KR20170004894A - 조직 접착 및 지혈용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 접착 및 지혈용 조성물에 관한 것으로, 아텔로 콜라겐 및 항혈액 응고에 관련된 인자에 특이적으로 결합 그 기능을 억제하는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조직 접착 및 지혈용 조성물은 감염의 우려가 전혀 없으며, 매우 경제적이고, 간단한 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.

Description

조직 접착 및 지혈용 조성물 {AN ADHESIVE HEMOSTATIC AGENT}

본 발명은 생체적합성 및 기계적 강도가 우수하고 우수한 조직 접착력을 갖는 조직 접착 및 지혈용 조성물에 관한 것이다.

실란트(Sealant)와 지혈제(hemostats)를 포함하는 조직 접착제 분야의 연구개발은 빠르게 성장하고 있다. 1998년 미국 FDA에서 피브린 실란트(Fibrin sealant)가 허가되면서, 매년 새로운 조직 접착제들이 끊임없이 개발되고 있다. 이러한 조직 접착제는 기존에 외과적 또는 내과적 수술에서 사용되고 있는 봉합술, 클립술, 뜸술과 같은 기술을 대체할 수 있는 소재로 각광을 받고 있다.

봉합술 등과 같은 기존의 외과적인 기술은 강한 신장력(strong tensile strength)를 가지지만, 환자의 고통 유발 및 시술 후 제거 등의 문제를 가지고 있다. 반면, 조직 접착제는 빠른 접착시간, 간편한 사용, 시술 후 제거 불필요 등 수 많은 장점을 가지고 있지만 낮은 접착성 및 신장력(low adhesiveness and tensile strength)과 수분이 존재하는 경우 접착성이 현저히 떨어지는 제한점을 가지고 있다. 이러한 조직 접착제의 한계점을 극복하기 위한 연구가 지속되고 있다.

조직 접착제는 조직에 직접 접촉하므로 생체적합성이 요구된다. 또한, 의료용 접착제의 경우에는 통상적으로 생체 내에서 사용되기 때문에 접착이 본질적으로 체액과 혈액 중으로 흘러 들어가면 생체가 직접 관여하므로, 보다 엄격한 조건으로 독성과 위해성이 없어야 하고, 보다 엄밀한 생체 적합성과 생분해성 소재가 요구된다.

현재 상용화 및/또는 실용화되고 있는 조직 접착제는 크게 시아노아크릴레이트 순간 접착제, 피브린 글루, 젤라틴 글루 및 폴리우레탄계 등이 있다. 시아노아크릴레이트 순간 접착제는 최근 들어 고기능성 및 고성능을 갖는 순간 접착제의 연구에서 각광을 받고 있다. 특히, 생체적합성, 유연성 및 저독성의 생체 조직봉합용 의료용 순간 접착제는 지혈, 항균 효과뿐만 아니라 봉합사의 대체도 가능하기 때문에 선진국을 중심으로 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 현재 더마본드(Dermabond; Johnson&Johnson)와 인더밀 (Indermil; US Surgical) 등의 제품으로 상용화되어 있다. 이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 단일 물질로 짧은 시간에 실온에서 개시제 없이 수분에 의해서 경화되고 외관이 투명하고 접착강도가 큰 장점이 있지만, 충격에 약하고 내열성이 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한, 독성이 심해서 현재는 거의 사용되지 않으며 미국을 제외한 다른 국가에서 임상에서 부분적으로 사용하고 있지만 일부 조직 독성과 취약성 때문에 사용이 제한되고 있다.

또, 피브린 글루 접착제는 최초 1998년 미국 FDA에 의하여 심장외과에 응용이 허가되었다. 그 이후, 피브린 조직 접착제에 대한 연구 개발이 활발하게 이루어졌으며, 현재 Tisseel VH (Baxer)와 Evicel TM(Johnson&Johnson) 등과 같은 제품들이 상용화되어 있다. 피브린계 조직 접착제는 시아노아크릴레이트 계열과 함께 조직 접착제 시장의 대부분을 차지하고 있다. 피브린 조직 접착제는 피브린의 가교 반응을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘 및 선용 효소의 저해제를 조직 접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상 응용이 실시되고 있다. 이러한 피브린 글루 접착제는 접착부위의 수분에 영향을 받지 않고 빠르게 접착하고 혈소판과 응고장해가 없고 생체적합성이 우수한 장점을 가지고 있다. 하지만, 접착력이 약하고 생분해속도가 빠르며 혈액의 감염의 위험이 있는 제한점을 가지고 있다.

또, 젤라틴 글루는 생체 유래의 조직 접착제로 젤라틴-레조르시놀-포르말린(GRF)으로 가교시킨 것이 개발되었다. 그 외에서 젤라틴-글루타알데하이드와 같은 조직접착제가 개발되었으나, 조직 접착성은 높지만, 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드이 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 단점을 가지고 있다.

또, 폴리우레탄계 접착제는 경화 후 접합부의 유연성이 유지되는 탄성 접착제 형태로 개발되었다. 이 접착제는 생체 조직 표면의 물을 흡수하여 조직과의 밀착성을 높이고, 물과 반응하여 수분 이내에 경화하며, 경화물이 유연성을 가지는 것이 특징이며, 경화된 접착제가 적절히 생분해되는 장점을 가지고 있다. 하지만, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트가 생체 독성이 있다는 단점을 가지고 있다.

또, 'Avitene'(Alcon), 'Helitene'(두하메드)과 같이 콜라겐 단독 성분의 지혈제들은 비 혈액제제이나 매우 고가이고 단독성분으로서 조직접착효과가 없기 때문에 지혈제로서만 사용하고 있다.

또 다른 종래기술로 "Fibrin monomer based tissue adhesive, US Patent 5464471, 1995", "Hemostatic and tissue adhesive, US Patent 5883078, 1999", "Fibrinogen/chitosan hemostatic agents, US Patent 5773033, 1998", "Therapeu tic fibrinogen compositions, US Patent 5605887, 1997" 등이 소개되고 있지만 이들은 접착성 지혈제의 제품에 피브리노겐, 트롬빈, 혈액응고제, 아프로티닌 등의 혈액제제 및 소유래 단백질 등을 사용함으로써 이때 야기될 수 있는 특정질환의 감염 우려 및 원료확보, 저장, 제조과정 등에 소요되는 과다한 비용으로 제품가격이 고가인 문제점이 있고 비 혈액제제들 중 통상의 콜라겐을 이용한 지혈제도 단지 지혈효과만 있을 뿐 조직접착제로는 사용된 바가 없다.

이러한 단점을 개선하기 위해 한국 특허등록 10-0875136 호 등에서는 아텔로 콜라겐을 에스테르화 시킨 다음 DOPA(3,4-디하이드록시-페닐알라닌) 및 염수용액을 참가한 접착 지혈제를 게시하고 있다.

그러나, 이 경우 아텔로 콜라겐의 접착력은 뛰어나지만 지혈 성능이 우수하지 못한 단점이 있어 지혈을 기능보다는 접착의 기능에 치우쳐 있다 할 수 있었다.

미국특허등록 5464471호 미국특허등록 5773033호 미국특허등록 5605887호 한국 특허등록 10-1103423호 한국 특허등록 10-0875136호

이에 본 발명은 기존의 지혈제와는 달리 특정질환이나 바이러스 감염체를 옮길 수 있는 가능성을 배제하고 저렴하며 간단한 방법으로 제조할 수 있는 조직 접착 및 지혈용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 종래의 접착 지혈제에 비해 탁월한 지혈 효과를 나타낼 수 있는 조직 접착 및 지혈용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 조직 접착 및 지혈용 조성물은 아텔로 콜라겐 및 항혈액 응고에 관련된 인자에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조직 접착 및 지혈용 조성물은 감염의 우려가 전혀 없으며, 매우 경제적이고, 간단한 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 종래의 접착 지혈제에 비해 탁월한 지혈 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 접착 및 지혈용 조성물을 쥐의 간에 적용했을 때의 효과를 나타내는 것으로, A는 적용 전, A는 적용시, 그리고 C는 적용 후의 접착된 상태를 나타내는 것이다.
도 2는 실시예1 의 실험에서 나온 결과 data 이다. 2% esterified atelocollagen+ 1% aptamer in 1% CaCl2 조건에서 용해도가 가장 우수함을 확인하였다.
도 3은 실시예1의 solution의 photomicrographs 이다.
도 4는 절제된 병변의 시간에 따른 접착강도를 대조군과 바교한 데이터로 접착 강도는 시료 적용 후 30초 경과 시부터 양성 대조군과의 차이가 줄어듬을 확인하였다.
도 5는 대조군과 본 조성물의 시간에 따른지혈효과를 간조직의 H&E staining으로 본 결과이다.

본 발명에 사용되는 아텔로 콜라겐의 제조방법에는 특별한 제한은 없으며, 통상 의료용으로 사용되는 아텔로 콜라겐을 사용할 수 있다. 일반적으로는 돼지로부터 추출한 천연콜라겐을 효소(펩신)처리하여 콜라겐 양단에 존재하는 면역반응을 일으키는 텔로 펩타이드(telo-peptide)을 제거한 아텔로 콜라겐을 얻는다.

65~95중량 농도의 에탄올 수용액에 상기 아텔로콜라겐 0.5~5중량% 농도의 수용액을 첨가하여 온도 4℃로 유지하면서 24~48시간 충분히 교반하여 반응액을 0.1~1M의 초산을 이용 pH7.4로 조절한 에스터화 콜라겐을 제조할 수 있다. 상기 아텔로 콜라겐 0.5~5중량% 농도의 수용액 30~70중량%에 0.1~1중량%의 항혈액 응고에 관련된 인자에 특이적으로 결합하는 압타머의 수용액 30~70중량%첨가하여 온도 4℃를 유지하여 교반하면 본 발명의 조직 접착 및 지혈용 조성물을 얻을 수 있다.

압타머는 항혈액 응고에 관련된 인자를 불활성화시킬 수 있는 것, 즉 조직인자계 응고억제자(TFPI), Antithrombin, Activated protein C, Heparin cofactor II 등에 특이적으로 결합하고 그 기능을 억제하는 압타머이면 모두 가능하고 그 종류에 제한은 없다. 예를 들어 Inhibition of tissue factor pathway inhibitor by the aptamer BAX499 improves clotting of hemophilic blood and plasma 등에 게시되어 있다. 염을 첨가하면 압타머의 용해도가 높아지고 또한 더욱 접착이 향상된 조직 접착 및 지혈용 조성물을 얻을 수 있다. 염은 염화칼슘, 염화나트륨, 인산염화칼슘, 인산염화나트륨 중에서 선택되는 하나의 염을 사용할 수 있고, 염화칼슘이 특히 바람직하다. 또한, 그 밖에 0.5~5중량%의 에스터화한 콜라겐 30~70중량%에 섬유소분해 억제제 0.001~0.1중량%의 수용액을 첨가하여 4℃를 유지하여 교반하면 기능성이 향상된 접착성 지혈제를 얻을 수 있다. 여기에서 콜라겐 섬유소 분해 억제제는 6-아미노헥사노익산이 바람직하다.

교반 시의 온도는 4℃ 정도로 유지하는 것이 콜라겐의 변질이 발생하지 않아 바람직하며, 온도가 지나치게 낮으면 용해도가 떨어진다.

<실시 예1>

조직 접착 및 지혈용 조성물의 제조

돼지로부터 추출한 천연콜라겐을 효소(펩신)처리하여 콜라겐의 양단에 존재하는 면역반응을 일으키는 텔로펩타이드를 제거하여 아텔로콜라겐을 얻었다. 75wt% 에탄올 수용액에 상기 아텔로콜라겐을 2중량만큼 첨가한 후 4 ℃에서 24 시간~48 시간 동안 충분히 교반하였다. 0.5M 초산을 이용하여 pH 7.4로 조절하였다. Inhibition of tissue factor pathway inhibitor by the aptamer BAX499 improves clotting of hemophilic blood and plasma에 게시된 압타머를 합성하여 상기 논문에 나와있는 농도의 용액을 제조하였다. 1중량% 염화칼슘 용액에 압타머 적정 농도를 첨가한 후 교반하며 용해시켰다. 0.5~5중량%의 에스터화한 콜라겐 30~70중량%에 섬유소분해 억제제 0.001~0.1중량%의 수용액을 첨가하여 4℃를 유지하여 교반하였다. 페트리디쉬에 아텔로 콜라겐 1mL을 넣는다. 압타머를 용해시킨 용액 1mL를 에스테르화된 아텔로 콜라겐 분산액 1 ml와 섞고 용액에서의 접착상태를 확인하였다.접착력이 우수한 것을 관찰할 수 있었다.

<실시 예2>

조직 접착 및 지혈 성능 시험

토끼의 귀에서 혈액을 채취한 후 페트리디쉬에 혈액 1mL을 넣고 실시 예1의 용액 0.5 mL를 페트리디쉬에 첨가한 후 혈액응고 과정 및 접착 정도를 관찰하였다. 빠른 응고와 접착상태를 관찰할 수 있었다.

<실시 예 3>

SD rat을 이용한 실험을 통해 in vivo 상에서의 효능을 확인

: 8주령의 웅성 백서를 개복한 다음 간의 right lobe를 반지름 1cm, 둘레 0.5cm의 부채꼴 형태로 절제하여 지혈과 접착력을 확인

: 음성 대조군을 제외한 실험군의 절제 부위에 실험 용액을 도포한 다음, 각 시간대 별로 접착을 유지한 후 간을 적출하여 H&E staining을 한 후 조직학적 관찰을 하고 그 결과를 도 1에 게시하였다.

도 1에서 A는 적용 전, B는 적용시, 그리고 C는 적용 후의 접착된 상태를 나타내는 것이다. 본 발명의 조성물이 우수한 접착효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.

Claims (5)

1. 아텔로 콜라겐 및 항혈액 응고에 관련된 인자에 특이적으로 결합하여 그 기능을 억제하는 압타머를 포함하는 조직 접착 및 지혈용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 접착 및 지혈용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 염은 염화칼슘인 것을 특징으로 하는 조직 접착 및 지혈용 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 콜라겐 섬유소 분해 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 접착 및 지혈용 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서, 콜라겐 섬유소 분해 억제제는 6-아미노헥사노익산인 것을 특징으로 하는 조직 접착 및 지혈용 조성물.

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