DE102009017015A1

DE102009017015A1 - Adhäsives Blutstillmittel auf der Basis von Schweine-Atelokollagen und Verfahren zu dessen Herstellung

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Publication number: DE102009017015A1
Application number: DE102009017015A
Authority: DE
Original assignee: IND ACADEMIC COOP; Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Dalim Biotech Co Ltd
Current assignee: IND ACADEMIC COOP; Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Dalim Biotech Co Ltd
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2010-02-04
Anticipated expiration: 2029-04-15
Also published as: US8067374B2; US8809274B2; DE102009017015B4; US20090264921A1; KR100875136B1; US20120010143A1

Abstract

Offenbart wird ein adhäsives Blutstillmittel, das auf nicht aus Blut gewonnenen Bestandteilen einschließlich DOPA basiert und das in der Lage ist, stark an Kollagenfasern zu haften und neben einem veresterten Atelokollagen, welches nicht-immunogen ist und positiv aufgeladen werden kann, so dass das adhäsive Blutstillmittel im Gegensatz zu konventionellen Mitteln, die Blutbestandteile enthalten, keine Möglichkeit hat, bestimmte Krankheiten oder virale Infektionen (HIV, HCV, HBV, CMV, usw.) zu übertragen, sich leicht bei hoher Klebekraft mit negativ geladenen Blutplättchen verbindet und dadurch eine schnelle Blutgerinnung herbeiführt, ein Antifibrinolytikum enthält. Ein Verfahren zur Herstellung desselben wird ebenfalls zur Verfügung gestellt.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein von Blutbestandteilen freies adhäsives Blutstillmittel, das bei chirurgischen Operationen nützlich ist, und auf ein Verfahren zu seiner Herstellung. Schweine-Kollagen wird als ein aktiver Bestandteil des adhäsiven Blutstillmittels verwendet. Um verwendet werden zu können, wird das Schweine-Kollagen dadurch nicht-immunogen gemacht, dass die Telopeptiden daraus entfernt werden. Das resultierende Atelokollagen wird verestert, um darauf positive Ladungen zu erzeugen, die das Kollagen befähigen, sich schneller an negativ geladene Blutplättchen zu binden und dadurch schnell eine Blutstillung auszulösen. Außerdem kann 3,4-Dihydroxyphenylalanin (im Folgenden als ”DOPA” bezeichnet), das sich gegenüber Plasma-Proteinen hochgradig adhäsiv verhält, wenn es sich in einer Salzlösung befindet, für das adhäsive Blutstillmittel auf Kollagenbasis starke Klebkraft und Blutgerinnungsaktivität sicherstellen. Außerdem kann dem adhäsiven Blutstillmittel auf Kollagenbasis ein Antifibrinolytikum in Spuren beigegeben werden.
Ausgehend von der Tatsache, dass die Blutgerinnung beginnt, wenn Blutplättchen mit dem Kollagen, der allgegenwärtigen extrazellulären Matrix, eine Verbindung eingehen, hat die vorliegende Erfindung ein in seiner blutungshemmenden und wundheilenden Wirksamkeit stark verbessertes adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis und ein Verfahren zur Herstellung desselben zum Ziel. Anstelle von Rinder-Kollagen wird Schweine-Kollagen, das von TSE (Transmissible Spongiforme Encephalopathie)-Erregern frei ist, nicht-immunogen gemacht, imdem man die Telopeptiden daraus entfernt, und die Carbonsäuregruppen des nicht-immunogen Kollagens werden mit Äthanol verestert, so dass das Atelokollagen positiv geladen ist und sich daher schnell mit negativ geladenen Blutplättchen verbinden kann, wodurch schnell Blutstillung hervorgerufen wird. Außerdem stellt die Verwendung von DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin), das der Stabilisierung der Kollagenfasern dient, in Kombination mit Salz und einem Antifibrinolytikum für das adhäsive Blutstillmittel auf Kollagenbasis ausgezeichnete Klebefestigkeit und Wundheilungswirkung sicher.
2. Beschreibung verwandter Produkte
Blutstillung und Gewebeklebung sind bei chirurgischen Operationen sehr wichtig, weil sie zu schneller post-operativer Wundheilung und Gewebeverschließung führen. Wie 'Beriplast P' (Aventis), 'Greenplast kit' (Green Cross), 'Tisseel kit' (Baxter AG), 'Tissucol Duo Quick' (Baxter AG), 'TachoSil' (Nycomed) and Tachocomb' (Nycomed) verwenden die meisten konventionellen blutstillenden Bio-Leime oder Bio-Klebstoffe Blutbestandteile wie Fibrinogen, Thrombin usw. und basieren somit auf dem Blutgerinnungsprozess, bei dem Thromboplastin zusammen mit Kalzium Prothrombin zu Thrombin aktiviert, welches wiederum Fibrinogen in Fibrin umwandelt, welches in Anwesenheit von Transglutaminase (Faktor XIII) vernetzt wird und Fibringerinnsel bildet. Weil die Grundstoffe der konventionellen blutstillenden Bio-Leime oder Bio-Klebstoffe aus Blutbestandteilen gewonnen werden und die Möglichkeit haben, mit Viren wie HIV, HBV, HCV und CMV infiziert zu sein, unterliegen die Herstellung der blutstillenden Bio-Leime oder Bio-Klebstoffe sowie die Gewinnung und Lagerung der Grundstoffe strikten Vorschriften.
Insbesondere die blutstillenden Produkte 'Greenplast kit', 'Tisseel kit', 'Tissucol Duo Quick' und 'Tachocomb' enthalten zusätzlich Aprotinin, ein Protein, das aus Rinderlunge isoliert wird, als ein Antifibrinolytikum, verursachen aber Anaphylaxie oder eine schwere allergische Reaktion, wenn auch mit einer sehr niedrigen Auftrittshäufigkeit.
Neuerdings sind blutstillende Mittel, die nicht auf Blutbestandteilen basieren, entwickelt worden und sind kommerziell erhältlich, wie z. B. 'Avitene' (Alcon) und 'Helitene' (Duhamed). Da sie jedoch einzelne Kollagenkomponenten besitzen, sind sie sehr teuer und werden wegen ihrer fehlenden Wirksamkeit als Gewebekleber lediglich als Blutstillmittel verwendet.
Andere blutstillende Mittel kann man im U. S. Pat. No. 5464471 , betitelt ”Fibrin Monomer Based Tissue Adhesive”, 1995, im U. S. Pat. No. 5883078 , betitelt ”Hemostatic and Tissue Adhesive”, 1999, im U. S. Pat. No. 5773033 , betitelt ”Fibrinogen/chitosan hemostatic agents”, 1998, und im U. S. Pat. No. 5605887 , betitelt ”Therapeutic Fibrinogen Compositions”, 1997, finden. Diese Mittel verwenden ebenfalls Blutbestandteile einschließlich Fibrinogen, Thrombin, Gerinnungsmittel, Aprotinin, Rinderproteine und dergleichen und geben damit Anlass zur Besorgnis hinsichtlich der Verunreinigung mit bestimmten Pathogenen und übermäßiger Kosten für die Sicherung und Lagerung der. Materialien und der Herstellung der Produkte. Konventionelle Blutstillmittel, die nicht aus Blut gewonnen sind und Kollagen verwenden, zeigen lediglich blutstillende Effekte, wirken jedoch nicht als Gewebeklebstoffe.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verestertes adhäsives. Blutstillmittel auf Kollagenbasis, das von Blutbestandteilen frei und bei der wundheilenden Blutstillung und dem Wundverschluss wirksam ist, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung zu liefern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen adhäsives Blutstillmittel zu liefern, das auf nicht aus Blut gewonnenen Bestandteilen einschließlich DOPA basiert und in der Lage ist, stark an Kollagenfasern zu haften, und zusätzlich zu einem veresterten Atelokollagen, das nicht-immunogen ist und derart positiv aufgeladen werden kann, dass das adhäsives Blutstillmittel im Gegensatz zu konventionellen Mitteln, die Blutbestandteile enthalten, keine Möglichkeit besitzt, bestimmte Krankheiten oder virale Infektionen (HIV, HCV, HBV, CMV, usw.) zu vermitteln und sich ohne weiteres mit hoher Klebefestigkeit mit negativ geladenen Blutplättchen verbindet und dadurch schnelle Blutgerinnung herbeiführt, ein antifibrinolytisches Mittel enthält.
Die oben genannten Ziele konnten durch die Bereitstellung eines auf nicht aus Blut gewonnenen Bestandteilen basierenden adhäsiven Blutstillmittels erreicht werden, das verestertes Schweine-Atelokollagen, welches im Unterschied zu Rinder-Proteinen frei von TSE (Transmissible Spongiforme Enzephalopathie)-Erregern ist, keine Immunreaktionen verursacht und positv aufgeladen werden kann, wodurch die schnelle Verbindung mit negativ geladenen Blutplättchen ermöglicht wird, L-DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin), das die Stabilisierung von Kollagenfasern bewirkt, wodurch die Klebewirkung des adhäsiven Blutstillmittels verstärkt wird, und ein Salz, das der Förderung der Blutgerinnung dient, enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben erwähnten und andere Objekte, Eigenschaften und anderen Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen klarer verstanden werden. Dabei gilt folgendes:
1a stellt FT-IR Spektren von Atelokollagen (smaragdgrüne Farbe) und verestertem Atelokollagen (braun) dar;
1b ist ein MALDI-TOF Spektrum von Atelokollagen (B-1);
1c ist ein MALDI-TOF Spektrum von verestertem Atelokollagen (B-2);
2 zeigt Blutgerinnung (oberer Abbildungsteil) in Fotodarstellungen (oberer Abbildungsteil) and in Mikrofotogrammen (10.08 x) (unterer Abbildungsteil) in Anwesenheit von Atelokollagen (A, D), succinyliertem Atelokollagen (B, E) und verestertem Atelokollagen (C, F);
3 zeigt die adhäsiven Zustände von verestertem Atelokollagen in Anwesenheit oder Abwesenheit von L-DOPA unter verschiedenen Bedingungen: Kontrollprobe (verestertes Atelokollagen) allein (A), verestertes Atelokollagen + 0,56 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (B), verestertes Atelokollagen + 1 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (C), verestertes Atelo kollagen + 1,5 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (D), verestertes Atelokollagen + 2 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (E), verestertes Atelokollagen + 0,62 Gewichts-% L-DOPA in 0,9 Gewichts-% NaCl (F), verestertes Atelokollagen + 0,67 Gewichts-% L-DOPA in 1,5 Gewichts-% NaCl (G) und verestertes Atelokollagen + 0,71 Gewichts-% L-DOPA in 1 Gewichts-% CaCl₂ (H);
4 zeigt Mikrofotogramme von 3 (10.08 X): Kontrollprobe (verestertes Atelokollagen) allein (A), verestertes Atelokollagen + 0,56 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (B), verestertes Atelokollagen + 1 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (C), verestertes Atelokollagen + 1,5 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (D), verestertes Atelokollagen + 2 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (E), verestertes Atelokollagen + 0,62 Gewichts-% L-DOPA in 0,9 Gewichts-% NaCl (F), verestertes Atelokollagen + 0,67 Gewichts-% L-DOPA in 1,5 Gewichts-% NaCl (G) und verestertes Atelokollagen + 071 Gewichts-% L-DOPA in 1 Gewichts-% CaCl₂ (H); und
5 zeigt Mikrofotogramme von Blut, das unter verschiedenen Bedingungen der Gerinnung ausgesetzt ist: Kontrollprobe 1 (Blut allein, A), Kontrollprobe 2 (Blut + Kollagen, B), Kontrollprobe 3 (Blut + Ca(Na)Cl₂, C), Blut + verestertes Atelokollagen + 0,56 Gewichts-% L-DOPA in destilliertem Wasser (D), Blut + verestertes Atelokollagen + 0,67 Gewichts-% L-DOPA in 1,5 Gewichts-% NaCl (E) und Blut + verestertes Atelokollagen + 0,71 Gewichts-% L-DOPA in 1% CaCl₂ (F).
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN
In Übereinstimmung mit einem Aspekt davon betrifft die vorliegende Erfindung ein adhäsives Blutstillmittel. Im Unterschied zu konventionellen Blutstillmitteln, die Blutbestandteile verwenden, basiert das adhäsive Blutstillmittel auf verestertem Atelokollagen, das durch Entfernung der Telopeptiden und Veresterung aus Schweine-Kollagen hergestellt wurde, wobei die Tatsache zu beachten ist, dass Kollagen im Blutgerinnungsprozess mit Blutplättchen interagiert.
Das adhäsive Blutstillmittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich zu dem veresterten Kollagen von Schweinen weitere funktionale Bestand teile zur Förderung der Blutgerinnung und/oder Verbesserung der Wundheilung, wie z. B. gerinnungsfördernde Mittel, Stoffe zur Verbesserung des Wundverschlusses und Antifibrinolytika enthalten.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt davon betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines adhäsiven Blutstillmittels auf der Basis von Schweine-Kollagen. Das Verfahren beinhaltet das Entfernen immunogener Telopeptiden aus dem Schweine-Kollagen durch Enzym (Pepsin)-Behandlung, um Atelokollagen zu erzeugen und das Umsetzen einer wässrigen Lösung von 0,5–5 Gewichts-% Atelokollagen mit einer Lösung von 65–95 Gewichts-% Athanol bei 4°C für 24–48 Stunden unter Rühren, gefolgt von der Einstellung des pH-Werts der Lösung auf 7,4 mit 0,1–1 Mol/Liter Essigsäure, um das veresterte adhäsive Blutstillmittel auf Kollagen-Basis herzustellen.
Die Veresterung (Esterification) von Atelokollagen für die Verwendung in dem veresterten adhäsiven Blutstillmittel auf Kollagen-Basis der vorliegenden Erfindung wird wie folgt illustriert.
Native Kollagene von Schweinen verursachen Immunreaktionen wegen der mit ihren beiden Enden verbundenen Telopeptiden. Daher ergibt das Entfernen der immunogenen Telopeptiden Atelokollagene, die auf sichere Weise benutzt werden können, ohne Immunreaktionen auszulösen. Außerdem wird Atelokollagen der Veresterung mit Athanol unterworfen, um verestertes Atelokollagen zu ergeben, das bei einem pH-Wert von 7,4 positiv geladen ist und schnell und leicht negativ geladene Blutplättchen binden kann.
Das veresterte Atelokollagen gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf sein Blutgerinnungspotential im Hinblick auf die für die Erzeugung von Blutgerinnseln benötigte Zeit untersucht. Als Referenz werden Atelokollagen und anionisches succinyliertes Atelokollagen benutzt. Wenn succinyliertes Atelokollagen hinzugefügt wurde, wurden keine Gerinnsel gebildet, und bei Atelokollagen wurde die Bildung von Blutgerinnseln nach 4–5 Minuten beobachtet, während das veresterte Atelokollagen nur 2–3 Minuten benötigte, um Blutgerinnsel zu bilden. Also verbindet sich das veresterte Atelokollagen schnell mit Blutplättchen und zeigt ein gegenüber Atelokollagen oder succinyliertem Atelokollagen überlegenes Blutgerinnungspotential.
In Übereinstimmung mit einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung beinhaltet das adhäsive Blutstillmittel der gegenwärtigen Erfindung neben dem veresterten Atelokollagen ein funktionales Material zur Verbesserung der Haftwirkung, Förderung der Blutgerinnung, Verstärkung der Lyse und/oder Hemmung der Fibrinolyse.
30–70 Gewichts-% einer Lösung von 0,5–5 Gewichts-% veresterten Atelokollagens in Wasser werden z. B. mit 30–70 Gewichts-% einer Lösung von 0,1–1 Gewichts-% DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin) in Wasser unter Rühren bei 4°C gemischt, um ein in seiner Haftwirkung verbessertes adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis zu ergeben.
Außerdem kann eine wässrige Salzlösung ein zusätzliches Haftpotenzial für das adhäsive Blutstilmittel auf Kollagenbasis liefern. Hierfür werden 30–70 Gewichts-% einer Lösung, die einen Anteil von 0,5–5 Gewichts-% verestertes Atelokollagen enthält, mit 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die einen Anteil von 0,1–1 Gewichts-% DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin) und einen Anteil von 0,5–5 Gewichts-% eines Salzes enthält, unter Rühren bei 4°C gemischt. Das Salz dient der Steigerung der Löslichkeit von DOPA und kann aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Kalziumchlorid, Natriumchlorid, Kalziumchlorphosphat und Natriumchlorphosphat besteht.
In einer alternativen Ausgestaltung werden 30–70 Gewichts-% einer Lösung, die einen Anteil von 0,5–5 Gewichts-% veresterten Atelokollagens enthält, mit 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die einen Anteil von 0,1–1 Gewichts-% DOPA, einen Anteil von 0,5–5 Gewichts-% eines Salzes und einen Anteil von 0,001–0,1 Gewichts-% eines Kollagen-Fibrinolyse-Inhibitors unter Rühren bei 4°C gemischt, um ein adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis zu erzeugen, das der Kollagen-Fibrinolyse vorbeugt. Außerdem kann sogar eine wässrige Lösung, die einen Anteil von 0,001–0,1 Gewichts-% eines Antifibribolytikums enthält, allein schon dem veresterten adhäsiven Blutstillmittel auf Kollagenbasis die Funktion der Verhinderung von Kollagen-Fibrinolyse verleihen.
Als Kollagen-Fibrinolyse-Inhibitor brauchbar sind bei der vorliegenden Erfindung Tranexamsäure oder Aminocapronsäure.
Es muss unbedingt darauf geachtet werden, dass das Umrühren bei 4°C erfolgt, denn eine höhere Temperatur wird das Kollagen wahrscheinlich zersetzen, während eine niedrigere Temperatur die Löslichkeit des Kollagens herabsetzt.
DOPA, das in dem veresterten adhäsiven Blutstillmittel auf Kollagenbasis der vorliegenden Erfindung als funktionaler Bestandteil dient, wird zu Catecholamin oxidiert, welches wiederum mit einer Lysingruppe des Kollagens verbunden wird, was für das starke Haftvermögen des adhäsiven Blutstillmittels verantwortlich ist. Außerdem kann DOPA Kollagenfasern stabilisieren. Das Salz verbessert die Löslichkeit von DOPA und erhöht damit das Haftvermögen weiter. Beispiele des in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Salzes schließen Kalziumchlorid, Natriumchlorid, Kalziumchlorphosphat und Natriumchlorphosphat ein, wobei Kalziumchlorid Präferenz besitzt. Da sie die Aktivität von Plasminogen hemmen, sind Tranexamsäure oder Aminocapronsäure ((4-Aminomethyl)Cyclohexan-1-Carboxylsäure) in der vorliegenden Erfindung als Antifibrinolytikum brauchbar.
Zusätzliche Funktionen und Wirkungen der in dem adhäsiven Blutstillmittel auf Kollagenbasis der vorliegenden Erfindung verwendeten Bestandteile werden in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann durch die folgenden Beispiele erreicht werden, die dargelegt werden, um die vorliegende Erfindung zu illustrieren, die jedoch nicht als diese begrenzend ausgelegt werden dürfen.
<BEISPIEL 1>
Herstellung von verestertem Atelokollagen mit Äthanol

1. Natives Schweine-Kollagen wurde mit einem Enzym (Pepsin) behandelt, um die Telopeptiden, ein Immunogen, von dessen beiden Enden zu entfernen, wodurch man Atelokollagen erhält.
2. Das Atelokollagen wurde in einer Menge von 2 Gewichts-% einer Athanollösung von 75 Gewichts-% zugegeben, gefolgt von kräftigem Umrühren bei 4°C über 24–48 Stunden.
3. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 0,5 Mol/Liter Essigsäure auf 7,4 einreguliert.

Als Ergebnis erhielt man ein verestertes Atelokollagen, und es konnte allein zur Herstellung eines adhäsiven Blutstillmittels benutzt werden.
Die Veresterung wurde durch FT-IR- und MALDI-TOF-Analysen bestätigt. Es gab eine spektrale Differenz zwischen Atelokollagen und verestertem Atelokollagen.
1 enthält FT-IR- und MALDI-TOF-Spektren von Atelokollagen und verestertem Atelokollagen, die den Unterschied zwischen beiden zeigen. Wie in 1a gesehen, wird ein deutlicher Spitzenwert (Peak) ungefähr bei 1.900–2.400 (durch einen Pfeil gekennzeichnet) abgelesen, während davon verschiedene Werte (durch einen Pfeil gekennzeichnet) auf den Haupt-Spitzen der MALDI-TOF-Spektren von 1b beobachtet werden, womit angezeigt wird, dass das Kollagen verestert war.
<BEISPIEL 2>
Messen der Zeit, die Atelokollagen, succinyliertes Atelokollagen und verestertes Atelokollagen benötigen, um Blutgerinnsel hervorzurufen

1. 2 Gewichts-% Atelokollagen wurden einer PBS-Lösung zugesetzt und bei 4°C 24–48 Stunden lang verrührt.
2. Die resultierende Lösung wurde mit 0,1 Mol/Liter Na₂HPO₄ auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
3. Separat davon wurden 2 Gewichts-% succinyliertes Atelokollagen einer PBS-Lösung zugesetzt und bei 4°C 24–48 Stunden lang verrührt.
4. Die resultierende Lösung wurde mit 0,1 Mol/Liter Na₂HPO₄ auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
5. Dem Ohr eines Kaninchens oder der Bauchvene einer Ratte wurde eine Blutprobe entnommen, und 2 ml davon wurden in eine Petrischale gegeben.
6. Jeweils 1 ml von jeder der auf obige Weise hergestellten Lösungen sowie von der in Beispiel 1 beschriebenen wurde mit den Blutproben gemischt.
7. Die Zeit, die benötigt wurde, um Blutgerinnsel hervorzurufen, wurde gemessen.

Es wurde herausgefunden, dass das veresterte Atelokollagen zwei oder drei Minuten für die Blutgerinnung benötigt, welches kürzer ist als die vier oder fünf Minuten, die vom Atelokollagen für die Blutgerinnung benötigt werden. Hingegen wurden in der Blutprobe, der succinyliertes Atelokollagen zugesetzt wurde, keine Blutgerinnsel gefunden.
2 zeigt Blut unter den oben beschriebenen Gerinnungsbedingungen auf Fotografien (oberer Abbildungsteil) und Mikrofotogrammen (unterer Abbildungsteil).
<BEISPIEL 3>
Haftfestigkeit zwischen verestertem Atelokollagen und DOPA

1. DOPA wurde in Mengen von 0,56 Gewichts-%, 1 Gewichts-%, 1,5 Gewichts-% und 2 Gewichts-% aufgelöst.
2. Destilliertes Wasser, eine Natriumchlorid-Lösung von 0,9 Gewichts-%, eine Natriumchlorid-Lösung von 1,5 Gewichts-% und eine Kalziumchlorid-Lösung von 1 Gewichts-% wurden hergestellt.
3. Eine Menge von 0,62 Gewichts-% DOPA wurde der Natriumchlorid-Lösung von 0,9 Gewichts-% hinzugegeben, gefolgt von Rühren.
4. Eine Menge von 0,67 Gewichts-% DOPA wurde der Natriumchlorid-Lösung von 1,5 Gewichts-% hinzugegeben, gefolgt von Rühren.
5. Eine Menge von 0,71 Gewichts-% DOPA wurde der Kalziumchlorid-Lösung von 1 Gewichts-% hinzugegeben, gefolgt von Rühren.
6. 1 ml des veresterten Atelokollagens wurde jeder Petrischale hinzugegeben.
7. 1 ml von jeder der sieben Lösungen, die DOPA-Lösungen von 0,56 Gewichts-%, 1 Gewichts-%, 1,5 Gewichts-% und 2 Gewichts-% aus 1 und die Lösungen aus 3, 4 und 5, wurden mit 1 ml des veresterten Atelokollagens aus 6 vermischt und auf ihr Adhäsionsverhalten hin beobachtet.

Die höchste Haftfestigkeit wurde bei dem veresterten Atelokollagen, dem 0,71 Gewichts-% DOPA in einer Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% hinzugefügt wurde, beobachtet.
3 und 4 zeigen die Adhäsion zwischen verestertem Atelokollagen und DOPA, das in verschiedenen Salzlösungen gelöst ist.
<BEISPIEL 4>
Adhäsion von Blut, verestertem Atelokollagen und DOPA

1. DOPA wurde destilliertem Wasser in einer Menge von 0,56 Gewichts-%, einer Natriumchloridlösung von 1,5 Gewichts-% in einer Menge von 0,67 Gewichts-%, und einer Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% in einer Menge von 0,71 Gewichts-% zugesetzt, jeweils gefolgt von Rühren.
2. Aus dem Ohr eines Kaninchens oder der Bauchvene einer Ratte entnommene Blutproben wurden in einer Menge von jeweils 1 ml in Petrischalen gegeben.
3. 0,5 ml der in Beispiel 1 beschriebenen und 0,5 ml von jeder der drei Lösungen aus 1 wurden den Petrischalen aus 2 zugesetzt und auf ihr Blutgerinnungs- und Adhäsionsverhalten hin beobachtet.

Es wurde herausgefunden, dass das veresterte Atelokollagen in Zusatzmischung mit 0,71 Gewichts-% DOPA in einer Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% die schnellste Blutgerinnung und Adhäsion verursachte.
5 zeigt Mikrofotogramme des Bluts, das unter verschiedenen Bedingungen der Gerinnung unterworfen ist.
<BEISPIEL 5>
Einfluss von Tranexamsäure auf die Blutgerinnung
Tranexamsäure, ein Blutstillmittel mit antifibrinolytischer Wirkung, wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen verwendet. Dabei wurde die Zeit beobachtet, die benötigt wurde, um Blutgerinnsel herbeizuführen.
– Versuchsbedingung A

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der' 0,71 Gewichts-% DOPA und 0,02 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,71 Gewichts-% DOPA und 0,05 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
4. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,71 Gewichts-% DOPA und 0,1 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
5. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.

Bei allen Mischungen wurde beobachtet, dass sie unmittelbar nach ihrer Zugabe Blutgerinnung verursachten und 1 – 2 Minuten nach der Zugabe sichtbare Blutgerinnsel bildeten. Das Blut wurde in allen Petrischalen vollständig zur Gerinnung gebracht und bildete Blutgerinnsel.
– Versuchsbedingung B

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,67 Gewichts-% DOPA und 0,02 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1,5 Gewichts-%A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,67 Gewichts-% DOPA und 0,05 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1,5 Gewichts-%A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
4. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,67 Gewichts-% DOPA und 0,1 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1,5 Gewichts-%A wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
5. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.

Sobald sie zugegeben wurden, leiteten alle Mischungen die Blutgerinnung ein, aber es dauerte etwa 10 Minuten bis sich Blutgerinnsel bildeten, was sich erheblich von der unter Versuchsbedingung A benötigten Zeit unterschied.
– Versuchsbedingung C

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml von 0,56 Gewichts-% DOPA und 0,02 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltendem destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml von 0,56 Gewichts-% DOPA und 0,05 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltendem destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
4. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml von 0,56 Gewichts-% DOPA und 0,1 Gewichts-% Tranexamsäure enthaltendem destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
5. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.

Blutgerinnung wurde direkt nach Zugabe jeder der Mischungen eingeleitet, aber es dauerte länger als unter Versuchsbedingung A bis sich sichtbare Blutgerinnsel bildeten.
– Versuchsbedingung D

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,71 Gewichts-% DOPA enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1 Gewichts-% wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml der 0,67 Gewichts-% DOPA enthaltenden Kalziumchloridlösung von 1,5 Gewichts-% wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
4. Eine Mischung aus 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 und 0,25 ml von 0,56 Gewichts-% DOPA enthaltendem destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
5. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.

Verglichen mit den Bedingungen, bei denen Tranexamsäure anwesend war, wurde für die Blutgerinnung bis zur Bildung von Blutgerinnseln eine längere Zeit gemessen.
– Versuchsbedingung E

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 1 wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.

Es wurde beobachtet, dass das Blut, im Unterschied zu Blut ohne jede Zusätze, in Gegenwart des veresterten Atelokollagens geronn, jedoch mit geringerer Geschwindigkeit als in Gegenwart von Tranexamsäure.
– Versuchsbedingung F

1. 0,5 ml Blut wurde in jede Petrischale gegeben.
2. 0,25 ml einer Lösung von 0,02 Gewichts-% Tranexamsäure in destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
3. 0,25 ml einer Lösung von 0,05 Gewichts-% Tranexamsäure in destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.
4. 0,25 ml einer Lösung von 0,1 Gewichts-% Tranexamsäure in destilliertem Wasser wurden der Petrischale aus 1 zugegeben.

3. Die Reaktionen in den Petrischalen wurden beobachtet.
Es wurde beobachtet, dass, im Unterschied zu Blut ohne jede Zusätze, das Blut in Gegenwart von Tranexamsäure geronn, jedoch mit geringeren Geschwindigkeiten als in Gegenwart von verestertem Atelokollagen.
Wie oben beschrieben hat das adhäsive Blutstillmittel der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zu konventionellen Mitteln, die Blutbestandteile enthalten, keine Möglichkeit, bestimmte Krankheiten oder virale Infektionen (HIV, HCV, HBV, CMV, usw.) zu übertragen, weil es auf nicht aus Blut gewonnenen Bestandteilen basiert. Das adhäsive Blutstillmittel der vorliegenden Erfindung enthält verestertes Schweine-Atelokollagen, das im Gegensatz zu Rinder-Proteinen von TSE (Transmissible Spongiforme Encephalopathien)-Erregern und Anaphylaxie frei ist, keine Immunreaktionen hervorruft und positiv aufgeladen werden kann, wodurch die schnelle Verbindung mit negativ geladenen Blutplättchen ermöglicht wird, sowie L-DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin), das die Stabilisierung von Kollagenfasern bewirkt, wodurch die Klebewirkung des adhäsiven Blutstillmittels verstärkt wird, und ein Salz, das der Förderung der Blutgerinnung dient. Darüber hinaus verleiht ein Antifibrinolytikum dem adhäsiven Blutstillmittel die Langzeit-Stabilisierung, hohe Klebefestigkeit und ausgezeichnete Wundheilwirkung, wenn es in Kombination mit dem veresterten Atelokollagen verwendet wird.
Obwohl die bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung zur Veranschaulichung offengelegt wurden, werden Fachleute verstehen, dass verschiedene Modifikationen, Ergänzungen und Substitutionen möglich sind, ohne vom Geltungsbereich und Sinn der Erfindung, wie sie in den begleitenden Ansprüchen offengelegt wird, abzuweichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 5464471 [0006]
- US 5883078 [0006]
- US 5773033 [0006]
- US 5605887 [0006]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines adhäsiven Blutstillmittels auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: Entfernen von immunogenen Telopeptiden aus Schweine-Kollagen durch Enzymbehandlung zur Erzeugung von Atelokollagen; Umsetzen einer wässrigen Atelokollagen-Lösung von 0,5–5 Gewichts-% mit einer Athanollösung von 65–95 Gewichts-% bei 4°C über 24–48 Stunden unter Rühren zur Erzeugung von verestertem Atelokollagen; und Einstellen des pH-Wertes des veresterten Atelokollagens auf 7,4 mittels 0,1–1 Mol/Liter Essigsäure.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis, hergestellt unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die das unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellte veresterte Atelokollagen in einer Menge von 0,5–5 Gewichts-% enthält; und 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die 3,4-Dihydroxyphenylalanin in einer Menge von 0,1–1 Gewichts-% enthält.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die das unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellte veresterte Atelokollagen in ei ner Menge von 0,5–5 Gewichts-% enthält; und 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die 3,4-Dihydroxyphenylalanin in einer Menge von 0,1–1 prozentual nach Gewicht (w/w%) und ein Salz in einer Menge von 0,5–2 Gewichts-% enthält.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die das unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellte veresterte Atelokollagen in einer Menge von 0,5–5 prozentual nach Gewicht (w/w%) enthält; und 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die 3,4-Dihydroxyphenylalanin in einer Menge von 0,1–1 Gewichts-%, ein Salz in einer Menge von 0,5–2 Gewichts-% und ein Antifibrinolytikum in einer Menge von 0,01–0,1 Gewichts-% enthält.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die das unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellte veresterte Atelokollagen in einer Menge von 0,5–5 prozentual nach Gewicht (w/w%) enthält; und 30–70 Gewichts-% einer wässrigen Lösung, die ein Antifibrinolytikum in einer Menge von 0,01–0,1 Gewichts-% enthält.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis nach Anspruch 5, wobei das Salz aus einer aus Kalziumchlorid, Natriumchlorid, Kalziumchlorphosphat und Natriumchlorphosphat bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Adhäsives Blutstillmittel auf Kollagenbasis nach Anspruch 7, wobei das Antifibrinolytikum Tranexamsäure oder Aminocapronsäure ist.