digitalen Datenfolge mit dem Analog-Digital-Wandler abgetastet wird und/oder dass b. die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse – insbesondere mit umgekehrtem Vorzeichen – mit Hilfe eines Power-Combiners überlagert werden und das Überlagerungssignal zur Erzeugung der digitalen Datenfolge mit dem Analog-Digital-Wandler abgetastet wird und/oder dass c. die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse zur Erzeugung der digitalen Datenfolge von demselben Analog-Digital-Wandler abgetastet werden und/oder dass
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere digitale Datenfolge, durch Abtasten der weiteren Folge von weiteren elektrischen Impulsen mit einem weiteren Analog-Digital-Wandler mit einer weiteren Abtastrate erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verarbeitung der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitalen Datenfolge mit einer Auswertelektronik erfolgt und/oder dass die Verarbeitung der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge mit einer Auswertelektronik auf der Basis programmierbaren integrierten Schaltkreises, insbesondere eines Field Programmable Gate Array (kurz: FPGA), erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass a. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt werden und/oder dass b. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt werden, die jeweils einen Messzeitraum repräsentieren, der mindestens so lang ist, insbesondere genauso lang ist, wie der zeitliche Abstand aufeinanderfolgender Anregungslichtpulse, und/oder dass c. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt werden, die jeweils unterschiedlichen Probenorten, insbesondere Pixeln, zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass a. den Datenpaketen weitere Daten hinzugefügt werden und/oder dass b. den Datenpaketen weitere Daten bezüglich der Position des jeweils untersuchten Probenortes und/oder bezüglich des zugehörigen Bildpunktes und/oder ein Zeitstempel und/oder eine fortlaufende Nummer und/oder jeweils unterschiedliche Nummern hinzugefügt werden c. jedem Datenpaket das Ende eines vorhergehenden Datenpaketes und/oder der Anfang des nachfolgenden Datenpaketes angehängt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass a. aus jedem Datenpaket die Anzahl der Anregungslichtpulse und/oder die Anzahl der detektierten Photonen ermittelt werden und/oder dass b. die Anzahl der Anregungslichtpulse pro Zeiteinheit und/oder die Anzahl der detektierten Photonen pro Zeiteinheit aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus den Datenpaketen ermittelt werden und/oder dass b. die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Signale und/oder die Datenfolge und/oder die weitere Datenfolge und/oder die Datenpakete – insbesondere digital – gefiltert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass a. wenigstens ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter verwendet wird und/oder dass b. wenigstens ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter verwendet wird, der Alterungseffekte und/oder thermische Effekte des Detektors und/oder der analogen Elektronik kompensiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils eine Zweitdifferenz zwischen dem Eintreffen eines Anregungslichtpulses an dem Probenbereich und dem Ausgehen eines Detektionsphotons von dem beleuchteten Probenbereich ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Häufigkeitsverteilung mehrerer errechneter zeitlicher Differenzen berechnet wird.
Vorrichtung zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe mit einer Lichtquelle zum Erzeugen von Anregungslicht, das mit einer Anregungspulsfrequenz aufeinanderfolgende Anregungslichtpulse beinhaltet, zum Beleuchten eines Probenbereichs mit dem Anregungslichtpuls und mit einem Detektor zum Detektieren des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichts, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor für jedes detektierte Photon des Detektionslichtes einen elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von elektrischen Impulsen erzeugt, und dass ein Analog-Digital-Wandler vorgesehen ist, der eine digitale Datenfolge durch Abtasten der Folge von elektrischen Impulsen mit einer Abtastrate erzeugt.
Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Abtastrate höher ist, als die Anregungspulsfrequenz und/oder dass b. die Abtastrate mehr als 50 mal höher ist, als die Anregungspulsfrequenz und/oder dass c. die Abtastrate größer als 1 Gigasample pro Sekunde ist, insbesondere größer als 3 Gigasample pro Sekunde ist, insbesondere ca. 5 Gigasample pro Sekunde beträgt, insbesondere größer als 5 Gigasample pro Sekunde ist. d. Das Abtasten mit einer Auflösung von 8 Bit erfolgt oder dass das Abtasten mit einer Auflösung von 10 Bit erfolgt.
Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungspulsfrequenz größer als 50 MHz ist, insbesondere ca. 80 MHz beträgt und/oder dass die Dauer eines Anregungslichtpulses kürzer als 10 ps, insbesondere kürzer als 1 ps, insbesondere kürzer als 100 fs ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht aus Primärlicht abgespalten ist und dass ein Anregungsdetektor vorgesehen ist, der einen vom Anregungslicht verschiedenen Teil des Primärlichtes detektiert und der für jeden detektierten Puls einen weiteren elektrischen Impuls und dadurch eine Folge von weiteren elektrischen Impulsen erzeugt.
Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass a. eine Überlagerungsvorrichtung, insbesondere ein Power-Combiner, die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse – insbesondere mit umgekehrtem Vorzeichen – überlagert und das Überlagerungssignal zur Erzeugung der digitalen Datenfolge mit dem Analog-Digital-Wandler abgetastet wird und/oder dass b. der Analog-Digital-Wandler die elektrischen Impulse und die weiteren elektrischen Impulse zur Erzeugung der digitalen Datenfolge abgetastet.
Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Analog-Digital-Wandler vorgesehen ist, der eine weitere digitale Datenfolge, durch Abtasten der weiteren Folge von weiteren elektrischen Impulsen mit einer weiteren Abtastrate erzeugt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass a. eine Auswertelektronik die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge verarbeitet und/oder dass b. eine Auswertelektronik auf der Basis programmierbaren integrierten Schaltkreises, insbesondere eines Field Programmable Gate Array (kurz: FPGA) die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge verarbeitet.
Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteelektronik a. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt und/oder dass b. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt, die jeweils einen Messzeitraum repräsentieren, der mindestens so lang ist, insbesondere genauso lang ist, wie der zeitliche Abstand aufeinanderfolgender Anregungslichtpulse, und/oder dass c. die digitale Datenfolge und/oder die weitere digitale Datenfolge in Datenpakete zerteilt, die jeweils unterschiedlichen Probenorten, insbesondere Pixeln, zugeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteelektronik a. den Datenpaketen weitere Daten hinzugefügt und/oder dass b. den Datenpaketen weitere Daten bezüglich der Position des jeweils untersuchten Probenortes und/oder bezüglich des zugehörigen Bildpunktes und/oder ein Zeitstempel und/oder eine fortlaufende Nummer und/oder jeweils unterschiedliche Nummern hinzugefügt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteelektronik a. aus jedem Datenpaket die Anzahl der Anregungslichtpulse und/oder die Anzahl der detektierten Photonen ermittelt und/oder dass b. die Anzahl der Anregungslichtpulse pro Zeiteinheit und/oder die Anzahl der detektierten Photonen pro Zeiteinheit aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertevorrichtung a. die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus den Datenpaketen ermittelt werden und/oder dass b. die Zeitpunkte der Anregungslichtpulse und/oder der detektierten Photonen aus der digitalen Datenfolge und/oder der weiteren digitale Datenfolge ermittelt werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein Filter die elektrischen Signale und/oder die Datenfolge und/oder die weitere Datenfolge und/oder die Datenpakete – insbesondere digital – filtert.
Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter a. ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter ist und/oder dass b. ein adaptiver und/oder einstellbarer Filter ist, der Alterungseffekte und/oder thermische Effekte des Detektors und/oder der analogen Elektronik kompensiert.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertevorrichtung jeweils eine Zweitdifferenz zwischen dem Eintreffen eines Anregungslichtpulses an dem Probenbereich und dem Ausgehen eines Detektionsphotons von dem beleuchteten Probenbereich ermittelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertevorrichtung eine Häufigkeitsverteilung mehrerer errechneter zeitlicher Differenzen berechnet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass a. eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes auf unterschiedliche Probenorte und/oder zum Abrastern einer Probe vorgesehen ist und/oder dass b. eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes auf unterschiedliche Probenorte und/oder zum Abrastern einer Probe vorgesehen ist wobei die Steuerungsvorrichtung Daten und/oder Signale bereitstellt, die Ortsinformationen bezüglich der jeweiligen Stellung der Scaneinrichtung beinhalten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Teil eines Scanmikroskops, insbesondere eines konfokalen Scanmikroskops ist.
Scanmikroskop mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 33.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und/oder einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 33 und/oder eines Scanmikroskops nach Anspruch 34 zum Messen der Lebensdauer eines angeregten Zustandes in einer Probe, insbesondere zum Messen einer Fluoreszenzlebensdauer.