-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Analysenverfahren von Mykotoxinen, insbesondere von Ergot- bzw. Mutterkornalkaloiden.
-
Ergot- bzw. Mutterkornalkaloide (auch Secalealkaloide genannt) werden aus dem Sklerotium (Mutterkorn) der auf Roggen und anderen Gramineen parasitierenden Pilze, der Clavicipitaceae gewonnen. Dazu zählen neben Claviceps purpurea, C. paspali, C. fusiformis – insbesondere auch Vertreter der Gattungen Balansia und Epichloë/Neotyphodium. Diese Pilze leben als Epibionten und Endophyten auf mehr als 600 Pflanzenarten der Familien der Süßgräser, Binsengewächse und Sauergrasgewächse.
-
Viele Vertreter der Gattung Balansia produzieren selektiv Clavinalkaloide. Das durch die Gattungen Claviceps und Epichloë/Neotyphodium produzierte Spektrum an Mutterkornalkaloiden ist jedoch umfangreicher. In Gräsern, die von Neotyphodium coenophialum befallen wurden, kann neben einfachen Mutterkornalkaloiden auch das Ergopeptin Ergovalin nachgewiesen werden. Claviceps purpurea wächst bevorzugt auf Roggen, er kann jedoch auch auf anderen Getreide- und Wildgräserarten parasitieren. Der Gehalt an Mutterkornalkaloiden – in seinem Sklerotium – liegt zwischen etwa 0,2 bis 1% der Trockenmasse und umfasst alle Gruppen dieser Stoffklasse.
-
Weitere Produzenten von Mutterkornalkaloiden sind Schlauchpilze der Gattungen Penicillium und Aspergillus [M. Isaka, P. Kittakoop, Y. Thebtaranonth: Secondary Metabolites of Clavicipitalean Fungi. In: James Francis White (Hrsg.): Clavicipitalean fungi: evolutionary biology, chemistry, biocontrol, and cultural impacts, S. 25–56, CRC Press 2003, ISBN 0824742559; Klaus B. Tenberge: Biology and Life Strategy of the Ergot Fungi in: Vladimír Křen, Ladislav Cvak (Hrsg.): Ergot: the genus Claviceps, S. 411–440, CRC Press 1999, ISBN 9789057023750].
-
Wegen ihrer pharmakodynamischen Wirkungen sind einige Mutterkornalkaloide in der Medizin u. a. zur Behandlung von Migräne, von peripheren Durchblutungsstörungen, der Parkinson-Krankheit und des Restless-Legs-Syndroms relevant und werden auch als Wehenmittel und Antihypertensiva eingesetzt.
-
Die Ergot- oder Mutterkornalkaloide gehören drei Gruppen an. Die erste stellt Alkaloide vom Clavin Typ dar, die beiden anderen repräsentieren Alkaloide, die sich von der Lysergsäure ableiten. Die Konstitution der Mutterkornalkaloide wurde vor allem von Jacobs und Graig (z. B.: Jacobs, W. A. and L. C. Craig (1935). ”The ergot alkaloids.” Science 81(2097): 256–257.) sowie von A. Stoll (z. B.: Stoll, A. (1935). ”THE NEW ERGOT ALKALOID.” Science 82(2131): 415–417.) ermittelt, und ergab, dass die Ergotalkaloide als Amide der L-(+)-Lysergsäure vorliegen, die aus einem Indol- und aus einem weitgehend hydrierten Chinolinring aufgebaut sind. Die Struktur dieser Säure konnte auf synthetischem Wege von Woodward 1954 (Kornfeld, E. C., E. J. Fornefeld, et al. (1954). ”THE TOTAL SYNTHESIS OF LYSERGIC ACID AND ERGONOVINE.” Journal of the American Chemical Society 76(20): 5256–5257) bestätigt werden – demnach besitzt sie eine (5R, 8R)-Konfiguration.
-
Aus dem Stand der Technik sind mehrere Verfahren zur Isolierung von Mutterkornalkaloiden bekannt.
-
Die einzelnen Verfahren, hauptsächlich diejenigen, die für die großtechnische Isolierung der Mutterkornalkaloide verwendet werden, unterscheiden sich in den Lösungsmitteln, die bei der Extraktion zum Einsatz kommen. So wird beispielsweise in älteren Verfahren wässriges Methanol oder Ethanol [
DE 697 760 ] eingesetzt. Neuere Isolierungsverfahren setzen dagegen chlorierte Kohlenwasserstoffe [
DE 2 113 281 A ,
DE 2 637 764 A1 und
DD 10 059 A ], Diethylether [CS 264 880 A1 und CS 264 881 A1], Aceton [
DE 1 695 986 A ], Methyl-isobutylketon [
BE 891 421 A1 ] oder Ethylacetat [
DE 2 949 593 A1 und
EP 022 418 A1 ] ein.
-
Einige dieser Verfahren sind jedoch aufgrund von Sicherheitserwägungen (Explosionsgefahr bei der Verwendung von Diethylether) sowie aus Umwelt- und Gesundheitsschutz-Überlegungen (z. B. beim Einsatz halogenierter bzw. chlorierter Kohlenwasserstoffe) heute nicht mehr in einem industriellen Maßstab durchführbar. Daneben erweisen sich einige der genannten Lösungsmittel zudem nicht als genügend selektiv, um Mutterkornalkaloide in befriedigender Reinheit zur Verfügung stellen zu können. Hierzu gehören in erster Linie Verfahren, die unter Verwendung von wässrigem Methanol oder Ethanol sowie Aceton arbeiten.
-
Des Weiteren enthält Mutterkorn gewöhnlich bis zu 30% Öl und sonstige Lipide. Frühere Verfahren, in denen die eingesetzten Lösungsmittel auch andere Bestandteile des Mutterkorns – im Hauptanteil Öl – co-extrahierten, machten zwangsläufig einen weiteren Reinigungsschritt, in dem die Alkaloide von den assoziierten Lipiden abgetrennt werden mussten, unausweichlich.
-
Allerdings erweisen sich nicht alle bekannten Lösungsmittel für das direkte Entfernen der Lipide auf dem Wege der Flüssig/Flüssig-Extraktion als geeignet. Damit erhöht sich die Komplexität der gesamten Isolierungsverfahren, da die Extrakte durch Verdampfen der Extraktionsmittel zunächst noch aufkonzentriert werden müssen und der Rückstand wieder in einem geeigneten Lösungsmittel für die weitere Aufreinigung bzw. Isolierung gelöst werden muss. Daneben erweist sich die thermische Belastung wegen der mangelnden thermischen Stabilität der Ergotalkaloide als nachteilig.
-
Des Weiteren spielt folgendes Problem eine ausschlaggebende Rolle: (R)-Isomere der Ergotalkaloide verkörpern Derivate der Lysergsäure und isomerisieren unter sauren und basischen Bedingungen beschleunigt zur iso-Lysergsäure bzw. zu deren Derivaten, den (S)-Isomeren der Ergotalkaloide. Diese Tatsache erschwert die Quantifizierung der originären Isomerenverteilung in einer Probe.
-
Dieses Problem betrifft zumindest alle sechs prioritären Ergotalkaloide: Ergometrin, α- und β-Ergosin, Ergotamin, Ergocornin, α- und β-Ergocryptin und Ergocrystin. Sie alle kommen in zwei isomeren Formen vor – dem (R)-Isomer (in-Form) und dem (S)-Isomer (inin-Form).
-
Im Hinblick auf den Umstand, dass lediglich die (R)-Isomeren biologisch aktiv sind, ist es vom analytischen Standpunkt her sehr wichtig, dass (R)- und (S)-Isomere getrennt erfasst werden können, um den Gehalt an dem/den biologisch aktiven Isomer(en) möglichst genau erfassen zu können.
-
Unter sauren oder auch unter basischen Behandlungsbedingungen erfolgt jedoch eine beschleunigte Isomerisierung (d. h. eine Umwandlung der isomeren Formen ineinander).
-
Die bisher aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren arbeiten jedoch unter Anwendung von sauren oder basischen – nicht aber unter pH-neutralen – Bedingungen. Dies führt aus den oben genannten Gründen zwangsläufig zu eklatanten Verfälschungen der Ergebnisse (falsch positiv oder falsch negativ), die im Rahmen einer quantitativen isomeren-spezifischen Ergotalkaloid-Bestimmung erhalten werden.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Analysenverfahren für ergolinbasierte Mykotoxine – insbesondere für Ergotalkaloide – zur Verfügung zu stellen bei dem der zur Reinigung erforderliche Extraktions- und „Clean-up”-Schritt unter basischen oder sauren Reaktionsbedingungen vermieden wird und das in einer nachgeschalteten instrumentellen Analyse eine korrekte quantitative Erfassung der einzelnen Stereoisomere der Ergotalkaloide erlaubt.
-
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das in dem unabhängigen Patentanspruch 1 und das in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 12 beschriebene Verfahren gelöst. Insbesondere wird die oben erwähnte Aufgabe dadurch gelöst, dass der zur Reinigung zunächst erforderliche Extraktionsschritt und der nachfolgende Aufreinigungsschritt (Clean-up) in einem pH-Bereich von 6 bis 8 – vorzugsweise in einem pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 und besonders bevorzugt unter pH-neutralen Bedingungen – erfolgt.
-
Die vorliegende Erfindung basiert dabei insbesondere auf der Aufgabe, ein Analysenverfahren verfügbar zu machen, das eine richtige und präzise Quantifizierung der einzelnen Ergotalkaloid-Isomere erlaubt.
-
Gelöst wird die vorgenannte Aufgabe durch die Verwendung eines pH-neutralen makroporösen Kationenaustauscherharzes zur Aufreinigung (und der anschließenden Isolierung/Analyse) der Ergotalkaloid-Stereoisomere; insbesondere durch die Verwendung eines mit Natrium-Kationen beladenen Kationenaustauschers auf der Basis eines Polystyrol/Divinylbenzol-Harzes. Dabei kann der Kationenaustauscher z. B. in Form von Kartuschen (SPE-Prinzip) zum Einsatz kommen oder aber auch direkt dem Extrakt zugefügt werden (z. B. in einem sog. Batch-Verfahren).
-
In dem ersten Isolierungsschritt wird die die Mykotoxine enthaltende Matrix – beispielsweise Mehl, Brot etc. – extrahiert, oder im Falle eines Öls mit einem Lösungsmittel verdünnt. Für die Extraktion kommt prinzipiell jedes geeignete Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelsystem in Frage, sofern es in einem der o. a. pH-Bereiche liegt oder pH-neutral arbeitet. Die oben genannten festen Matrices können typischerweise mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser – besonders bevorzugt im Volumenverhältnis 84:16 – extrahiert werden, während das betreffende/zu untersuchende Öl in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise mit Aceton – verdünnt und anschließend aufgetragen werden kann. In Abhängigkeit von der eingesetzten Matrix kann sich jedoch die Verwendung von anderen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Ethylacetat – oder Heptan für Öle – bzw. in entsprechenden Lösungsmittelsystemen ebenfalls als vorteilhaft erweisen.
-
Zur Aufreinigung wird der pH-neutrale, Ergotalkaloide enthaltende Extrakt zunächst mit dem Kationenenaustauscherharz in Kontakt gebracht, wodurch die ergolinbasierten Mykotoxine bzw. Ergotalkaloide aufgrund ionischer Wechselwirkungen an das Austauscherharz gebunden werden. Kationenaustauscherharze bzw. saure Ionenaustauscher sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt; sie beinhalten unterschiedlichste zum Ionenaustausch befähigte aktive Gruppen, wie z. B. -OH, -SO3H oder -COOH oder – bevorzugt – p-Toluolsulfonsäuregruppen. Für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung sollten sie vorzugsweise in Form Ihrer Alkalisalze – besonders bevorzugt in Form ihrer Natriumsalze – vorliegen.
-
Dabei sollten die Ionenaustauscher vorzugsweise eine makroporöse Struktur aufweisen.
-
Im anschließenden Aufreinigungsschritt werden im Rahmen eines ersten Elutionsschritts zunächst die Matrixbestandteile eluiert. Dies kann mit dem bereits bei der Extraktion der festen Probe eingesetzten Acetonitril/Wasser-Gemisch erfolgen oder mit Gemischen anderer Mischungszusammensetzung. Im Falle des eingesetzten Öls erfolgt die weitere Aufreinigung zweistufig, beispielsweise in einem ersten Elutionsschritt mit Aceton und in einem zweiten Elutionsschritt ebenfalls mit dem bereits erwähnten Acetonitril/Wasser-Gemisch. Im abschließenden Elutionsschritt werden die gewünschten Ergotalkaloide unter Verwendung einer neutralen tensidischen Elutionslösung – vorzugsweise eines Natriumhexansulfonat-Acetonitril/Wasser-Gemisches – freigesetzt und eluiert.
-
In Abhängigkeit von der eingesetzten Matrix kann es ggf. zweckmäßiger sein, andere pH-neutrale Extraktionsmittel zu wählen. Dem Fachmann steht hierzu eine Vielzahl von alternativen Extraktionsmitteln zur Verfügung.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Isolierung und Analyse von Mykotoxinen mit einer Ergolin-Grundstruktur umfassend folgende Verfahrensschritte:
- a) Bereitstellung eines Mykotoxins mit einer Ergolin-Grundstruktur enthaltenden Extrakts, der gegebenenfalls teilweise oder ganz vom Extraktionsmittel befreit wurde,
- b) Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Kationenaustauscher,
- c) Elution der Matrixbestandteile mit einem Acetonitril/Wassergemisch,
- d) Elution und gegebenenfalls Isolierung der eluierten Mykotoxine mit einem Acetonitril/Wassergemisch,
wobei die Elution der Matrixbestandteile und die Elution der Mykotoxine in einem pH-Bereich von 6 bis 8 erfolgt.
-
In einer typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem das die Ergolin-Grundstruktur enthaltende Mykotoxin ein Ergotalkaloid – vorzugsweise Ergometrin, α- und β-Ergosin, Ergotamin, Ergocornin, α- und β-Ergocryptin und Ergocrystin oder Ergovalin, sowie deren isomere – inin-Verbindungen – ist.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem das gegebenenfalls teilweise oder ganz vom Extraktionsmittel befreite Extrakt ein Öl verkörpert.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem das Öl vor dem Inkontaktbringen mit dem Kationenaustauscher mit einem Lösemittel – vorzugsweise mit einem Keton und besonders bevorzugt mit Aceton – verdünnt wird.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorbeschriebenen Verfahren, in dem der Kationenaustauscher ein Kationenaustauscherharz darstellt.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem der Kationenaustauscher eine makroporöse Struktur aufweist.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem der Kationenaustauscher ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz ist und eine makroporöse Struktur aufweist.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem die zum Ionenaustausch befähigten aktiven Gruppen des Kationenaustauschers, OH-Gruppen, SO3H-Gruppen oder COOH-Gruppen – und bevorzugt p-Toluolsulfonsäure-Gruppen – darstellen.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das vorgenannte Verfahren, in dem der Kationenaustauscher in Form seines Alkalisalzes – bevorzugt in Form seines Natriumsalzes – vorliegt.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorbeschriebenen Verfahren, in dem die Bindung der Mykotoxine an den Kationenaustauscher und die anschließende Reinigung durch Elution der Matrixbestandteile und die abschließende Elution der so aufgereinigten Mykotoxine in einem pH-Bereich von 6 bis 8 – vorzugsweise in einem pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 und besonders bevorzugt unter pH-neutralen Bedingungen – erfolgt.
-
In einer weiteren typischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorbeschriebenen Verfahren, in dem die gebundenen Mykotoxine mit einer neutralen tensidischen Elutionslösung – vorzugsweise mit einem Natriumhexansulfonat-Acetonitril/Wasser-Gemisch – vom Kationenaustauscher freigesetzt und eluiert und werden.
-
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kationenaustauschers auf der Basis eines Polystyrol/Divinylbenzol-Harzes zur Aufreinigung und/oder Isolierung von Mykotoxinen – typischerweise mit einer Ergolin-Grundstruktur und insbesondere dessen Verwendungen in dem vorbeschriebenen Verfahren.
-
Weitere Vorteile, Kennzeichen, Aspekte und Details werden aus der Beschreibung und dem nachfolgenden Beispiel deutlich. Dabei sind die Patentansprüche als ein erster nicht limitierender Versuch zu verstehen, die vorliegende Erfindung mittels allgemeiner Definitionen zu beschreiben.
-
Beispiele
-
Aufarbeitung einer Mehlprobe
-
Erster Isolationsschritt:
-
Es werden 10 g Mehl in einem Zentrifugenglas mit 50 ml Acetonitril:Wasser (84:16, v:v) versetzt und eine Stunde geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch zentrifugiert und 4 ml des Überstandes durch einen 0,2 μm PTFE Spritzenfilter filtriert.
-
Inkontaktbringen des Extraktes mit dem Kationenaustauscher:
-
Es werden 4 ml des filtrierten Extraktes auf eine Kartusche, befüllt mit 100 mg (±2 mg) eines makroporösen Polystyrol/Divinylbenzol-Kationenaustauscherharzes, welches zuvor mit Natriumionen beladen wurde, gegeben. Die Korngröße der Harzpartikel beträgt zwischen 100 und 200 μm. Das Harz wird direkt vor Zugabe des Extraktes mit 1 ml Acetonitril:Wasser (84:16, v:v) konditioniert. Der Extrakt wird gleichmäßig in mindestens 15 min durch die Kartusche geleitet (d. h. Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,27 ml/min).
-
Elution der Matrixbestandteile:
-
Es werden 5 ml Acetonitril:Wasser (84:16, v:v) innerhalb von 15 min durch die Kartusche geleitet (d. h. Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,3 ml/min).
-
Elution der Mykotoxine:
-
Durch die Kartusche werden 4 ml einer Lösung aus Acetonitril:(Wasser +2,2 M Natriumhexansulfonat) (84:16, v:v) innerhalb von 15 min geleitet (das bedeutet: eine Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,27 ml/min). Die erhaltene Elutionslösung wird durch einen 0,2 μm PTFE Spritzenfilter filtriert, in ein HPLC-Vial überführt und mittels HPLC-MS analysiert.
-
Aufarbeitung einer Ölprobe
-
Erster Isolationsschritt:
-
Es werden 0,5 g Speiseöl mit 6 ml Aceton versetzt und eine Minute geschüttelt.
-
Inkontaktbringen des Extraktes mit dem Kationenaustauscher:
-
Das Öl-Aceton-Gemisch wird auf eine Kartusche, befüllt mit 100 mg (±2 mg) eines makroporösen Polystyrol/Divinylbenzol-Kationenaustauscherharzes, welches zuvor mit Natriumionen beladen wurde, gegeben. Die Korngröße der Harzpartikel beträgt zwischen 100 und 200 μm. Das Harz wird direkt vor Zugabe des Extraktes mit 1 ml Aceton konditioniert. Das Öl-Aceton-Gemisch wird gleichmäßig in mindestens 15 min durch die Kartusche geleitet (das bedeutet: eine Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,27 ml/min).
-
Elution der Matrixbestandteile:
-
Es werden 3 ml Aceton innerhalb von 9 min durch die Kartusche geleitet. Anschließend wird das Kationenaustauscherharz durch Anlegen eines Unterdrucks getrocknet. Im nächsten Schritt werden 3 ml Acetonitril:Wasser (84:16, v:v) innerhalb von 9 min durch die Kartusche geleitet (das bedeutet: eine Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,3 ml/min).
-
Elution der Mykotoxine:
-
Durch die Kartusche werden 2 ml einer Lösung aus Acetonitril:(Wasser +2,2 M Natriumhexansulfonat) (84:16, v:v) innerhalb von 15 min geleitet (das bedeutet: eine Durchflussgeschwindigkeit ≤ 0,13 ml/min). Die erhaltene Elutionslösung wird durch einen 0,2 μm PTFE Spritzenfilter filtriert, in ein HPLC-Vial überführt und mittels HPLC-MS analysiert.