DE102009008320A1

DE102009008320A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung von Impedanzen biologischer Proben

Info

Publication number: DE102009008320A1
Application number: DE102009008320A
Authority: DE
Inventors: Maik Schmidt; Steffen Schott; Botho Dr. Hirschfeld; Jörg Dr. Kiesewetter; Claus Dr. Dietrich; Michael Dr. Harz; Stojan Dr. Kanev; Andrej Rumiantsev
Original assignee: SUSS MicroTec Test Systems GmbH
Current assignee: Cascade Microtech Dresden GmbH
Priority date: 2008-02-12
Filing date: 2009-02-10
Publication date: 2009-08-27

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Messung von Impedanzen biologischer Proben (3) durch Einspeisung eines Messsignals in die Probe (3) mittels einer geeigneten Sensoranordnung (6) sowie Mitteln zur Einspeisung und Abgriff der Messsignale und Messung des durch die Probe (3) modulierten Messsignals angegeben. Es wird ebenso eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens angegeben. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Messungen dielektrischer und permeabler Eigenschaften von biologischen Proben (3) zu ermöglichen, mit denen auch für hochfrequente Messsignale und auch in HTS-Verfahren definierte Messbedingungen mit geringem Zeit- und Kostenaufwand reproduzierbar einstellbar sind. Zur Lösung dieser Aufgabe wird mittels einer impedanzkontrollierten Wellenleiterstruktur das Reflexions- und/oder Transmissionsverhalten einer Probe (3) ermittelt, indem die Wellenleiterstruktur mittels Prüfspitzen (20) temporär kontaktiert und ein Messsignal mit einer definierten Frequenz eingespeist und ein moduliertes Messsignal abgegriffen und ausgewertet wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von Impedanzen biologischer Proben durch Einspeisung eines Messsignals in die Probe mittels einer geeigneten Sensoranordnung und Messung des durch die Probe modulierten Messsignals. Die Erfindung betrifft ebenso eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die Sensoranordnung, Mittel zur Einspeisung sowie Abgriff der Messsignale und eine geeignete Signaleinheit umfassend.
Impedanzmessungen werden im Rahmen der Impedanzspektroskopie sowohl an biologischen und biomedizinischen Systemen als auch in der Biochemie und Biophysik zur Untersuchung von Ionentransportvorgängen eingesetzt. Impedanzanalysatoren bieten die Möglichkeit, die frequenzabhängige Leitfähigkeit und die frequenzabhängige Dielektrizität einer Probe im Frequenzbereich von einigen mHz bis zu einigen MHz zu ermitteln. Die Zustände des biologischen, biomedizinischen oder elektrochemischen Messobjekts und ebenso molekulare oder zellulare Ereignisse im Messobjekt werden in einer geeigneten Messzelle untersucht. Dabei tragen alle Phasen des Materials zwischen der Arbeitselektrode am Messobjekt und einer Gegenelektrode ihren Teil zur gemessenen Gesamtimpedanz bei, z. B. die Ionenkonzentration in einem Elektrolyten, die dielektrische Eigenschaften von Grenzschichten oder Durch tritts- und Diffusionsprozesse. Aus solchen Impedanzbeiträgen können so verschiedene Zustände und Ereignisse des Messobjekts herausgelesen werden und es sind Rückschlüsse auf Mechanismus und Kinetik beteiligter Vorgänge möglich.
Des Weiteren bilden die passiven elektrischen Eigenschaften biologischer Proben (Gewebe, Zellen, Zellsuspensionen, Moleküle und deren molekulare und zellulären Ereignisse) im Zusammenhang mit den morphologischen Eigenschaften einen messbaren Parameter für Untersuchungen zur Vitalität eines biologischen Systems. Die Nutzung der Bio-Impedanzspektroskopie für Frequenzen von einigen kHz bis in den MHz-Bereich liefert ein relativ spezifisches Messsignal, das u. a. Auskunft über die Zellzahl und den Zustand von Zellmembranen gibt und somit die Bestimmung der Aktivität und der Lebensfähigkeit von Zellen ermöglicht.
Der Begriff „biologische Probe", im Folgenden auch nur als „Probe" benannt, kennzeichnet alle sich in einem Medium oder Puffer befindlichen Materialien biologischen Ursprungs, die im Folgenden als Target bezeichnet sein sollen. Dies umfasst u. a. Moleküle, Proteine, Aminosäuren, Antikörper und Antigene, Nukleinsäuren, Zellen, Spheroide, Mikroorganismen, Viren, Pilze, Gewebeschnitte und Gewebe- und Organsegmente von Interesse die in einem festen, flüssigen oder gasförmigen Medium oder Puffer kultiviert, gelöst oder emulgiert sind. Die verwendeten Medien oder Puffer können dabei natürlich oder synthetisch sein. Flüssige Medien oder Puffer können als wässrige oder organische Lösungen, als auch ionische Flüssigkeiten oder Gele vorliegen. Sie können aus natürlichen oder künstlichen Polymerstrukturen bestehen oder diese enthalten. Beispiele für natürliche Polymere sind Zellulosen und Dextrane sowie andere Makromoleküle, die aus natürlichen Monomeren aufgebaut sind. Künstliche Polymere umfassen dabei beispielsweise Nylon^®, Teflon^® oder andere aus nichtnatürlichen Monomeren aufgebaute Makromoleküle sowie Hydrogele. Der Begriff „Moleküle" umfasst dabei alle biologisch relevanten Moleküle natürlichen oder synthetischen Ursprungs.
„Molekulare Ereignisse" kennzeichnen alle Interaktionen (molekulare Bindungen, elektrostatische Wechselwirkungen, etc.) zwischen dem interessierenden Molekül und einem anderen Molekül, Protein oder sonstigem biologischen Material in dessen Folge es zu einer Veränderung der strukturellen Eigenschaften des interessierenden Targets kommt. Molekulare Bindungen umfassen alle nicht-kovalente und kovalenten Bindungstypen zwischen mehreren Molekülen.
„Zelluläre Ereignisse" umfassen alle Reaktionen und strukturellen Veränderungen als Ergebnis der Aktivität lebender Zellen. Dies schließt den Zelltod durch Nekrose oder Apoptose ein. Beispiele für zelluläre Ereignisse sind das Öffnen und Schließen von Ionenkanälen, Transportprozesse in und aus der Zelle (z. B. durch Endo-, Exo- und Phagozytose), Transkriptionsregulation infolge veränderter Umweltbedingungen, etc.
Bekannte bioelektrische Sensoren, als Biosensoren bezeichnet, sind häufig als Kondensator ausgebildet, an dessen Elektrodenplatten sich Schichten der Probe anlagern und die Kapazität des Biosensors ändern. Die Änderung wird gemessen mittels eines elektrischen Signals, meist eines Wechselspannungssignals geringer Frequenz, das vor und nach einer festzustellenden Zustandsänderung in der Probe oder einem fraglichen Ereignis gemessen wird. Im Vergleich zu derartigen Biosensoren sind mit solchen, die Signale höherer Frequenzen verwenden deutlich mehr und gezieltere Informationen über die biologische Probe zu gewinnen.
Aus diesem Grund werden gegenwärtig Biosensoren verwendet, mit denen auch hochfrequente Signale in die Probe eingespeist und von der Probe empfangen werden können ( US 2003/0040004 A1 ). Aufgrund der Welleneigenschaften dieser Signale haben die Strukturen und die physikalischen Eigen schaften der Leiter ebensolchen Einfluss auf eine Messung, wie deren Kontaktierungen und die elektromagnetische Umgebung. Diese Anforderungen in Analyseverfahren mit hohen Durchsätzen, so genannten High-Throughput-Screening-(HTS-)Verfahren, zu gewährleisten und für die Vergleichbarkeit der Messungen z. B. an einer Referenzprobe oder einem Ausgangszustand und der späteren interessierenden Probe über einen Zeitraum oder verschiedene Sensoren konstant zu realisieren, benötigt viel Messzeit oder ist nur in Grenzen möglich. Häufig liegen bei solchen Impedanzmessungen die Messfehler in der Größenordnung des Messsignals, wodurch der durch hochfrequente Signale gewonnene Informationsgehalt durch die damit verbundene Messunsicherheit und die hohen Kosten in Frage gestellt werden.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung dielektrischer und permeabler Eigenschaften von biologischem Proben anzugeben, mit denen auch für hochfrequente Messsignale und auch in HTS-Verfahren definierte Messbedingungen mit geringem Zeit- und Kostenaufwand reproduzierbar einstellbar sind.
Das nachfolgend beschriebene Verfahren und dazu verwendeten Vorrichtungen beruhen auf dem Step-and-Repeat-Verfahren so genannter Prober, die aus der Halbleitertechnologie bekannt sind. Zur Messung von Objekten wird ein temporärer elektrischer Kontakt zwischen einer oder mehreren Prüfspitzen und dem Objekt hergestellt, um nach erfolgter Messung das nächste Objekt mit den Prüfspitzen anzufahren und die Kontaktierung und darauffolgende Messung zu wiederholen. Das vorgestellte Verfahren und die Vorrichtungen gestatten die Anwendung dieses Messprinzips auf die Impedanzmessung an biologischen Proben.
Mittels des Step-and-Repeat-Verfahrens können die Messmethode deutlich vereinfacht und deren Empfindlichkeit sowie Reproduzierbarkeit erhöht werden, da bei jeder Wiederholung die Messung einer weiteren Probe unter identischen Messbedingungen realisierbar ist, ohne signalverfälschende Umschalter oder Multiplexer verwenden zu müssen. Das beanspruchte Verfahren eröffnet in Verbindung mit den verwendeten Biosensoren sowie den Vorrichtungen, in welchen die Biosensoren eingesetzt werden, die Möglichkeit eines schnellen Tests einer großen Anzahl von Biosensoren in kurzer Zeit und ebenso die reproduzierbare Ausführung von Langzeitmessungen, z. B. zur Untersuchung eines zeitlichen Verlaufs eines zellulären Ereignisses.
Des Weiteren sind zahlreiche Anpassungen und Optimierungen der Vorrichtungen und Testeinrichtungen sowie des Verfahrens selbst an die Anforderungen sehr unterschiedlicher Messaufgaben ebenso möglich wie eine optimale Adaption verschiedenster, zum Teil sehr empfindlicher Messgeräte an eine Testeinrichtung. Eine geschirmte Messumgebung gestattet auch Messungen passiv abgeleiteter Signale, wodurch die Beeinflussung des Messergebnisses minimiert und selbst Messungen im Kleinstsignalbereich, d. h. im Bereich von z. B. Femtoampere, Nanovolt oder Terraohm möglich werden. Mit der vorgeschlagenen Testeinrichtung kann eine Kalibrierung bis zur Probe hin erfolgen, womit die statistische Sicherheit der Messungen und deren Reproduzierbarkeit optimiert werden, so dass HTS-Verfahren mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit auch automatisiert realisierbar sind.
Darüber hinaus sind in der Testeinrichtung Messparameter, wie Lichteinfall, die Temperatur der Proben oder die Umgebungsfeuchte für die gesamte Messdauer und sofern erforderlich auch für eine Zeit vor oder nach der Messung mit geeigneten Ausgestaltungen der Testsysteme gezielt einstellbar. Auch Spülungen der Messumgebung mit Gasgemischen definierter Zusammensetzung oder mit Inertgas sind realisierbar.
Die Einstellung einer von der Umgebungsluft abweichenden Gaszusammensetzung innerhalb einer Testeinrichtung z. B. Luft mit 5% Kohlendioxidgehalt und gesättigter Luftfeuchte bei 37°C Messtemperatur, was den natürlichen Bedingungen biologischer Proben entspricht, und ebenso die Spülung der Messumgebung ist entsprechend einer Ausgestaltung der Testeinrichtung über eine Gaszufuhr in das Gehäuse und ein kontrolliertes Abströmen aus dem Gehäuse entweder durch besondere Gasauslässe oder durch undichte Anschlussstellen des nicht gasdicht ausgeführten Gehäuses möglich. Die Einstellung der Gaszusammensetzung im Gehäuse kann hierbei über die Messung der Konzentration einzelner Bestandteile des Gasgemisches mittels geeigneter Sensoren und die Steuerung der Mischung und/oder der Temperierung des eingelassenen Gases erfolgen. Sofern nichttoxische Gase zum Einsatz kommen, ist ein einfaches Abströmen in die Umgebung möglich. Alternativ kann auch ein definiertes Absaugen des Gases oder Gasgemisches aus dem Gehäuse durch eine Abströmöffnung erfolgen.
In einer alternativen Ausgestaltung der Testeinrichtung ist das Gehäuse gasdicht ausgeführt, so dass in dem abgeschlossenen Volumen innerhalb des Gehäuses eine definierte Messatmosphäre hinsichtlich Zusammensetzung und Temperatur eingestellt und aufrechterhalten wird. Auch hier kann die Messatmosphäre mittels geeigneter Sensorik überwacht werden. Im Folgenden sollen Verfahren und Vorrichtungen in ihrer Wirkung und Ausführung anhand von Ausführungsbeispielen verdeutlicht werden. Die zugehörigen Zeichnungen zeigen in
1A bis 1C verschiedene Sensoranordnungen mit Wellenleiterstrukturen zur Reflexionsmessung;
2A und 2B weitere Sensoranordnungen mit Wellenleiterstrukturen zur Reflexionsmessung;
3A und 3B weitere Sensoranordnungen mit Wellenleiterstrukturen zur Transmissionsmessung;
4 ein Teil eines Sensorarrays mit drei Sensoranordnungen mit zweitorigen Wellenleiterstrukturen;
5 ein Teil eines Sensorarrays mit drei Sensoranordnungen mit eintorigen Wellenleiterstrukturen;
6A und 6B Vorrichtungen zur Messung von Impedanzen biologischer Proben mittels Transmissions- und Reflexionsmessung;
7 einen Ausschnitt eines Sensorarrays mit einer Messspitze und
8 eine Testeinrichtung zur Messung von Impedanzen biologischer Proben.
Zur Messung der Impedanz der interessierenden biologischen Probe wird eine Sensoranordnung 6 verwendet, die eine Wellenleiterstruktur aufweist. Mittels der Wellenleiterstruktur sind Frequenzsignale im Bereich von wenigen μHz bis zu einigen Hundert GHz von einer Signaleinheit, die konfiguriert ist solche Signale zu erzeugen, in die biologische Probe 3 zu leiten. Derartige Wellenleiterstrukturen umfassen stets eine Signalleitung S und eine oder mehr Groundleitungen G. Auch komplexere Wellenleiterstrukturen mit mehr als einer Signalleitung S sind anwendbar, der Einfachheit halber soll hier jedoch nur auf den Fall einer Signalleitung S eingegangen werden. In dieser Wellenleiterstruktur breitet sich das Signal als elektromagnetische Welle aus und wird in die Probe 3 eingespeist aufgrund der elektromagnetischen Kopplung zwischen Wellenleiterstruktur und Probe 3.
Die elektromagnetische Welle wird an der Anschlussstelle zur Probe 3, als Tor 10 bezeichnet, größtenteils reflektiert und breitet sich nur zu einem geringen Teil in der Probe 3 aus, sofern dem einen Tor 10 ein weiteres Tor 10 der Wellenleiterstruktur gegenübersteht (4). Dazu weist die Wellenleiterstruktur eine weitere Signalleitung S auf, deren offenes Ende dem offenen Ende der ersten Signalleitung S beabstandet gegenüberliegt. Aufgrund des hohen Reflexionsanteils des Signals erfolgt mit einer solchen Wellenleiter struktur eine Reflexionsmessung und aufgrund der beschriebenen Wellenleiterstruktur an einem Zweitor. Werden weitere Signalleitungen S in einer Wellenleiterstruktur verwendet, erfolgen die Messungen an einem n-Tor.
Eine Reflexionsmessung erfolgt auch mit solchen Wellenleiterstrukturen, bei denen eine Signalleitung S in der Probe endet ohne dass ihr eine zweite Signalleitung S gegenüber steht (1, 2 und 5). Die Reflexionsmessungen an diesen Wellenleiterstrukturen erfolgen an einem Eintor. In diesem Fall stellt die Probe 3 den Abschluss der Wellenleiterstruktur dar, so dass die sich darin ausbreitende Welle am Abschluss reflektiert wird.
Verschiedene mögliche Wellenleiterstrukturen zur Reflexionsmessung sind in den 1A bis 1C sowie 2A und 2B dargestellt. Der Abschluss der Wellenleiterstrukturen in 1A bis 1C ist offen, in der HF-Technik als Open bezeichnet, während er in den Wellenleiterstrukturen der 2A und 2B als Kurzschluss der Signal- und Groundleitungen S, G realisiert ist, bezeichnet als Short. Die 1A und 2A weisen eine Signal-Groundstruktur auf, die sich von den Ground-Signal-Ground-Strukturen in 1B, 1C und 2B unter anderem dadurch unterscheiden, dass die Feldliniendichte des elektromagnetischen Feldes zwischen der Signal- und der Groundleitung S, G dichter ist, so dass die Empfindlichkeit der Messung erhöht ist. Im Vergleich zu Wellenleiterstruktur in 1B stellt die Ausführung in 1C eine Variation der Gestaltung des Groundleiters G dar, mit der Lage und Dichte der Feldlinien in Bezug auf die Lage des Targets, d. h. des zu messenden biologischen Materials, variierbar sind.
Die Wellenleiterstruktur zur Messung des Transmissionsverhaltens ist in 3 beispielhaft dargestellt. Der Transmissionspfad wird in 3A durch den Signalleiter S gebildet. In Abhängigkeit von den dielektrischen Eigenschaften der Probe 3 kann auch ein Teil des Transmissionspfades durch die Probe selbst gebildet sein, die den Signalleiter S umgibt und sich so auch in einer Lücke des Signalleiters S befindet (3B). Bei einer solchen Messung ist das Messsystem einschließlich der Probe 3 so zu konfigurieren, dass der an der Lücke im Signalleiter S reflektierte Anteil des Signals deutlich geringer ist, als der durchlaufende Anteil.
Die zu untersuchende Probe 3 wird mittels einer geeigneten Probenaufnahme 4, die in den Figuren nur schematisch angedeutet ist und wie unten beschrieben verschieden ausgeführt sein kann, so auf der Wellenleiterstruktur angeordnet, dass sich das Target 5, z. B. Zellen im Bereich zwischen den Signalleitungen S am Zweitor oder zwischen Signal- und der oder den Groundleitungen S, G am Ein- oder Zweitor anhaften kann oder zumindest dort angeordnet ist, so dass das Dielektrikum, das die Signalleitung S umgibt und insbesondere im Bereich zwischen den Leitungen durch die dielektrischen Eigenschaften des Targets 5 bestimmt werden. Auf diese Weise werden das Frequenzsignal und dessen Amplitude als Maß der Leistung durch eine Änderung der dielektrischen Eigenschaften des Targets 5 infolge eines molekularen oder zellulären Ereignisses moduliert.
Durch die Impedanzmessung sollen Eigenschaften des Targets 5 ermittelt werden. Da es jedoch in einem Medium vorliegt betrifft die Messung immer die gesamte Probe 3, d. h. Target 5 und Medium. Zur Ermittlung der interessierenden Targeteigenschaften wird deshalb durch geeignete, unten beschriebene Maßnahmen der Einfluss des Mediums berücksichtigt.
Die reflektierten und transmittierten Wellen werden an dem jeweils freien Ende des einen oder beider Signalleiter S, d. h. an den Enden der Signalleiter S an denen die Probe 3 nicht anliegt, mittels jeweils einer Prüfspitze (hier nicht dargestellt) abgegriffen und der Messung und Auswertung zugeführt. Bezogen auf die obige Beschreibung der Zwei- und Eintor-Messungen werden somit zur Transmissionsmessung zwei Prüfspitzen an den beiden Enden der Wellenleiterstruktur und zur Reflexionsmessung eine Prüfspitze an dem einen freien Ende kontaktiert. Zur Gestaltung der Prüfspitzen und deren Kontaktierung der Wellenleiterstrukturen wird auf die Erläuterungen zu 6A und 6B verwiesen.
Eine solche Messung der an einem Ein-, Zwei- oder n-fachen Tor reflektierten und durch eine Probe 3 hindurch laufenden elektromagnetischen Welle zur Charakterisierung der Probe 3 ist aus der Prüfung elektronischer Hochfrequenzbauelemente bekannt. Häufig werden hier Wellenleiterstrukturen mit einer Systemimpedanz von 50 oder 75 Ω verwendet. Diese können auch in dem beschriebenen Impedanzmessverfahren biologischer Proben verwendet werden. In Analogie zur Analyse elektronischer Netzwerke wird in dem beschriebenen Verfahren die Probe 3 als Bauelement bzw. elektrisch, technische Ersatzschaltung betrachtet und die interessierenden molekularen oder zellularen Zustände oder Ereignisse anhand der Änderung des Reflexions- und Transmissionsverhaltens der Probe 3 ermittelt.
Die Wellenleiterstrukturen kann in einer Ausführungsform mit lithografischen Mitteln oder im Druckverfahren auf einem geeigneten Trägersubstrat als koplanare Struktur hergestellt werden. Auch dreidimensionale Strukturen sind für die Impedanzmessung verwendbar. In diesem Fall weisen die Leitungen eine definierte Dicke auf.
Derartige Wellenleiterstrukturen sind impedanzkontrolliert herstellbar, d. h. deren physikalische Eigenschaften, wie Länge, Querschnitt oder Leitungsführung sind reproduzierbar und somit auch bei einer Vielzahl von Wellenleiterstrukturen identisch herstellbar. Da zur Herstellung einer Verbindung zwischen jeder Wellenleiterstruktur und der für jede Einzelmessung erneut verwendeten Prüfspitze oder Prüfspitzen eine Zustellung zwischen beiden erfolgt, sind für jede der Wellenleiterstrukturen identische physikalische Verhältnisse und damit einheitliche Leitungsimpedanzen, z. B. 50 oder 75 Ω, zwischen Probe 3 und Signaleinheit realisierbar. Das stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber bekannten Systemen dar, in welchen die einzelnen Kontaktstellen zur Probe 3 über Leitungen unterschiedlicher Länge und Gestalt mit einem zentralen Kontakt verbunden sind, an dem die Signaleinheit angeschlossen und ein Kontakt durch Schalten hergestellt wird. Solche unterschiedlichen Leitungen weisen unterschiedliche Impedanzen auf, die rechnerisch oder durch zusätzliche Messungen berücksichtigt werden müssen und zwar für jeden einzelnen Kontakt.
Die in der beschriebenen Vorrichtung verwendeten impedanzkontrollierten und identischen Leitungs- und Wellenleiterstrukturen gestatten im Zusammenhang mit der Zustellbewegung die einmalige rechnerische oder messtechnische Berücksichtigung der Leitungsimpedanzen, die dann auf jede der Messungen übertragen werden kann. Erfolgen Referenzmessungen an bekannten Proben und wird ein molekulares oder zellulares Ereignis durch Vergleich mit der Referenzmessung ermittelt, kann aufgrund der Verwendung identischer Wellenleiterstrukturen die Leitungsimpedanz jeder einzelnen Wellenleiterstruktur, wie auch den des Mediums oder Puffers, vollständig unberücksichtigt bleiben. Referenzmessungen können wegen der Identität der Messstrukturen sowohl seriell als auch parallel in gleichen oder verschiedenen Messstellen mit denselben oder mehreren Prüfspitzen erfolgen.
Für die Wellenleiterstrukturen können, aufgrund der Möglichkeit der indirekten Verbindung zwischen Wellenleiterstruktur und Probe 3 durch elektromagnetische Kopplung, die neben der direkten galvanischen Verbindung besteht, sehr unterschiedliche Materialien verwendet werden, sofern diese ein hochfrequentes Signal mit begrenztem Verlust weiterleiten können. Aus diesem Grund kann auch jedes biokompatible Material verwendet werden. Eine elektromagnetische Kopplung liegt dann vor, wenn zwischen Probe 3 und dem elektrisch leitfähigen Material der Wellenleiterstruktur eine die lektrische Schicht angeordnet ist. Solch eine Schicht kann z. B. durch eine Passivierung des Leitungsmaterials oder durch eine Gestaltung der Probenaufnahme gebildet sein, die einen direkten Kontakt ausschließt.
Die beschriebene Wellenleiterstruktur ist in der Lage, sowohl hochfrequente als auch niederfrequente Signale in die Probe 3 zu übertragen, so dass die Sensoranordnung für die verschiedensten Anwendungsgebiete verwendbar ist, bei denen sich solche Änderungen im Signal, die durch die zu untersuchenden Zustandsänderungen oder Ereignisse hervorgerufen werden, in sehr unterschiedlichen Frequenzbereichen feststellen lassen. Dementsprechend durchläuft das Signal ein definiertes Frequenzband in dem oben benannten Frequenzbereich während der Messung. Für andere Messungen, z. B. zur Ermittlung einer Resonanzfrequenz, wird zur Impulsimpedanzmessung ein Signalpuls in die Probe 3 geleitet und das empfangene, modulierte Signal fouriertransformiert. Für solch eine oder vergleichbare Messungen, in denen eine hohe Empfindlichkeit für die interessierenden Frequenzen erforderlich ist, können die Wellenleiterstrukturen alternativ angepasste Gestaltungen aufweisen. Auch solche Strukturen wie Interdigitalelektroden sind in den beschriebenen Sensoranordnungen und für das beschriebene Verfahren anwendbar.
Zur Einspeisung des Signals in die Probe 3 weist die Sensoranordnung eine Probenaufnahme 4 auf, die so ausgestaltet ist, dass die Probe 3 jeweils einen Abschnitt an den Enden des einen oder beider Signalleiter S und der zugehörigen Groundleitungen G überdeckt und in diesem Bereich eine Kultivierung der Probe 3, je nach Art der Probe 3 z. B. durch Adhäsion oder Schütteln, erfolgen kann. Solche Probenaufnahmen 4 können verschiedenartig gestaltet sein, z. B. Kavitäten, die in das Trägersubstrat 1 der Signal- und Groundleitungen S, G eingebracht sind, so dass jeweils ein Abschnitt dieser Leitungen in den Kavitäten verläuft.
Alternativ sind auch Behältnisse verwendbar, die auf der Sensoranordnung 6 im betreffenden Bereich mittels gängiger Aufbau- und Verbindungstechniken fixiert sind. Aufgrund der sehr klein herstellbaren Strukturen der Wellenleiter sind auch sehr kleine Volumina für eine Messung ausreichend. Dies ist insbesondere für die HTS-Verfahren von Vorteil, wo eine Vielzahl von Proben auf einem Substrat angeordnet und gemessen werden.
In diesen Ausgestaltungen der Sensoranordnung 6 und deren Probenaufnahme 4 sind die Abschnitte der Signal- und Groundleitungen S, G, die mit der Kontaktspitze 20 zur elektrischen Kontaktierung der Wellenleiterstruktur in Berührung kommen, von der Probe 3 nicht bedeckt. Damit wird eine Querkontamination zwischen den einzelnen Proben 3 eines Sensorarrays infolge Kontaktierung mehrerer Wellenleiterstrukturen nacheinander mit derselben oder denselben Prüfspitzen vermieden.
Die Kontaktierung der Wellenleiterstrukturen zur Einspeisung und zum Abgriff eines Signals ist in den 6A und 6B dargestellt. In 6A ist eine auf einem Trägersubstrat 1 ausgebildete Wellenleiterstruktur zur Transmissionsmessung dargestellt, die eine mittig unterbrochene Signalleitung S und beidseitig davon zwei durchgehende Groundleitungen G aufweist, vergleichbar 3B.
Im mittleren Bereich der Wellenleiterstruktur ist eine Probe 3 in einer Probenaufnahme 4 angeordnet. Die Probenaufnahme 4 ist als flacher, oben und zum Trägersubstrat hin offenen zylindrischer Behälter auf dem mittleren Bereich der Wellenleiterstruktur montiert, so dass alle drei Leitungen abschnittsweise im Inneren der Probenaufnahme 4 verlaufen und das Target 5 die Unterbrechung der Signalleitung S überbrückt. Im Bereich der Unterbrechung der Signalleitung S wurde dazu mittels biokompatiblen Materials ein Target 5 ausgebildet, das sich über alle drei Leitungen erstreckt.
Die freien, von der Probenaufnahme 4 nicht bedeckten Enden der Signalleitungen S und der Groundleitungen G dienen der elektrischen Verbindung der Wellenleiterstruktur durch eine oder mehr Prüfspitzen 20. Zu diesem Zweck werden zwei Prüfspitzen 20, jeweils einen Signalfinger SF und zwei Groundfinger GF hinsichtlich Anzahl und Lage entsprechend der Wellenleiterstruktur aufweisend, so auf die beiden freien Enden der Wellenleiterstruktur aufgesetzt, dass jeweils ein Signalfinger SF eine Signalleitung S und jeweils ein Groundfinger GF eine Groundleitung G kontaktiert. Mit dieser Anordnung sind ein Transmissionsanteil und alternativ auch ein Reflexionsanteil eines eingespeisten Signals zu messen.
6B stellt eine Wellenleiterstruktur zur Reflexionsmessung an einem Eintor dar, das wie oben zu 1C beschrieben einen offenen Abschluss aufweist. In dieser Ausgestaltung ist eine zu 6A vergleichbare Probenaufnahme 4 über dem Ende der Signalleitung S und der darum verlaufenden Groundleitung G montiert, so dass ein zentrales Target 5 den Spalt zwischen Signal- und Groundleitung S, G am offenen Ende der Signalleitung S überbrückt. Die Probenaufnahme 4 lässt wiederum das andere Ende der Signalleitung S und die beiden benachbarten Enden der Groundleitung G frei.
Auf dieses freie Ende wird eine Prüfspitze 20 aufgesetzt, die einen Signalfinger SF und zwei Groundfinger GF mit den entsprechenden Abständen zueinander aufweist. Über diese eine Prüfspitze 20 erfolgt sowohl die Einspeisung der Signale als auch der Abgriff der reflektierten, modifizierten Signale.
Über geeignete Kabel 22 werden die Prüfspitzen 20 mit der das Signal erzeugenden und das empfangene, modulierte Signal verarbeitende Signaleinheit (nicht dargestellt) verbunden. Diese Signaleinheit ist häufig eine Rechnereinheit, die z. B. Teil eines vektoriellen Netzwerkanalysators, eines Parameter-Netzwerkanalysators, eines Spektrumanalysators oder ei nes anderen, geeigneten Messinstruments ist. Letzterer ist zur Messung von Streuparametern (S-Parameter) und von Mixed-Mode-Parametern (M-Parameter), d. h. Parametern eines Zweitorpaares mit zwei Signalleitungen S, konfiguriert. Auch Tuner, die eine Frequenzeinstellung mittels elektrischer oder mechanischer Mittel, z. B. über die Einstellung eines Kondensatorplattenabstandes, realisieren sind für die Signaleinheit verwendbar.
Als Prüfspitze 20 kommen verschiedene, der betreffenden Messaufgabe und dem Frequenzbereich angepasste Ausführungen in Betracht. Zur Einspeisung eines Hochfrequenzsignals kommen Hochfrequenzspitzen zum Einsatz, die entsprechend der Wellenleiterstruktur eine Signalleitung S und eine oder mehr Groundleitungen G aufweist, so dass jede Leitung der Wellenleiterstruktur durch eine korrespondierende Leitung der Prüfspitze beim Aufsetzen der Prüfspitze sicher kontaktiert wird.
Neben der beschriebenen Verwendung einer Prüfspitze 20 an einer Wellenleiterstruktur mit reflektierendem Abschluss (6B) oder zweier Prüfspitzen 20 zur Messung eines Transmissionspfades durch die Probe 3 hindurch (6A) kann mittels einer ergänzenden Prüfspitze (nicht dargestellt) auch eine weitere Elektrode realisiert werden, die ebenfalls über einen geeigneten Leiter oder direkt oder durch elektromagnetische Kopplung mit der Probe 3 in elektrischen Kontakt gebracht wird. Auf diese Weise ist das Medium auf ein definiertes Potential zu legen, wie es vom triaxialen Aufbau bekannt ist. In Abhängigkeit von der Messaufgabe und von dem dementsprechend einzuspeisenden Signal können auch einpolige Prüfspitzen zur Anwendung kommen, z. B. wenn ein Leitungspfad mit Ionentransport durch die Probe 3 realisiert werden soll.
Der verwendete Aufbau der Wellenleiterstruktur und dementsprechend der Prüfspitze aus Signal- und Groundleitungen S, G bietet sowohl für passive als auch aktive Messungen die Möglichkeit einer ideal geschirmten Messumgebung. Damit sind, auch im HTS-Verfahren, Messungen im Kleinstsignalbereich durchführbar, bei denen ohne eine entsprechende Schirmung in der Messebene eine Beeinflussung des Messsignals durch die unmittelbare Messumgebung in der Größenordnung des Messsignals selbst liegen würde. Solche Messungen sind insbesondere triaxiale Messungen zur Strom-, Spannungs- und Kapazitätsbestimmung sowie Kelvinmessungen für Widerstandsbestimmungen der Probe 3.
Für derartige Messungen ist z. B. eine Leiterbahnstruktur vergleichbar 3B oder 6A verwendet werden, mit dem Unterschied, dass die Guardleitung G die Signalleitung S vollständig, d. h. auch an den freien Enden, auf denen eine Prüfspitze 20 aufgesetzt wird, vollständig umgibt und beidseitig der Signalleitung S jeweils eine galvanisch getrennten Spalt aufweist, wo auch jener der Signalleitung S liegt.
In einer Modifikation ist auch die Leiterbahnstruktur selbst triaxial ausführbar, indem um die umgebende Guardleitung G von einer weiteren Leiterschleife umgeben ist. In diesem Fall wird die bisherige Guardleitung G als Schirmung der inneren Signalleitung S auf ein Potential gelegt, welches in der Größenordnung des Messsignals liegt und dient der Minimierung von Leckströmen und parasitären Kapazitäten. Die äußere, ergänzte Leiterschleife wird auf Guardpotential gelegt.
Der Spalt zwischen den beiden Signalleitungen S, der von dem Target überbrückt wird, ist an die jeweiligen Messanforderungen anpassbar, wie z. B. an die Zellgröße und Signalstärke. Die einzelnen Leitungen der Leiterbahnstruktur sind galvanisch voneinander getrennt. Zur Messung wird entweder jeweils eine einfingrige Prüfspitze 20 auf einen Signalleiter S gelegt oder ergänzend die Guardleitungen G über einen Guardfinger GF auf Guardpotential gelegt.
Die Prüfspitzen 20 werden, wie oben beschrieben nur temporär mit einer Wellenleiterstruktur in mechanischen und elektrischen Kontakt gebracht. Dazu werden beide relativ zueinander bewegt bis der Kontakt hergestellt ist. Der Kontakt wird und während der gesamten Messung stabil aufrechterhalten und nach Beendigung der Messung gelöst, um die Wellenleiterstruktur der nächsten Sensoranordnung 6 zu kontaktieren.
Die Relativbewegung von Prüfspitze 20 und Wellenleiterstruktur umfasst die Bewegung von nur einem von beiden oder ebenso eine gleichzeitige oder wechselnde Bewegung von beiden mittels einer oder mehrerer geeigneter Positionierungsvorrichtungen. Diese Positionierungsvorrichtungen unterstützen die Bewegung in X-, Y- und Z-Richtung sowie eine Drehbewegung, womit auch bei einer gleichzeitigen Kontaktierung einer oder mehr Wellenleiterstrukturen mit zwei oder mehr Prüfspitzen 20 eine Ausrichtung der zu kontaktierenden Enden der Wellenleiterstruktur, nachfolgend als Kontaktflächen bezeichnet, zu den Prüfspitzen 20 erfolgen kann.
Die eine oder mehr Prüfspitzen 20 werden durch eine geeignete Sondenhalterung gehalten und zwar in einer solchen Lage relativ zueinander, dass deren Anordnung mit der Anordnung der Kontaktflächen korrespondiert. Die Anordnung mehrerer Prüfspitzen 20 relativ zueinander ist für die gleichzeitige Kontaktierung von einer oder mehr Wellenleiterstrukturen in besonderen Messaufgaben oder für HTS-Verfahren erforderlich.
Zur Durchführung eines HTS-Verfahrens ist eine Vielzahl von Sensoranordnungen in den verschiedenen zuvor beschriebenen Ausführungsformen, in einem Array, d. h. rasterartig angeordnet. 7 zeigt einen Ausschnitt eines solchen Sensorarrays mit einer Vielzahl von Sensoranordnungen 6 gemäß 6B von denen die erste mit einer Prüfspitze 20 kontaktiert ist. Als Sensorarray kann ein standardisiertes Wellformat sowie andere der Probe 3 und Messaufgabe angepasste Formate angewandt werden.
Die einzelnen Sensoranordnungen 6 eines Sensorarrays sind vorzugsweise identisch, um für jede Impedanzmessung reproduzierbare und vergleichbare Bedingungen herzustellen bei minimiertem Aufwand für die Messung oder Kalibrierung und für die Auswertung. Vorzugsweise werden die Wellenleiterstrukturen derart gestaltet und zueinander angeordnet, dass zumindest eine Groundleitung G von zwei benachbarten Sensoranordnungen 6 eine Abschirmung der benachbarten Signalleitung S realisiert, indem sie zwischen diesen zwei Signalleitungen S angeordnet ist (4 und 5).
Jede der Sensoranordnungen 6 wird nacheinander positioniert und mit einer Prüfspitze 20, für Reflexionsmessungen, oder zwei Prüfspitzen 20, für Transmissionsmessungen, kontaktiert und die Impedanz der jeweiligen Probe 3 gemessen. Alternativ sind auch so viele Prüfspitzen durch die Sondenhalterung zu halten und zueinander anzuordnen, dass mit einem Positionier- und Kontaktierungsvorgang mehrere Sensoranordnungen gleichzeitig messbar sind.
Ein solches Sensorarray, das meist auf einem Trägersubstrat 1 angeordnet ist, kann durch weitere Sensoren (nicht dargestellt) ergänzt werden, die weitere Parameter der Impedanzmessung überwachen und gegebenenfalls deren Regelungen dienen. Solche Parameter sind zum Beispiel die Umgebungstemperatur oder die Temperatur des Trägersubstrats, die Zusammensetzung und Feuchtegehalt der umgebenden Atmosphäre oder andere. Relevant sind sämtliche auf die Vitalität der Zelle Einfluss nehmende Parameter, die auf den Zustand der Probe 3 an sich oder auf Vorgänge in der Probe 3 und somit auf deren Impedanz Einfluss haben.
Aufgrund der Art und Größe der zum Einsatz kommenden Signale kommt der Kalibrierung des Systems eine besondere Bedeutung zu. Mittels der Kalibrierung ist zu gewährleisten, dass die festgestellten Impedanzänderungen auch tatsächlich Ereignissen und Zuständen der interessierenden Probe 3 zugeordnet werden können und nicht durch das Messsystem bedingt sind. Vorteilhaft ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit der Kalibrierung des Messsystems bis zur Kontaktstelle zwischen dem Wellenleiter und der Probe 3. Dafür sind verschiedene Verfahren bekannt, in denen durch Messung von Kalibrierstandards mit und ohne Transmissionspfad, deren elektrische Eigenschaften nicht in jedem Fall bekannt sein müssen, und durch geeignete Kombination und Reihenfolge dieser Standards und der zur Berechnung der unbekannten Standards verwendeten Methode eine Selbstkalibrierung der unbekannten Standards während der Kalibrierung erfolgt. Damit ist eine sehr präzise Kalibrierung möglich, die es gestattet auch unbekannte Kalibrierstandards zu verwenden. Solche Verfahren sind in der DE 10 2004 020 037 A1 und der DE 10 2007 057 394 A1 sowie DE 10 2006 056 192 A1 ausführlich beschrieben. Auf die dortige Beschreibung der hier verwendbaren Kalibrierverfahren wird ausdrücklich Bezug genommen.
Eine weitere Möglichkeit zur Ermittlung des Reflexions- und Transmissionsverhaltens der Probe 3 an sich ist das so genannte Deembedding-Verfahren. In diesem Verfahren wird im Unterschied zum oben beschriebenen Kalibrierverfahren die Wellenleiterstruktur in die Messebene mit einbezogen. Das eigentliche Messobjekt wird dazu als in einer Serienschaltung in eine oder mehr weitere Messobjekte „eingebettet" betrachtet, wobei diese weiteren Messobjekte durch eine oder mehr Wellenleiterstrukturen bis zur Anschlussstelle der Probe 3 verkörpert sind. Aus dieser Serienschaltung muss mittels einer so genannten Transmissionsmatrix, welche diese Hintereinanderschaltung von Messobjekten berücksichtig, die Streumatrix der Probe 3 berechnet werden. Das oder die umgebenden Messobjekte sind durch Modellierung oder Messung ebenso bekannt, wie das Gesamtsystem, die Wellenleiterstrukturen und die Probe 3 umfassend. Damit wird, im Gegensatz zur oben beschriebenen Kalibrierung des Systems bis zur Anschlussstelle der Probe 3, die Wellenleiterstruktur in die Messebene einbezogen und später herausgerechnet. Die Berechnung der Streuparameter der Probe 3 aus der Transmissionsmatrix des Systems einschließlich der Wellenleiterstruktur z. B. ist in „Hochfrequenztechnik", Holger Heuermann, Vieweg Verlag 2005, ISBN 3-528-03980-9, Seite 24–25 beschrieben.
Eine Impedanzmessung unter Verwendung einer der zuvor beschriebenen Sensoranordnung 6, Prüfspitze 20 und Positionierungsvorrichtung sowie Signaleinheit kann in einer Testeinrichtung erfolgen, deren grundsätzlicher Aufbau in 8 dargestellt ist.
Eine solche Testeinrichtung umfasst eine auch als Chuck bezeichnete Aufnahmeeinheit 24, die so gestaltet ist, dass sie eine oder mehrere oder ein Array von Sensoranordnungen 6 aufnehmen kann. Je nach Gestalt der Sensoranordnungen 6 kann diese Aufnahmeeinheit 24 entsprechend gestaltet sein. Z. B. weist sie eine planare Aufnahmefläche auf, auf der die Sensoranordnungen 6 auflegbar und haltbar sind.
Die Prüfspitzen 20 werden von einer Sondenhalterung 28 über dem Chuck 24 gehalten. Sie sind mittels Kabel 22, im Ausführungsbeispiel über eine optionale Signalvorverarbeitungseinheit 30, mit einer Signaleinheit (nicht dargestellt) verbunden.
Im Ausführungsbeispiel umfasst die Aufnahmeeinheit 24 als Positionierungsvorrichtung 26 z. B. einen motorisch oder manuell angetriebenen X-Y-Kreuztisch, einen Z-Hub und eine Drehvorrichtung zum Drehen des Chucks um eine senkrecht zur Aufnahmefläche stehende Drehachse. Damit sind eine Positionierung der Sensoranordnungen 6 genau unter einer Anordnung von Prüfspitzen 20 in der X-Y-Ebene sowie die Winkelausrichtung von beiden zueinander und nachfolgend eine Zustellbewegung zwischen den Sensoranordnungen 6 und den Prüfspitzen 20 in Z-Richtung, d. h. in Richtung der Prüfspitzen 20 bis zur Herstellung des Kontakts möglich. Alternativ kann zumindest die Zustellbewegung in Z-Richtung oder eine Feinausrichtung zueinander auch durch eine ergänzende Positionierungsvorrichtung der Sondenhalterung 28 ausgeführt werden.
Der Chuck 24 kann darüber hinaus auch die Temperierung der Proben 3 über die Einstellung einer definierten Temperatur der Aufnahmefläche realisieren. Aufgrund der möglichen geringen Probenvolumina ist eine deutlich geringere Wärmeleistung zur Einstellung der Temperatur erforderlich, verglichen mit Messungen, die in großvolumigen Inkubatoren durchgeführt werden müssen. Darüber hinaus treten geringere Temperaturgradienten in einer Probe 3 auf, was für die Vergleichbarkeit der Messungen und die Stabilität des zu untersuchenden Zustandes oder Ereignisses vorteilhaft ist. Die Temperatur kann kalibriert werden oder mittels eines geeigneten Temperatursensors, der sich auch innerhalb der Messstelle befinden kann, geregelt werden.
Ein den Chuck 24 und die Sensoranordnungen 26 sowie die Prüfspitzen 20 umgebendes Gehäuse 32 aus einem elektrisch leitfähigen Material, das auf Groundpotential gelegt wird, realisiert eine EMV-Abschirmung, sofern für die betreffende Messung erforderlich. Im Zusammenhang mit einer speziellen Gestaltung des Chucks 24, z. B. mit einem mehrlagigen Aufbau aus wechselnden elektrisch leitfähigen und dielektrischen Schichten und der Schaltung gezielter Potentiale an den leitfähigen Schichten ist auch ein triaxialer Messaufbau realisierbar, so dass selbst kleinste Signale oder Signalmodulationen messbar sind. Ein technisch gleichwertiger triaxialer Aufbau ist auch für die Prüfspitzen 20 und deren Halterungen anwendbar. Anwendungsfälle für diese Ausgestaltung sind z. B: aktive oder passive Ableitungen an Kardiomyozythen oder Nervenzellen.
Wie oben beschrieben kann mithilfe des Gehäuses 32 neben der EMV-Abschirmung auch eine solche Atmosphäre für die Messung eingestellt werden, wie es eine biologische Probe 3 erfor dert. Wichtige Parameter sind z. B. die Temperatur, die Luftfeuchte und der CO₂-Gehalt. Im Ausführungsbeispiel weist das Gehäuse 32 oberhalb der Prüfspitzen 20 mehrere Öffnungen 34 zur Gaszufuhr auf, die mit einer Gasquelle verbunden sind, welche das erforderliche Gasgemisch mit dem gewünschten Feuchtegehalt und der gewünschten Temperatur bereitstellt. Das durch die Öffnugen 34 einströmende Gasgemisch, z. B. Luft mit 5% CO₂-Gehalt und gesättigter Luftfeuchte bei 37°C, strömt über die Messspitzen 20 und die Sensoranordnungen 6 und tritt durch Abströmöffnungen 36 in der seitlichen Wandung des Gehäuses 32 wieder aus. Die Zusammensetzung und die Temperatur des auf die Sensoranordnungen auftreffenden Gasgemischen sind durch Sensoren, die auf dem Sensorarray integriert sind (nicht dargestellt) mess- und regelbar.
Alternativ können aufgrund der Trennung von Probe 3 und Kontaktflächen der Wellenleiterstruktur die erforderlichen Umgebungsbedingungen auch in jeder einzelnen Probenaufnahme 4 hergestellt und durch deren Verschluss während der Messung aufrechterhalten werden, wenn die Probenaufnahme 4 ein dafür geeignetes Gefäß aufweist. Mittels eines gasdichten Gehäuses 32 oder gasdichter Probenaufnahmen 4 sind auch verschiedene Drücke einstellbar und deren Wirkung auf die Proben 3 zu testen.
Mittels einer mikroskopischen Beobachtungseinheit 38 ist die Kontaktierung einer einzelnen oder mehrerer Sensoranordnungen 6 und die Messung zu beobachten.
Eine Testeinrichtung kann darüber hinaus ein Magazin mit oder ohne Laderoboter aufweisen, dessen Innenraum z. B. über eine Schleuse mit dem Innenraum des Gehäuses der Testeinrichtung verbunden werden kann. In einem solchen Magazin können die Temperatur und die weiteren Umgebungsbedingungen eingestellt sein, um die in den Probenaufnahmen 4 befindlichen Proben 3 dort zu lagern. Diese Lagerung und Verbindung beider ist z. B. für Langzeitprozesse oder Automatisierungen der Messungen geeignet.
Für automatisierte Messabläufe und ebenso für die reproduzierbare Applikation auch kleiner Probenmengen kann die Testeinrichtung ergänzend eine geeignete Vorrichtung zur Applikation von Proben 3, von Wirkstoffen oder anderer Zusatzstoffe zur Probe 3 aufweisen oder dem Mediumwechsel dienen.
Nachfolgend soll der Ablauf der Impedanzmessung biologischer Proben an einem Sensorarray beschrieben werden. Dieses Sensorarray ist wie oben beschrieben durch eine Vielzahl von Kavitäten, die in Kontakt mit den Wellenleiterstrukturen stehen, gekennzeichnet, wobei diese auf einem temperierbaren Chuck 24 in Reihen angeordnet sind, um gleichbleibende Temperaturbedingungen einzustellen und aufrechtzuerhalten.
Zu Beginn einer Messung ist das System zu kalibrieren, wobei entweder bis zum Kontakt zwischen Prüfspitze und Wellenleiterstruktur kalibriert und nachfolgend das oben beschriebene Deembedding-Verfahren angewendet werden kann. Die Kalibrierung mittels Kalibrierstandards, die entweder auf einem gesonderten Kalibriersubstrat oder auf Trägersubstrat 1 des Sensorarrays ausgebildet sind. Alternativ wird nur die Probe 3 in die Messebene einbezogen, indem das gesamte Leitungssystem außerhalb der Probe 3 kalibriert wird. Auch hierzu wird auf die obigen Ausführungen verwiesen. Bei der nachfolgend beschriebenen Referenzmessung ist aufgrund der verwendeten impedanzkontrollierten Wellenleiterstrukturen für jede der Sensoranordnungen grundsätzlich keine Kalibrierung erforderlich. Zur Berücksichtigung der systematischen Fehler kann sie aber dennoch eingangs der Messung vorgenommen werden.
Die biologischen Proben werden in geeignetes Medium, das in Zusammensetzung und Menge definiert ist, eingebracht und mittels eines geeigneten Verfahrens zur reproduzierbaren Applikation der Probe 3 in die Probenaufnahme des Sensor-Arrays, z. B. eine Kavität überführt. Dabei kann die erste Reihe der Kavitäten als Referenzreihe dienen, die mit den in den anderen Reihen ermittelten Impedanzen verglichen wird. Dabei kann beispielsweise der Einfluss veränderter Konzentrationen des Interaktionspartners bestimmt werden oder der Einfluss variabler Interaktionszeiten ermittelt werden. Die gemessenen Impedanzen werden dabei direkt auf die Referenz bezogen. Auch Negativkontrollen zur Überwachung von Effekten, die vom Target 5 selbst herrühren, können auf diese Weise in die Messung einbezogen werden.
Dabei wird die zu messende Sensoranordnung durch Bewegung des Chucks 24 in X-Y-Richtung positioniert und anschließend der Kontakt mit der WEllenleiterstruktur durch Zufahren der Prüfspitzen 20 in Z-Richtung hergestellt. Die Art der Kontaktierung ist in folgender Weise abhängig vom Messverfahren. Für die Transmissionsmessung ist eine Kontaktierung mit mindestens einer Prüfspitze 20 erforderlich. Für die Reflexionsmessung wird der Kontakt mit einer Prüfspitze 20 hergestellt.
Anschließend erfolgt die Einbringung des Signals über die eine oder mehr Prüfspitzen 20. Das Signal kann dabei über den gesamten Frequenzbereich von wenigen μHz bis zu einigen hundert GHz oder, wenn das relevante Frequenzband bekannt ist, in dem sich eine Modulation feststellen lässt, auf dieses Frequenzband eingeschränkt eingebracht werden.
Alternativ ist die Einbringung eines Pulses mit einem eng begrenzten Frequenzbereich möglich, wobei eng begrenzt in dem Sinne zu verstehen ist, dass ein möglichst schmaler Puls erzeugt wird. Je schmaler der Puls, umso gezielter ist eine Auswertung mittels einer Fouriertransformation möglich.
Danach erfolgt die Aufnahme der transmittierten und/oder reflektierten Wellen, welche an eine verarbeitende Signal einheit zur Auswertung weitergeleitet werden. Danach erfolgt ein Vergleich mit den Referenzen.
Nach erfolgter Messung wird der Kontakt durch Bewegung in Z-Richtung gelöst und die nächste Sensoranordnung 6 durch Bewegung in X-Y-Richtung angesteuert. Auf diese Weise kann nachfolgend jede weitere Sensoranordnung 6 zur weiteren Messung angesteuert, kontaktiert und deren Impedanz gemessen werden. Durch das Anfahren der Sensoranordnungen 6 nacheinander ist es jederzeit möglich, zwischen zwei Positionierungsbewegungen Modifikationen am Messsystem vorzunehmen, z. B. Wirkstoffapplikation, Auswechseln des Mediums oder Puffers durch Absaugen und Neubefüllen oder ähnliches. Die Step-by-Step-Bewegungen des Sensorarrays gestatten das nacheinander folgende Abfahren von Stationen, in denen solche Manipulationen des Messsystems mittels geeigneter Vorrichtungen erfolgen können.
Mithilfe entsprechend konfigurierter Testeinrichtungen können auch Langzeitmessungen erfolgen, in denen z. B. zeitliche Verläufe von zellulären Ereignissen auch mit geeigneten Modifikationen während des Verlaufs untersucht werden. Beispielsweise kann auch der Einfluss von Temperaturverläufen auf die Impedanz der Proben untersucht werden. Durch mehrmaliges Abrastern des Sensorarrays sind die Sensoranordnungen 6 zu verschiedenen Zeitpunkten immer wieder zu messen. Dabei kann ein automatisierte Austausch von Pipetten einer Applikationsvorrichtung und/oder einer Vorrichtung zum Absaugen des Mediums oder der Pufferlösung erfolgen, ohne in die Messanordnung einzugreifen und bei unveränderten Messbedingungen.
Zur statistischen Auswertung der Messergebnisse werden pro veränderter Konzentration oder Interaktionszeit mit dem Interaktionspartner mehrere Sensoranordnungen 6 mit denselben Bedingungen untersucht.
Die beschriebene Sensoranordnung 6 gestattet es ebenso, eine Zellbewegung in der Probe 3 zu ermitteln. Dabei wird die Bewegung einer Zelle 5 entlang eines definierten Pfades, der sich entlang der Signal- und Groundleitungen S, G erstreckt, auf der Oberfläche der Sensoranordnung 6 verfolgt (4, 5). Dieser Pfad kann beispielsweise durch chemotaktische Substanzen gebildet werden, die auf der Oberfläche der Sensoranordnung 6 durch geeignete Verfahren immobilisiert wurden. Weitere Alternativen sind möglich, z. B. solche, die Möglichkeit der elektromagnetischen Kopplung der Probe 3 zur Wellenleiterstruktur wie oben beschrieben ausnutzen oder optische Guiding-Verfahren wie z. B. eine optische Pinzette.
Die Richtung der Bewegung der Zelle 5 und deren Wandergeschwindigkeit werden durch Änderung der Impedanz in Abhängigkeit der Lage der Zelle 5 ermittelt. Dabei können sowohl Reflexionsmessungen am Zwei- oder n-Tor (4) als auch am Eintor (5) wie oben beschrieben durchgeführt werden. Auch sukzessives impedimetrisches Rastern einer Probe 3 im Orts- und Zeitbereich ist somit möglich. Eine solche Feststellung der Zellbewegung gestattet es darüber hinaus, die Änderung des Zustandes der Zelle in Funktion eines beispielsweise applizierten Wirkstoffes ortsabhängig zu bestimmen.

1: Trägersubstrat
3: Probe
4: Probenaufnahme
5: Target, Zelle
6: Sensoranordnung
10: Tor
20: Prüfspitze
22: Kabel
24: Aufnahmeeinheit, Chuck
26: Positionierungsvorrichtung
28: Sondenhalterung
30: Signalvorverarbeitungseinheit
32: Gehäuse
34: Öffnungen
36: Abströmöffnungen
38: Beobachtungseinheit
S: Signalleitung
G: Groundleitung
SF: Signalfinger
GF: Groundfinger

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 2003/0040004 A1 [0008]
- DE 102004020037 A1 [0060]
- DE 102007057394 A1 [0060]
- DE 102006056192 A1 [0060]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- „Hochfrequenztechnik", Holger Heuermann, Vieweg Verlag 2005, ISBN 3-528-03980-9, Seite 24–25 [0061]

Claims

Verfahren zur Messung von Impedanzen biologischer Proben (3), wobei – mittels einer Sensoranordnung (6), eine impedanzkontrollierte Wellenleiterstruktur und eine Probenaufnahme (4) umfassend, das Reflexions- und/oder Transmissionsverhalten einer in der Probenaufnahme (4) angeordneten Probe (3) ermittelt wird, – die Probe (3) zur Reflexionsmessung als Eintor ohne Transmissionspfad durch die Probe (3) und/oder zur Transmissionsmessung als Zweitor mit Transmissionspfad durch die Probe (3) mit der Wellenleiterstruktur direkt oder indirekt verbunden ist, – die Wellenleiterstruktur mittels zumindest einer Prüfspitze (20), welche zur Übertragung eines Frequenzsignals ausgelegt ist, temporär kontaktiert wird, indem die Sensoranordnung (6) und besagte Prüfspitze (20) relativ zueinander positioniert werden, so dass eine Prüfspitze (20) auf einer Kontaktfläche der Wellenleiterstruktur aufliegt und – über besagte zumindest eine Prüfspitze (20) ein Messsignal mit einer definierten Frequenz eingespeist und ein moduliertes Messsignals abgegriffen und ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest eine Kalibrierung der Messanordnung erfolgt, indem die Streuparameter und die Fehlerkoeffizienten der Messanordnung ermittelt und die Wellenleiterstruktur bis zu deren Verbindungsstelle mit der Probe (3) in die Kalibrierung eingeschlossen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest eine Kalibrierung der Messanordnung erfolgt, indem die Streuparameter und die Fehlerkoeffizienten der Messanordnung bis zum Signaleingang der Wellenleiterstruktur ermittelt werden und die Ermittlung der Transmissions- und/oder Reflexionsparameter der Probe (3) durch Deembedding erfolgt, indem das Reflexions- und/oder das Transmissionsverhalten jenes Systems gemessen wird, welches die Wellenleiterstruktur und die Probe (3) umfasst, und anschließend die bekannten Reflexions- und/oder Transmissionsparameter der Wellenleiterstruktur herausgerechnet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zunächst das Reflexions- und/oder Transmissionsverhalten einer Referenzprobe ermittelt wird und dieses mit dem Reflexions- und/oder Transmissionsverhalten der interessierenden Probe (3) verglichen wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Messung des Reflexions- und/oder Transmissionsverhaltens von Proben (3) mittels einer Vielzahl von Sensoranordnungen (6) durchgeführt wird, deren Wellenleiterstrukturen übereinstimmende Impedanzen aufweisen, und die Sensoranordnungen (6) von der zumindest einen Prüfspitze (20) nacheinander kontaktiert werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Frequenz des Messsignals während der Messung einer Probe (3) kontinuierlich im Bereich eines definierten Frequenzbandes geändert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als Messsignal ein Pulssignal mit einer definierten Frequenzbandbreite eingespeist und das empfangene modulierte Signal zur Auswertung fouriertransformiert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Messung an einer Probe (3) unter definierten atmosphärischen und thermischen Bedingungen erfolgt, die in einer geschlossenen Probenaufnahme (4) erzeugt und während der Messung aufrechterhalten werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Messung in einer Testeinrichtung erfolgt, in der die Temperatur der Sensoranordnungen (6) mittels einer Aufnahmeeinheit (24), welche der Halterung der Sensoranordnungen (6) dient, eingestellt und aufrechterhalten wird und eine EMV-Abschirmung durch ein Gehäuse (32) der Testeinrichtung und/oder schirmende Komponenten erfolgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Reflexions- und/oder Transmissionsverhalten einer Probe (3) zumindest zweimal aufeinander folgend gemessen wird, während in der Probe (3) eine Bewegung zumindest einer Zelle entlang eines Pfades erfolgt, welcher die Wellenleiterstruktur kreuzt.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, folgende Bestandteile umfassend: – eine Sensoranordnung (6), die eine impedanzkontrollierte Wellenleiterstruktur und eine Probenaufnahme (4) zur Aufnahme einer Probe (3) umfasst, – wobei die Wellenleiterstruktur zumindest eine Signal leitung (S) zur Leitung eines Messsignals definierter Frequenz und eine oder mehr zur Signalleitung (S) beabstandete Groundleitungen (G) umfasst, und – wobei die Probenaufnahme (4) so gestaltet ist, dass sie zumindest einen Abschnitt der Signalleitung (S) und zumindest einer Groundleitung (G) überdeckt und dabei eine elektromagnetische Kopplung der Probe (3) zu Signal- und Groundleitungen (S, G) realisiert, – zumindest eine Prüfspitze (20) zur temporären Kontaktierung der Wellenleiterstruktur und – zumindest eine Signaleinheit, die mit der Prüfspitze (20) elektrisch verbunden ist zur Übertragung eines Messsignals und/oder Empfang eines modulierten Messsignals.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Wellenleiterstruktur koplanar auf einem dielektrischen Trägersubstrat (1) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Wellenleiterstruktur dreidimensional auf einem dielektrischen Trägersubstrat (1) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Signalleitung (S) und zumindest eine Groundleitung (G) derart zueinander angeordnet sind, dass sie einen Pfad entlang der Abschlüsse der Signal- und Groundleitungen (S, G) definieren.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei eine Vielzahl von Sensoranordnungen (6) als Sensorarray angeordnet ist und sich die Impedanzen der Wellenleiterstrukturen des Sensorarrays gleichen.
Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Groundleitungen (G) der einzelnen Sensoranordnungen (6) des Sensorarrays derart angeordnet sind, dass sie eine Abschir- Sensorarrays derart angeordnet sind, dass sie eine Abschirmung der Signalleitung (S) zur benachbarten Wellenleiterstruktur realisieren.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei die Vorrichtung einen Sensor umfasst zur Messung weiterer, die Messung beeinflussender Parameter.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei die Wellenleiterstruktur als Filterstruktur ausgebildet ist, so dass sie Signale eines definierten, schmalen Frequenzbandes weiterleiten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei die Signaleinheit konfiguriert ist zur Übertragung von kontinuierlich änderbaren Frequenzen im Bereich von wenigen μHZ bis 500 GHz.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei die Signaleinheit konfiguriert ist zur Übertragung eine Signalpulses in einem schmalen Frequenzband mit Frequenzen im Bereich von wenigen μHZ bis 500 GHz.
Testeinrichtung zur Messung von Impedanzen biologischer Proben (3), folgende Bestandteile umfassend: – eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 20 mit zumindest einer Sensoranordnung (6), zumindest einer Prüfspitze (20) und einer Signaleinheit, – eine Aufnahmeeinheit (24) zur Aufnahme und Halterung der Sensoranordnung (6), – eine Sondenhalterung (28) zur Aufnahme und Halterung der Prüfspitzen (20), – zumindest eine Positionierungseinheit zur Positionierung der Aufnahmeeinheit (24) und der Sondenhalterung (28) relativ zueinander und – umgebendes Gehäuse (32) zur EMV-Abschirmung.
Testeinrichtung nach Anspruch 21, wobei die Temperatur der Sensoranordnung (6) und der Probe (3) mittels temperierbarer Aufnahmeeinheit (24) eingestellt und während der Messung aufrechterhalten wird.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 21 oder 22, wobei der Aufbau der Aufnahmeeinheit (24) aus elektrisch leitfähigen und dielektrischen Ebenen und die Potentiale der leitfähigen Ebenen gemeinsam mit dem Gehäuse (32) und dessen Potential relativ zum Potential der Messebene als Triaxialaufbau gestaltet ist.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, ein umgebendes Gehäuse (32) und Mittel zur Einstellung einer Messatmosphäre mit einer definierten, von der Umgebungsluft abweichenden Gaszusammensetzung innerhalb des Gehäuses (32) umfassend.
Testeinrichtung nach Anspruch 24, wobei die Mittel zur Einstellung einer Messatmosphäre zumindest eine Gaszuführung in das Gehäuse (32), eine Messeinrichtung zur Messung der Konzentration zumindest einer Komponente der Messatmosphäre und zumindest eine Abströmöffnung (36) zum Entweichen des Gases umfasst.
Testeinrichtung nach Anspruch 24, wobei das umgebende Gehäuse gasdicht ausgebildet ist und die Mittel zur Einstellung einer Messatmosphäre zumindest eine verschließbare Gaszuführung in das Gehäuse (32) umfasst.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, zumindest eine Vorrichtung zur Applikation von Substanzen definierter Menge in eine oder mehrere Probenaufnahmen (4) umfassend.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 27, zumindest eine Vorrichtung zum Entnehmen von Substanzen de finierter Menge aus einer oder mehrerer Probenaufnahmen (4) umfassend.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei zumindest eine Applikationsvorrichtung oder/und zumindest eine Entnahmevorrichtung mittels zumindest einer weiteren Positionierungseinheit relativ zur Sensoranordnung (6) positionierbar ist.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei eine Applikationsvorrichtung oder/und eine Entnahmevorrichtung Pipetten umfasst und die Pipetten innerhalb des Gehäuses (32) und ohne dessen Öffnung wechselbar sind.
Testeinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 30, ein Magazin zur Temperierung und Lagerung einer Vielzahl von Sensoranordnungen (6) unter den auch zur Messung herrschenden atmosphärischen und thermischen Bedingungen, welches mit dem Gehäuseinneren verbindbar ist.