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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden
einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur mit den Merkmalen
des unabhängigen
Patentanspruchs 1 so wie auf eine Vorrichtung zum räumlich hoch
aufgelösten
Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur
mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 15.
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Bei
einem derartigen Verfahren und einer derartigen Vorrichtung geht
es darum, eine räumliche Konzentrationsverteilung
des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestimmen. Diese räumliche Konzentrationsverteilung
kann ein Bild der Struktur in unterschiedlichen lokalen Helligkeitsstufen
sein, wobei die lokale Helligkeit der lokalen Konzentration des
Fluoreszenzfarbstoffs entspricht. Die Konzentrationsverteilung über die
Struktur kann aber auch qualitativ, d.h. in absoluten Konzentrationen
oder relativen Konzentrationseinheiten bestimmt werden.
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STAND DER TECHNIK
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Es
sind Fluoreszenzmikroskope bekannt, bei denen ein Fluoreszenzfarbstoff
in einer Probe mit gepulstem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht
angeregt wird, indem er aus einem Grundzustand in einen angeregten
fluoreszierenden Zustand überführt wird.
Dabei kann das gepulste Anregungslicht verwendet werden, um den
Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs, indem er zunächst in
einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wurde, mit Abregungslicht
wieder zurück
in den Grundzustand überführen zu
können,
so dass das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht
anschließend
nur aus dem verbliebenen Bereich stammen kann, in dem der Fluoreszenzfarbstoff
nicht abgeregt wurde. Auf diese Weise wird die räumliche Auflösung bei
der Registrierung des spontan emittierten Fluoreszenzlichts erhöht, wobei
eine Unterschreitung der Berechnungsgrenze möglich ist. Diese Vorgehensweise
ist als SIED(Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzmikroskopie
aus S.W. Hell, J. Wichmann: Opt. Lett. 19, 11 (1994) 780-782 bekannt.
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Eine
weitere Möglichkeit
der Erhöhung
der räumlichen
Auflösung
bei der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, den Fluoreszenzfarbstoff
in einem Teilbereich des Bereichs, in dem er anschließend zur Emission
von Fluoreszenzlicht angeregt wird, zuvor mit Überführungslicht in einen Dunkelzustand,
beispielsweise in einen nicht fluoreszierenden Tripletzustand zu überführen. Auch
dann kann das in Folge der Anregung registrierte Fluoreszenzlicht
nur aus dem verbliebenen Bereich stammen, in dem sich der Fluoreszenzfarbstoff
nicht in dem Tripletzustand befindet. Diese Vorgehensweise ist als
GSD(Ground State Depletion)-Fluoreszenzmikroskopie
aus S.W. Hell, M. Kroug: Appl. Phys. B 60, 5(1995)495-7 bekannt.
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Beim
wiederholten Anregen eines Fluoreszenzfarbstoffs mit Anregungslicht
zur Emission von Fluoreszenzlicht tritt häufig eine über die Wiederholungen der
Anregung stetig größer werdende
Abnahme bei der Ausbeute an Fluoreszenzlicht auf. Diese Abnahme
ist zum Teil reversibel, d.h. sie geht nach gewisser Zeit wieder
zurück
und ist somit nicht auf ein vollständiges Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs
zurückzuführen. Aber
auch das vollständige Ausbleichen
eines Fluoreszenzfarbstoffs tritt bei höherer Frequenz seiner Anregung
schon nach einer geringeren Gesamtausbeute an Fluoreszenzlicht auf, als
wenn seine Anregung mit niedrigerer Frequenz erfolgt. Umgekehrt
ist eine häufige
Wiederholung der Anregung notwendig, um über einen begrenzten Messzeitraum, über den
beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop stabil gehalten werden kann,
genügend
Fluoreszenzlicht zu registrieren, um hierüber beispielsweise die mit
dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur erkennen zu können. Es
muss in der Regel ein Kompromiss eingegangen werden, bei dem die
Wiederholung des Anregens des Fluoreszenzfarbstoffs mit Anregungslicht
zur Emission von Fluoreszenzlicht gerade so langsam erfolgt, dass
von Wiederholung zu Wiederholung die Ausbeute an Fluoreszenzlicht
nicht allzu sehr zurückgeht,
während die
Wiederholungen gleichzeitig so schnell erfolgen, dass in einem begrenzten
Messzeitraum möglichst viel
Fluoreszenzlicht registriert wird. Dabei wird eine Abnahme des Verhältnisses
zwischen der Ausbeute an Fluoreszenzlicht und der vorliegenden Konzentration
an Fluoreszenzfarbstoff über
die Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs hinweg in
Kauf genommen.
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Ein
Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs
1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs
11 sind aus Zhengxi Huang, et al.: Colloids and Surfaces A: Physiochem.
Eng. Aspects 257-258, 203 (2005) bekann. Hier wird über Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
an einem Fluoreszenzfarbstoff berichtet, bei der eine Ausbeute an
Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff durch eine erhöhte Wiederholungsrate der
Anregung und/oder eine hohe Intensität der Anregung erhöht ansteigt.
Dies wird darauf zurückgeführt, dass
unter den genannten Bedingungen die Wahrscheinlichkeit erhöht ist,
dass der Fluoreszenzfarbstoff aus seinem nicht fluoreszierenden
Tripletzustand in seinen fluoreszenzfähigen Singuletzustand zurückkehrt.
Im Zusammenhang mit dieser Erklärung wird
darauf verwiesen, dass es grundsätzlich
bekannt ist, dass Fluoreszenzfarbstoff mit einem optischen Signal
einer anderen Wellenlänge
als derjenigen, die zu ihrer Anregung benötigt wird, aus ihrem Tripletzustand
in ihren Singuletzustand zurückgebracht
werden können.
In der Veröffentlichung
wird auch berichtet, dass die Vorgehensweise mit erhöhter Widerholungsrate
und/oder erhöhter
Intensität
zu einem schnelleren Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs führt. Ein
räumlich
hochaufgelöstes
Abbilden wird nur insoweit beschrieben, als dass bei dem bekannten
Verfahren zum Erfassen des Fluoreszenzlichts von den einzelnen Molekülen des
Fluoreszenzfarbstoffs ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop eingesetzt
wird. Damit wird nur die Verteilung der einzelnen Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs
wiedergegeben, es liegt aber zumindest keine mit dem Fluoreszenzfarbstoff
aktiv markierte Struktur vor.
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AUFGABE DER ERFINDUNG
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum räumlich hoch
aufgelösten
Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur
aufzuzeigen, bei denen trotz einer in kurzer Zeit erreichten hohen
Ausbeute an Fluoreszenzlicht eine Proportionalität zwischen dem registrierten
Fluoreszenzlicht und der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs
auch über viele
Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs nicht verloren
geht.
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LÖSUNG
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs
1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs
15 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
des neuen Verfahrens und der neuen Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen beschrieben.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei
dem neuen Verfahren zum räumlich
hoch aufgelösten
Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur
wird der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich, in dem er wiederholt
mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird,
vor einer Wiederholung seiner Anregung mit einem optischen Signal
beaufschlagt. Dieses optische Signal weist eine andere Wellenlänge als
das Anregungslicht auf und stabilisiert in dem Bereich ein Verhältnis einer
Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs
bei der sich anschließenden
Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs. Die Stabilisierung erfolgt dabei
auf einem Wert, der gegenüber
einem ohne das optische Signal abfallenden Wert erhöht ist.
Bei dem neuen Verfahren wird also neben dem Anregungslicht ein weiteres optisches
Signal auf die mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur gerichtet,
das weder den Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand in den angeregten
fluoreszierenden Zustand überführt oder noch
dazu vorgesehen ist, ihn aus seinem angeregten fluoreszierenden
Zustand zurück
in seinen Grundzustand zu versetzen, sondern das den Fluoreszenzfarbstoff
bezüglich
seiner in Folge seiner häufig
wiederholten Anregung mit dem Anregungslicht reduzierten Fähigkeit
zur Emission von Fluoreszenzlicht regeneriert. Dabei ist die Regeneration
des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal in einem ganz
erheblichen Umfang möglich,
so dass zumindest die Größenordnung
der Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff auch
bei sehr schnell wiederholter Anregung mit Anregungslicht zur Emission
von Fluoreszenzlicht nicht verloren geht. In der Regel stabilisiert
sich die auf die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs bezogene
Ausbeute an Fluoreszenzlicht binnen weniger Wiederholungen der Anregungen
des Fluoreszenzfarbstoffs auf den bereits angesprochenen Wert, der
gegenüber dem
ohne das optische Signal immer weiter abfallenden Wert selbst zu
Beginn der Wiederholungen schon deutlich erhöht ist.
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Besondere
Vorteile weist das neue Verfahren dadurch auf, dass die Struktur
während
des wiederholten Anregens mit dem Anregungslicht auf einer reduzierten
Temperatur von weniger als 0 °C,
vorzugsweise weniger als –20 °C, gehalten
wird. Die grundsätzlichen
Vorteile von Fluoreszenzmikroskopie bei tiefen Temperaturen, die
ebenfalls die Reduzierung der Gefahr des Ausbleichens aufgrund von Anregungslicht
und damit die Erhöhung
der Ausbeute von Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff betreffen,
sind aus der
EP 1 582
858 A1 bekannt. Es stellt sich jedoch heraus, dass bei
reduzierten Temperaturen die temporäre Reduktion der Ausbeute an
Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff bei dessen hochfrequent
wiederholten Anregung drastisch ansteigt. Dies scheint darauf zurückzuführen zu
sein, dass bei jeder Anregung mit Anregungslicht ein Teil des Fluoreszenzfarbstoffs
in einen Dunkelzustand gelangt, aus dem er bei reduzierten Temperaturen
aufgrund fehlender thermischer Anregung rückführender Übergänge noch langsamer in seinen
fluoreszenzfähigen
Zustand zurückkehrt.
Mit dem optischen Signal wird diese oder eine andere Rückkehrwahrscheinlichkeit
des Fluoreszenzfarbstoffs in seinen fluoreszenzfähigen Zustand und damit seine
erneute Anregbarkeit zur Emission von Fluoreszenzlicht deutlich
erhöht.
Die mit Fluoreszenzmikroskopie bei tiefen Temperaturen verbundenen Nachteile
werden damit durch das neue Verfahren beseitigt, so dass ihre Vorteile
erstmals voll nutzbar werden.
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Das
optische Signal, das zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs
verwendet werden kann, weist in der Regel eine größere Wellenlänge als
das Anregungslicht auf. Damit ist es eindeutig nicht zur Anregung
des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Grundzustand in seinen angeregten
fluoreszierenden Zustand in der Lage. Konkret kann das optische Signal
bei Anregungslicht in einem Wellenlängenbereich von 440 bis 532
nm in einem Wellenlängenbereich
von 600 bis 800 oder auch bis 900 nm liegen. Bei langwelligerem
Anregungslicht von bis zu 650 nm verschiebt sich die untere Grenze
des Wellenlängenbereichs
des optischen Signals nach oben. Es ist weiter darauf zu achten,
dass es durch das optische Signal auch zu keiner nennenswerten unerwünschten
Mehrphotonenanregung von Fluoreszenzlicht kommt. Das optische Signal
weist darüber
hinaus typischerweise eine um so viel größere Wellenlänge oder
geringere Intensität
als das Anregungslicht auf, dass es auch zur Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs
durch stimulierte Emission nicht in der Lage ist. Dies ist dann
von besonderer Bedeutung, wenn es zur zeitlichen Überlappung
des Anregungslichts und des optischen Signals kommt. Die obere Grenze
der Wellenlänge
für das
optische Signal, bei deren Überschreiten
kein nutzbarer Effekt mehr auftritt, wird mit der Größenordnung
der thermischen Anregung (3·kB·T) erreicht.
Bei Raumtemperatur beträgt
dieser Wert etwa 150 µm.
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Eine
solche zeitliche Überschneidung
kann sich beispielsweise dann einstellen, wenn der Fluoreszenzfarbstoff
in dem Bereich mit dem optischen Signal über mehrere Wiederholungen
seiner Anregung hinweg kontinuierlich beaufschlagt wird, d.h. also
beispielsweise mit einer kontinuierlichen Laserstrahlung, während das
Anregungslicht von einem Pulslaser stammt. Angesichts der Tatsachen,
dass das optische Signal die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs
mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht nicht stört und dass
aufgrund der unterschiedlichen Wellenlängen auch eine Trennung des
Fluoreszenzlichts von dem optischen Signal problemlos ist, ist diese
vollständige
zeitliche Überlappung
des optischen Signals mit dem Anregungslicht und auch mit dem Zeitraum,
in dem der Fluoreszenzfarbstoff das Fluoreszenzlicht emittiert,
unbedenklich. Sie lässt
vielmehr den Einsatz kostengünstiger Signalquellen
für das
optische Signal zu.
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Ein
Raum, über
den das optische Signal hinweg auf die Probe aufgebracht wird, kann
zudem größer sein
als der Bereich, aus dem anschließend Fluoreszenzlicht registriert
wird. Zumindest sollte das optische Signal den gesamten Raum abdecken,
in dem der Fluoreszenzfarbstoff mit dem Anregungslicht beaufschlagt
wird, unabhängig
davon, aus welchem Bereich hiervon das Fluoreszenzlicht registriert wird.
Hintergrund ist, dass das optische Signal nicht nur in Bezug auf
die kurzzeitig abfallende Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff
regenerierend auf den Fluoreszenzfarbstoff wirkt, sondern auch das
Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs erheblich verzögert, d.h.
die Gesamtausbeute des Fluoreszenzlichts von dem Fluoreszenzfarbstoff deutlich
erhöht.
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Ein
Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, auf dem die Anwendung des neuen
Verfahrens ebenfalls mit besonders großen Vorteilen verbunden ist,
ist die STED-Fluoreszenzmikroskopie, bei der vor dem Registrieren
des Fluoreszenzlichts der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich
des Bereichs, aus dem das Fluoreszenzlicht grundsätzlich registriert
wird, mit Abregungslicht aus dem angeregten Zustand zurück in den
Grundzustand abgeregt wird. Bei dieser Anwendung des neuen Verfahrens
kann die Wellenlänge
des optischen Signals, das zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs
verwendet wird, auch größer als
die Wellenlänge
des Abregungslichts sein. Das optische Signal stört dann nicht die selektive
Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs in den Teilbereichen des Bereichs,
aus dem das Fluoreszenzlicht registriert wird, um die räumliche
Auflösung
beim Registrieren des Fluoreszenzlichts zu erhöhen. Es ist aber auch möglich, Licht
mit der Wellenlänge
des Abregungslichts als das optische Signal zu verwenden, soweit
dieses die erfindungsgemäße Regenerierungsfunktion
erfüllt,
was auch bei üblichen
Wellenlängen
des Abregungslichts bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie praktisch
der Fall sein kann. Das optische Signal unterscheidet sich aber
auch in diesem Fall von dem Abregungslicht und zwar durch eine andere
räumliche
und vorzugsweise auch eine andere zeitliche Verteilung. So deckt
das optische Signal gerade den Rest des Bereichs ab, der von dem Teilbereich
des Abregungslichts ausgelassen wird, und dies erfolgt vorzugsweise
vor der Anregung des Fluoreszenzlichts anstatt in dem Zeitraum von
der Anregung bis zu der spontanen Emission des Fluoreszenzlichts,
in dem das Abregungslicht aufgebracht wird.
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Konkret
kann Licht, das von einer gemeinsamen Lichtquelle für das optische
Signal und das Abregungslicht kommt, welche mit derselben Frequenz gepulst
wird, wie eine Anregungslichtquelle für das Anregungslicht, auf zwei
optische Pfade unterschiedlicher Länge aufgeteilt werden. Der
eine optische Pfad richtet das optische Signal mit breiter räumlicher Verteilung
und vergleichsweise geringer Intensität vor dem (bis während des)
Anregungslicht(s) auf die Struktur, um den Fluoreszenzfarbstoff
zu regenerieren; und der andere optische Pfad richtet das Abregungslicht
(während
des bis) nach dem Anregungslicht(s) mit hoher Intensität in einen
Teilbereich des beobachteten Bereichs, um dort den angeregten Fluoreszenzfarbstoff
durch stimulierte Emission wieder abzuregen.
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Bei
der STED-Fluoreszenzmikroskopie ist die Anwendung des neuen Verfahrens
deshalb mit besonderen Vorteilen verbunden, weil der Fluoreszenzfarbstoff
bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie in den Teilbereichen, in denen
er mit dem Abregungslicht aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand
abgeregt wird, sowohl durch das Anregungslicht als auch das Abregungslicht
beansprucht wird, ohne dass er, wenn er nicht gerade in den nicht
abgeregten verbleibenden Rest des Bereichs fällt, Fluoreszenzlicht emittiert,
das registriert wird. D.h., der Fluoreszenzfarbstoff wird möglicherweise
vielfach angeregt und abgeregt, bis er beim Abscannen der jeweiligen
Probe in den verbleibenden Bereich fällt, aus dem verbleibendes
spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert wird. Ohne die Regeneration
des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal nach dem neuen
Verfahren kann dann der Fluoreszenzfarbstoff bereits erheblich bezüglich der
Ausbeute an Fluoreszenzlicht geschwächt oder gar vollständig ausgebleicht
sein. Konkret verbessert die Anwendung des neuen Verfahrens bei
der STED-Fluoreszenzmikroskopie in ganz erheblichem Maße das Signalverhältnis zwischen
dem Restfluoreszenzlicht, das aus dem mit dem Abregungslicht beaufschlagten
Teilbereich des jeweils beobachteten Bereichs spontan emittiert
wird, und dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden
Rest des Bereichs, der nicht mit Abregungslicht beaufschlagt wird.
Dieser vorteilhafte Effekt ist auch darauf zurückzuführen, dass das optische Signal
die Abregungseffizienz des Abregungslichts verbessert, indem es
durch die Regeneration des Fluoreszenzfarbstoffs verhindert, dass
das Abregungslicht diese Regeneration bewirkt und dadurch verbraucht
wird, so dass es nicht mehr für
die Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs zur Verfügung steht.
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Ein
weiteres Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, auf dem die Anwendung
des neuen Verfahrens mit besonders großen Vorteilen verbunden ist, ist
die GSD-Fluoreszenzmikroskopie, bei der vor dem Anregen des Fluoreszenzlichts
der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs mit Überführungslicht
in einen Dunkelzustand überführt wird,
aus dem heraus er nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar
ist. Das erfindungsgemäße optische Signal
bringt den Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Dunkelzustand definiert
in seinen Grundzustand zurück,
so dass beispielsweise eine Scanngeschwindigkeit beim Abscannen
einer Probe nicht von einer spontanen Rückkehrrate abhängig ist,
mit der der Fluoreszenzfarbstoff in der Umgebung des jeweils letzten
Messpunkts aus seinem Dunkelzustand in seinen fluoreszenzfähigen Grundzustand
zurückkehrt.
Diese Rückkehrrate
kann insbesondere bei tiefen Temperaturen sehr klein sein. Bei der
erfindungsgemäßen GSD-Fluoreszenzmikroskopie
ist die Wellenlänge
des optischen Signals in aller Regel größer als die Wellenlänge des Überführungslichts
ist. Auch bei der Anwendung des neuen Verfahrens bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie
kommt es zu einer erheblichen Verbesserung, d.h. Verkleinerung des
Signalverhältnisses
zwischen dem Restfluoreszenzlicht, das aus dem mit dem Überführungs licht
beaufschlagten Teilbereich des jeweils beobachteten Bereichs spontan
emittiert wird, und dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht aus
dem interessierenden Rest des beobachteten Bereichs, der nicht mit Überführungslicht
beaufschlagt wird.
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Wie
in der Fluoreszenzmikroskopie üblich, kann
das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht
auch bei dem neuen Verfahren aufgrund seiner Wellenlänge abgetrennt
werden. Die zusätzliche
Abtrennung des zum Regenerieren des Fluoreszenzfarbstoffs verwendeten
optischen Signals ist aufgrund seiner im Vergleich zu allen anderen
auftretenden Wellenlängen
typischerweise deutlich größeren Wellenlänge problemlos möglich.
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Es
ist denkbar, dass das optische Signal bei dem neuen Verfahren nicht
nur dann, wenn es bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie angewandt wird,
im Wesentlichen dadurch wirkt, dass es den Fluoreszenzfarbstoff
aus einem Tripletzustand zurück
in einen Singuletzustand überführt, wobei
der Grundzustand des Fluoreszenzfarbstoffs ein Singuletgrundzustand
und der angeregte Zustand ein angeregter Singuletzustand ist.
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Konkret
kann die Wirkungsweise des neuen Verfahrens darin zu sehen sein,
dass das optische Signal den Fluoreszenzfarbstoff aus einem unteren Tripletzustand
in einen höheren
Tripletzustand anregt, aus dem heraus eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit
zurück
in den Singuletzustand besteht. Dass solche Übergänge bei einem fluoreszierenden Molekül mit einem
optischen Signal ausgelöst
werden können,
um das Molekül
aus einem Tripletzustand, der ein Dunkelzustand des Moleküls ist,
zurück
in seinen fluoreszenzfähigen
Singuletzustand zu bringen, ist z. B. aus S. Reindl, A. Penzkofer:
Chemical Physics 211, 431 (1996) für Farbstoffe allgemein bekannt
und wird im Bereich der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie zur
Verbesserung der Signalausbeute genutzt (siehe z. B. Zhengxi Huang,
et al.: Colloids and Surfaces A: Physiochem. Eng. Aspects 257-258,
203 (2005)). Die Anwendung dieser Kenntnisse zur Signalverbesserung
bei der Bestimmung einer räumlichen
Konzentrationsverteilung eines Fluoreszenzfarbstoffs ist jedoch
bislang nicht erfolgt und die damit erzielbaren Vorteile beim Signalverhältnis zwischen
dem Restfluoreszenzlicht aus dem unterdrückten Teilbereich und aus dem
interessierenden Rest des beobachteten Bereichs sind absolut überraschend.
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Die
Details und bevorzugten Ausführungsformen
der neuen Vorrichtung sind im Wesentlichen bereits unmittelbar oder
mittelbar zusammen mit dem neuen Verfahren erläutert worden.
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Insbesondere
bevorzugt ist es, wenn die neue Vorrichtung ein SIED- oder GSD-Fluoreszenzscanningmikroskop
ist, das eine Kühleinrichtung
zum Absenken der Temperatur der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten
Struktur aufweist. In jedem Fall weist die neue Vorrichtung als
Besonderheit eine zusätzliche
Signalquelle zur Abgabe eines optischen Signals auf den Fluoreszenzfarbstoff
auf, bei deren Einschalten während
einer sich wiederholenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs das
Verhältnis
der Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration der Fluoreszenzfarbstoffs
erhöht
und über
mehrere Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit
dem Anregungslicht hinweg auf einen derart erhöhten Wert stabilisiert. Bei
einem STED-Fluoreszenzscanningmikroskop kann die Signalquelle für das optische
Signal dieselbe Lichtquelle aufweisen wie eine Abregungslichtquelle
für das
Abregungslicht.
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Vorteilhafte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der
Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung
genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer
Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ
zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen
erzielt werden müssen.
Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten
Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander
sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen.
Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen
der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls
abweichend von den gewählten
Rückbeziehungen
der Patentansprüche
möglich
und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in
separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung
genannt werden. Diese Merkmale können
auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso
können in
den Patentansprüchen
aufgeführte
Merkmale für weitere
Ausführungsformen
der Erfindung entfallen.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter
bevorzugter Ausführungsbeispiele
weiter erläutert
und beschrieben.
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1 zeigt
einen möglichen
Aufbau der neuen Vorrichtung (ohne Wiedergabe ihrer Kühleinrichtung).
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2 zeigt
die zeitlichen Verläufe
der Intensitäten
von Anregungslicht, Abregungslicht, Fluoreszenzlicht und eines optischen
Signals bei der Vorrichtung gemäß 1.
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3 zeigt
die räumliche
Verteilung der Signale, deren zeitlicher Verlauf in 2 dargestellt
ist.
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4 zeigt
Energiezustände
eines Fluoreszenzfarbstoffs bei seiner Anregung zur spontanen Emission
von Fluoreszenzlicht unter Anwendung des neuen Verfahrens.
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5 zeigt
weiter aufgegliederte Energiezustände des Fluoreszenzfarbstoffs,
die dieser bei STED-Fluoreszenzmikroskopie unter Anwendung des neuen
Verfahrens annimmt.
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6 zeigt
den zeitlichen Verlauf eines Verhältnisses einer Ausbeute an
Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des fluoreszierenden Fluoreszenzfarbstoffs
bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs.
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7 zeigt
die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von Fluoreszenzfarbstoff, der über begrenzte Zeiträume von
50 ms mit gepulstem Anregungslicht beaufschlagt wird, wobei der
Fluoreszenzfarbstoff in jeder zweiten Pause zwischen zwei 50 ms-Zeiträumen mit
dem erfindungsgemäßen optischen
Signal beaufschlagt wird.
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8 zeigt
die Ausbeute von Fluoreszenzlicht von Fluoreszenzfarbstoff, der
während
seiner Beaufschlagung mit gepulstem Anregungslicht vorübergehend
auch mit Abregungslicht beaufschlagt wird, wobei rechts in 8 zusätzlich das
erfindungsgemäße optische
Signal auf die Probe zugeschaltet ist; und
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9 zeigt
eine weitere mögliche
Verteilung der Intensitäten
des Anregungslichts, des Abregungslichts, des Fluoreszenzlichts
und des optischen Signals bei der der Durchführung einer Ausführungsform
des neuen Verfahrens.
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FIGURENBESCHREIBUNG
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Die
in 1 skizzierte Vorrichtung dient zur Untersuchung
einer Probe 1 in der eine als solche nicht wiedergegebene
Struktur mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Auf die Probe 1 werden
mit der Vorrichtung verschiedene optische Signale durch ein Objektiv 2 gerichtet,
und das Objektiv 2 dient auch dazu, Fluoreszenzlicht 3 von
der Probe mit einem Detektor 4 zu registrieren. Der Detektor 4 kann ein
konfokal zu dem Brennpunkt des Objektivs 2 angeordneter
Detektor sein, um die räumliche
Grundauflösung
bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts 3 von der Probe 1 hoch
zu setzen. Mit einer Anregungslichtquelle 5 wird Anregungslicht 6 auf
die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff aus einem
Grundzustand in einen angeregten Zustand anzuregen, aus dem heraus
er spontan das Fluoreszenzlicht 3 emittiert. Mit einer
Abregungslichtquelle 7 wird Abregungslicht 8 auf
die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff in einem
Teilbereich des Bereichs, aus dem der Detektor 4 das Fluoreszenzlicht 3 registriert,
wieder abzuregen, um so die räumliche
Auflösung
beim Registrieren des Fluoreszenzlichts 3 noch weiter zu
erhöhen.
Die Anregungslichtquelle 5 und die Abregungslichtquelle 7 sind
miteinander synchronisierte Pulslichtquellen. Eine weitere Signalquelle 9,
die ein optisches Signal 10 auf die Probe 1 richtet,
kann ebenfalls eine gepulste Lichtquelle aber auch eine Dauerstrichlichtquelle
sein. Das optische Signal 10 dient dazu, den Fluoreszenzfarbstoff
in der Probe 1 gegenüber
einer Abnahme einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 zu regenerieren, die
ohne das optische Signal bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs
mit dem Anregungslicht 6 insbesondere unter gleichzeitiger
Beaufschlagung mit dem Abregungslicht 8 auftritt. Zudem
führt das
optische Signal 10 zu einer Verbesserung der Abregungseffizienz
durch das Abregungslicht 8, indem es einer ebenfalls mögliche Regenerierung
des Fluoreszenzfarbstoffs durch das Abregungslicht 8 und
einem damit einhergehenden Verbrauch des Abregungslichts 8 für etwas
anderes als die beabsichtigte Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs,
vorgreift. In 1 angedeutete Strahlteiler 11 dienen
dazu, die optischen Wege der Signal 3, 6, 8 und 10 zusammenzuführen bzw.
wieder voneinander zu trennen. Die verschiedenen Signale 3, 6, 8 und 10 müssen jedoch nicht
alle aus einer Richtung auf die Probe 1 gerichtet bzw.
von der Probe 1 aufgefangen werden; insbesondere das optische
Signal 10, das nicht in demselben Maße wie die anderen Signale
fokussiert bzw. auf deren Fokuspunkt abgestimmt werden muss, kann auch
auf einem anderen optischen Pfad zu der Probe 1 gelangen.
Alternativ können
die Abregungslichtquelle 7 und die Signalquelle 9 auch
auf einer gemeinsamen Lichtquelle aufbauen, an die sich zwei unterschiedliche
optische Pfade anschließen.
Pfeile 12 und 13 deuten an, dass die Probe 1 mit
den optischen Signalen 6, 8 und 10 abgescannt
wird, um die Probe 1 bzw. die darin befindliche, mit dem
Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur punktweise bezüglich der
vorhandenen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermessen.
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2 zeigt
eine mögliche
zeitliche Abfolge der einzelnen Signale 3, 6, 8 und 10 bei
der Vorrichtung gemäß 1.
Dabei handelt es sich hier nur um eine prinzipielle Darstellung,
die keinen Anspruch auf Detailgenauigkeit erhebt. An einen Puls
des Anregungslichts 6 schließt sich mit teilweiser Überlappung
ein Puls des Abregungslichts 8 an, wobei diese beiden Signale
unterschiedliche räumliche
Verteilungen aufweisen. Aus dem nicht von dem Abregungslicht 8 erfassten
Bereich, der von dem Detektor 4 gemäß 1 erfasst
wird, wird das in Folge der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs spontan
emittierte Fluoreszenzlicht 3 registriert. Das optische
Signal 10 zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs kann (a)
ebenfalls gepulst sein und beispielsweise jeweils vor dem Anregungslicht 6 auf
den Fluoreszenzfarbstoff einwirken, oder (b) kontinuierlich auf
die Probe 1 gemäß 1 gerichtet
werden. Auch im Fall (a) eines gepulsten optischen Signals 10 kann
eine zeitliche Überlappung
mit dem Anregungslicht 6 und/oder dem Abregungslicht 8 und/oder
dem Fluoreszenzlicht 3 gegeben sein.
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3 skizziert
einen Teil der Probe 1 mit Blickrichtung von dem Objektiv 2 auf
die Probe 1 gemäß 1.
Das Anregungslicht 6 wird über ein von einer punktierten
Linie umschlossenes Gebiet hinweg auf die Probe 1 gerichtet.
Der Detektor 4 erfasst Fluoreszenzlicht aus einem hiervon
eingeschlossenen, durch eine gestrichelte Linie begrenzten Bereich 14.
Fluoreszenzlicht 3 wird dabei aber nur aus einem Messbereich 15 registriert,
der von einem Doghnutförmigen
Gebiet ausgelassen wird, in dem das Abregungslicht 8 auf
die Probe 1 gerichtet wird. Das Abregungslicht 8 erfasst
neben einem Teilbereich des Bereichs 14 auch daran angrenzende
Teile des Gebiets, in dem das Anregungslicht 6 auf die
Probe 1 fällt.
Das optische Signal 10 fällt über den gesamten hier wiedergegebenen
Raum auf die Probe 1. Bei ihm besteht von allen Signalen
die geringste, d.h. gar keine Notwendigkeit einer Lokalisierung.
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4 skizziert
Energiezustände
eines Fluoreszenzfarbstoffs, wobei die links wiedergegebenen S-Zustände die
Singuletzustände
und die rechts wiedergegebenen T-Zustände die Tripletzustände des Fluoreszenzfarbstoffs
sind. Durch das Anregungslicht 6 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff
aus seinem Grundzustand S0 in den angeregten
Singuletzustand S1, aus dem heraus er spontan
das Fluoreszenzlicht 3 emittiert. Teilweise gelangt der
Fluoreszenzfarbstoff jedoch aus seinem Zustand S1 durch
einen Übergang 16 in
seinen untersten Tripletzustand T1. Bei
dem Tripletzustand T handelt es sich um einen Dunkelzustand, d.h.,
solange sich der Fluoreszenzfarbstoff in diesem Zustand befindet,
kann er weder Fluoreszenzlicht 3 emittieren noch zur Emission
von Fluoreszenzlicht mit dem Anregungslicht 6 angeregt
werden. Vielmehr besteht die Gefahr, dass er durch Anregung mit
dem Anregungslicht 6 aus seinem untersten Tripletzustand
T1 in einen hier nicht dargestellten höheren Tripletzustand
gelangt, was zu einem Ausbleichen des Farbstoffs führt. Aus
seinem Tripletzustand T1 kann der Fluoreszenzfarbstoff über einen Übergang 17 zwar
zurück
in seinen Grundzustand S0 gelangen; die Übergangswahrscheinlichkeit
des Übergangs 17 ist
jedoch insbesondere bei tiefen Temperaturen sehr klein, so dass
sich bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs durch das
Anregungslicht 6 auch bei einer nur kleinen Übergangswahrscheinlichkeit
des Übergangs 16 zunehmende Anteile
des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Tripletzustand T1 befinden
und somit kein Fluoreszenzlicht 3 liefern können. Mit
dem optischen Signal 10 wird der in seinem Tripletzustand
T1 befindliche Fluoreszenzfarbstoff in einen
höheren
Tripletzustand TN angeregt, aus dem heraus
er mit einer hohen Übergangswahrscheinlichkeit über einen Übergang 18 in
einen höheren
Singuletzustand SN gelangt, aus dem heraus
er dann mit einer ebenfalls hohen Übergangswahrscheinlichkeit über einen Übergang 19 in
den Zustand S1 oder direkt in den Zustand
S0 zurückgelangt und
so wieder für
die Anregung von Fluoreszenzlicht 3 zur Verfügung steht.
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5 ist
gegenüber 4 insoweit
erweitert, als dass die Auffächerung
der Zustände
S0 und S1 in Vibrationsunterzustände wiedergegeben
ist. Hier ist entsprechend auch dargestellt, dass der mit dem Anregungslicht 6 aus
seinem Grundzustand angeregte Fluoreszenzfarbstoff zunächst in
einen höheren
Unterzustand des Zustands S1 gelangt und erst
durch einen Übergang 20 in
den untersten Unterzustand des Zustand S1.
Aus diesem heraus kann er dann mit dem Anregungslicht 8 räumlich selektiv
wieder in einen Unterzustand des Grundzustands S0 zurückgebracht
werden, wobei eine spektrale Trennbarkeit des Anregungslichts 6 des
Fluoreszenzlichts 3 und des Abregungslichts 8 bzw.
der hierdurch stimulierten Emission gegeben ist, weil diese Signale
in der hier verwendeten Reihenfolge zunehmende Wellenlängen aufweisen.
Das Abregungslicht 8 ist aber grundsätzlich auch geeignet, den Fluoreszenzfarbstoff
aus seinem Tripletzustand T1 über den
höheren Tripletzustand
T'N zurück in seinen
Singulettzustand S zu bringen (Übergang 18') oder ihn aus
seinem Tripletzustand T heraus zu bleichen. Der Verbrauch des Abregungslichts 8 für den Übergang 18' und das Bleichen
des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T heraus wird
auch hier durch das optische Signal 10. bzw. die durch
dieses bewirkte Rückführung des
Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand
S effektiv verhindert. Dadurch, dass die sich aufbauende Besetzung des
Tripletzustands mit dem optischen Signal 10 kontinuierlich abgebaut
wird, stellt sich ein Gleichgewicht mit einer nur kleinen mittleren
Besetzung des Tripletzustands ein.
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Während die
Erfindung anhand der Figuren hier bislang ausschließlich in
Bezug auf die STED-Fluoreszenzmikroskopie
beschrieben wurde, ist ihre Anwendung auch bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie
mit großen
Vorteilen verbunden. Bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie würde, statt
dass Abregungslichts 8 nach dem bzw. schon während des Anregungslichts 6 auf
die Probe 1 gerichtet wird, in demselben Teilbereich des
Bereichs 14 und zwar schon vor dem Anregungslicht 6 Überführungslicht auf
die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb
des Messbereichs 15 aus seinem fluoreszenzfähigen Grundzustand
S0 gezielt in seinen nicht-fluoreszenzfähigen Tripletzustand
T1 zu überführen. Das
optische Signal 10 dient auch dabei zur gezielten Rückführung des
Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand
S, was hier insbesondere bei jeder Verlagerung des Messbereichs 15,
wie sie beim Scannen der Probe 1 erfolgt, zu einer erheblichen
Vergrößerung des Anteils
des Fluoreszenzfarbstoffs führt,
der sich in dem fluoreszenzfähigen
Singuletzustand S befindet.
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In 6 ist
die resultierende Auswirkung des erfindungsgemäßen optischen Signals 10 auf
die relative Ausbeute, d.h. das Verhältnis einer Ausbeute A an Fluoreszenzlicht
zu der Konzentration K des fluoreszierenden Fluoreszenzfarbstoffs
aufgetragen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisiert
sich dieses Verhältnis
A/K sehr schnell auf einen Wert 20, der wie hier nur etwas
gegenüber
dem maximalen Verhältnis
M reduziert ist oder gar dessen Niveau erreicht. Ohne das optische
Signal 10 zeigt das Verhältnis A/K einen stark abfallenden
Wert 21, insbesondere dann, wenn die Wiederholungen der
Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs sehr schnell aufeinander folgen,
so dass dieser aufgrund der geringen Übergangswahrscheinlichkeit
des Übergangs 17 gemäß den 4 und 5 nicht
in dem nötigen
Umfang von allein aus einem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand
S zurückkehrt.
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7 zeigt
die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von einem Fluoreszenzfarbstoff
aufgetragen in relativen Einheiten über der Zeit in ms. Das Fluoreszenzlicht 3 wird
durch das Anregungslicht 6 angeregt, wobei das Anregungslicht 6 in
Form hier nicht aufgelöster
Einzelpulse einer Frequenz von 80 MHz über Zeiträume von jeweils 50 ms auf den
Fluoreszenzfarbstoff gerichtet wird. Danach ist 50 ms Pause, bis die
Probe erneut mit Anregungslicht 6 beaufschlagt wird. In
jeder zweiten Pause wird der Fluoreszenzfarbstoff für etwa 20
ms kontinuierlich mit dem optischen Signal 10 beaufschlagt.
Hierdurch wird der Fluoreszenzfarbstoff in erheblichem Maße regeneriert,
wie sich an den Ausbeuten an Fluoreszenzlicht 3 bei den
ersten darauf folgenden Pulsen des Anregungslichts 6 ablesen
lässt.
Bezogen auf diese ersten Pulse liegt die Steigerung der Ausbeute
an Fluoreszenzlicht bei mehr als 100 %.
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8 zeigt
im linken Teil die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von Fluoreszenzfarbstoff,
der ab dem Zeitpunkt 50 ms mit demselben gepulsten Anregungslicht 6 wie
in 7 beaufschlagt wird. Hier wird der Fluoreszenzfarbstoff
zusätzlich
während
Zeiträumen
von jeweils 100 ms mit 100 ms Pause mit dem gepulsten und mit dem
Anregungslicht 6 gemäß 2 synchronisierten
Abregungslicht 8 beaufschlagt. Erwartungsgemäß geht dabei
die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von dem Fluoreszenzfarbstoff zurück. Das
optische Signal 10 ist in dem linken Teil von 8 aus.
Im rechten Teil von 8 wird das optische Signal 10 etwas
später
als das gepulste Anregungssignal 6 eingeschaltet, was sofort
zu einer Erhöhung
der Ausbeute an Fluoreszenzlicht führt und wodurch insbesondere
das Verhältnis
zwischen der Ausbeute an Fluoreszenzlicht bei gleichzeitig einfallendem
Abregungslicht 8 und der Ausbeute an Fluoreszenzlicht ohne
Abregungslicht 8 deutlich erhöht wird. Die Ausbeute an Fluoreszenzlicht
mit Abregungslicht 8 entspricht der Ausbeute an Fluoreszenzlicht
aus den Teilen des Bereichs 14 gemäß 3 außerhalb
des Messbereichs 15, während
die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 ohne das Abregungssignal 8 der
Ausbeute an Fluoreszenzlicht aus dem Messbereich 15 entspricht.
Je kleiner das genannte Verhältnis
ist, desto dominanter ist das registrierte Fluoreszenzlicht 3 aus
dem Messbereich 15 gegenüber dem Rest des Bereichs 14 und
desto höher
ist die erzielte räumliche
Auflösung
beim Erfassen einer mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur
in der Probe 1.
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9 zeigt
eine weitere mögliche
räumliche Verteilung
der Intensitäten
des Anregungslichts 6, des Abregungslichts 8,
des Fluoreszenzlichts 3 und des optischen Signals 10.
Die Probe 1 wird gleichmäßig mit dem Anregungslicht 6 beleuchtet.
Mit dem Abregungslicht 8 werden Interferenzstreifen erzeugt,
so dass eine sinusförmige
Modulation der Intensitätsverteilung
des Abregungslichts 8 entsteht. Durch das Abregen der Fluoreszenz
entsteht ein Streifenmuster die dem Fluoreszenzlicht 3.
Dieses Muster wird von dem Objektiv 2 auf den Detektor 4,
z. B. eine CCD-Kamera, abgebildet, wobei 9 oberhalb
des Detektor 4 die Intensitätsverteilung 3' des Fluoreszenzlichts 3 auf
der CCD-Kamera wiedergibt. Ist der seitliche Abstand der Streifen
des Fluoreszenzlichts auf der Kamera größer als 0.5·λFI/NA,
wobei λFI die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 3 ist,
so können die
Streifen eindeutig voneinander getrennt werden. Um eine höhere Abregungseffizienz
mit dem Abregungslicht 8 zu erreichen, wird die Probe 1 mit
dem Überführungslicht 10 ebenso
wie mit dem Anregungslicht 6 gleichmäßig beaufschlagt.
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- 1
- Probe
- 2
- Objektiv
- 3
- Fluoreszenzlicht
- 4
- Detektor
- 5
- Anregungslichtquelle
- 6
- Anregungslicht
- 7
- Abregungslichtquelle
- 8
- Abregungslicht
- 9
- Signalquelle
- 10
- optisches
Signal
- 11
- Strahlteiler
- 12
- Pfeil
- 13
- Pfeil
- 14
- Bereich
- 15
- Messbereich
- 16
- Übergang
- 17
- Übergang
- 18
- Übergang
- 19
- Übergang
- 20
- Wert
- 21
- Wert