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Die Erfindung bezieht sich auf Flugzeitmassenspektrometer, in denen Einzelflugzeitspektren mit Detektionssystemen eingeschränkter Messdynamik gemessen und zu Summenspektren addiert werden.
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Die Erfindung besteht darin, die Messdynamik der Spektrenaufnahme zu erhöhen, indem solche Ionensignale, deren Messwerte eine Sättigung des Analog-zu-Digital-Converters (ADC) aufweisen, durch Korrekturwerte ersetzt werden, insbesondere, wenn sich mehrere aufeinanderfolgende Messwerte in Sättigung befinden. Die Korrekturwerte werden aus der Breite der Signale gewonnen, vorzugsweise einfach aus der Anzahl der Messwerte in Sättigung.
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Stand der Technik
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Flugzeitmassenspektrometer akquirieren in schneller Folge Einzelflugzeitspektren, die zur Vermeidung von Sättigungseffekten für die intensivsten Ionensignale jeweils nur maximal wenigen Hundert Ionenenthalten dürfen und daher sehr lückenhaft und stark streuend sind. Für Ionensignale geringer Intensität wird nur in jedem zehnten, hundertsten oder gar tausendsten Einzelflugzeitspektrum ein Ion gemessen. Tausende dieser Einzelflugzeitspektren, die mit sehr hohen Aufnahmefrequenzen bis zu Zehntausend Spektren pro Sekunde und mehr aufgenommen werden, werden dann sofort zu einem Summenspektrum verarbeitet, um brauchbare Flugzeitspektren mit konzentrationsgetreuen Signalen über einen großen Messumfang hinweg für die Ionensorten der verschiedener Analysensubstanzen zu erhalten.
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Unter dem Begriff „Ionensignal” wird hier derjenige Teil einer Ionenstromkurve verstanden, der Ionen einer ladungsbezogenen Masse m/z umfasst. Das Ionensignal wird auch als „Ionenpeak” bezeichnet.
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Für die Messung der Flugzeitspektren werden die Ionenströme zunächst durch Sekundärelektronenverstärker (SEV) um Faktoren zwischen 105 und 107 verstärkt und dann mit speziellen Digitalisierungseinheiten abgetastet, die als „Transientenrekorder” bezeichnet werden. Diese enthalten sehr schnelle Analog-zu-Digital-Wandler (ADC); sie arbeiten heute mit Abtastraten von etwa 4 Gigasample pro Sekunde (GS/s), höhere Abtastraten bis zu etwa 10 Gigasample pro Sekunde sind gegenwärtig in Entwicklung. Die Digitalisierungstiefe pro Messung beträgt meist nur acht bit, umfasst also nur Werte von 0 bis 255; eine gute Messdynamik von fünf bis sechs Zehnerpotenzen kann also nur durch Addition von Hunderten oder Tausenden von Einzelspektren erreicht werden.
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Um in den Einzelflugzeitspektren keine Sättigung des Analog-zu-Digital-Wandlers zu bewirken, bedarf es einerseits eines begrenzten Ionenstroms. Andererseits soll jedes einzelne Analytion auch sicher gemessen werden, Um kein Ion zu verlieren, aber auch bei der Messung nicht in Sättigung zu geraten, muss die Verstärkung des SEV sehr genau engestellt werden. Verfahren zur optimalen Einstellung der Verstärkung der SEVs sind bekannt (siehe beispielsweise A. Holle,
DE 10 2008 010 118 A1 ;
GB 2 457 559 A ;
US 2009/0206247 A1 ). Wegen der Poisson-Verteilung der gebildeten Sekundärelektronen durch ein aufprallendes Ion ist es günstig, wenn ein einzelnes Ion ein Signal ergibt, das im ADC einen Messwert von etwa 2 bis 3 Counts erzeugt. Das schränkt die Intensitätsdynamik in einem Einzelflugzeitspektrum aber auf zwei Zehnerpotenzen ein: von etwa 2,5 Counts bis 255 Counts.
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Diese optimale Einstellung des Sekundärelektronenverstärkers gilt aber nur für Ionen einer ausgewählten ladungsbezogenen Masse m/z, da die Empfindlichkeit des SEV von der Masse abhängig ist und etwa mit 1/√(m/z) abnimmt. Ist die Verstärkung eines SEV beispielsweise so eingestellt, dass die erwähnten 2 bis 3 Counts für ein Ion der ladungsbezogene Masse m/z = 5000 Dalton erreicht werden, um insbesondere keine Ionen hoher Masse zu verlieren, so ergibt ein Ion der Masse m/z = 50 Dalton bereits etwa 25 Counts, und der Messumfang ist für Ionen dieser Masse auf nur noch eine Zehnerpotenz von 25 bis 255 Counts eingeschränkt.
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Bis vor wenigen Jahren war diese Einschränkung nicht sehr störend, weil die besten Ionenquellen nur begrenzte Mengen an Ionen pro Zeiteinheit lieferten, und die Transmission der besten Massenspektrometer noch so gering war, dass die Sättigung des ADC kaum erreicht werden konnte. Das traf sowohl bei Ionenquellen mit einer Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI) wie auch bei Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) zu. Die Sättigung wird ja überhaupt erst erreicht, wenn sich in einem Ionensignal einer Masse einige Hundert Ionen befinden, weil sich dieses Signal, wie unten ausgeführt wird, über mindestens etwa acht Messungen von je 0,25 Nanosekunden Dauer verteilt. 800 einfach geladene Ionen pro Nanosekunden entsprechen aber einem Ionenstrom von etwa 5 Nanoampère, einem für die Massenspektrometrie großmolekularer Substanzen recht hohen Ionenstrom. Durch die weiterlaufende Entwicklung der Ionenquellen und auch der Massenspektrometer wird allerdings die Sättigungsgrenze immer öfter erreicht und überschritten; es ist somit nach Verfahren zu suchen, die es erlauben, an die Sättigungsgrenze heranzugehen oder sie gar um Faktoren zu überschreiten.
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In den Massenspektrometern dieser Art werden ausnahmslos Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) für die Messung der Ionenströme eingesetzt. Diese können verschiedenartig aufgebaut sein; der Fachmann kennt aber diese Detektoren, so dass hier nicht weiter auf sie eingegangen zu werden braucht. Der Prozess der lawinenartigen Sekundärelektronenverstärkung führt zur Verstärkung, aber auch zu einer Verbreiterung des Elektronenstromsignals. Aus einem einzigen auftreffenden Ion wird in den besten Sekundärelektronenverstärkern ein Signal von etwa 0,5 Nanosekunden Halbwertsbreite erzeugt; die Signalbreiten preiswerterer Sekundärelektronenverstärker liegen bei 1 bis 2 Nanosekunden. Es ist nicht zu erwarten, dass hier in Zukunft wesentliche Fortschritte erzielt werden können, da die Technik im Wesentlichen ausgereift ist.
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Tastet man den Elektronenstromverlauf aus den SEV Punkt für Punkt ab, beispielsweise durch einen Transientenrekorder mit 8 Gigasample pro Sekunde, so erhält man somit bei Verwendung bester Geräte Mindestsignalbreiten in halber Höhe von 0,5 Nanosekunden für jedes einzelne Ion, unabhängig von der Masse des Ions. Werden die Signalprofile einzelner Ionen in aufeinander folgenden Einzelflugzeitspektren aufaddiert, oder gibt es in einem Einzelflugzeitspektrum mehrere Ionen der gleichen Masse, so sind die Signalbreiten noch größer, da Fokussierungsfehler der Massenspektrometer, nicht voll kompensierte Einflüsse anfänglicher Energieverteilungen der Ionen vor ihrer Beschleunigung in die Flugstrecke und andere Einflüsse hinzukommen. Diese Einflüsse ergeben zusätzliche Signalverschmierungen in der Größenordnung von mindestens einer Nanosekunde, meist abhängig von der Masse der Ionen. Da sich der Erfahrung nach alle diese Beiträge zur Signalbreite pythagoräisch addieren (also die Wurzel aus den addierten Breitenquadraten bilden), lassen sich mit den allerbesten Spektrometern und Detektoren nur Signalbreiten von minimal etwa einer Nanosekunde erzielen, meist liegen die realen Signalbreiten im Bereich von 2 bis 3 Nanosekunden. Ihre Halbwertsbreite ist im unteren Massenbereich, in dem die Lawinenbreite des SEV vorherrscht, nahezu konstant; im oberen Massenbereich dagegen in etwa proportional zur Wurzel aus der ladungsbezogenen Masse m/z.
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Durch diese unvermeidlichen Signalbreiten der Ionensignale ist die Auflösung der Flugzeitmassenspektrometer beschränkt. Eine Abhilfe bietet die Erzeugung längerer Flugzeiten durch geringere Beschleunigungsspannung; doch stellen sich hier andere Nachteile ein. Besser ist schon die Anwendung längerer Flugstrecken durch längere Flugrohre, obwohl auch diese Lösung nicht sehr elegant ist. Die Verwendung mehrfach geknickter Flugstrecken mit mehreren Reflektoren zur Erzeugung extrem guter Auflösungen hat sich nicht bewährt. Bewährt hat sich jedoch eine künstliche Erhöhung der Flugzeit- und Massenauflösung durch rechentechnische Maßnahmen.
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Eine solche rechentechnische Verbesserung der Massenauflösung kann wie folgt aussehen: Für jedes Einzelflugzeitspektrum wird eine Signalanalyse durchgeführt. Wird ein Ionensignal gefunden, so wird ein flächen- oder höhenproportionaler Wert nur dort addiert, wo sich die Flugzeit des Signalmaximums befindet. Im einfachsten Fall wird nur der Messwert des Signalmaximums an der jeweiligen Stelle des Signalmaximums im Einzelflugzeitspektrum addiert. Da die Flugzeiten des Signalmaximums statistischen Schwankungen unterliegen, ergibt sich für dieses Ionensignal ein Additionssignal, das wiederum eine endliche Breite besitzt, die aber schmaler ist als es der Addierung aller Messwerte entspräche. Dieses Additionssignal enthält nur noch die statistischen Streuungen, nicht mehr die Lawinenbreite und die Breite der Abbildungsfehler (siehe dazu O. Raether:
DE 102 06 173 B4 ;
GB 2 390 936 B ;
US 6,870,156 B2 ). Diese bedingten Additionen sind jedoch nicht einfach auszuführen, da der gesamte Algorithmus mit vier oder gar acht Gigahertz ablaufen muss, was trotz des Einsatzes sehr schneller FPGA (field programmable gate arrays) oder sehr schneller digitaler Signalprozessoren (DSP) sehr schwierig ist.
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Es ist erstaunlich, dass dieses Verfahren nicht nur die Massenauflösung erhöht, sondern auch die Massengenauigkeit verbessert. Durch die Addition von Tausenden von Einzelflugzeitspektren erhält man ein Summenflugzeitspektrum, das im Folgenden einfach „Flugzeitspektrum” genannt wird. Aus diesen Flugzeitspektren werden Massenspektren berechnet. Es ist das Ziel dieser Flugzeitmassenspektrometer, die Massen der einzelnen Ionenspezies möglichst genau zu bestimmen. Durch die soeben beschriebene rechentechnische Maßnahme, die eigentlich zur Erhöhung der Massenauflösung eingeführt wurde, können heute in entsprechend konstruierten Massenspektrometern Massengenauigkeiten von 0,5 ppm oder besser erreicht werden.
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Unter der Angabe „ppm” (parts per million) für die Genauigkeit wird dabei die relative Genauigkeit der Massenbestimmung in Millionsteln der ladungsbezogenen Masse m/z verstanden. Die Genauigkeit ist wiederum statistisch und unter der stillschweigenden Annahme einer Normalverteilung der Messstreuung als deren Breiteparameter Sigma festgelegt. Dieser Breiteparameter gibt den Abstand zwischen Wendepunkt und Maximum der Gaußschen Normalverteilungskurve an. Definitionsgemäß gilt dann folgendes: Wird die Massenbestimmung vielfach wiederholt, so befinden sich 68% der Werte im beidseitig aufgespannten einfachen Sigma-Intervall (also zwischen den Wendepunkten), 95,57% im doppelten Sigma-Intervall, 99,74% im dreifachen Sigma-Intervall und 99,9936% im vierfachen Sigma-Intervall der normalverteilten Fehlerstreukurve.
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Leider findet durch dieses Verfahren der Erhöhung von Massenauflösung und Massengenauigkeit keine Erhöhung der Messdynamik statt. Nach wie vor muss darauf geachtet werden, die Ionensignale nicht in die Sättigung zu treiben.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 99/67801 A2 offenbart einen Ionendetektor, der mehrere Detektoranoden mit unterschiedlichen Anodengrößen aufweist. Die Anoden empfangen gleichzeitig einen Ionenstrom bei unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen. Tritt eine Sättigung in Bereichen des Ionenstromsignals an der großen Anode mit hoher Empfindlichkeit auf, können diese Bereiche durch die nicht gesättigten Ionenstrommessungen der kleinen Anode mit geringer Empfindlichkeit ersetzt werden.
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Die Patentanmeldung
US 2005/0086017 A1 beschreibt ein Verfahren zum Erstellen eines Kalibrierungsfilters für ein Massenspektrometer.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 2004/006159 A1 offenbart ein Verfahren zum Auswählen von monoisotopischen Peaks in einem Massenspektrum.
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Die Patentanmeldung
US 2004/0211895 A1 zeigt ein Verfahren zur Erhöhung des dynamischen Bereichs eines Massenspektrometers. Während einer Messung des Ionenstroms kann eine ionenoptische Linse vor dem Detektor von einem Fokussiermodus, nach dem die Ionen auf den Detektor fokussiert werden (hohe Empfindlichkeit), und einem Defokussiermodus (niedrige Empfindlichkeit) hin- und hergeschaltet werden. Dadurch lassen sich Ionenstromsignale, die im Fokussiermodus bei hoher Empfindlichkeit in Sättigung sind, durch die mit niedriger Empfindlichkeit im Defokussiermodus aufgenommenen Messungen in einem Massenspektrum segmentweise ersetzen.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Messdynamik der Spektrenaufnahme für Flugzeitmassenspektrometer zu erhöhen, ohne die Messdauer für die Summenspektren zu erhöhen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung basiert darauf, dass es mit heutigen Ionenquellen und Flugzeitspektrometern möglich ist, dem Messsystem so hohe Ionenströme zuzuführen, dass die Messungen in Sättigung geraten können. Die Erfindung besteht darin, unter diesen Umständen die Messdynamik der Spektrenaufnahme zu erhöhen, indem Messwerte des Analog-zu-Digital-Wandlers (ADC), die sich in Sättigung befinden, durch Korrekturwerte ersetzt werden, bevor die Addition zum Summenflugzeitspektrum stattfindet. Die Korrekturwerte leiten sich aus der Breite der Signale ab, vorzugsweise einfach aus der Anzahl der Messwerte in Sättigung.
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In einer besonders einfachen und daher bevorzugten Ausführungsform kann an der Flugzeitstelle, die der Mitte der Folge von Messwerten in Sättigung entspricht, einfach ein korrigierter Wert addiert werden, wobei der korrigierte Wert einem statistisch gemittelten überschießenden Messwert bei gegebener Sättigungsbreite entspricht und einer Tabelle entnommen wird. Der Tabellenwert ist von der Anzahl der Messwerte in Sättigung abhängig und kann darüber hinaus auch noch von der Flugzeit abhängen.
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Die Tabellenwerte können durch Kalibriermessungen gewonnen werden. Dafür eignen sich insbesondere die Isotopenmuster organischer Substanzen, aus deren Isotopensignalen niedriger Intensität, die noch im ungesättigten Messbereich liegen, die nicht mehr direkt messbaren Ionensignale hoher Intensität jenseits der Sättigungsgrenze berechnet werden können. Es können dann die statistischen Zusammenhänge zwischen überschießender Intensität und Anzahl nebeneinander liegender Messwerte in Sättigung bestimmt werden. – Die Korrekturwerte können aber auch aus genauen Vermessungen der Signalform berechnet werden.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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veranschaulicht den statistischen Zusammenhang zwischen der Überhöhung der Ionensignale über den Sättigungswert 255 hinaus und der Anzahl von Messungen in Sättigung (schwarze Punkte).
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Die verdeutlicht, dass es für die Signalhöhen einen großen Spielraum gibt, bevor aus einem Messwert in Sättigung eine Folge von zwei Messwerten in Sättigung wird. Eine näherungsweise richtige Korrektur der Signalüberhöhungen kann nur durch eine große Anzahl an Korrekturen für Ionensignale der gleichen Masse erreicht werden.
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Beste Ausführungsformen
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Wie oben bereits kurz geschildert, besteht die Erfindung darin, die Messdynamik der Spektrenaufnahme dadurch zu erhöhen, dass diejenigen Ionensignale, die in einem Einzelflugzeitspektrum den Analog-zu-Digital-Wandler (ADC) in Sättigung bringen, durch Korrekturen erhöht werden, insbesondere, wenn sich die Sättigungswerte über mehrere aufeinander folgende Messungen hinziehen. Die Korrekturen leiten sich aus der Breite der Signale ab, vorzugsweise einfach aus der Anzahl der Messwerte in Sättigung. Da sich die Signalformen mit der Masse der Ionen ändern können, können die Korrekturwerte zusätzlich von der Flugzeit abhängen. Die Korrekturwerte können beispielsweise geordnet nach Signalbreiten und Flugzeitbereichen in einer Tabelle gespeichert sein. Die Tabellenwerte werden durch hohe Anzahlen an Kalibriermessungen gewonnen oder durch Berechnung anhand der gemessenen oder berechneten Signalform für die Ionen gleicher Masse.
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Dabei ist vorausgesetzt, dass der SEV wie einleitend beschrieben so eingestellt ist, dass eine maximale Messdynamik erzielt wird, ohne einzelne Ionensignale zu verlieren.
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In einer sehr einfachen, aber bereits sehr effektiven Ausführungsform werden alle Messwerte, die in einem ADC im Takt von beispielsweise acht Gigasample pro Sekunde und mit acht bit Tiefe aufgenommen werden, wie üblich sofort in einem FPGA oder einem DSP auf das Auftreten eines Signalmaximums untersucht. Tritt ein Signalmaximum auf, so wird der maximale Messwert und die zugehörige Flugzeit, die als Zählindex mit 24 bit Tiefe vorliegt, an ein besonderes Rechenwerk geschickt, das den Messwert an der Stelle der Flugzeit des Signalmaximums zu einem Summenspektrum aufaddiert. Da in einem Einzelflugzeitspektrum etwa eine Million Messwerte gemessen werden, aber nur höchstens einige Tausend Ionensignale vorkommen, kann das besondere Rechenwerk auch langsamer arbeiten als das FPGA; beispielsweise kann hier ein einfacher PC verwendet werden.
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Wird bei der Untersuchung auf Signalmaxima im FPGA festgestellt, dass der Sättigungswert 255 vom ADC übermittelt wurde, so beginnt eine Zählung der Messwerte in Sättigung. Tritt der erste Messwert auf, der nicht mehr in Sättigung ist, so schickt das FPGA dem besonderen Rechenwerk den Flugzeitindex zusammen mit der Anzahl von Messwerten in Sättigung. Das besondere Rechenwerk entnimmt einer Tabelle, die nach Anzahl der gesättigten Messwerte und nach Flugzeitbereichen aufgebaut ist, einen korrigierten Messwert und addiert diesen zum Summenspektrum, und zwar an der Stelle der Flugzeit, die der Mitte des Sättigungsbereiches entspricht.
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Die Tabellenwerte für die Korrekturen können durch statistische Mittelungen aus großen Anzahlen von Kalibriermessungen gewonnen werden. Für diese Kalibriermessungen ist es notwendig, die wahren Signalgrößen an den Stellen der Sättigung zu kennen. Für diesen Zweck eignen sich besonders die Isotopenmuster organischer Substanzen, die Signale mit sehr unterschiedlichen, aber bekannten Intensitäten enthalten. Aus Isotopensignalen niedriger Intensität, die noch im ungesättigten Messbereich liegen, können die nicht mehr direkt messbaren Ionensignale hoher Intensität jenseits der Sättigungsgrenze berechnet werden. Für diese können dann die statistischen Zusammenhänge zwischen Intensität jenseits der Sättigung und der Anzahl nebeneinander liegender Messwerte in Sättigung bestimmt werden. Die Messungen werden jeweils an vielen Einzelflugzeitspektren ausgeführt. Dabei sind unter Benutzung geeigneter Substanzen verschiedener Massen, die jeweils genügend hohe Ionenströme liefern, auch Messungen in verschiedenen Flugzeitbereichen möglich. Die Kalibriermessungen können durch entsprechende Programme automatisch ausgeführt werden und liefern die oben angeführten Tabellen mit Korrekturwerten in Abhängigkeit von der Anzahl der nebeneinander liegenden Messwerte in Sättigung und in Abhängigkeit vom Flugzeitbereich.
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Die korrigierten Messwert aus der Tabelle werden im Einzelfall nicht den wahren Intensitätswerten der Ionensignale entsprechen; im statistischen Mittel über Tausende von Einzelspektren ergibt sich aber bei guter Kalibrierung des Verfahrens ein recht guter Näherungswert. Es kann damit eine Erweiterung des dynamischen Messbereichs um eine Zehnerpotenz und mehr erreicht werden, was gleichzeitig auch eine Empfindlichkeitserhöhung um eine Zehnerpotenz bedeutet. Diese Empfindlichkeitserhöhung liegt natürlich primär in der Verbesserung der Ionenquelle und der Ionentransmission im Massenspektrometer; sie kann aber mit herkömmlichen Detektionssystemen ohne Anwendung dieser Erfindung nicht ausgenutzt werden.
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Das Verfahren arbeitet aber nur, wenn bei Sättigung benachbarte Ionensignale nicht ineinander laufen. Das erfordert ein gutes Massenauflösungsvermögen des Flugzeitmassenspektrometers an sich, also ohne die rechentechnische Verbesserung der Massenauflösung. Das ist aber besonders im unteren Massenbereich, in dem die Erweiterung der Messdynamik besonders wünschenswert ist, regelmäßig gegeben.
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Neben diesem sehr einfachen Verfahren, das immer nur einen einzigen Korrekturwert zum Summenspektrum addiert, können auch aufwändigere Verfahren benutzt werden. So ist es durchaus möglich, Korrekturwerte an den Flugzeiten aller in Sättigung befindlicher Messwerte zu addieren. Auch diese Korrekturwerte können durch Kalibriermessungen anhand von Isotopenmustern gewonnen und in geeigneten Tabellen abgespeichert werden. Es findet dann keine Erhöhung der Massenauflösung statt, es können aber quantitativ genauere Messungen gewonnen werden.
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Die Entwicklung von Transientenrekordern geht nicht nur zu schnelleren Aufnahmeraten, sondern auch zu höheren Datentiefen für die Analog-zu-Digital-Wandlung. Es werden hier durchaus 10 oder sogar 12 bit Datentiefe angestrebt. Wenn diese Transientenrekorder auf dem Markt sein werden, wird sich aber durch die weitere Entwicklung der Ionenquellen und der Massenspektrometer bald wieder das Problem mit gesättigten Messwerten stellen. Es kann dann wiederum der Ersatz gesättigter Messwerte durch Korrekturwerte nach dieser Erfindung eingesetzt werden.
