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Die Erfindung betrifft eine mikroskopische Einrichtung zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten, umfassend zwei Abbildungsoptiken, die ein und dasselbe in einem Objektraum angeordnete punktförmige Objekt jeweils in Form einer Fokuslichtverteilung in zwei separate Bildräume abbilden, zwei Detektoreinheiten, die jeweils einer der beiden Abbildungsoptiken zugeordnet sind und in Detektionspunkten einer in dem jeweiligen Bildraum liegenden Detektionsfläche einen auswertbaren Lichtfleck erfassen, der einen ebenen Schnitt durch die jeweilige Fokuslichtverteilung darstellt, und eine Auswerteeinheit, die die Detektionspunkte der beiden Detektionsflächen paarweise in Korrespondenz zueinander setzt und durch Auswerten der beiden Lichtflecke unter Berücksichtigung dieser Bildpunktkorrespondenz eine laterale x-y-Position des punktförmigen Objektes innerhalb einer in dem Objektraum liegenden Objektebene und eine axiale z-Position des punktförmigen Objektes in Richtung einer senkrecht zu der Objektebene liegenden optischen Achse ermittelt. Ferner betrifft die Erfindung ein mikroskopisches Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten.
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In jüngerer Vergangenheit wurden lichtmikroskopische Abbildungsverfahren entwickelt, mit denen sich basierend auf einer sequentiellen, stochastischen Lokalisierung von einzelnen Markern, insbesondere Fluoreszenzmolekülen, Probenstrukturen darstellen lassen, die kleiner sind als die beugungsbedingte Auflösungsgrenze klassischer Lichtmikroskope. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in
WO 2006/127692 A2 ;
DE 10 2006 021 317 B3 ;
WO 2007/128434 A1 ,
US 2009/0134342 A1 ;
DE 10 2008 024 568 A1 ;
WO 2008/091296 A2 ;
„Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)", Nature Methods 3, 793–796 (2006), M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang;
„Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching", Geisler C. et al, Appl. Phys. A, 88, 223–226 (2007). Dieser neue Zweig der Mikroskopie wird auch als Lokalisierungsmikroskopie bezeichnet. Die angewandten Verfahren sind in der Literatur z.B. unter den Bezeichnungen (F)PALM ((Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy), PALMIRA (PALM with Independently Running Acquisition), GSD(IM) (Ground State Depletion Individual Molecule return) Microscopy) oder (F)STORM ((Fluorescence) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) bekannt.
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Den neuen Verfahren ist gemein, dass die abzubildenden Probenstrukturen mit punktförmigen Objekten, sogenannten Markern präpariert werden, die über zwei unterscheidbare Zustände verfügen, nämlich einen „hellen“ Zustand und einen „dunklen“ Zustand. Werden beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet, so ist der helle Zustand ein fluoreszenzfähiger Zustand und der dunkle Zustand ein nicht fluoreszenzfähiger Zustand.
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In bevorzugten Ausführungsformen werden, wie z.B. in der
WO 2008/091296 A2 und der
WO 2006/127692 A2 , photoschaltbare oder photoaktivierbare Fluoreszenzmoleküle verwendet. Alternativ können, wie z.B. in der
DE 10 2006 021 317 B3 , inhärente Dunkelzustände von Standard-Fluoreszenzmolekülen genutzt werden.
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Zur Abbildung von Probenstrukturen mit einer Auflösung, die höher als die klassische Auflösungsgrenze der bildgebenden Optik ist, wird nun wiederholt eine kleine Teilmenge der Marker in den hellen Zustand überführt. Dabei ist die Dichte der diese aktive Teilmenge bildenden Marker so zu wählen, dass der mittlere Abstand benachbarter Marker im hellen und damit lichtmikroskopisch abbildbaren Zustand größer als die Auflösungsgrenze der bildgebenden Optik ist. Die die aktive Teilmenge bildenden Marker werden auf einem räumlich auflösenden Lichtdetektor, z.B. eine CCD-Kamera, abgebildet, so dass von jedem punktförmigen Marker eine Lichtverteilung in Form eines Lichtflecks erfasst wird, dessen Größe durch die Auflösungsgrenze der Optik bestimmt ist.
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Auf diese Weise wird eine Vielzahl von Rohdaten-Einzelbildern aufgenommen, in denen jeweils eine andere aktive Teilmenge abgebildet ist. In einem Bildanalyse-Prozess werden dann in jedem Rohdaten-Einzelbild die Schwerpunktpositionen der Lichtverteilungen bestimmt, die die im hellen Zustand befindlichen, punktförmigen Marker darstellen. Die aus den Rohdaten-Einzelbildern ermittelten Schwerpunktpositionen der Lichtverteilungen werden dann in einer Gesamtdarstellung in Form eines Gesamtbild-Datensatzes zusammengetragen. Das durch diese Gesamtdarstellung entstehende hochaufgelöste Gesamtbild spiegelt die Verteilung der Marker wider.
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Für eine repräsentative Wiedergabe der abzubildenden Probenstruktur müssen ausreichend viele Markersignale detektiert werden. Da jedoch die Anzahl an Markern in der jeweils aktiven Teilmenge durch den minimalen mittleren Abstand, den zwei Marker im hellen Zustand voneinander haben müssen, limitiert ist, müssen sehr viele Rohdaten-Einzelbilder aufgenommen werden, um die Probenstruktur vollständig abzubilden. Typischerweise liegt die Anzahl an Rohdaten-Einzelbildern in einem Bereich von 10.000 bis 100.000.
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In den vorstehend erläuterten lokalisierungsmikroskopischen Verfahren werden die Schwerpunktpositionen der einzelnen auf den Lichtdetektor erzeugten Lichtflecke üblicherweise nur in zwei Dimensionen bestimmt, so dass das aus sämtlichen Schwerpunktpositionen rekonstruierte, hochaufgelöste Bild der Probenstruktur ebenfalls ein lediglich zweidimensionales Bild ist. Wünschenswert wäre jedoch, die Probenstruktur in drei Dimensionen zu rekonstruieren.
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Aus dem Stand der Technik sind auch Verfahren bekannt, die eine dreidimensionale Lagebestimmung einzelner punktförmiger Objekte in einer Probe ermöglichen. Hierzu wird beispielhaft auf die
WO 2009/085218 A1 und die
US 7772569 B2 sowie auf
„Three-dimensional tracking of fluorescent nanoparticles with subnanometer precision by use of off-focus imaging", Optics Letters, 2003, Vol. 28 (No. 2), Michael Speidel et al; und
"Three-dimensional Particle Tracking via Bifocal Imaging", Nano Letters, 2007, Vol. 7 (No. 7), Seiten 2043–2045, Erdal Toprak, et al verwiesen. Dabei basiert das in der
US 7772569 B2 beschriebene Verfahren auf der Analyse von defokussierten Bildmustern auf mindestens zwei Bildsensoren in unterschiedlichen Bildebenen. Bei dem Verfahren nach der
WO 2009/085218 A1 werden Elliptizitäten von Lichtmustern unter Zuhilfenahme spezieller Optiken analysiert.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erfordern eine komplizierte Bildanalyse zur Schwerpunktbestimmung und Mustererkennung oder spezielle Optiken, die die allgemeine Nutzbarkeit von mikroskopischen Einrichtungen, die nach diesen Verfahren arbeiten, einschränken.
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine Einrichtung und ein Verfahren anzugeben, die eine einfache und technisch aufwandsarme dreidimensionale Lokalisierung von punktförmigen Objekten ermöglichen.
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Die Erfindung löste diese Aufgabe für die mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 1 dadurch, dass die beiden Abbildungsoptiken jeweils ein optisches Mittel aufweisen, das die jeweilige Fokuslichtverteilung schräg zu einer in der jeweiligen Abbildungsoptik vorgesehenen Detektionsachse ausrichtet, die senkrecht zur Detektionsfläche der jeweiligen Detektoreinheit liegt, dass die durch die optischen Mittel bewirkten Schrägstellungen der beiden Fokuslichtverteilungen einander derart entgegengesetzt sind, dass sich die beiden Lichtflecke mit einer Änderung der z-Position des punktförmigen Objektes in ihren jeweiligen Detektionsflächen unter Berücksichtigung der Bildpunktkorrespondenz gegenläufig verschieben, und dass die Auswerteeinheit die axiale z-Position des punktförmigen Objektes anhand der relativen Lage der beiden Lichtflecke ermittelt.
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Erfindungsgemäß ist unter einer Fokuslichtverteilung eine dreidimensionale Lichtverteilung zu verstehen, die sich aus der Abbildung eines (idealisiert) punktförmigen Objektes unter Berücksichtigung des begrenzten Auflösungsvermögens der Abbildungsoptik ergibt. Eine solche Fokuslichtverteilung wird auf dem vorliegenden technischen Gebiet auch häufig mit der sogenannten Punktspreizfunktion, kurz PSF, beschrieben.
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Die Erfindung sieht also vor, die von den Abbildungsoptiken erzeugten dreidimensionalen Fokuslichtverteilungen, durch die das punktförmige Objekt, beispielsweise ein fluoreszierendes Molekül, auf die beiden Detektoreinheiten abgebildet wird, bezüglich der Detektionsachse der jeweiligen Detektoreinheit schräg zu stellen, um so gleichsam einen Symmetriebruch in den Fokusverteilungen zu erzielen, der in besonders einfacher Weise zur Lokalisierung des punktförmigen Objektes genutzt werden kann. So bewirkt die Schrägstellung der jeweiligen Fokuslichtverteilungen, dass ein Versatz der Fokuslichtverteilung längs der Detektionsachse der jeweiligen Detektoreinheit zu einer lateralen Verschiebung des durch die Fokuslichtverteilung auf der zugehörigen Detektoreinheit erzeugten Lichtflecks führt. Indem die Schrägstellungen der beiden Fokuslichtverteilungen einander entgegengesetzt sind, sind die vorstehend genannten lateralen Verschiebungen der zugehörigen Lichtflecke auf den beiden Detektoreinheiten gegenläufig. Aus dieser gegenläufigen lateralen Verschiebung der Lichtflecke lässt sich somit (neben der lateralen x-y-Position) auch die axiale-z-Position des punktförmigen Objektes im Objektraum bestimmen. So ist eine einfache dreidimensionale Lokalisierung des Objektes möglich.
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Um aus der vorstehend beschriebenen, gegenläufigen Verschiebung der beiden Lichtflecke auf den Detektoreinheiten auf die dreidimensionale Position des punktförmigen Objektes zurückschließen zu können, ist eine paarweise räumliche Zuordnung der Detektionspunkte der einen Detektionsfläche zu den Detektionspunkten der anderen Detektionsfläche vorgesehen. Durch diese Zuordnung wird eine eindeutige Korrespondenz der Detektionspunkte der beiden Detektionsflächen geschaffen, die es ermöglicht, die Lagen der beiden Lichtflecke zur Bestimmung der dreidimensionalen Position des punktförmigen Objektes miteinander zu vergleichen. Die erfindungsgemäße Detektionspunktkorrespondenz kann deshalb auch als eine die Lokalisierung ermöglichende Bildüberlagerung aufgefasst werden.
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Die erfindungsgemäße Einrichtung ermöglicht eine einfache Auswertung der auf den Detektoreinheiten erzeugten Lichtflecke ohne komplizierte Bildanalyse oder Mustererkennung. Sie erlaubt eine schnelle, idealerweise echtzeitfähige dreidimensionale Objektlokalisierung ohne technisch aufwändige oder kostenintensive Spezialoptiken.
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Die Einrichtung kann in der eingangs erläuterten hochauflösenden Lokalisierungsmikroskopie, in der bisher lediglich eine zweidimensionale Lokalisierung üblich ist, angewandt werden. Sie ist jedoch nicht auf eine solche Anwendung beschränkt. So kann die Einrichtung beispielsweise auch in einem als „Particle Tracking“ bezeichneten Verfahren eingesetzt werden, das dazu dient, bewegliche, z.B. diffundierende Teilchen zeitlich zu verfolgen. Denkbar ist jede Anwendung, bei der eine dreidimensionale Positionsbestimmung von definierten, punktförmigen Objekten vorgesehen ist. Beispielhaft ist hier auch die Einzelmolekül-Mikroskopie zu nennen. Dabei sind im hier vorliegenden Zusammenhang als punktförmige Objektive sämtliche Objekte zu verstehen, deren räumliche Ausdehnung kleiner als die klassische (beugungsbegrenzte) Auflösung der bildgebenden Optik ist.
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Vorzugsweise erfasst die Auswerteeinheit eine Schwerpunktposition des jeweiligen Lichtflecks und ermittelt die laterale x-y-Position sowie die axiale z-Position anhand der erfassten Schwerpunktpositionen der beiden Lichtflecke. Die Erfassung der Schwerpunktpositionen kann in an sich aus der Lokalisierungsmikroskopie bekannter Weise erfolgen. Dabei hängt die Präzision der Schwerpunktpositionsbestimmung im Wesentlichen vom Signal-Rausch-Verhältnis ab, mit dem die Lichtflecke von den Detektoreinheiten erfasst werden, also beispielsweise von der Anzahl detektierter Photonen eines das punktförmige Objekt bildenden fluoreszierenden Moleküls. Durch eine geeignete Bildverarbeitung zur Unterscheidung und/oder Eliminierung von Hintergrund-, Untergrund- oder Rauschsignalen kann die Lokalisierungspräzision verbessert werden. Die Bestimmung der jeweiligen Schwerpunktposition beruht jedenfalls auf der Kenntnis, dass der jeweilige Lichtfleck durch ein einzelnes punktförmiges Objekt erzeugt wird. Im Ergebnis kann so die Position des Objektes mit einer räumlichen Präzision bestimmt werden, die weitaus besser als die Auflösungsgrenze der abbildenden Optik ist.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung ermittelt die Auswerteeinheit die laterale x-y-Position des punktförmigen Objektes anhand des Mittelwertes der Schwerpunktposition der beiden Lichtflecke. Dies ermöglicht eine besonders präzise Bestimmung der lateralen Position des Objektes im Objektraum.
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Vorzugsweise ermittelt die Auswerteeinheit die axiale z-Position des punktförmigen Objektes anhand des Abstandes der Schwerpunktpositionen der beiden Lichtflecke. Für den Fall, dass die Detektionsflächen der beiden Detektoreinheiten optisch zueinander konjugiert sind, d.h. die gleiche Objektebene abbilden, ist der Abstand der Schwerpunktpositionen der beiden Lichtverteilungen – unter Berücksichtigung der weiter oben beschriebenen Detektionspunktkorrespondenz – bei exakter Fokussierung auf die Objektebene im Wesentlichen gleich null. Fasst man die Detektionspunktkorrespondenz als Bildüberlagerung auf, so fallen die Schwerpunktpositionen in diesem Fall zusammen. Mit zunehmender Defokussierung nimmt dagegen der Abstand in Folge der gegenläufigen Schrägstellung der beiden Fokuslichtverteilungen betragsmäßig zu, wobei die gegenläufige Schrägstellung der Verteilungen auch eindeutig erkennen lässt, in welcher Richtung diese Defokussierung erfolgt, d.h. ob die beiden Detektionsflächen vor oder hinter einer Ebene liegen, die im Bildraum optisch konjugiert zu der das zu lokalisierende Objekt enthaltenden Objektebene angeordnet ist. Auf diese Weise ist eine eindeutige und präzise Bestimmung der axialen z-Position des Objektes möglich.
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Vorzugsweise sind die Detektionsflächen der beiden Detektoreinheiten zu der gleichen Objektebene im Objektraum optisch konjugiert. Dies ermöglicht eine besonders einfache Auswertung der beiden Lichtflecke, deren Lagen in den jeweiligen Detektionsflächen vom Fokussierungszustand abhängen, den die Detektionsflächen gegenüber der das lokalisierende Objekt enthaltenden Objektebene aufweisen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform hat die erfindungsgemäße Einrichtung ein für die beiden Abbildungsoptiken gemeinsam vorgesehenes Aufnahmeobjektiv, welches das von dem punktförmigen Objekt ausgehende Licht in ein vorzugsweise paralleles Strahlenbündel umsetzt, und einen Strahlteiler, der das von dem Aufnahmeobjektiv erzeugte Strahlenbündel in zwei Teilstrahlenbündel teilt, die jeweils einen der beiden Lichtflecke auf der jeweiligen Detektoreinheit erzeugen. Der Strahlteiler kann beispielsweise so ausgebildet sein, dass er das von dem punktförmigen Objekt ausgehende Licht zu einer Hälfte auf die eine und zur anderen Hälfte auf die andere Detektoreinheit leitet. In dieser Ausführungsform kann das gemeinsame Aufnahmeobjektiv sowohl als Teil der einen als auch als Teil der anderen Abbildungsoptik angesehen werden. Setzt das Aufnahmeobjektiv das von dem Objekt ausgehende Licht in ein paralleles Strahlenbündel um, so können die dem Aufnahmeobjektiv nachgeordneten Abbildungsoptiken in den ihnen jeweils zugeordneten Strahlengängen sehr flexibel angeordnet werden.
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Vorzugsweise weisen die Abbildungsoptiken jeweils eine Tubuslinse auf, die das jeweilige Teilstrahlenbündel auf die jeweilige Detektoreinheit bündelt. In diesem Fall kann die Tubuslinse in der jeweiligen Abbildungsoptik dazu genutzt werden, die zugehörige Fokuslichtverteilung in der erfindungsgemäßen Weise schräg zu stellen. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Tubuslinse quer zur optischen Achse der Abbildungsoptik versetzt wird, so dass das die Fokuslichtverteilung erzeugende Teilstrahlenbündel dezentral auf die Tubuslinse fällt. Bei einem solch dezentralen Einfall bewirkt die Tubuslinse die gewünschte Schrägstellung der Fokuslichtverteilung. Ist der Versatz der Tubuslinse quer zur optischen Achse des Abbildungsstrahlengangs variabel einstellbar, so kann die Schrägstellung der Fokuslichtverteilung nach Belieben verändert werden. In diesem Fall ist es von Vorteil, die zugehörige Detektoreinheit ebenfalls räumlich verstellbar auszuführen, um sie entsprechend der Lageänderung der Fokuslichtverteilung nachzuführen.
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Beispielsweise sieht das optische Mittel zum Schrägstellen der jeweiligen Fokuslichtverteilung eine dezentrale Ausleuchtung, vorzugsweise eine dezentrale Unterleuchtung eines in der jeweiligen Abbildungsoptik vorgesehenen optischen Elementes vor. Die vorstehend in Bezug auf eine Tubuslinse erläuterte dezentrale Ausleuchtung kann somit auch für ein beliebiges anderes optisches Element der jeweiligen Abbildungsoptik vorgesehen sein, um die gewünschte Schrägstellung der Fokuslichtverteilung zu erzielen. Mit Unterleuchtung ist ein Lichteinfall gemeint, bei dem die Eintrittspupille des optischen Elementes nicht vollständig, sondern nur zu einem Teil von dem Licht durchsetzt wird. Durch eine solche Unterleuchtung lassen sich die Abmessungen der Fokuslichtverteilung vergrößern. Besonders bevorzugt ist eine variable Unterleuchtung, so dass sich die Größe der Fokuslichtverteilung in weiten Grenzen einstellen lässt.
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Die gewünschte gegenläufige Schrägstellung der Fokuslichtverteilungen lässt sich auch in beliebig anderer Weise realisieren. Neben Linsen oder Linsengruppen, die quer zur optischen Achse des jeweiligen Strahlengangs versetzt sind, können beispielsweise auch Linsen verwendet werden, die eine asphärische Linsenfläche haben, welche die gewünschte Schrägstellung der Fokuslichtverteilung bewirkt. Auch kann das erfindungsgemäße optische Mittel ein räumlicher Lichtmodulator sein, der die Wellenfront des einfallenden Lichtes so beeinflusst, dass die gewünschte Schrägstellung der Fokuslichtverteilung erzielt wird.
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Die beiden Detektoreinheiten sind nicht notwendigerweise separat ausgeführte Bauteile. Sie können auch gemeinsam auf einer Baugruppe angeordnet sein, beispielsweise in Form zweier Teilbereiche einer CCD-Kamerabaugruppe. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, die beiden Detektoreinheiten so zu justieren, dass sie in der gewünschten Weise zueinander angeordnet sind.
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Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein mikroskopisches Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten nach Anspruch 12 vorgesehen.
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Besonders gewinnbringend ist das erfindungsgemäße Verfahren in der eingangs beschriebenen Lokalisierungsmikroskopie anwendbar. In diesem Fall werden jeweils mehrere punktförmige Objekte zur dreidimensionalen Lokalisierung gleichzeitig auf die jeweilige Detektoreinheit abgebildet, wobei die punktförmigen Objekte in dem Objektraum laterale Abstände voneinander haben, die so groß sind, dass die die punktförmigen Objekte abbildenden Lichtflecke in der jeweiligen Detektionsfläche räumlich voneinander getrennt erfasst werden. Auf diese Weise kann durch Aufnahme eines einzigen Rohdaten-Einzelbildes eine Vielzahl von punktförmigen Markern dreidimensional lokalisiert werden. Indem anschließend die ermittelten Schwerpunktpositionen für eine Sequenz von Einzelbildern in einem Gesamtbild zusammengetragen werden, können auch komplizierte dreidimensionale Strukturen einfach und schnell rekonstruiert werden.
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
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1 eine schematische Darstellung eines Lichtmikroskops zur Veranschaulichung einer herkömmlichen Abbildung von punktförmigen Objekten auf eine Detektoreinheit;
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2 eine der 1 entsprechende Darstellung eines Lichtmikroskops zur Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Abbildung von punktförmigen Objekten auf eine Detektoreinheit;
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3 eine schematische Darstellung eines detektorseitigen Strahlengangs des Lichtmikroskops nach 2, wobei diese Darstellung die Erzeugung einer schräggestellten Fokuslichtverteilung veranschaulicht;
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4 eine schematische Darstellung, welche die erfindungsgemäße Verwendung von zwei Detektoreinheiten für verschiedene Fokussierzustände zeigt; und
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5 eine schematische Darstellung, welche die beiden Fokuslichtverteilungen und durch diese auf den beiden Detektoreinheiten erzeugte Lichtflecke für verschiedene Fokussierzustände zeigt.
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Ein Weitfeld-Mikroskop 10, das im Stande ist, eine erfindungsgemäße dreidimensionale Lokalisierung von punktförmigen Objekten vorzunehmen, ist in den 2 bis 4 dargestellt. Dabei sind in den 2 bis 4 jeweils nur diejenigen Mikroskopkomponenten gezeigt, die für das Verständnis des diesbezüglich zu erläuternden Sachverhalts erforderlich sind.
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Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Lokalisierungsprinzips soll das in 2 gezeigte Lichtmikroskop 10 zunächst einem in 1 dargestellten Mikroskop gegenübergestellt werden, das in weiten Teilen baugleich mit dem Lichtmikroskop nach 10 ist, jedoch nicht in der erfindungsgemäßen Weise arbeitet. In den 1 und 2 sind die einander entsprechenden Mikroskopkomponenten mit den gleichen Bezugszeichen versehen.
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Das in herkömmlicher Weise arbeitende Weitlicht-Lichtmikroskop 10 nach 1 umfasst ein Aufnahmeobjektiv 12, welches das von zwei punktförmigen Objekten 14 und 16 ausgehende Licht empfängt. Die punktförmigen Objekte 14 und 16 sind beispielsweise fluoreszierende Moleküle, die in einer Probe 18 enthalten sind.
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Im Folgenden soll erläutert werden, wie die punktförmigen Objekte 14 und 16 innerhalb der Probe 18 lokalisiert werden. Diese Lokalisierung soll unter Bezugnahme auf ein Koordinatensystem erfolgen, das in 1 durch die Achsen x, y, z angedeutet ist. Insbesondere soll für die punktförmigen Objekte 14 und 16 eine laterale x-y-Position innerhalb einer Objektebene bestimmt werden, die in einem durch die Probe 18 gebildeten Objektraum liegt und unter Bezugnahme auf das in 1 dargestellte Koordinatensystem parallel zur x-y-Ebene angeordnet ist. Ferner soll eine axiale z-Position des jeweiligen Objekts 14, 16 in Richtung einer senkrecht zu der vorstehend genannten Objektebene liegenden optischen Achse O1 ermittelt werden.
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Das von dem punktförmigen Objekt 14 ausgehende Licht wird von dem Aufnahmeobjektiv 12 in ein paralleles Strahlenbündel 20 umgesetzt. Entsprechend formt das Aufnahmeobjektiv 12 aus dem von dem punktförmigen Objekt 16 ausgehenden Licht ein paralleles Strahlenbündel 22. Dabei wird für das in 1 gezeigte Beispiel angenommen, dass das punktförmige Objekt 14 auf der optischen Achse O1 angeordnet ist, so dass das dem Objekt 14 zugeordnete Strahlenbündel 20 parallel zur optischen Achse O1 verläuft. Demgegenüber soll das punktförmige Objekt 16 zur optischen Achse O1 lateral versetzt sein, so dass das dem Objekt 16 zugeordnete Strahlenbündel 22 schräg zur optischen Achse O1 verläuft.
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Die beiden Strahlenbündel 20 und 22 werden an einem Spiegel 24 auf eine Tubuslinse 26 reflektiert. Die Tubuslinse 26 lässt die beiden Strahlenbündel 22 und 24 auf eine Detektionsfläche 27 einer Detektoreinheit 28 konvergieren. Die beiden punktförmigen Objekte 14 und 16 werden so über die aus dem Objektiv 12 und der Tubuslinse 26 gebildete Abbildungsoptik auf die Detektionsfläche 27 der Detektoreinheit 28 abgebildet.
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In 1 sind die Detektionsfläche 27 sowie die in Richtung der Detektionsfläche 27 konvergierenden Strahlenbündel 20 und 22 nochmals vergrößert dargestellt, um zu verdeutlichen, dass die punktförmigen Objekte 14 und 16 entsprechend ihrer räumlichen Lage innerhalb der Probe 18 in unterschiedliche Bereiche 30 und 32 eines dreidimensionalen Bildraums 34 abgebildet werden. So entstehen in der Detektionsfläche 27 der Detektoreinheit 28 Abbildungen der punktförmigen Objekte 14 und 16, die je nach deren räumlicher Lage in z-Richtung, also axial mehr oder weniger auf die Detektionsfläche 27 fokussiert sind. Zur Vereinfachung der Erläuterung wird hier und auch im Weiteren auch detektorseitig auf das der Probe 18 zugeordnete Koordinatensystem mit dessen Achsen x, y, z Bezug genommen.
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Aus der Unschärfe der Strahlenbündel 20 und 22 in der Detektionsfläche 27 lässt sich ableiten, ob die punktförmige Objekte 14 und 16 innerhalb oder außerhalb einer Objektebene liegen, zu der die Detektionsfläche 27 optisch konjugiert ist. Da bei der in 1 dargestellten optischen Abbildung die Strahlenbündel 20 und 22 jedoch senkrecht auf die Detektionsfläche 27, d.h. in Richtung einer senkrecht zur Detektionsfläche 27 liegenden Detektionsachse 36, auf die Detektionsfläche 27 fallen, lässt sich nicht entscheiden, ob die punktförmigen Objekte 14 und 16 in z-Richtung vor oder hinter der vorstehend genannten konjugierten Objektebene liegen. Wie aus der Darstellung nach 1 deutlich wird, verhält sich nämlich die Defokussierung der Strahlenbündel 20 und 22 symmetrisch bezüglich einer Verschiebung vor bzw. hinter die Detektionsfläche 27.
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Aus dem vorstehend Erläuterten ergibt sich, dass bei der in 1 dargestellten Abbildung zwar eine laterale Positionsbestimmung in einer zur x-y-Ebene parallelen Objektebene möglich ist, jedoch keine Positionsbestimmung in z-Richtung, da die durch die Strahlenbündel 20 und 22 erzeugten Fokuslichtverteilungen in z-Richtung symmetrisch sind. Für eine dreidimensionale Lagebestimmung, die eine Bestimmung in z-Richtung beinhaltet, ist gleichsam ein Symmetriebruch der Fokuslichtverteilungen erforderlich, der im Folgenden unter Bezugnahme auf das Ausführungsbeispiel nach 2 erläutert wird.
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Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop 10 nach 2 weist im Wesentlichen die gleichen Komponenten wie das in 1 dargestellte Mikroskop auf. Jedoch ist an dieser Stelle darauf hinzuweisen, dass das Lichtmikroskop 10 nicht nur die in 2 gezeigte Detektoreinheit 28, sondern eine weitere im wesentlichen baugleiche Detektoreinheit umfasst, wie sich beispielsweise aus der später erläuterten 4 ergibt. Die Darstellung nach 2 ist mithin vereinfacht, um die Unterschiede gegenüber der herkömmlichen Anordnung nach 1 hervorzuheben.
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Ein wesentliches Merkmal der in 2 dargestellten Lösung liegt darin, dass die von den punktförmigen Objekten 14 und 16 ausgehenden Strahlenbündel 20 und 22 in dem Bildraum 34 Fokuslichtverteilungen 40 bzw. 42 erzeugen, die zur Detektionsachse 36 der Detektoreinheit 28 schräggestellt sind. Wie der Darstellung nach 2 zu entnehmen ist, weisen die Fokuslichtverteilungen 40 und 42 bezüglich der Detektionsachse 36 einen Verlauf auf, der sich auch als diagonal bezeichnen lässt. Dieser diagonale Verlauf der Fokuslichtverteilungen 40 und 42 wird in dem Ausführungsbeispiel nach 2 dadurch erzielt, dass die Tubuslinse 26 quer zur optischen Achse O1, die durch den Spiegel 24 auf die Tubuslinse 26 umgelenkt wird, versetzt angeordnet ist. Dieser Querversatz der Tubuslinse 26 bewirkt, dass die Tubuslinse 26 von den Strahlenbündeln 20, 22 dezentral durchsetzt wird.
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Im Vergleich mit der in 1 gezeigten Abbildung lässt sich dies am besten an dem parallel zur optischen Achse O1 verlaufenden Strahlenbündel 20 erkennen, das von dem auf der optischen Achse O1 liegenden Objekt 14 ausgeht. Bei der in 1 gezeigten herkömmlichen Anordnung ist das Strahlenbündel 20 rotationssymmetrisch zur optischen Achse der Tubuslinse 26 angeordnet. Die Rotationssymmetrie des Strahlenbündels 20 bezüglich der Tubuslinse 26 ist bei der Lösung nach 2 gebrochen. Dieser Sachverhalt ist in der Darstellung nach 3 nochmals veranschaulicht. Dabei ist in 3 unter a) gezeigt, wie das Strahlenbündel 20 durch die Tubuslinse 26 auf die Detektionsfläche 27 fokussiert wird, während unter b) die aus dem Strahlenbündel 20 hervorgehende Fokuslichtverteilung 40 in der x-z-Ebene dargestellt und unter c) die dezentrale Unterleuchtung einer Eintrittspupille 44 der Tubuslinse 26 in der x-y-Ebene gezeigt ist.
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Wie aus 3 unter c) hervorgeht, wird die Eintrittspupille 44 der Tubuslinse 26 nicht vollständig mit dem Strahlenbündel 20 ausgeleuchtet. Vielmehr ist eine Unterleuchtung dergestalt vorgesehen, dass das Strahlenbündel 20 nur einen Teilbereich der Eintrittspupille 44 durchsetzt, der aus der Mitte der Eintrittspupille 44 in x-Richtung versetzt ist. Daraus ergibt sich in dem Bildraum 34 die unter b) gezeigte, in der x-z-Ebene diagonal verlaufene Form der Fokuslichtverteilung 40.
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Wie weiter oben erläutert, bilden die zwischen dem Aufnahmeobjektiv 12 und der Tubuslinse 26 verlaufenen Strahlenbündel 20 und 22 parallele Lichtbündel. Die Strahlenbündel 20, 22 sind jedoch in diesem Bereich des Abbildungsstrahlengangs nicht notwendigerweise parallele Lichtbündel. Es ist beispielsweise ebenso denkbar, die optische Abbildung so auszulegen, dass die Pupillenebene der Tubuslinse 26 eine konjugierte Ebene der Pupillenebene des Aufnahmeobjektivs 12 ist.
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Bei der in 2 gezeigten Anordnung wird also die Tubuslinse 26 in vorstehend beschriebener Weise asymmetrisch unterleuchtet. Hierzu wird sie quer zur optischen Achse O1 versetzt. Zur Realisierung der asymmetrischen Unterleuchtung der Tubuslinse 26 kann jedoch ebenso die Führung der Strahlenbündel 20 und 22 selbst versetzt werden. Hierzu können spezielle Strahlführungskomponenten, z.B. ein Kippspiegel, in den Strahlengang eingefügt werden.
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Auch die in den 2 und 3 dargestellte asymmetrische Unterleuchtung der Tubuslinse 26 ist lediglich beispielhaft zu verstehen. Es sind auch andere Maßnahmen denkbar, die die in den 2 und 3 dargestellten diagonalen Verläufe der Fokuslichtverteilungen 40 und 42 bewirken. Hier ist beispielsweise auf die Verwendung von asphärischen Linsen oder die Verwendung von räumlichen Lichtmodulatoren zu verweisen, die ebenfalls im Stande sind, die gewünschten Fokuslichtverteilungen zu erzeugen.
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Wie schon weiter oben erwähnt, weist das erfindungsgemäße Lichtmikroskop 10 nicht nur die in 2 gezeigte Detektoreinheit 28, sondern eine weitere Detektoreinheit auf, die in 4 mit 28‘ bezeichnet ist. Entsprechend ist auch eine weitere Tubuslinse 26‘ vorgesehen, die der Detektoreinheit 28‘ zugeordnet ist. Die Tubuslinse 26 bildet so mit dem Aufnahmeobjektiv 12 eine erste Abbildungsoptik. Entsprechend ist durch das Aufnahmeobjektiv 12 und die Tubuslinse 26‘ eine zweite Abbildungsoptik gegeben.
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In 4 ist beispielhaft das Strahlenbündel 20 dargestellt, das durch einen Strahlteiler 50 in ein erstes Teilstrahlenbündel 52 und ein zweites Teilstrahlenbündel 52‘ geteilt wird. Das erste Teilstrahlenbündel 52 tritt durch die Tubuslinse 26 und erzeugt dann die Fokuslichtverteilung 40, 40‘. Entsprechend tritt das zweite Teilstrahlenbündel 52‘ durch die Tubuslinse 26‘ und erzeugt die Fokuslichtverteilung 40‘.
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In 4 sind unter a) und b) zwei verschiedene Fokussierzustände dargestellt. So erkennt man unter a), dass die Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ größtenteils hinter der jeweiligen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ angeordnet sind. Demgegenüber sind sie in dem unter b) gezeigten Fokussierzustand größtenteils vor der jeweiligen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ angeordnet.
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In 5 ist unter a) gezeigt, dass die beiden Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel in einem Schnitt parallel zur x-z-Ebene gegenläufig schräg gestellt sind. Dabei sind drei verschiedene Fokussierzustände gezeigt, die in 5 mit I, II und III bezeichnet sind und sich jeweils durch eine bestimmte räumliche Lage der Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ relativ zu der zugehörigen Fokuslichtverteilung 40 bzw. 40‘ auszeichnen. Ferner zeigt 5 unter b) Lichtflecke 54 bzw. 54‘, welche die Fokuslichtverteilungen 40, 40‘ für die drei unter a) dargestellten Fokussierzustände I, II und III jeweils in der zugehörigen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ erzeugen. Dabei bilden die Lichtflecke 54 und 54‘ jeweils eine zweidimensionale Lichtverteilung, die einen ebenen Schnitt durch die jeweilige dreidimensionale Fokuslichtverteilung 40, 40‘ parallel zur x-y-Ebene darstellt.
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Um anhand der in den Detektionsflächen 27 und 27‘ erzeugten Lichtflecke 54 und 54‘ die laterale x-y-Position sowie die axiale z-Position des punktförmigen Objektes 14 zu ermitteln, müssen die Detektionspunkte der beiden Detektionsflächen 27 und 27‘ (z.B. die einzelnen Bildelemente eines CCD-Bildsensors), in denen die Lichtflecke 54 und 54‘ erfasst werden, paarweise in Korrespondenz zueinander gesetzt werden. Dadurch wird jedem Detektionspunkt der Detektionsfläche 27 in ein ein-eindeutiger Weise ein Detektionspunkt der Detektionsfläche 27‘ zugeordnet ist. Eine solche Detektionspunktkorrespondenz entspricht im Wesentlichen einer Überlagerung der auf den Detektionsflächen 27 und 27‘ erzeugten Objektbilder.
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Die drei unter a) der 5 dargestellten Fokussierzustände I, II und III spiegeln die Verhältnisse für drei verschiedene z-Positionen des punktförmigen Objektes 14 innerhalb der Probe 12 wider. Bei dem in 5 gezeigten Beispiel liegen die Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ in dem Fokussierzustand I größtenteils hinter der zugehörigen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘. Dementsprechend sind die Lichtflecke 54 und 54‘ in der zugehörigen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ in x-Richtung nach unten bzw. nach oben versetzt. In dem Fokussierzustand II befinden sich dagegen die Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ mit ihrem jeweiligen Schwerpunkt direkt in der zugehörigen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘. Dementsprechend sind die Lichtflecke 54 und 54‘ mittig in der Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ angeordnet. Schließlich liegen die Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ in dem Fokussierzustand III weitgehend vor der zugehörigen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘. Entsprechend ist der Lichtfleck 54 in der Detektionsfläche 27 nach oben und der Lichtfleck 54‘ in der Detektionsfläche 27‘ nach unten versetzt.
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Die Gegenläufigkeit der Fokuslichtverteilungen 40 und 40‘ bewirkt in dem vorliegenden Beispiel entgegengesetzte Verschiebungen der Lichtflecke 54 und 54‘ in den ihnen zugeordneten Detektionsflächen 27 bzw. 27‘ längs der x-Achse. Ist beispielsweise der Lichtfleck 54 in der Detektionsfläche 27 längs der x-Achse in negativer Richtung (in 5 nach unten) verschoben, wie dies im Fokussierzustand I der Fall ist, so ist der Lichtfleck 54‘ in der Detektionsfläche 27‘ längs der x-Achse in positiver Richtung (in 5 nach oben) versetzt. Im Fokussierzustand III ist dies gerade umgekehrt, während sich die beiden Lichtflecke 54 und 54‘ im Fokussierzustand II, der im Rahmen der Auflösungsgrenze der Abbildungsoptik die optimal scharfe Abbildung des punktförmigen Objekts 14 auf die Detektionsflächen 27 und 27‘ veranschaulichen soll, jeweils in der Mitte der jeweiligen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ befinden.
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Um das punktförmige Objekt 14 in drei Dimensionen zu lokalisieren, werden zunächst die Schwerpunktpositionen der beiden Lichtflecke 54 und 54‘ ermittelt. Zur Bestimmung der lateralen x-y-Position des Objektes 14 wird dann der Mittelwert der Schwerpunktpositionen der Lichtflecke 54 und 54‘ ermittelt. Wie dem Beispiel nach 5 zu entnehmen ist, ist der Mittelwert der Schwerpunktpositionen der beiden Lichtflecke 54 und 54‘ für alle drei Fokussierzustände I bis III gleich. So entspricht dieser Mittelwert gerade dem Mittelpunkt der jeweiligen Detektionsfläche 27 bzw. 27‘ (wobei der Mittelpunkt im optimalen Fokussierzustand II ohnehin mit den Schwerpunktpositionen der beiden Lichtflecke 54 und 54‘ zusammenfällt). Eine korrekte Bestimmung der lateralen x-y-Position ist mithin nicht nur im optimalen Fokussierzustand II, sondern auch in den beiden anderen Fokussierzuständen I und III möglich, in denen die Detektionsflächen 27 und 27‘ nicht exakt optisch konjugiert zu der Objektebene sind, in der sich das zu lokalisierende Objekt befindet.
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Die Bestimmung der axialen z-Position erfolgt dann anhand des Abstandes der beiden Lichtflecken 54 und 54‘ von ihrem zuvor ermittelten gemeinsamen Mittelpunkt. Dies bedeutet, dass die z-Position des zu lokalisierenden Objektes anhand der relativen Lage, insbesondere des relativen Abstandes der beiden Lichtflecke 54 und 54‘ ermittelt wird. Wie aus der Darstellung nach 5 unmittelbar hervorgeht, ergibt dieser relative Abstand für die drei dargestellten Fokussierzustände I, II und III verschiedene Werte, was die verschiedenen z-Positionen des zu lokalisierenden Objektes, die diesen Fokussierzuständen zugrunde liegen, widerspiegelt. Für das in 5 gezeigte Beispiel ergibt der relative Abstand der beiden Lichtflecke 54 und 54‘ in dem optimalen Fokussierzustand II idealerweise den Wert 0, während er für die beiden anderen Fokussierzustände I und III Werte liefert, die betragsmäßig etwa gleich sein dürften, sich jedoch durch ihr Vorzeichen voneinander unterscheiden. In jedem Fall ist so eine eindeutige Bestimmung der z-Position des Objektes möglich.
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Es ist noch darauf hinzuweisen, dass das in 2 gezeigte Lichtmikroskop 10 für die vorstehend erläuterte Auswertung der Lichtflecke 54 und 54‘ eine Auswerteeinheit 60 aufweist. Diese Auswerteeinheit 60 führt sämtliche für die Lokalisierung der punktförmigen Objekte vorgesehenen Operationen durch. So nimmt sie beispielsweise die vorstehend beschriebene Bildüberlagerung zur Herstellung der Detektionspunktkorrespondenz, die Ermittlung der Schwerpunktpositionen und schließlich die Berechnung der lateralen x-y-Position sowie der axialen z-Position vor.
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Ferner ist darauf hinzuweisen, dass in oben beschriebener Weise selbstverständlich nicht nur ein einziges Objekt, sondern eine Vielzahl von Objekten zur gleichen Zeit lokalisiert wird. Hierbei ist lediglich darauf zu achten, dass die auf den Detektionsflächen 27 und 27‘ erzeugten Lichtflecke, die jeweils von einem einzelnen punktförmigen Objekt stammen, räumlich voneinander trennbar sind.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Lichtmikroskop
- 12
- Aufnahmeobjektiv
- 14, 16
- punktförmige Objekte
- 18
- Probe
- 20, 22
- Strahlenbündel
- 26, 26‘
- Tubuslinse
- 27, 27‘
- Detektionsfläche
- 28, 28‘
- Detektoreinheit
- 30, 32
- Bereiche eines Bildrahmens
- 34
- Bildraum
- 36
- Detektionsachse
- 40, 40‘, 42, 42‘
- Fokuslichtverteilungen
- 44
- Eintrittspupille
- 50
- Strahlteiler
- 52, 52‘
- Teilstrahlenbündel
- 54, 54‘
- Lichtflecke
- O1
- optische Achse
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2006/127692 A2 [0002, 0004]
- DE 102006021317 B3 [0002, 0004]
- WO 2007/128434 A1 [0002]
- US 2009/0134342 A1 [0002]
- DE 102008024568 A1 [0002]
- WO 2008/091296 A2 [0002, 0004]
- WO 2009/085218 A1 [0009, 0009]
- US 7772569 B2 [0009, 0009]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- „Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)“, Nature Methods 3, 793–796 (2006), M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang [0002]
- „Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching“, Geisler C. et al, Appl. Phys. A, 88, 223–226 (2007) [0002]
- „Three-dimensional tracking of fluorescent nanoparticles with subnanometer precision by use of off-focus imaging“, Optics Letters, 2003, Vol. 28 (No. 2), Michael Speidel et al [0009]
- “Three-dimensional Particle Tracking via Bifocal Imaging”, Nano Letters, 2007, Vol. 7 (No. 7), Seiten 2043–2045, Erdal Toprak, et al [0009]
