DE102008024568A1

DE102008024568A1 - Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe

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Publication number: DE102008024568A1
Application number: DE102008024568A
Authority: DE
Inventors: Jonas FÖLLING; Christian Dr. Eggeling; Alexander Dr. Egner; Andreas Dr. Schönle; Mariano Dr. Bossi; Stefan W. Prof. Dr. Hell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2009-12-03

Abstract

Zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe (2) wird eine Substanz aus einer Gruppe von nicht schaltbaren Substanzen ausgewählt, die einen ersten fluoreszenten elektronischen Zustand und einen zweiten nicht oder anders fluoreszenten elektronischen Zustand aufweisen; die aus ihrem ersten Zustand mit Licht (3), das sie zur Fluoreszenz anregt, anteilig in ihren zweiten Zustand überführbar sind und die spontan und/oder durch Einwirkung des Lichts (3) aus ihrem zweiten Zustand in ihren ersten Zustand zurückkehren; wird die interessierende Struktur der Probe (2) mit der Substanz markiert; wird die Probe (2) auf ein Sensorarray (11) abgebildet, wobei eine räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung größer (also schlechter) ist als ein mittlerer Abstand zwischen nächst benachbarten Molekülen der Substanz in der Probe (2); wird die Probe (2) in einem Bereich, der größere Abmessungen als die räumliche Auflösungsgrenze aufweist, mit dem Licht (3) beaufschlagt, wobei wechselnde Anteile der Substanz mit dem Licht (3) zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht (7) angeregt und in ihren zweiten Zustand überführt werden und wobei mindestens 10% der jeweils in dem ersten Zustand befindlichen Moleküle der Substanz einen Abstand zu den ihnen nächst benachbarten Molekülen in dem ersten Zustand aufweisen, der größer als die räumliche Auflösungsgrenze ist; und wird das Fluoreszenzlicht (7), das aus dem Bereich von der Substanz spontan emittiert wird, in ...

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 17.
STAND DER TECHNIK
Aus der WO 2006/127692 A2 ist ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe bekannt, bei dem die interessierende Struktur mit phototransformierbaren optischen Markierungen markiert wird. Von den Markierungen wird jeweils eine Untergruppe in einen Zustand aktiviert, in dem sie zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind. Dabei umfasst die jeweilige Untergruppe so wenige der Markierungen, dass diese untereinander einen Abstand aufweisen, der größer als die räumliche Auflösungsgrenze beim Abbilden der Probe auf ein Sensorarray ist. Dadurch wird ermöglicht, nach Anregung der Markierungen der Untergruppe zur Fluoreszenz die Ursprungsorte des Fluoreszenzlichts mit einer besseren Auflösung als der Beugungsgrenze zu lokalisieren, die für die räumliche Auflösung bei der Abbildung der Probe auf das Sensorarray gilt, wodurch jeweils auch ein Punkt der markierten interessierenden Struktur mit dieser erhöhten Auflösung erfasst wird. Die phototransformierbaren optischen Markierungen sind in der WO 2006/127692 so definiert, dass sie durch ein aktivierendes Signal in den Zustand eingeschaltet werden können, in dem sie zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind. Dabei kann dieses aktivierende Signal identisch mit dem Anregungslicht sein, dass die Markierungen danach zur Fluoreszenz anregt.
Konkretere Ausführungsformen von phototransformierbaren optischen Markierungen, die in der WO 2006/127692 offenbart sind, umfassen ausschließlich photoaktivierbare fluoreszente Proteine, d. h. Moleküle, die erst nachdem sie mindestens ein Lichtquant absorbiert haben, zu einem Fluorophor werden oder anders gesagt zunächst eingeschaltet werden müssen, bevor sie fuoreszent sind. Dieser Aktivierungs- oder Schaltprozess geht mit einer Veränderung der molekularen Struktur der Moleküle (Umlagerung von Atomgruppen oder sogar Brechen oder Entstehung einer Bindung) einher. Das aus der WO 2006/127692 bekannte Verfahren wird auch als PALM (Photoactivated Localisation Microscopy) bezeichnet.
Bei einem ähnlichen, STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) genannten und von Rust et al. in Nature Methods, 3, 793–796 (2006) beschriebenen Verfahren werden ebenfalls in einen fluoreszenten Zustand schaltbare Moleküle verwendet, bei denen es sich jedoch nicht um Proteine sondern um photoschaltbare organische Fluorophore, konkret die Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5, handelt. Es ist von diesen Cyanin-Farbstoffen bekannt, dass sie zwischen verschiedenen Konformations-, konkret Isomer-Zuständen geschaltet werden können.
Aus C. Geisler et al.: Resolution of λ/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching, Appl. Phys. A 88, 223–226 (2007) ist ein als PALMIRA bezeichnetes Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 bekannt. Auch hier wird eine interessierende Struktur einer Probe mit einem schaltbaren fluoreszenten Protein markiert. Hierbei handelt es sich konkret um ein Protein namens rsFastLime, das durch Licht der Wellenlänge 488 nm nicht nur in seinem Ausgangszustand zu Fluoreszenz angeregt, sondern anteilig auch in einen nicht fluoreszenten Zustand ausgeschaltet und aus diesem teilweise wieder zurück in seinen fluoreszenten Zustand geschaltet wird. Der zugrunde liegende Mechanismus ist eine Konformationsänderung des Fluorophors. Diese Eigenschaften des schaltbaren fluoreszenten Proteins ermöglichen es, mit Licht nur einer einzigen Wellenlänge wechselnde Untergruppen von fluoreszenzfähigen Molekülen des Proteins einzustellen, in denen die fluoreszenzfähigen Moleküle untereinander einen größeren Abstand als die Beugungsgrenze haben, und die fluoreszenzfähigen Moleküle zur Fluoreszenz anzuregen. Dabei können fortlaufend, d. h. mit hoher Frequenz Bilder aufgenommen werden, die die wechselnden Untergruppen der fluoreszenten Moleküle erfassen und in denen die Position der jeweils erfassten Moleküle mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze bestimmbar ist.
Mit der Summe der Bilder wird die Struktur in der Probe mit einer die Beugungsgrenze unterschreitenden räumlichen Auflösung erfasst.
Die bei den voranstehend beschriebenen Verfahren verwendeten schaltbaren Fluoreszenzfarbstoffe sind erstmals bei einem als RESOLFT (Reversible Saturable OticaL Fluorescence Transition) bezeichneten und aus der DE 103 25 460 A bekannten Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit einer Substanz markierten Struktur einer Probe verwendet worden. Hier werden die schaltbaren Fluoreszenzfarbstoffe dahingehend erläutert, dass sie aus einer Gruppe von Substanzen ausgewählt sind, die mit einem optischen Umschaltsignal wiederholt aus einem ersten Zustand mit ersten optischen Eigenschaften in einen zweiten Zustand mit zweiten optischen Eigenschaften überführbar sind und die aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand zurückkehren können, wobei sich die beiden Zustände mindestens hinsichtlich eines der folgenden Kriterien unterscheiden: Konformationszustand eines Moleküls; Strukturformel eines Moleküls; räumliche Anordnung von Atomen innerhalb eines Moleküls; räumliche Anordnung von Bindungen innerhalb eines Moleküls; Anlagerung weiterer Atome oder Moleküle an ein Molekül; Gruppierung von Atomen und/oder Molekülen; räumliche Orientierung eines Moleküls; Orientierung benachbarter Moleküle zueinander und von einer Vielzahl von Molekülen und/oder Atomen ausgebildete Ordnung.
Die Auswahl an schaltbaren Proteinen und Fluorophoren, die für die voranstehend geschilderten Verfahren PALM, STORM, PALMIRA und RESOLFT verwendbar sind, ist verglichen mit der Gesamtzahl der grundsätzlich bekannten und verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe sehr klein. Farbstoffe, die sowohl schaltbar als auch (in einem der Schaltzustände) zur Fluoreszenz fähig sind, sind sehr selten. Sie werden daher in aufwendigen Verfahren synthetisiert und optimiert. Hinzu kommt, dass das Schalt- und das Fluoreszenzverhalten sehr stark von der chemischen Umgebung des Moleküls abhängen. Das gilt sowohl für schaltbare fluoreszente Proteine als auch für schaltbare organische Fluorophore. Dieser Mangel ist als grundsätzlich zu werten und hängt unter anderem damit zusammen, dass Fluoreszenz und Schalten des Moleküls zueinander konkurrierende molekulare Prozesse sind, die oftmals aus ein und demselben angeregten Zustand heraus in Konkurrenz zueinander stehen. Auch die Helligkeit der schaltbaren Fluoreszenzfarbstoffe in ihrem fluoreszenten Zustand, d h. die relative Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einem Molekül während wiederholter Anregung ist gegenüber einer Vielzahl nicht-schaltbarer organischer Fluorophore und nicht-schaltbarer fluoreszenter Proteine häufig nur klein. Die starken Beschränkungen durch schaltbare Proteine oder Fluorophore werden jedoch bislang hingenommen, um die durch die voranstehend angesprochenen Verfahren erreichbaren hohen räumlichen Auflösungen bei der Abbildung interessierender Strukturen zu realisieren.
Bei der sogenannten GSD (Ground State Depletion)-Mikroskopie (S. Bretschneider et al.: Breaking the dfiffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving, Phys. Rev. Lett. 98, 218103 (2007)) wird die Beugungsgrenze beim Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe dadurch unterschritten, dass der jeweilige Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des jeweiligen Messpunkts aus seinem elektronischen Grundzustand, aus dem heraus er mit Anregungslicht zur Fluoreszenz anregbar ist, in einen elektronischen Dunkelzustand überführt wird, in dem er nicht fluoreszenzfähig ist. Dies erfolgt vor der Anregung der verbleibenden Moleküle in dem Messpunkt zur Fluoreszenz mit Entvölkerungslicht derselben Wellenlänge wie das Anregungslicht. Typischerweise handelt es sich bei dem elektronischen Dunkelzustand um einen Triplettzustand, während der Grundzustand des Fluoreszenzfarbstoffs ein Singulettzustand ist. Typischerweise kehren die Moleküle thermisch, d. h. nicht (optisch) geschaltet, aus diesem Dunkelzustand in den elektronischen Grundzustand zurück, so dass nur Licht einer einzigen Wellenlänge, nämlich das Anregungslicht, zum Durchführen des Experiments notwendig ist.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein zur Umsetzung dieses Verfahrens geeignetes Fluoreszenzlichtmikroskop aufzuzeigen, mit denen die Auflösungsvorteile der als PALM, STORM oder PALMIRA bekannten Verfahren nutzbar sind, ohne deren Nachteile aufgrund der Beschränkung auf schaltbare Fluoreszenzfarbstoffe in Kauf nehmen zu müssen.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des neben geordneten Patentanspruchs 17 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens und des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren sind der erste und der zweite Zustand unterschiedliche elektronische Zustände der Substanz, d. h. Zustände der Substanz, die sich nur in elektronischer Hinsicht voneinander unterscheiden. Zu Beginn des Beaufschlagens der Probe mit dem Licht der einen Wellenlänge wird dessen Intensität so eingestellt, dass die Substanz aus ihrem fluoreszenten ersten Zustand in ihren zweiten nicht fluoreszenten oder zumindest unterscheidbar fluoreszenten Zustand überführt wird, bis mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% der in dem ersten Zustand verbleibenden Moleküle der Substanz den kritischen Abstand zu den ihnen nächst benachbarten Molekülen in dem ersten Zustand aufweisen, der größer als die räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung der Probe auf das Sensorarray ist. Dies ist in aller Regel damit gleichbedeutend, dass mehr als 90%, vorzugsweise mehr als 95%, noch mehr bevorzugt mehr als 98% und am meisten bevorzugt mehr als 99% der Moleküle der Substanz in den zweiten elektronischen Zustand überführt werden. Anschließend werden Bilder, in denen das Fluoreszenzlicht, das von der Substanz spontan emittiert wird, registriert wird, mit dem Sensorarray aufgenommen, während die Probe weiter mit dem Licht der einen Wellenlänge beaufschlagt wird. Dabei führt die bei Bedarf gegenüber der anfänglichen Intensität herabgesetzte Intensität des Lichts dazu, dass die sich jeweils noch in dem ersten Zustand befindenden Moleküle zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden, das in den Bildern registriert wird, und zu einem kleineren Teil in den nicht oder anders fluoreszenten zweiten Zustand überführt werden. Dieser kleinere Teil der Moleküle der Substanz ist idealer Weise genau so groß, wie ein Anteil der Moleküle der Substanz, die aus dem zweiten Zustand spontan oder unter Einwirkung desselben Lichts der einen Wellenlänge gleichzeitig in den ersten Zustand zurückkehren. Die fortlaufend mit der Beaufschlagung der Probe mit dem Licht der einen Wellenlänge aufgenommenen Bilder registrieren so immer Fluoreszenzlicht von soweit vereinzelten Molekülen der Substanz, dass deren Position in der Probe mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze bestimmt werden kann. Aus der Summe der auf diese Weise registrierten Einzelpositionen ist die interessierende Struktur in der Probe, die mit der Substanz markiert ist, ebenfalls mit einer räumlichen Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erfassbar.
Es ist nicht immer erforderlich, die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge für die Aufnahme der Bilder herabzusetzen, sondern nur dann, wenn die anfängliche Konzentration der Fluorophore sehr groß war. Bei mittleren und niedrigen Konzentrationen lässt sich die Intensität von vorn herein so einstellen, dass das Vereinzeln und das Registrieren der Moleküle mit demselben Wert der Intensität durchzuführen ist. Dies hängt damit zusammen, dass die Zahl der Photonen, die als Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff im ersten Zustand hintereinander bis zur Überführung in den zweiten Zustand emittiert werden (im selben Fluoreszenz-Burst), weitgehend unabhängig von der Intensität des verwendeten Lichts ist.
Es ist völlig überraschend, dass das erfindungsgemäße Verfahren, obwohl es im Wesentlichen denselben Ablauf wie das als PALMIRA bekannte Verfahren aufweist, ohne schaltbare Proteine oder Fluorophore auskommt. Vielmehr wird bei dem neuen Verfahren eine Substanz als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, die nicht unter die Definitionen der DE 103 25 460 A fällt und die irgendein herkömmlicher, nicht schaltbarer Fluoreszenzfarbstoff sein kann. Nahezu alle herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffe weisen neben ihrem elektronischen Grundzustand, aus dem heraus sie zur Fluoreszenz anregbar sind, einen elektronischen Dunkelzustand auf, in den sie aufgrund einer Anregung mit Licht derselben Wellenlänge, wie es zum Anregen der Fluoreszenz einsetzbar ist, mit einer relevanten Rate überführbar sind. In der Regel handelt es sich dabei um einen Singulettzustand als fluoreszenzfähigen Grundzustand und einen Triplettzustand als Dunkelzustand. Bei der normalen Fluoreszenzlichtmikroskopie ist das anteilige Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs statt in seinen angeregten Singulettzustand in seinen nicht fluoreszenten Triplettzustand – gerade bei höheren Intensitäten des Anregungslichts – als Nachteil bekannt, weil es die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einer Probe reduziert. Bei der vorliegenden Erfindung wird genau dieser Effekt ausgenutzt, weil die Position jedes einzelnen Moleküls der Substanz, mit der die interessierende Struktur in der Probe markiert ist, nur dann mit einer besseren Auflösung als der Beugungsgrenze erfasst werden kann, wenn das Fluoreszenzlicht von dem Molekül isoliert, d. h. getrennt von dem Fluoreszenzlicht benachbarter Moleküle registriert werden kann. Dazu dürfen sich jeweils nur wenige der Moleküle in dem ersten Zustand befinden.
Bei dem neuen Verfahren ist es vielfach vorteilhaft, Maßnahmen zu ergreifen, die die Lebensdauer des nicht fluoreszenten zweiten Zustands des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe verändern. Im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie geht es dabei jedoch häufig nicht um eine Verlängerung sondern eine Verkürzung der Lebensdauer des nicht fluoreszenten zweiten Zustands. Zu den Maßnahmen, die eine solche Verkürzung der Lebensdauer bewirken, zählen eine Abkühlung der Probe auf tiefe Temperaturen, bei denen thermische Anregungen zu stoßinduzierten Übergängen reduziert sind, ein Absenken der Konzentration an den Triplettzustand des Fluoreszenzfarbstoffs löschenden Sauerstoff in der Probe, zum Beispiel mit Sauerstoff bindender Glucose-Oxidase oder durch Messen in Vakuum, oder ein Fixieren oder Einbetten der Probe in Polymere, wie beispielsweise PVA. Die erhöhte Lebensdauer des nicht fluoreszenten zweiten Zustands erlaubt es auch mit geringeren Intensitäten des Lichts der einen Wellenlänge, große Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs in dem nicht fluoreszenten zweiten Zustands zu halten.
Die bekannte Gefahr des Photobleichens eines herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Triplettzustand stellt bei dem neuen Verfahren ebenfalls kein Problem dar. Es ist streng genommen ausreichend, wenn ein wesentlicher Anteil der Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs, nachdem sie in ihren zweiten nicht fluoreszenten oder anders fluoreszenten zweiten Zustand gepumpt wurden, einmal in ihren fluoreszenten ersten Zustand zurückkehren. Nach dieser Rückkehr werden die Moleküle einzeln registriert. ihr anschließendes Schicksal ist unerheblich. So können sie erneut in den Triplettzustand gelangen und daraus photogebleicht werden.
Ein teilweises Photobleichen des Fluoreszenzfarbstoffs kann bei dem neuen Verfahren sogar gezielt durchgeführt werden, bevor die verbleibenden ungebleichten Moleküle registriert werden. Das neue Verfahren ist in besonders vorteilhafter Weise durchführbar, wenn die Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs eine gewisse räumliche Dichte in der Probe nicht überschreiten, weil dann ein bestimmter in dem ersten Zustand verbleibender Prozentsatz der Moleküle ebenfalls eine gewisse räumliche Dichte nicht überschreitet, was wesentlich für die getrennte Registrierbarkeit der einzelnen Moleküle ist. Wenn die tatsächliche Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe die gewisse räumliche Dichte überschreitet, kann es umgekehrt schwierig werden, die Moleküle einzeln zu registrieren. Zur Beseitigung dieser Schwierigkeit kann der Überschuss an Fluoreszenzfarbstoff mittels einer hohen Intensität des Lichts der einen oder einer anderen Wellenlänge durch Photobleichen ausgeschaltet, das heißt in einen anhaltenden Dunkelzustand überführt werden, der sich von dem ersten Zustand und dem zweiten Zustand unterscheidet. Typischerweise unterscheidet sich der anhaltende Dunkelzustand, in dem der Fluoreszenzfarbstoff nicht mehr an den Schritten zum Aufnehmen der Bilder für das Registrieren der einzelnen Moleküle beteiligt ist, nicht nur elektronisch, sondern bspw. auch chemisch von dem ersten Zustand und dem zweiten Zustand, die für dieses Registrieren der einzelnen Moleküle erfindungsgemäß genutzt werden.
Das neue Verfahren wurde mit kommerziell erhältlichen und jedem Fachmann als nicht schaltbar bekannten Fluoreszenzfarbstoffen wie Rhodamin 6G erfolgreich durchgeführt. Seine Durchführung erforderte dabei gegenüber üblicher Fluoreszenzlichtmikroskopie unter Verwendung dieses Fluoreszenzfarbstoffs – abgesehen von abweichenden bevorzugten Details bei der Probenpräparation – ausschließlich eine Abstimmung der Intensität des Lichts der einen Wellenlänge mit der Frequenz, mit der die Bilder mit dem Sensorarray aufgenommen werden. Die hierfür notwendigen apparativen Voraussetzungen sind bei vielen Fluoreszenzlichtmikroskopen vorhanden. Hier muss nur die Steuerung der Intensität des Lichts der einen Wellenlänge gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden. Alternativ ändert man die Frequenz der Bildaufnahme des Sensorarrays oder einer das Sensorarray aufweisenden Kamera. Entsprechend ist das neue Fluoreszenzlichtmikroskop nur durch eine spezielle Ausbildung der Steuerung für die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge gekennzeichnet. Vorzugsweise ist dabei eine Online-Bildverarbeitung für die einzelnen mit dem Sensorarray aufgenommenen Bilder vorgesehen.
Diese Auswertung ist sinnvoll, um die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge auf einen solchen Wert einzustellen, der tatsächlich die Registrierung von Fluoreszenzlicht einzelner, räumlich voneinander getrennter Moleküle in den einzelnen Bildern erlaubt. Der eingestellte Wert der Intensität des Lichts der einen Wellenlänge kann ein konstanter Wert sein. Hierzu zählt auch eine sehr schnelle Pulsfolge mit einer viel höheren Frequenz als die Bildfrequenz der aufgenommenen Bilder. Die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge kann aber auch einen mit der Abfolge der Aufnahme der Bilder zeitlich modulierten Intensitätsverlauf aufweisen, um beispielsweise zwischen den einzelnen Bildern die Untergruppe der in dem ersten Zustand befindlichen Moleküle der Substanz gezielt einzustellen und während der Aufnahme der einzelnen Bilder primär die Moleküle der eingestellten Untergruppe zur Fluoreszenz anzuregen. Auch dabei kann das Licht der einen Wellenlänge sowohl kontinuierlich (mit dem zeitlich modulierten Intensitätsverlauf) oder in bei der Aufnahme der Bilder nicht aufgelösten Pulsen (ebenfalls mit dem zeitlich modulierten Intensitätsverlauf) auf den jeweils interessierenden Bereich gerichtet werden.
Die Online-Auswertung der einzelnen aufgenommenen Bilder kann dazu dienen, die nicht räumlich trennbaren fluoreszenten Moleküle der Substanz zu ermitteln, wonach die Intensität des Lichts so variiert werden kann, bis ein Dichtegrenzwert für derartige nicht trennbare fluoreszente Moleküle unterschritten ist. Auf diese Weise wird eine Obergrenze für die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge definiert. Eine Untergrenze kann dadurch definiert werden, dass die einzelnen aufgenommenen Bilder online bezüglich der maximalen Dichte ausgewertet werden, in der sie trennbare fluoreszente Moleküle der Substanz zeigen, und indem die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge variiert wird, bis ein Dichtegrenzwert für derartige trennbare fluoreszente Moleküle von unten erreicht ist. Während es einerseits wichtig ist, dass die Moleküle in dem fluoreszenten Zustand keine so hohe Konzentration aufweisen, dass sie nicht mehr getrennt voneinander registrierbar sind, sollte ihre Konzentration unterhalb dieser Grenze so hoch wie möglich sein, um mit jedem Bild möglichst viele Informationen über die interessierende Struktur zu erhalten.
Das anfängliche Beaufschlagen der Substanz mit dem Licht der einen Wellenlänge, das primär dazu dient, sie im wesentlichen in ihren zweiten Zustand zu überführen, kann auch dazu benutzt werden, mit dem Sensorarray eine Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der gesamten Substanz in der Probe aufzunehmen. Diese Intensitätsverteilung entspricht einer Konzentrationsverteilung der Substanz in der Probe mit der räumlichen Auflösung der Abbildung der Probe auf das Sensorarray.
Diese Konzentrationsverteilung der Substanz in der Probe stellt eine Übersicht über die Lage der mit der Substanz markierten interessierenden Struktur in der Probe bereit. Dies vereinfacht die weiteren Schritte des neuen Verfahrens, da diese so beispielsweise auf solche Bereiche der Probe konzentriert werden können, in denen sich überhaupt Teile der markierten Struktur befinden. Dies ist üblicherweise mit schaltbaren und vor allem mit aktivierbaren Fluorophoren nicht möglich, da diese sich anfangs zum größten Teil nicht im fluoreszierenden Zustand befinden, welches aufgrund des fehlenden Signals eine Übersicht nicht zulässt.
Abhängig von der Konzentrationsverteilung der Substanz in der Probe kann zudem die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge für den jeweils näher betrachteten Bereich eingestellt oder zumindest auf einen in etwa geeigneten Wert für die Feineinstellung voreingestellt werden. Weiterhin kann aufgrund der Konzentrationsverteilung der Substanz in der Probe ein lokales Abbruchkriterium für das Aufnehmen weiterer Bilder desselben Bereichs der Probe definiert werden. Der Informationsgehalt zusätzlicher Bilder eines Bereichs der Probe weist einen abnehmenden Informationsgehalt auf, wobei der Abfall des Informationsgehalts von der Konzentration der Substanz in dem jeweiligen Bereich abhängt. Wenn in einem Bereich nur sehr wenige Moleküle der Substanz sind, reichen relativ wenige Bilder aus, um die Position eines hohen Prozentsatzes der Moleküle zu erfassen. Weitere Bilder stellen nur hierzu redundante Informationen bereit. Anders verhält es sich bei einer sehr hohen Konzentration der Substanz in einem Bereich. Hier werden auch mit vielen Bildern nur kleinere Anteile der Substanz in der Probe erfasst, und jedes weitere Bild stellt neue Informationen zur Verfügung.
Konkret kann bei dem neuen Verfahren jede in den aufeinander folgenden Bildern registrierte Position eines Moleküls nicht nur in ein hoch aufgelöstes Gesamtbild der interessierenden Struktur in der Probe, sondern gefaltet mit der PSF (Point Spread Function) der Abbildung der Probe auf das Sensorarray auch in eine Rekonstruktion der anfänglich aufgenommenen Intensitätsverteilung eingetragen werden. Wenn sich diese Rekonstruktion bis zu einem bestimmten Maß an die anfänglich aufgenommene Intensitätsverteilung angenähert hat, sind mit den Positionen weiterer Moleküle aus weiteren Bildern keine nennenswerten weiteren Informationen über die interessierende Struktur zu erwarten. Bei der Faltung mit der PSF kann die Helligkeit des jeweiligen Moleküls als Wichtungsfaktor berücksichtigt werden. Als Maß der Annäherung der Rekonstruktion an die anfänglich aufgenommene Intensitätsverteilung können verschiedene Werte, wie beispielsweise eine Kreuzkorrelation, eine einfache Differenz oder quadratische Abweichung der normierten Intensitätsverteilungen oder Abweichungen zwischen den Raumfrequenzen (Fourier-Transformierten) der Intensitätsverteilungen, genommen werden.
Das neue Verfahren ist besonders gut geeignet, die interessierende Struktur der Probe mit der nicht schaltbaren Fluorophore zu markieren, indem eine biologische Probe gentechnisch so verändert wird, dass sie selbst die nicht schaltbaren Fluoreszenzfarbstoffe oder spezifische Bindungsplätze für die nicht schaltbaren Fluoreszenzfarbstoffe oder für daran gekoppelte Linker exprimiert. Besonders vorteilhaft wird auf diese Weise die interessierende Struktur in der Probe mit nicht schaltbaren organischen Farbstoffen über sogenannte small-Labels oder self-labeling Protein Tags wie FlAsh, Snap-tags oder Halo-tags markiert. Diese und ähnliche Konzepte sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt, siehe zum Beispiel http://www.promega.com/cnotes/cn011/cn011_02.htm oder http://www.covalys.com/ oder BioForum Europe 6, 51–59 (2005). Dadurch wird es möglich, Proteine in einer biologischen Probe mit weit verbreiteten, herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit hoher Auflösung abzubilden.
Bei dem Fluoreszenzfarbstoff, der bei dem neuen Verfahren zum Einsatz kommt, ist es nicht entscheidend, das sein zweiter elektronischer Zustand nicht fluoreszent, d. h. nicht fluoreszenzfähig und damit vollständig dunkel ist. Er kann auch anders fluoreszent als der erste elektronische Zustand sein. Wenn der Fluoreszenzfarbstoff dabei in dem zweiten Zustand durch dasselbe Licht zur Fluoreszenz angeregt wird wie in seinem ersten elektronischen Zustand, ist es wichtig, dass sich Fluoreszenzlicht, das von dem Fluoreszenzfarbstoff in dem ersten elektronischen Zustand emittiert wird, von dem Fluoreszenzlicht, das von dem Fluoreszenzfarbstoff in dem zweiten elektronischen Zustand emittiert wird, unterscheiden lässt.
Es versteht sich, dass das neue Verfahren mit verschiedenen Maßnahmen kombiniert werden kann, die dem Fachmann insbesondere auf dem Gebiet der als PALM, STORM oder PALMIRA bekannten Verfahren geläufig sind. Hierzu zählen insbesondere Maßnahmen zur dreidimensionalen Auflösung der registrierten Positionen der Moleküle in der Probe, d. h. zur räumlichen Auflösung dieser Positionen auch in z-Richtung. Zu diesen Maßnahmen gehören eine Mehrphotonenanregung des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem ersten Zustand sowohl zur Fluoreszenz als auch zum Überführen in seinen nicht fluoreszenten zweiten Zustand unter Fokussierung des anregenden Lichts der einen Wellenlänge auf die jeweils interessierende Ebene und eine Verwendung von zwei einander gegenüber liegenden Objektiven hoher numerischer Apertur in 4Pi-Konfiguration zum Beaufschlagen der Probe mit dem Licht der einen Wellenlänge und/oder zum Registrieren des Fluoreszenzlichts aus der Probe. Soweit dabei das Lichts jeweils nur in einen oder mehrere einzelne Punkte der Ebene fokussiert wird, ist die Ebene mit diesen Punkten in allen Schritten des Verfahrens, z. B. während der Aufnahme jedes einzelnen Bildes, abzuscannen. Die Fokussierung des Lichts der einen Wellenlänge in einzelne Punkte der Probe kann in vorteilhafter Weise mit einer konfokalen Registrierung des Fluoreszenzlichts aus der Probe kombiniert werden. Alternativ ist es möglich, die Probe orthogonal zur Richtung der Abbildung der Probe auf das Sensorarray mit dem Licht der einen Wellenlänge zu beaufschlagen, aus dem mittels einer Zylinderlinse ein Lichtschnitt geformt wird. Diese Vorgehensweise ist dem Fachmann als SPIM (Selective Plane IlluMination) bekannt.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt den Aufbau eines Fluoreszenzlichtmikroskops, das zur Durchführung des neuen Verfahrens geeignet ist.
2(A) zeigt ein mit dem neuen Verfahren aufgenommenes Gesamtbild von Mikrotubuli einer PtK2-Zelle als interessierender Struktur. Die Struktur ist mit dem Farbstoff Rhodamin 6G angefärbt. Das Medium, in dem sich die Zelle befindet, ist eine wässrige Pufferlösung mit Glucose-Oxidase und Catalase (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, Glucose Oxidase (Sigma, G2133), 40 μg/mL Catalase (Roche Applied Science, 106810), 10% (w/v) Glucose). Die Anzahl der für das Gesamtbild aufgenommenen Einzelbilder beträgt 61440 mit Belichtungszeiten von 5 ms. Die Lichtintensität lag konstant bei 50 kW/cm².
2(B) ist eine Rekonstruktion, die einer auflösungsbegrenzten Abbildung desselben Objekts wie in 1(A) entspricht. Die Rekonstruktion wurde durch die Summe der 61440 Einzelbilder erzeugt. Die kleine Abbildung unten rechts in (B) zeigt ein Profil an den markierten Stellen von 1(A) und (B), anhand dessen die Auflösungserhöhung des neuen Verfahrens gut ersichtlich ist.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Bei dem in 1 skizzierten Fluoreszenzlichtmikroskop 1 wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe 2 Licht 3 eine Wellenlänge (schwarze Linie) von einer geeigneten Lichtquelle 4 zur Verfügung gestellt und mittels der Linse 5 in ein Objektiv 6 fokussiert. Dass Licht 3 dient der großflächigen Beleuchtung des gesamten interessierenden Bereichs der Probe 2. Fluoreszenzlicht 7 (graue Linie) von Fluoreszenzfarbstoff in der Probe 2 wird ebenfalls von einem Objektiv, in diesem Falle demselben Objektiv 6, gesammelt und von dem Licht 3 mittels eines dichroitischen Spiegels 8 getrennt und, falls nötig, durch einen geeigneten Fluoreszenzlichtfilter 9 weiter aufgereinigt. Eine Linse 10 sorgt im Zusammenspiel mit dem Objektiv 5 für eine geeignete Abbildung der fluoreszenten Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs auf ein Sensorarray 11.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 laufen folgende Schritte ab:
Zunächst wird eine interessierende Struktur in einer Probe mit einem nicht schaltbaren Fluoreszenzfarbstoff gefärbt.
Danach wird die Probe in eine geeignete Umgebung eingebettet. Dies kann z. B. PVA sein, oder auch ein wässriges Medium (z. B. für lebende Zellen), dem Sauerstoff entzogen wird. Diese Maßnahme ist in der Regel nötig, da bei heutiger Technik und üblichen Fluoreszenzfarbstoffen die Lebensdauer des dunklen Triplettzustands in wässrigen Lösungen ohne Sauerstoffkonzentrationsreduktion nicht ausreichend lang ist, um Einzelmolekülereignisse trennen zu können. Die Sauerstoffreduktion kann z. B. durch Hinzugeben von Glucose-Oxidase und Catalase geschehen. Derartige wässrige Puffer sind allgemein bekannte Medien für die Mikroskopie. Ein Medium, das im Prinzip auch für Lebendzellanwendungen geeignet ist, ist: 88% (v/v) Gibco-DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) mit 10 mM HEPES, 10% (v/v) Glucose-Oxidase (5 mg/ml, Sigma, G2133), 2% (v/v) Catalase (2 mg/ml, Roche Applied Science, 106810)
Vor Beginn der eigentlichen Messung muss u. U., wenn die Markierungsdichte, d. h. die räumliche Dichte des Fluoreszenzfarbstoffs, zu hoch ist, ein ausreichender Anteil der Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs durch geeignetes Bestrahlen der Probe mit dem Licht irreversibel gebleicht werden. Auf jeden Fall muss vor Beginn der Messung durch Einstrahlen des Lichts ein ausreichend großer Anteil der Moleküle aus deren ersten, fluoreszenten in deren zweiten, dunklen Zustand gepumpt werden, so dass die Abbildungen der wenigen, im fluoreszenten Zustand verbleibenden Moleküle auf dem Sensorarray weiter als die Auflösungsgrenze auf ein Sensorarray voneinander entfernt sind. Typische Intensitäten liegen zwischen 1 und 100 kW/cm², je nach Umgebung und Fluoreszenzfarbstoff. Die Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts, die zu Beginn des Einstrahlens des Lichts mit dem Sensorarray aufgenommen werden kann, zeigt das auflösungsbegrenzte Bild der interessierenden Struktur. Dieses kann später als Referenz für ein Abbruchkriterium dienen. In der Praxis muss für die Aufnahme des auflösungsbegrenzten Bilds der interessierenden Struktur unter Umständen die Belichtungszeit einer das Sensorarray aufweisenden Kamera oder die Verstärkung derselben anpasst oder ein Intensitätsfilter einsetzt werden, da die Kamera zur Detektion von Einzelmolekülsignalen optimiert sein wird. Alternativ kann auch vor dem Lichtsignal, das zur Überführung der Mehrzahl der Moleküle in den dunklen Zustand dient, ein Lichtsignal geringer Intensität zur Aufnahme eines beugungsbegrenzten Referenzbildes eingestrahlt werden.
Sowie ein ausreichender Anteil der Moleküle in den dunklen Zustand gepumpt wurde, kann die eigentliche Messung übergangslos gestartet werden, auf jeden Fall jedoch muss dies in einem Zeitraum geschehen, der viel kleiner ist als die Lebensdauer des dunklen Zustands. Die Belichtungszeit der Einzelbilder richtet sich dabei nach der mittleren Dauer, über die ein Molekül, das sich im ersten, leuchtenden Zustand befindet, Fluoreszenzlicht emittiert, bevor es wieder in den zweiten, dunklen Zustand übergeht. Bei den verwendeten Beispielen führt dies zu einer typischen Belichtungszeit von 2 bis 10 ms. In dieser Zeit wird im Mittel eine Größenordnung von 1000 Photonen pro Molekül auf dem Detektor aufgefangen, bevor es wieder in den dunklen Zustand übergeht.
Während der Messung kann, nachdem Moleküle durch irreversibles Bleichen verloren gegangen sind, die Intensität des Lichts reduziert werden, um eine optimale Dichte der Moleküle zu erreichen, die sich im ersten Zustand befinden.
Die Dauer der gesamten Messung richtet sich nach der Anzahl der Einzelbilder und deren Belichtungszeit. Die nötige Anzahl der Einzelbilder richtet sich nach dem gewählten Abbruchkriterium. Bei komplexeren Strukturen werden typischerweise bis zu 100.000 Einzelbilder aufgenommen. Damit liegt die Gesamtaufnahmezeit in der Größenordnung von Minuten.

1: Lichtmikroskop
2: Probe
3: Licht
4: Lichtquelle
5: Linse
6: Mikroskopobjektiv
7: Fluoreszenzlicht
8: dichroitischer Spiegel
9: Fluoreszenzlichtfilter
10: Linse
11: Sensorarray
12: Spiegel

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2006/127692 A2 [0002]
- WO 2006/127692 [0002, 0003, 0003]
- DE 10325460 A [0007, 0014]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Rust et al. in Nature Methods, 3, 793–796 (2006) [0004]
- C. Geisler et al.: Resolution of λ/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching, Appl. Phys. A 88, 223–226 (2007) [0005]
- S. Bretschneider et al.: Breaking the dfiffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving, Phys. Rev. Lett. 98, 218103 (2007) [0009]
- http://www.promega.com/cnotes/cn011/cn011_02.htm [0025]
- http://www.covalys.com/ [0025]
- BioForum Europe 6, 51–59 (2005) [0025]

Claims

Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe, mit den Schritten: – Auswählen einer Substanz aus einer Gruppe von Substanzen, – die einen ersten Zustand mit ersten Fluoreszenzeigenschaften und einen zweiten Zustand mit zweiten Fluoreszenzeigenschaften aufweisen; – die in ihrem ersten Zustand mit Licht einer Wellenlänge zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind; – die aus ihrem ersten Zustand mit dem Licht der einen Wellenlänge in ihren zweiten Zustand überführbar sind und – die spontan und/oder durch Einwirkung des Lichts der einen Wellenlänge aus ihrem zweiten Zustand in ihren ersten Zustand zurückkehren können; – Markieren der interessierenden Struktur der Probe mit der Substanz; – Abbilden der Probe auf ein Sensorarray, wobei eine räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung größer (also schlechter) ist als ein mittlerer Abstand zwischen nächst benachbarten Molekülen der Substanz in der Probe; – Beaufschlagen der Probe in einem Bereich, der größere Abmessungen als die räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung der Probe auf das Sensorarray aufweist, mit dem Licht der einen Wellenlänge, wobei wechselnde Anteile der Substanz mit dem Licht der einen Wellenlänge zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht angeregt und in ihren zweiten Zustand überführt werden und wobei mindestens 10% der jeweils in dem ersten Zustand befindlichen Moleküle der Substanz einen Abstand zu den ihnen nächst benachbarten Molekülen in dem ersten Zustand aufweisen, der größer als die räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung der Probe auf das Sensorarray ist; und – Registrieren des Fluoreszenzlichts, das aus dem Bereich von der Substanz spontan emittiert wird, in mehreren während des anhaltenden Beaufschlagens der Probe dem Licht der einen Wellenlänge mit dem Sensorarray aufgenommenen Bildern; dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zustand und der zweite Zustand unterschiedliche elektronische Zustände der Substanz sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn des Beaufschlagens der Probe (2) mit dem Licht (3) der einen Wellenlänge dessen Intensität so groß eingestellt wird, dass die Substanz in ihren zweiten Zustand überführt wird, bis mehr als 90%, vorzugsweise mehr als 95%, noch mehr bevorzugt mehr als 98% und am meisten bevorzugt mehr als 99% der Moleküle der Substanz in den zweiten elektronischen Zustand überführt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz nicht schaltbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zustand ein Singulettzustand und der zweite Zustand ein Triplettzustand ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Maßnahme ergriffen wird, die die Lebensdauer des zweiten Zustands des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe (2) verändert, insbesondere verlängert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anteil der Substanz vor dem Aufnehmen der Bilder mittels einer hohen Intensität des Lichts (3) der einen oder einen anderen Wellenlänge durch Photobleichen in einen anhaltenden Dunkelzustand überführt wird, der sich von dem ersten Zustand und dem zweiten Zustand unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Lichts (3) der einen Wellenlänge während der Aufnahme der Bilder auf einen konstanten Wert eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Lichts (3) der einen Wellenlänge während der Aufnahme der Bilder auf einen mit der Abfolge der Aufnahme der Bilder zeitlich modulierten Intensitätsverlauf eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (3) der einen Wellenlänge kontinuierlich oder in schnellen, bei der Aufnahme der Bilder nicht aufgelösten Pulsen auf den Bereich gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen aufgenommenen Bilder online dahingehend ausgewertet werden, ob sie nicht trennbare fluoreszente Moleküle der Substanz zeigen, und dass die Intensität des Lichts (3) variiert wird, bis ein Dichtegrenzwert für derartige nicht trennbare fluoreszente Moleküle unterschritten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen aufgenommenen Bilder online bezüglich der maximalen Dichte ausgewertet werden, in der sie trennbare fluoreszente Moleküle der Substanz zeigen, und dass die Intensität des Lichts (3) variiert wird, bis ein Dichtegrenzwert für derartige trennbare fluoreszente Moleküle erreicht ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn des Beaufschlagens der Probe (2) mit dem Licht (3) der einen Wellenlänge mit dem Sensorarray eine Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der gesamten Substanz in der Probe (2) mit der räumlichen Auflösung der Abbildung der Probe (2) auf das Sensorarray aufgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Abbruchkriterium für das Aufnehmen weiterer Bilder desselben Bereichs der Probe (2) basierend auf der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der gesamten Substanz in der Probe (2) definiert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass jede in den aufeinander folgenden Bildern registrierte Position eines Moleküls der Substanz gefaltet mit der PSF (Point Spread Function) der Abbildung der Probe (2) auf das Sensorarray (11) in eine Rekonstruktion der anfänglich aufgenommenen Intensitätsverteilung eingetragen wird und dass diese Rekonstruktion mit der anfänglich aufgenommenen Intensitätsverteilung verglichen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die interessierende Struktur der Probe (2) mit der Substanz markiert wird, indem eine biologische Probe (2) gentechnisch so verändert wird, dass sie selbst die Substanz exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die interessierende Struktur der Probe (2) mit der Substanz markiert wird, indem eine biologische Probe (2) gentechnisch so verändert wird, dass sie Proteine mit spezifischen Bindungsplätzen für die Substanz oder einen daran gekoppelten Linker exprimiert.
Fluoreszenzlichtmikroskop mit einem Sensorarray zum Registrieren von Fluoreszenzlicht von einer Probe in aufeinander folgenden Bildern, mit einer Abbildungsoptik zum Abbilden der Probe auf das Sensorarray, wobei ein Rastermaß von Pixeln des Sensorarrays kleiner als die räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung der Probe auf das Sensorarray mal dem Abbildungsfaktor der Abbildung ist, mit einer Lichtquelle zum Beaufschlagen der Probe mit Licht einer Wellenlänge in einem Bereich, der größere Abmessungen als die räumliche Auflösungsgrenze der Abbildung der Probe auf das Sensorarray aufweist, und mit einer Steuerung für die Intensität des Lichts der einen Wellenlänge, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung die Intensität des Lichts (3) der einen Wellenlänge gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 steuert.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung eine Onlinebildverarbeitung für die einzelnen mit dem Sensorarray (11) aufgenommenen Bilder aufweist.