DE102009057274A1

DE102009057274A1 - Gadobutrolherstellung mittels Trioxobicyclo-octan

Info

Publication number: DE102009057274A1
Application number: DE102009057274A
Authority: DE
Inventors: Johannes Dr. Platzek
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2011-06-09
Anticipated expiration: 2029-12-03
Also published as: DE102009057274B4

Abstract

Es wird ein neues Verfahren zu Herstellung von Gadobutrol mittels Trioxobicyclooctan = 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan beschrieben, das in einem Eintopf-Prozess, ohne Zwischen-Isolierung und Zwischen-Aufreinigung von Intermediaten, die Zielverbindung in hoher Ausbeute und Reinheit liefert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Gadoliniumkomplexes des N-(1-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxypropyl)-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetra-azacyclododecans „Gadobutrol” mittels Trioxobicyclo-octan = 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan.
Das MRT-Kontrastmittel Gadobutrol (Gadovist^®1.0) zählt zu den neueren Entwicklungen im Bereich der Gadolinium-haltigen MR-Kontrastmittel ( EP 0448191 B1 , CA Patent 1341176 ). Es wird bei Untersuchungen eingesetzt, die eine hohe Kontrastmittelkonzentration erfordern – z. B. zur Diagnose des Schlaganfalls sowie zur Untersuchung von Gefäßen, z. B. in Tumoren.
Die Kontrastgebende Wirkung beruht auf Gadobutrol, einem nichtionischen Komplex bestehend aus Gadolinium(III) und dem makrozyklischen Liganden Dihydroxyhydroxy-methylpropyl-tetraazacyclododecan-triessigsäure (Butrol) und führt u. a. bei den klinisch empfohlenen Dosierungen zu einer Verkürzung der Relaxationszeiten von Protonen des Gewebewassers.
Wegen ihrer Bedeutung als bildgebende Diagnostika, insbesondere MRI-Diagnostika, ist die Herstellung von Metallkomplexen, insbesondere des Gadoliniumkomplexes, des N-(1-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxypropyl)-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetra-azacyclododecans „Gadobutrol” ( DE 4009119 ) auf verschiedenen Wegen möglich. Trotz erzielter Fortschritte gegenüber den ursprünglichen Verfahren besteht weiterhin ein Bedarf für vor allem im Betriebsmaßstab durchzuführende umweltfreundlichere und kostengünstigere Synthesemöglichkeiten. Vor allen ist ein hoher Bedarf an hohem Produkt-Durchsatz erwünscht, der zu einer optimalen Ausnutzung der Anlagen führt und somit eine semikontinuierliche Reaktionsführung ermöglicht, die sich in hohem Maße kostengünstig auswirkt.
Es wurde gefunden, dass ausgehend von dem literatur-bekannten Cyclen (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan) der Formel 1 ( DE19608307 ), spezifikationskonformes Gadobutrol in hoher Ausbeute ohne Zwischen-Isolierung von Intermediaten hergestellt werden kann und somit den Verfahren, die mit Zwischen-Isolierung
von Intermediaten und Zwischenaufreinigung arbeiten deutlich überlegen sind, vor allem was den Durchsatz und die Produktionszeit betrifft.
Das neue erfinderische Verfahren ist dem nächstliegenden Stand der Technik (Inorg. Chem. 1997, 36, 6086-6093 und DE 19724186.7 ), sowie dem in EP 1343770 B1 beschriebenen Verfahren, bei dem der Butrol-Ligand als Lithium-Komplex isoliert ist, deutlich überlegen, da es durch Verwendung von Keramik-Membranen gelingt, alle Salze und niedermolekularen Verunreinigungen abzutrennen und anschließend direkt eine finale Kristallisation aus Alkoholen durchzuführen. Derartige Keramik-Membranen sind mittlerweise Stand der Technik und sind kommerziell erhältlich (mit unterschiedlichen Cut off Größen; Chemie Ingenieur Technik – CIT, Volume 77 Issue 5, Pages 572–582; Anbieter z. B. TAMI Deutschland GmbH, Heinrich-Hertz-Str. 2–4, 07629 Hermsdorf Deutschland)
In der WO 98/56775 = US 6,042,810 wird ein Verfahren beschrieben, das den nächstliegende Stand der Technik darstellt. Die Nacharbeitung der in den Schriften zitierten Vorschriften war problematisch. Das Schwierige an diesem Verfahren ist die Tatsache, dass durch die drastischen Bedingungen der Amidketal-Bildung mit Triethylorthoformiat neue Typen von Verunreinigungen entstehen, die sich bis in die Endstufe durchschleppen, und dadurch kein spezifikationskonformes Material erhalten werden konnte. Es dürfen keine neuen, unbekannten Verunreinigungen von größer oder gleich 0,1% im Endprodukt enthalten sein. Wäre dieses der Fall liegt ein Batch „out of spec” vor und kann nicht für die Markt-Versorgung verwendet werden. Leider liefert dieses literaturbekannte Verfahren neue Verunreinigungen. Bei der weiteren Reaktion zum Endprodukt, entsteht eine neue Verunreinigung auf der Gadobutrol-Endstufe, die durch doppelte Alkylierung der „DO2A” entsteht. Unglücklicher Weise ist in dieser Verunreinigung durch die beiden hoch hydrophilen sperrigen Reste das positiv geladene Gadolinium-Ion so abgeschirmt, dass diese Verunreinigung mittels Kationenaustauscher nicht mehr abtrennbar ist ! Leider kristallisiert diese Verbindung auf Grund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Gadobutrol mit im Kristallisat aus und lässt sich auch durch Kristallisation nicht abtrennen (ca. 0,3–0,5% im Endprodukt enthalten).
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, das ausgehend von Cyclen analog der Lehre der EP 0596586 mit Trioxobicyclo-octan = 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan umgesetzt wird, anschließend durch Zugabe von Wasser und Lithiumhydroxid die Formyl-Zwischenstufe verseift, anschließend wird mit Chlor- oder Bromessigsäure umgesetzt, wobei als Basenfänger Lithiumhydroxid oder N-Methylimidazol dienen, anschließend im selben Topf mit Salz- oder Bromwasserstoffsäure sauer gestellt und dann mit Gadolinium komplexiert. Nach beendeter Komplexierung wird mit Lithiumhydroxid auf Neutral-pH gestellt und die Lösung an einer Keramik-Membran (Cut off von ca. M = 200) dialysiert. Dabei werden die gesamten niedermolekularen Anteile entfernt. Es wird mehrmals frisches Wasser zugesetzt und solange dialysiert, bis ein Leitwert von < 100 uS (für 2%ige Lösung) erreicht ist. Man konzentriert anschließend auf und führt eine finale Kristallisation aus Ethanol durch.
Da es sich bei Gadobutrol um einen elektrisch neutralen Stoff handelt, kann die Effizienz der Dialyse mittels Leitfähigkeits-Messung erfolgen. Hierzu wird erfahrungsgemäß die Leitfähigkeit einer 2%igen wässrigen Lösung des Produktes zugrunde gelegt. Ist der Wert der Leitfähigkeit < 100 uS, kann der Dialyse-Prozess in der Regel beendet werden. Die evtl. vorhandenen Rest-Spuren werden in der Folge-Kristallisation abgereichert. Die Leitfähigkeit wird mit den handelsüblichen Messgeräten bestimmt (im Technikum, bzw. in der Produktion sind ex-geschützte Geräte im Einsatz. In manchen Fällen wird die Elektrode stationär im Rührwerk, bzw. Dialyse-Modul mit eingebaut).
Derartige eingesetzte Keramik-Membranen (bzw. Membranen mit entsprechender Cut off size) sind bekannt und sind kommerziell leicht erhältlich (mit unterschiedlichen Cut off Größen; Chemie Ingenieur Technik – CIT, Volume 77 Issue 5, Pages 572–582; Anbieter z. B. TAMI Deutschland GmbH, Heinrich-Hertz-Str. 2–4, 07629 Hermsdorf Deutschland). Informationen zu Ultrafiltration und Membranen findet sich in: Bungay P. M. et. Al. „Synthetic Membranes", Science Engineering Application, D. Reidel, C181, 1986, sowie in US 5,447,635 .
Das Verfahren verwendet keine Ionenaustauscher und vermeidet auch die Zwischen-Isolierung vom Butrol-Liganden in freier oder auch in als Lithium-Komplex vorliegender Form, wie in EP 1343770 B1 (nächster Stand der Technik) beschrieben ist.
Die Vorteile dieses Verfahrens sind: hoher Durchsatz, ohne Isolierung und Zwischenreinigung von Intermediaten. Verwendung einer milden Base wie Lithiumhydroxid und deren Salze mit Salz- oder Bromwasserstoffsäure bei weiten weniger korrosiv gegenüber Stahl sind wie z. B. NaCl, das in älteren Verfahren verwendet wird. Die Lithiumsalze können im Prinzip zurück gewonnen werden und anschließend in den Produktions-Kreislauf wieder eingespeist werden. Die Abfall-Bilanz ist gegenüber der Stand der Technik Verfahren noch günstiger, da alles in einem „Topf” läuft, dadurch entfallen Mutterlaugenaufarbeitungen, Reinigung von Filterapparaten etc.. Durch eine genaue Gehaltsbestimmung des Liganden-Gehaltes vor Gadolinium-Komplexierung gelingt es, Gadoliniumhaltige Abwässer zu vermeiden, da die Gadolinium-Menge so dosiert werden kann, dass alles Metall vom Butrol-Liganden komplexiert wird.
Das Verfahren erlaubt es mit einem Rührwerk, einer Keramik-Membran-Dialysestation und einem Filterapparat auszukommen. Eine Zwischenreinigung erfolgt lediglich mit Wasser, es braucht nicht getrocknet werden, sondern direkt der nächste Ansatz gefahren werden. Dieses gewährleistet eine optimale Geräte-Ausnutzung und ermöglicht eine kontinuierliche Fahrweise, da parallel geschaltete Keramik-Membran-Module rund um die Uhr eingesetzt werden können und nach beendeter Filtration gleich mit neuer Rohlösung bestückt werden können. Durch dieses neue erfinderische Verfahren ist es gelungen den Herstellungspreis für Gadobutrol nochmals signifikant zu reduzieren.
Das neue erfinderische Verfahren wird wie folgt angewendet:
Gadobutrol wird hergestellt, indem man Cyclen wie in EP 0596586 beschrieben mit 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan bei Temperaturen zwischen 80 bis 200°C, bevorzugt bei 100–140°C, 8–40 h, bevorzugt 12–30 h umsetzt, anschließend mit Wasser aufnimmt und durch Zugabe von 1 bis 5 eq. LiOH die Formyl-Zwischenstufe bei 50–100°C, bevorzugt bei 100°C, 2–24 h, bevorzugt 8–16 h verseift, anschließend mit Chlor- oder Bromessigsäure versetzt, bevorzugt Chloressigsäure und LiOH, bevorzugt LiOH bei Temperaturen zwischen 40–150°C, bevorzugt bei 40–90°C, einem pH-Wert zwischen 8–14, bevorzugt bei pH-Wert 9–13, innerhalb von 0,5 bis 24 h, bevorzugt 1 bis 6 Stunden umsetzt. Anschließend mit Salzsäure oder HBr auf pH 1–4,5, bevorzugt 2,0–4,0 stellt, 0,5 bis 24 h, bevorzugt 0,5–5 h bei 20–100°C, bevorzugt bei 30–70°C rührt, anschließend eine Gehaltsbestimmung auf Butrol-Ligand durchführt und dann die stöchiometrische Menge eines Gadoliniumsalzes, wie Gadoliniumoxid, Gadoliniumcarbonat, Gadoliniumchlorid, bevorzugt aber Gadoliniumoxid zusetzt und anschließend 1 bis 12 h, bevorzugt 1–5 h bei 50–100°C, bevorzugt bei 70–100°C rührt. Nach beendeter Komplexierung wird durch Zugabe von LiOH (fest oder als aqu. Lösung) auf pH 4–8, bevorzugt aber auf pH 6–7,5 gestellt. Anschließend wird in einer Ultrafiltrations-Anlage über eine keramische Membran mit einem Cut off von M = 100 – 400, bevorzugt aber mit einem Cut off von M = 150 – 250 dialysiert, indem man mit reinem Wasser spült. Nach Erreichung eines bestimmten Leitfähigkeitswertes, bevorzugt < 100 uS für eine (2%ige Lösung) wird via Dialyse aufkonzentriert und final aus Ethanol umkristallisiert. Hierzu wird ein Teil des Wassers gegebenenfalls azeotrop entfernt, wobei das Produkt in der Siedehitze ausfällt. Es wird auf 0 bis 20°C abgekühlt, das Produkt abfiltriert und mit wenig kaltem Ethanol (bevorzugt 0 bis 20°C) nachgewaschen und anschließend getrocknet.
Ein so erhaltenes Produkt zeichnet sich durch hohe Qualität und Reinheit aus und entspricht den geforderten Ansprüchen der Spezifikation.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert:
Beispiel
Zu 24,0 kg (139,34 mol) Cyclen (= 1,4,7,10 Tetraazacyclododecan) in 200 l Toluol gibt am unter Stickstoff 20 l Dimethylformamiddimethylacetal. Es wird langsam hochgeheitzt und das Azeotrop aus Methanol/Dimethylamin/Toluol abdestilliert. Anschließend wird unter Vakuum das Lösungsmittel vollständig abdestilliert. Das zurückbleibende Öl lässt man auf 50°C abkühlen und gibt dann 22,44 kg (147,86 mol) 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan [Trioxobicyclo-octan] (ca. 95%ig vom Gehalt) zu (ebenfalls unter Stickstoff). Dann wird 12 h bei 130°C Manteltemperatur gerührt. Man kühlt auf 40°C ab und gibt 200 l Wasser und 17,53 kg (418,0 mol) Lithiumhydroxid-monohydrat zu. Man kocht 8 h unter Rückfluss, anschließend wird ca. 140 l Wasser im Vakuum abdestilliert, auf Raumtemperatur abgekühlt und weiterverarbeitet.
46,66 kg (493,83 mol) Chloressigsäure werden in 50 kg Wasser gelöst und auf 5°C abgekühlt. Zu dieser Lösung gibt man 20,73 kg (494,1 mol) Lithiumhydroxidmonohydrat zu. Anschließend wird die so hergestellte Lösung zu der oben beschriebenen Lösung zugeben. Das Gemisch wird auf ca. 65°C Innentemperatur erwärmt und bei dieser Temperatur innerhalb von 2 h insgesamt 12,0 kg (286,1 mol) Lithiumhydroxid-monohydrat (ca. 5–6 Portionen) zugesetzt. Danach wird 1 h bei 65°C nachgerührt. Man stellt mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1 und rührt 30 Minuten bei 65°C. Man kühlt auf 20°C ab, stellt mit Lithiumhydroxid-monohydrat auf pH 3,5 und führt anschließend eine Gehaltsbestimmung des Butrol-Liganden (= N-(1-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxypropyl)-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetra-azacyclododecan) per HPLC gegen externen Standard durch. Es ergibt sich umgerechnet ein Gehalt von 94,7%. Anschließend gibt man 23,92 kg (65,97 mol) Gadoliniumoxid zu und rührt 1 h bei 90°C. Nach beendeter Komplexierung (aus der ursprünglichen Suspension wird eine klare Lösung) wird durch Zugabe von Lithiumhydroxid-monohydrat auf pH 7,0 gestellt. Man gibt die auf 20°C abgekühlte Lösung zur Dialyse über eine Keramik-Membran (Cut off M = 200) und dialysiert durch Zugabe von Frischwasser solange, bis eine Leitfähigkeit von < 100 uS (für 2%ige Lösung, Probe nehmen und verdünnen) erreicht ist. Dann wird auf ca. 130 l Gesamtvolumen aufkonzentriert. Zu dieser Lösung gibt man in der Hitze (ca. 80°C) 1350 l Ethanol kocht 5 Stunden unter Rückfluss. Man kühlt auf 10°C ab und filtriert die ausgefallene Kristall-Suspension ab, wäscht 2 mal mit 100 l Ethanol nach.
Der noch Ethanol-feuchte Filterkuchen wird auf dem Filter in 75 l Wasser gelöst und die Lösung über eine Filterkerze filtriert. Anschließend wird 750 l Ethanol zugegeben und 5 h unter Rückfluss erhitzt. Man kühlt auf 10°C ab und filtriert die ausgefallene Kristall-Suspension ab, wäscht 2 mal mit 75 l Ethanol nach und trocknet im Vakuum bei 60°C
Ausbeute: 78,43 kg = 129,69 mol, dieses entspricht 85,1% der Theorie, bezogen auf eingesetztes 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan (auf Wasser und Restlösungsmittel korrigiert) farbloses Kristallpulver.
Wassergehalt (Karl-Fischer): 4,21%
Trockenverlust: 1,08% Elementaranalyse (auf Wasser korrigiert):

Element C H N O Gd

berechnet 35,75 5,17 9,26 23,81 26,00

gefunden 35,83 5,27 9,18 23,72 25,96

HPLC (100%-Methode): > 99%
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0448191 B1 [0002]
CA 1341176 [0002]
DE 4009119 [0004]
DE 19608307 [0005]
DE 19724186 [0006]
EP 1343770 B1 [0006, 0011]
WO 98/56775 [0007]
US 6042810 [0007]
EP 0596586 [0008, 0014]
US 5447635 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Inorg. Chem. 1997, 36, 6086-6093 [0006]
Chemie Ingenieur Technik – CIT, Volume 77 Issue 5, Pages 572–582 [0006]
Chemie Ingenieur Technik – CIT, Volume 77 Issue 5, Pages 572–582 [0010]
Bungay P. M. et. Al. „Synthetic Membranes”, Science Engineering Application, D. Reidel, C181, 1986 [0010]

Claims

Verfahren zur Herstellung des Gadoliniumkomplexes des N-(1-Hydroxymethyl-2,3-dihydroxypropyl)-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetra-azacyclododecans, indem man Cyclen mit 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan umsetzt, in Wasser aufnimmt und durch Zugabe von. Lithiumhydroxid verseift, anschließend mit Chlor- oder Bromessigsäure und Lithiumhydroxid versetzt, einem pH-Wert zwischen 8–14 einstellt, mit Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure auf pH 1–4,5 bringt, bei 20–100°C rührt, anschließend eine Gehaltsbestimmung auf Butrol-Ligand durchführt und danach die stöchiometrische Menge eines Gadoliniumsalzes zugibt und anschließend 1 bis 12 h, bei 50–100°C, rührt, durch Zugabe von Lithiumhydroxid auf pH 4–8, einstellt, mit einer Ultrafiltrations-Anlage über eine keramische Membran mit einem Cut off von M = 100 – 400 dialysiert, nach Erreichung eines bestimmten Leitfähigkeitswertes, bevorzugt < 100 uS für eine (2%ige Lösung) wird via Dialyse aufkonzentriert und umkristallisiert, das Wasser teilweise azeotrop entfernt, abgekühlt, das Produkt abfiltriert und anschließend trocknet.
Verfahren nach Anspruch 1, indem man Cyclen mit 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan bei Temperaturen zwischen 80 bis 200°C, bevorzugt bei 100–140°C, 8–40 h, bevorzugt 12–30 h umsetzt, anschließend mit Wasser aufnimmt und durch Zugabe von 1 bis 5 eq. Lithiumhydroxid die Formyl-Zwischenstufe bei 50–100°C, bevorzugt bei 100°C, 2–24 h, bevorzugt 8–16 h verseift, anschließend mit Chlor- oder Bromessigsäure versetzt, bevorzugt Chloressigsäure und Lithiumhydroxid, bei Temperaturen zwischen 40–150°C, einem pH-Wert zwischen 8–14, innerhalb von 0,5 bis 24 h, 1 bis 6 Stunden umsetzt, anschließend mit Säure auf pH 1–4,5 stellt, 0,5 bis 24 h, bevorzugt 0,5–5 h bei 20–100°C, rührt, anschließend eine Gehaltsbestimmung auf Butrol-Ligand durchführt und dann die stöchiometrische Menge von Gadoliniumoxid, Gadoliniumcarbonat oder Gadoliniumchlorid zusetzt und anschließend 1 bis 12 h, bei 50–100°C, rührt. Nach beendeter Komplexierung wird durch Zugabe von Lithiumhydroxid) auf pH 4–8, bevorzugt aber auf pH 6–7,5 gestellt, anschließend in einer Ultrafiltrations-Anlage über eine keramische Membran mit einem Cut off von M = 100 – 400, bevorzugt aber mit einem Cut off von M = 150 – 250 dialysiert, mit Wasser spült und nach Erreichung eines bestimmten Leitfähigkeitswertes, bevorzugt < 100 uS für eine (2%ige Lösung) wird via Dialyse aufkonzentriert und aus Ethanol umkristallisiert, das Wasser teilweise azeotrop entfernt, wobei das Produkt in der Siedehitze ausfällt, auf 0 bis 20°C abgekühlt, das Produkt abfiltriert und mit Ethanol wäscht und anschließend trocknet.
Verfahren nach Anspruch 1, indem man Cyclen mit 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo-(5.1.0)-octan bei Temperaturen zwischen 80 bis 200°C, bevorzugt bei 100–140°C, 8–40 h, bevorzugt 12–30 h umsetzt, anschließend mit Wasser aufnimmt und durch Zugabe von 1 bis 5 eq. Lithiumhydroxid die Formyl-Zwischenstufe bei 50–100°C, bevorzugt bei 100°C, 2–24 h, bevorzugt 8–16 h verseift, anschließend mit Chlor- oder Bromessigsäure versetzt, und Lithiumhydroxid, bevorzugt Lithiumhydroxid bei Temperaturen zwischen 40–150°C, bevorzugt bei 40–90°C, einem pH-Wert zwischen 8–14, bevorzugt bei pH-Wert 9–13, innerhalb von 0,5 bis 24 h, bevorzugt 1 bis 6 Stunden umsetzt, mit Salzsäure oder HBr auf pH 1–4,5, bevorzugt 2,0–4,0 stellt, 0,5 bis 24 h, bevorzugt 0,5–5 h bei 20–100°C, bevorzugt bei 30–70°C rührt, anschließend eine Gehaltsbestimmung auf Butrol-Ligand durchführt und die stöchiometrische Menge von Gadoliniumoxid, Gadoliniumcarbonat oder Gadoliniumchlorid, bevorzugt aber Gadoliniumoxid zusetzt und anschließend 1 bis 12 h, bevorzugt 1–5 h bei 50–100°C, bevorzugt bei 70–100°C rührt, danach durch Zugabe von Lithiumhydroxid auf pH 4–8, bevorzugt aber auf pH 6–7,5 gestellt, nschließend wird in einer Ultrafiltrations-Anlage über eine keramische Membran mit einem Cut off von M = 150 – 250 dialysiert, indem man mit reinem Wasser spült, und nach Erreichung eines bestimmten Leitfähigkeitswertes, bevorzugt < 100 uS für eine (2%ige Lösung) wird via Dialyse aufkonzentriert, aus Ethanol umkristallisiert, das Wasser teilweise azeotrop entfernt, wobei das Produkt in der Siedehitze ausfällt, auf 0 bis 20°C abgekühlt, das Produkt abfiltriert und mit wenig kaltem Ethanol bei 0 bis 20°C nachgewaschen und anschließend getrocknet.