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Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer Cyaninverbindung als Fluoreszenzstandard
im Nahinfrarotspektralbereich (NIR), insbesondere als spektraler
Fluoreszenzstandard zur Ermittlung der relativen spektralen Empfindlichkeit
von Photolumineszenzmesssystemen, zur Ermittlung der spektralen
Langzeit-Geräteperformance und der spektralen Empfindlichkeit,
als Fluoreszenzquantenausbeutestandard, als Fluoreszenzmarker in
flüssigen und festen transparenten Matrices und in flüssigen
und festen streuenden Systemen, als molekularer oder partikulärer
Fluoreszenzmarker und als integral auslesbarer Fluoreszenzintensitätsstandard in
flüssigen und festen transparenten Matrices und in flüssigen
und festen streuenden Systemen. Die Erfindung betrifft ferner einen
die Verbindung enthaltenden Kit zur rückführbaren
Kalibrierung eines Photolumineszenzmesssystems.
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Stand der Technik
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Photolumineszenzmessgeräte
weisen einen Anregungskanal auf, der eine Anregungslichtquelle und (jedenfalls
bei breitbandigen oder polychromatischen Anregungslichtquellen)
ein wellenlängenselektierendes optisches Bauelement enthält,
sowie mindestens einen meist rechtwinklig zum Strahlengang des Anregungslichtes
angeordneten Emissionskanal, mit dem das von dem im Probenraum befindlichen
Chromophor nach Lichtabsorption emittierte Licht spektral aufgelöst
oder integral aufgezeichnet wird. Oftmals wird über einen Strahlteiler
ein definierter Teil des Anregungslichts in einen Referenzkanal
eingekoppelt, der ein optisches Bauelement wie einen Spiegel oder
einen Streuer und einen (Referenz)Detektor enthält. Mit
dem Referenzkanal wird die aktuelle Anregungslichtintensität
bei der Anregungswellenlänge aufgezeichnet, um so kurzzeitige Schwankungen
der Anregungslichtintensität zu erfassen. Dies erfolgt,
indem der Quotient aus dem Emissionssignal (Signal, gemessen im
Emissionskanal) und dem Referenzsignal (Signal, gemessen im Referenzkanal) gebildet
wird. Nachfolgend werden verschiedene Kategorien von Standards für
unterschiedliche Kalibrierungszwecke von Photolumineszenzmessgeräten
sowie den dazugehörigen Stand der Technik beschrieben.
Dabei wird vorliegend unter dem Begriff ”Standard” oder ”Fluoreszenzstandard” jeglicher
referenzieller Einsatz eines fluoreszierenden Mediums verstanden,
ungeachtet dessen, ob gerätespezifische Beiträge
oder der Linearitätsbereich eines Detektorsystems des Photolumineszenzmesssystems
ermittelt werden sollen oder eine Aussage über die quantitative
Fluoreszenzintensität oder Streuintensität einer
Probe oder das Vorhandensein einer fluoreszierenden Quelle getroffen
werden soll oder dergleichen.
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Anregungs- und Emissionsstandards
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Jede
Lumineszenzmesstechnik liefert Messdaten, die sich aus analytspezifischen
und (unerwünschten) gerätespezifischen Beiträgen
zusammensetzen. Letztere spiegeln die Wellenlängenabhängigkeit
der im Anregungs- und Emissionskanal des Gerätes enthaltenen
Lichtquelle(n) und optischen Bauelemente wider sowie die spektrale
Empfindlichkeit der eingesetzten Detektionssysteme. Die Vergleichbarkeit
von Lumineszenzdaten über Geräte- und Laborgrenzen
hinaus, die Erfassung der Gerätealterung, die Rückführbarkeit
von Lumineszenzdaten (gemäß EN ISO/IEC
17025) und die Optimierung von Lumineszenzmessmethoden
erfordern die Ermittlung dieser gerätespezifischen Effekte.
Dies gilt auch für Messmethoden, welche die Emission von Luminophoren
mit spektral unterschiedlichen Emissionsspektren vergleichen wie
z. B. die Bestimmung von Fluoreszenzquantenausbeuten und für
Emissionsmessungen bei verschiedenen Anregungswellenlängen.
Die Erfassung dieser gerätespezifischen Effekte erfolgt
durch die Ermittlung sogenannter Emissions- und Anregungskorrekturfunktionen,
welche die Wellenlängenabhängigkeit und Polarisationsabhängigkeit
der spektrale Empfindlichkeit der eingesetzten Detektionskanäle
(Emissionskorrektur) und die Wellenlängenabhängigkeit und
Polarisationsabhängigkeit der spektralen Beleuchtungsstärke
am Probenort bzw. der Anregungslichtintensität (Anregungskorrektur)
beinhalten.
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Die
einfache und rückführbare Kalibrierung von Lumineszenzmesssystemen
erfordert rückführbare und idealerweise zertifizierte
Transferstandards, die unter identischen Bedingungen wie typische
Proben vermessen werden können, die für möglichst
viele verschiedene Gerätetypen, Formate und Messgeometrien
geeignet sind und die einen weiten Spektralbereich, typischerweise
UV/vis, vis/NIR oder UV/vis/NIR, abdecken. Mit zunehmender Nutzung
des NIR-Spektralbereiches für viele verschiedene Fluoreszenzapplikationen
(z. B. optische Bildgebung; erstes diagnostisches Fenster von ca.
650 bis 900 nm) gewinnen Standards für den NIR-Spektralbereich
stark an Bedeutung. Für die Erstellung von Anregungs- und
Emissionskorrekturfunktionen mit einer möglichst geringen
Messunsicherheit müssen Probe und Transferstandard unter
identischen Messbedingungen vermessen werden, also mit der gleichen
Messgeometrie, den gleichen Probenbehältern und -formaten,
den gleichen Polarisatoreinstellungen, Filtern und Abschwächen
sowie den gleichen Einstellungen für die Monochromatorspaltbreite,
Photomultiplierspannung, das „Sampling Interval” und
die Integrationszeit oder Scangeschwindigkeit. Für die
Erfüllung dieser Voraussetzungen und die Verlässlichkeit
der Emissions- und der Anregungskorrektur ist es daher wesentlich,
dass sich der zur Kalibrierung verwendete Transferstandard und die
zu untersuchenden lumineszierenden Proben hinsichtlich ihrer spektralen
Strahldichte bzw. wellenlängenabhängigen Lumineszenzintensität
möglichst wenig unterscheiden.
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Bekannt
ist der Einsatz zertifizierter physikalischer Transferstandards
zur Erfassung der gerätespezifischen Effekte. Zur Kalibrierung
des Anregungskanals kommen dabei typischerweise zertifizierte Empfängernormale
zum Einsatz und für die Kalibrierung des Emissionskanals
zertifizierte Strahldichtenormale bzw. Standardlampen. Für
den Einsatz physikalischer Transfernormale nachteilig sind die erforderlichen
guten Optikkenntnisse des Anwenders, kostenintensive Rekalibrierungen,
brenndauerabhängige Änderungen der Wellenlängenabhängigkeit
der spektralen Strahldichte von Standardlampen, ggf. unterschiedliche
Messgeometrien und Messparameter für Probe und Standard
und im Falle der Emissionskorrektur mit Standardlampen die unterschiedlichen
Emissionscharakteristika von Lampe und Probe und die um mindestens
zwei bis vier Größenordnungen unterschiedlichen
spektralen Strahldichten von Transfernormal und einer typischen
lumineszierenden Probe. Dies alles kann zu fehlerbehafteten und
unbefriedigenden Korrekturfunktionen führen und ist zudem
aufwändig und kostenintensiv.
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Für
die Anregungskorrektur werden auch so genannte Quantenzähler
eingesetzt. Dies sind hochkonzentrierte Farbstofflösungen,
die einfallende Lichtquanten praktisch vollständig absorbieren
und mit einer wellenlängenunabhängigen Fluoreszenzquantenausbeute
in emittierte Photonen umwandeln. Quantenzähler liefern
sehr konzentrations- und geometrieabhängige Messdaten und
sind zudem anfällig für Polarisationseffekte.
Standardisierte Kalibrierverfahren mit definierten Konzentrationen
in Kombination mit definierten Messgeometrien sind für
Quantenzähler nicht verfügbar.
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Bekannt
sind ebenfalls so genannte chemische Transfer- bzw. Fluoreszenzstandards
(Emissions- und/oder Anregungsstandards), die typischerweise auf
der Photolumineszenz einer chemischen Verbindung basieren und zusammen
mit ihren (idealerweise zertifizierten) spektral korrigierten, also
geräteunabhängigen Emissions- und/oder Anregungsspektren
eingesetzt werden. Solche Fluoreszenzstandards werden in verschiedenen
Formen eingesetzt, insbesondere in Form von Lösungen oder
eingebettet in feste Polymer- oder Glasmatrizes. Vorteil von Fluoreszenzstandards,
insbesondere in Form von Lösungen, ist, dass diese den
zu untersuchenden lumineszierenden Proben hinsichtlich ihrer Lumineszenzintensität
und Emissionscharakteristika stark ähneln. Fluoreszenzstandards
erlauben somit die (spektrale) Kalibrierung unter den bei typischen Probenmessungen
angewandten Bedingungen. Fluoreszenzstandards lassen sich in vielen
verschiedenen Gerätetypen, Formaten und Messgeometrien
vermessen und sind somit auch zur Kalibrierung von Fluoreszenzmesssystemen
mit speziellen Probengeometrien oder -formaten geeignet, beispielsweise
mit Mikroküvetten, Mikrotiterplatten oder Kryostatsystemen.
Allein Fluoreszenzstandards erlauben die Durchführung der
Kalibrierung in der selben Küvetten- und Messanordnung
wie die eigentliche Probenmessung und erfüllen die Anforderung ”gleiche
Messbedingungen für Standard und Probe”.
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Voraussetzungen
für die Eignung als chemischer Transferstandard ist dabei
die problemspezifische Farbstoffauswahl. Dies impliziert beispielsweise
breite, glatte und unstrukturierte Emissionsspektren im Falle von
Emissionsstandards für die Ermittlung der relativen spektralen
Empfindlichkeit zur Minimierung des Einflusses der spektralen Spaltbreite
des Emissionsmonochromators und breite, glatte und unstrukturierte
Absorptions- bzw. Anregungsspektren im Falle von Anregungsstandards.
Außerdem müssen die Fluoreszenzquantenausbeuten
der Farbstoffe moderat bis hoch sein, um Signalbeiträge
durch Störfluoreszenz, Streuung oder Eigenfluoreszenz vom
Lösungsmittel zu minimieren. Im UV/vis-Spektralbereich
bedeutet dies Fluoreszenzquantenausbeuten von mindestens 30%, im
NIR-Spektralbereich von mindestens ca. 10%, bevorzugt aber ≥ 20%.
Außerdem sollten im Falle von flüssigen Systemen
Polarisationseffekte minimiert werden durch die Wahl von Chromophoren
mit einer möglichst geringen Anisotropie der Emission (UV/vis-Spektralbereich ≤ 0,05,
NIR-Spektralbereich 0,15–0,20). Dies ist die Voraussetzung
für die einfache Charakterisierung von Fluoreszenzmesssystemen
ohne Polarisatoren. Bei festen Systemen gelingt eine Minimierung
der Emissionsanisotropie nur in Ausnahmefällen, z. B. mit
Ionen-dotierten Gläsern. Für eine Gerätecharakterisierung
mit minimaler Messunsicherheit muss für anisotrop emittierende
Standards bei der Charakterisierung von Fluoreszenzmesssystemen
ohne Polarisatoren der polarisationsbedingte Beitrag des Standards
zur Messunsicherheitsbilanz der Gerätecharakterisierung
rechnerisch erfasst werden. Für chemische Transferstandards
müssen außerdem neben den mit einer bekannten
Messunsicherheit charakterisierten, applikationsrelevanten Lumineszenzeigenschaften
wie dem korrigierten Emissions- und/oder Anregungsspektrum auch
die Reinheit der eingesetzten Verbindungen und, für den
Einsatz in Lösung, auch die Reinheit des Lösungsmittels
bekannt sein, um reproduzierbare Messungen zu garantieren. Darüber
hinaus sind Angaben zur Langzeitstabilität (thermisch und
photochemisch; Testung unter applikationsrelevanten Bedingungen)
und im Falle von festen Systemen zur Homogenität erforderlich.
Im Falle von Systemen, die für die einmalige Nutzung ausgelegt
sind, muss die Reproduzierbarkeit gewährleistet sein.
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In
der Fachliteratur sind zahlreiche Empfehlungen zu chemischen Transferstandards
wie potenziellen (sekundären) Emissions- und Anregungsstandards
umfassend diskutiert und vereinzelt auch zu Standard-Kombinationen
für die Abdeckung eines möglichst breiten Spektralbereichs.
Mit äußerst wenigen Ausnahmen sind für
keinen der literaturbekannten oder kommerziell verfügbaren
Fluoreszenzstandards alle applikationsrelevanten Eigenschaften verfügbar,
wie etwa die Reinheit des verwendeten Farbstoffs, seine Anisotropie,
die Wellenlängenabhängigkeit der Fluoreszenzspektren
und der Fluoreszenzquantenausbeute, die Temperaturabhängigkeit
der Fluoreszenzeigenschaften im applikationsrelevanten Temperaturbereich
sowie die Photostabilität und die thermische Stabilität
in der verwendeten Matrix. Darüber hinaus fehlen zumeist Angaben
zur Kalibrierung des eingesetzten Fluorometers, zu den verwendeten
Messparametern und zur Messunsicherheit. Damit sind diese Literaturdaten
nur von sehr eingeschränktem Nutzen. Die zertifizierten
Fluoreszenzstandards, nämlich Chininsulfat-Dihydrat vom
National Institute for Standards and Technology (NIST, USA), die
Standards der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung
(BAM, Deutschland) [
DE
10 2004 044 717 A ;
D. Pfeifer et al., J. Fluoresc.
2006, 16, 581] und zweier Glasstandards vom NIST (
SRM
1940 und
SRM 1941) sind bislang die einzigen
Emissionsstandards, deren korrigierte Emissionsspektren mit einem rückführbar
charakterisierten Referenz-Fluorometer mit bekannter wellenlängenabhängiger
Messunsicherheit zertifiziert wurden.
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Der
Spektralbereich, in dem ein Fluoreszenzstandard zur Kalibrierung
eingesetzt werden kann, ist durch die Lage und Breite seiner Fluoreszenzbande
limitiert. Der Emissionsstandard Chininsulfat deckt z. B. nur den
Spektralbereich von ca. 400 bis 550 nm ab. Um ein Photolumineszenzmesssystem
im gesamten UV/vis/NIR-Spektralbereich rückführbar
zu kalibrieren, ist somit die Kombination mehrerer hinsichtlich
ihrer Fluoreszenzspektren aufeinander abgestimmter Chromophore mit
(idealerweise zertifizierten) korrigierten Fluoreszenzspektren erforderlich.
Dabei sollten die Schnittpunkte benachbarter Spektren ausreichend
hohe Fluoreszenzintensitäten aufweisen, um so die Verknüpfung
der Einzelkorrekturkurven zu einer Gesamtkorrekturfunktion mit möglichst
geringer Messunsicherheit zu gewährleisten. Für
derartige Chromophorkombinationen zur Ermittlung der Emissionskorrektur
im UV/vis/NIR-Spektralbereich gibt es wenige Beispiele, für
Anregungsstandard-Kombinationen sogar nur ein Beispiel.
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Bekannt
ist beispielsweise eine – kommerziell nicht mehr erhältliche – Kombination
von Emissionsstandards, die aus fluorophorhaltigen Polymerfolien
mit NIST-zertifizierten Emissionsspektren besteht. Diese erfordert
jedoch einen Front-Face-Probenhalter und eine definierte Messgeometrie
sowie die Verwendung von Polarisatoren und ist damit grundsätzlich
für die Kalibrierung einfacher Lumineszenzmesssysteme nicht
geeignet. Zudem weichen die erforderlichen Messbedingungen von typischen
Bedingungen für flüssige Proben ab. Darüber
hinaus sind chromophorhaltige Polymethylmethacrylat (PMMA)-Blöcke
in Küvettenform der Firma Starna als Emissions- und Anregungsstandards
bekannt, die jedoch Polarisationseffekte sowie teilweise stark strukturierte
Emissions- und Anregungsspektren aufweisen, was ihre Eignung limitiert.
Steil anstei gende Flanken und eine Strukturierung führen
zu einer Abhängigkeit der Fluoreszenzspektren vom Monochromator-Bandpass
bzw. der Monochromator-Spaltbreite und zu einer Erhöhung
der Kalibrierunsicherheit. Es fehlen zudem Angaben zur Homogenität
der Farbstoffverteilung und zur photochemischen und thermischen
Langzeitstabilität; so nimmt jedenfalls die Farbstoffkonzentration
des Naphthalin-haltigen Polymerblocks mit der Zeit ab. Darüber
hinaus können bei diesem Ansatz – wie bei allen
Ansätzen, in denen Chromophore in eine feste Matrix eingebracht
werden, – Probleme durch lokale Ausbleicheffekte und die
lokale Bildung von Photoprodukten entstehen. Ein weiteres Beispiel
für eine Emissionsstandardkombination sind Farbstofflösungen
von der Firma Molecular Probes, die jedoch ebenfalls Fluorophore
beinhalten, die aufgrund ihrer sehr schmalen, steil ansteigenden
Emissionsspektren und des großen Überlappungsbereichs
zwischen Absorption und Emission als Emissionsstandards ungeeignet
sind. Eine weitere bekannte Kombination von Emissionsstandards umfasst
Fluorophore, die teilweise eine zu geringe Photostabilität
(Tryptophan, Coumarin 102), strukturierte und steil ansteigende
Emissionsbanden (alpha-NPO) eine große Fluoreszenzanisotropie
(LDS 751) oder vergleichsweise geringe Stabilitäten (Styryl
8) aufweisen (
J. A. Gardecki & M. Maroncelli, Appl. Spectrosc.
1998, 52, 1179). Ein aus einer Lösung und zwei
Gläsern bestehender Emissionskalibriersatz des NIST ist
aufgrund der langen Abklingzeiten der verwendeten Chromophore der
Gläser nur bedingt für die Kalibrierung von Spektrometern
mit gepulsten Lichtquellen geeignet. Außerdem zeigt der
Farbstoff
SRM 1942 ein leicht strukturiertes Emissionsspektrum.
Der bereits oben erwähnte Farbstoffkit der BAM (
DE 10 2004 044 7717
A ) stellt ein weiteres Beispiel für eine Standardkombination
dar. Sein Emissionsbereich deckt den UV/vis-Spektralbereich von etwa
300 bis 730 nm ab.
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Im
Gegensatz zum UV/vis-Spektralbereich gibt es bislang keinen zertifizierten
Emissionsstandard für den NIR-Spektralbereich. Grund hierfür
ist, dass die überwiegende Mehrzahl der im NIR-Spektralbereich
emittierenden Fluorophore schmale strukturierte Absorptions- und
Emissionsbanden und einen großen Überlappungsbereich
von Absorption und Fluoreszenz aufweist und damit für eine
Applikation als NIR-Emissionsstandard ungeeignet sind. Die einzigen,
bislang bekannten spektralen Fluoreszenzstandards für den
NIR-Spektralbereich sind LDS 751 bzw. Styryl 8, ein Styrylfarbstoff,
dessen Emissionsspektrum in Methanol den Spektralbereich von ca.
650 bis 840 nm abdeckt; N,N-Dimethylamino-m-nitrobenzol (N,N-DMAMB),
dessen breites, im lang welligen Bereich der Emissionsbande auslaufendes
Emissionsspektrum in einer n-Hexan-Benzol-Mischung den Spektralbereich
von ca. 650 bis 760 nm abdeckt; 4-Diamino-4'-nitrostilben (4,4'-DMANS),
dessen Emissionsspektrum in o-Dichlorbenzol den Spektralbereich
von ca. 590 bis 940 nm abdeckt, Styryl 9M (
DE 10 2004 044 717 A ),
dessen Emissionsspektrum in Acetonitril den Spektralbereich von
ca. 670 bis 970 nm abdeckt, und dotierte Gläser bzw. Glaskeramiken,
deren Emissionsspektren z. B. in der Matrix Lanthan-Phosphat-Glas
den Spektralbereich von ca. 750 bis 950 nm abdecken (
EP 1 696 224 A ). Nachteilig
an LDS 751 sind seine hohe Emissionsanisotropie und limitierte Stabilität,
wohingegen bei N,N-DMAMB und 4,4'-DMANS die für Nitroverbindungen
typischen geringen Fluoreszenzquantenausbeuten und die toxischen
Lösungsmittel problematisch sind. Kritisch an Styryl 9M
ist die geringe thermische und photochemische Stabilität
sowie seine niedrige Fluoreszenzquantenausbeute (< 10%) in polaren
Lösungsmitteln.
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Es
lässt sich somit feststellen, dass derzeit kein rückführbarer
und langzeitstabiler Emissionsstandard für den NIR-Spektralbereich
oberhalb von 700 nm verfügbar ist, der das diagnostische
Fenster von etwa 650 bis 900 nm abdeckt, sich durch glatte, unstrukturierte
und breite Emissionsspektren, eine gute Langzeitstabilität
und eine vergleichsweise hohe Fluoreszenzquantenausbeute (≥ 20%),
eine Emissionsanisotropie ≤ 0,20 in einem polaren, protischen
Lösungsmittel wie Ethanol auszeichnet sowie durch eine
geringe Überlappung von Absorption und Fluoreszenz und
der diese Eigenschaften sowohl in typischen kommerziell verfügbaren polaren
Lösungsmitteln zeigt als auch in festen Matrices unterschiedlicher
Polarität.
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Fluoreszenzquantenausbeutestandards
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Die
Photolumineszenzquantenausbeute (Φ) ist das Maß für
die Effizienz der Konversion von zuvor absorbiertem Licht in emittierte
Photonen und somit der fundamentalste Parameter für die
Charakterisierung von optischen Materialien, wie (Laser)Farbstoffen,
Phosphoren und LED/OLED-Systemen. Viele konventionelle Messverfahren
für die Photolumineszenzquantenausbeute funktionieren nur
dann zuverlässig, wenn die Probe besondere Anforderungen
erfüllt, z. B. hinsichtlich des Stokes-Shifts, der Emissionsanisotropie,
der Größe der Photolumineszenzquantenausbeute
und der optischen Eigenschaften der Matrix (Transmissionsverhalten etc.),
und erfordern einen gut charakterisierten Standard.
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Die
Messung von Lumineszenzquantenausbeuten erfolgt im Allgemeinen durch
relative optische, seltener durch kalorimetrische Verfahren. Relative
optische Messverfahren verwenden grundsätzlich eine Referenzprobe
bzw. einen sogenannten Fluoreszenzquantenausbeutestandard mit bekannter
Fluoreszenzquantenausbeute, dessen spektrale Strahldichte bzw. Emissionsintensität
mit der Probe direkt verglichen wird. Dieser möglichst
gut charakterisierte Quantenausbeutestandard sollte der Probe möglichst ähnlich
sein, beispielsweise hinsichtlich seiner spektralen Absorptions-
und Fluoreszenzeigenschaften, seiner Absorption bei der Anregungswellenlänge
und der Transmissionseigenschaften seiner Matrix. Im Vergleich zum
UV/vis-Spektralbereich gibt es bislang nur sehr wenige Empfehlungen
zu NIR-Fluoreszenzquantenausbeutestandards. Der oftmals als NIR-Quantenausbeutestandard
für die Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute von biomedizinisch
relevanten Systemen, wie beispielsweise fluoreszierenden Kontrastmitteln
für die optische Bildgebung, verwendete Fluorophor IR 125
bzw. Indocyanine Green ist nicht gut charakterisiert, zeigt nur
eine geringe Fluoreszenzquantenausbeute in polaren Lösungsmitteln
(kleiner 10%), hat Stabilitätsprobleme, bildet schnell nicht-fluoreszente
Aggregate insbesondere in wässrigen Medien und ist aufgrund
seiner großen Überlappung von Absorption und Fluoreszenz
sehr anfällig für innere Filter Effekte (Reabsorption).
Insgesamt gibt es bislang keinen rückführbaren,
zertifizierten und langzeitstabilen Fluoreszenzquantenausbeutestandard,
weder für den UV/vis- noch für den NIR-Spektralbereich,
und kein vollständig charakterisiertes System. Typischerweise
fehlen Angaben zur Charakterisierung des verwendeten Fluorometers,
Angaben zu den verwendeten Messparametern und Angaben zur Reinheit
des eingesetzten Farbstoffs. Relative optische Messverfahren erfordern
im Allgemeinen transparente, optisch dünne Lösungen
oder Festkörper. Es sind inzwischen auch Ansätze
zur Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute von optisch dichten
Systemen bekannt. Besonders problematisch ist generell die Bestimmung
der Fluoreszenzquantenausbeute von schwach und insbesondere von
stark streuenden Systemen.
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Standards zur Überprüfung
der spektralen Geräteperformance, der Langzeitstabilität
der spektralen Gerätecharakteristika und der spektralen
Sensitivität
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Standards
zur Überprüfung der spektralen Geräteperformance
und der Langzeitstabilität der spektralen Gerätecharakteristika,
wie der (relativen) spektralen Empfindlichkeit und der spektralen
Sensitivität, sind notwendig, um beispielsweise den durch
die Alterung von optischen und optisch-elektronischen Bauteilen
bedingten Gerätedrift zu erfassen und eine Vergleichbarkeit
der an verschiedenen Tagen durchgeführten Messungen von
relativen Fluoreszenzintensitäten zu ermöglichen.
Die Verfügbarkeit solcher Standards ist außerdem
unerlässlich für die im Rahmen von Laborakkreditierungen
nach ISO 17025 notwendige regelmäßige Durchführung
von Geräteüberprüfungen. Der bislang
einzige etablierte Test zur Überprüfung der Geräteperformance
und der Gerätelangzeitstabilität ist der sogenannte
Raman-Test. Dazu wird nicht-fluoreszentes Reinstwasser bei 350 nm
bestrahlt und die Intensität der Raman-Streuung bei 397
nm gemessen. Dieser Test ist nur für den UV-Spektralbereich
geeignet und erfasst aufgrund der sehr geringen Halbwertsbreite
der Ramanbande nur einen sehr kleinen Spektralbereich. Zudem wird
derzeit versucht, Gläser, die mit einer Mischung aus verschiedenen,
schmalbandig im Spektralbereich von ca. 400 bis 700 nm emittierenden
Seltenerd-Fluorophoren dotiert sind, als Day-to-Day-Intensity-Standards
für verschiedene Fluoreszenzmesstechniken zu etablieren
(U. Resch-Genger et al., J. Fluoresc. 2005, 15, 347).
Diese Gläser, deren Emissionsbanden einen breiten Spektralbereich
abdecken, sind aber nicht für den für medizinisch-diagnostische
Fluoreszenzapplikationen relevanten NIR-Spektralbereich von ca.
650 bis 900 nm geeignet.
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Standards zur Bestimmung des Linearitätsbereichs
von Lumineszenzdetektionssystemen
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Voraussetzung
für die Bestimmung der Emissions- und Anregungskorrekturfunktionen
von Lumineszenzmesssystemen und für jede quantitative Lumineszenzanalytik
ist die Kenntnis des Linearitätsbereichs der verwendeten
Detektionssysteme. Dieser hängt im Falle von gängigen
Detektoren wie PMTs und CCD-Systemen von der Detektionswellenlänge
ab. Hierfür gibt es bislang keine einheitliche Vorgehensweise.
Die einzige, einen Emissionsstandard einsetzende Methode beruht
auf Chininsulfat-Dihydrat. Des Weiteren sind seit kurzem vom NIST
zertifizierte Fluoreszein-Lösungen (NIST SRM 1932;
Invitrogen Fluorescein NIST-Traceable Standard F36915)
sowie die aus mehreren Fluorophoren bestehenden ”ReadyPlate
Microplate Intensity Standards” von der Firma Molecular
Probes verfügbar und die Fluorescence Reference Standards
der Firma MATSCH (Chromophore eingebaut in feste Matrices) für
verschiedene Anregungs- und Emissionswellenlängen im UV/vis-Spektralbereich.
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Farbstoffe,
die zur Bestimmung des Linearitätsbereichs von Fluoreszenzdetektionssystemen
geeignet sind, zeichnen sich insbesondere durch eine möglichst
geringe Überlappung von Absorption und Fluoreszenz aus.
Dies ist Voraussetzung dafür, dass die Emissionsspektren
bei Extinktionen bis ca. 0,1 (1-cm-Küvette) noch konzentrationsunabhängig
sind. Im Allgemeinen vorteilhaft sind auch hier glatte, unstrukturierte
Emissionsspektren, die einen möglichst großen
Emissionsspektralbereich abdecken. Eine zur Ermittlung des Linearitätsbereichs
von Fluoreszenzdetektionssystemen mit Chininsulfat-Dihydrat beschriebene
Methode (ASTM E 578-83) ist aufgrund der Empfehlung
von sehr hohen Farbstoffkonzentrationen problematisch, da dabei
Verfälschungen durch innere Filtereffekte auftreten können.
Die Wellenlängenbereiche, für die das Verfahren
eingesetzt werden kann, sind durch das Absorptions- und das Emissionsspektrum
von Chininsulfat-Dihydrat limitiert. Die Linearität von
gängigen Detektoren wie Photomultipliern hängt
aber von der Wellenlänge ab. Integral messende Fluoreszenzgeräte,
wie Filterfluorometer, viele Mikrotiterplattenauslesegeräte
und Scanner für die optische Bildgebung, sind in der Wahl
der Anregungs- und Emissionswellenlängen begrenzt durch
die verwendeten Anregungslichtquellen (Laser oder Lampe mit Anregungsfilter)
und die integrale Detektion (Emissionsfilter und Detektor). Die
zur Bestimmung des Linearitätsbereichs von Fluoreszenzdetektionssystemen
ebenfalls geeigneten BAM-Standards F001 bis F005 decken nur den
UV/vis-Spektralbereich ab und sind nur zur Bestimmung des Linearitätsbereichs
für Wellenlängen kleiner als 700 nm geeignet.
Seit kurzem sind zudem Fluoreszein-Lösungen für
die Ermittlung des Linearitätsbereichs kommerziell verfügbar.
Diese sind jedoch aufgrund des vergleichsweise schmalen Absorptions-
und Emissionsspektrum von Fluoreszein nur in einem engen visuellen
Spektralbereich einsetzbar. Problematisch ist auch hier die große Überlappung
der Absorptions- und Emissionsspektren. Dies gilt auch für
die für verschiedene Anregungs- und Emissionswellenlängen
einsetzbaren RediPlate Microplate Intensity Standards der Firma
Invitrogen bzw. Molecular Probes. Die MATSCH-Standards sind in Mikrotiterplatten
integriert und damit nur für Mikrotiterplattenauslesegeräte
geeignet. Eine Variation der Konzentration und damit der Fluoreszenzintensität
für eine problemspezifische Anpassung durch den Anwender
ist so nicht möglich. Die Absorptionsspektren der Chromophore
werden nicht angegeben.
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Fluorophor-dotierte Partikel im Nano-
und Mikrometerbereich
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Farbstoff-beladene,
nanometer- und insbesondere mikrometergroße Partikel sind
von großer Bedeutung für die Charakterisierung
von Fluoreszenzmikroskopen und Durchflusszytometern. Mikrometergroße
Partikel werden in zunehmendem Maße auch als Plattformen
für eine große Anzahl an bioanalytischen Applikationen
(Assays etc.) und als Sensorsysteme eingesetzt, hier oft in Kombination
mit mikroskopischen oder durchflusszytometrischen Detektionsmethoden
und FREI-Ansätzen. Diese zumeist oberflächenfunktionalisierten
(z. B. mit Amino- oder COOH-Gruppen zur weiteren Funktionalisierung
oder mit einem Biomolekül, etwa einem Antikörper,
Streptavidin oder Biotin) Partikel sind oftmals mit mindestens einem
Farbstoff kodiert, der bei typischerweise verwendeten Anregungswellenlängen
angeregt werden kann. Mitunter werden auch Farbstoffkombinationen
verwendet, die im Allgemeinen bei derselben Anregungswellenlänge
anregbar sind, aber bei unterschiedlichen Emissionswellenlängen
emittieren („optical barcodes”). Nanometergroße
fluoreszierende Partikel spielen auch als in vivo einsetzbare Sensorsysteme
und als hochfluoreszente Marker in der biomedizinischen Diagnostik
eine immer größere Rolle. Daher ist eine Vielzahl
an Fluorophor-beladenen Partikeln (verschiedene Matrices mit verschiedenen
Oberflächenfunktionalisierungen etc.) verfügbar,
insbesondere mikrometergroße Partikel für den
UV/vis-Spektralbereich. Die Beladung erfolgt dabei je nach Polymermaterial
und Fluorophor entweder durch Quellung, Einpolymerisation oder durch
Anbindung von Fluorophoren an Oberflächenfunktionalitäten.
Im Gegensatz zum letzteren Fall sind die Fluorophore in den beiden
ersten Fällen gekapselt, also vor äußeren
Einflüssen geschützt. Damit werden ihre optischen
Eigenschaften nicht von der Polymermatrix bestimmt, sondern system-
bzw. anwendungsspezifisch von der jeweiligen Mikroumgebung des Farbstoffes.
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Die
Mehrzahl der in Partikeln gekapselten Fluorophore sind Farbstoffe
mit schmalen, strukturierten Absorptions- und Emissionsspektren
und einer großen Überlappung zwischen Absorption
und Fluoreszenz, wie Fluoreszein-, Rhodamin- oder BODIPY-Farbstoffe
(Farbstoffe mit einer „resonanten Emission”).
Beispiele für gekapselte Fluorophore mit relativ breiten
und unstrukturierten Absorptions- und Fluoreszenzbanden (Farbstoffe
mit Charge Transfer (CT)-Zuständen oder einer Emission
von einem CT-Zustand) sind mit Nilrot oder Nile Blue dotierte Melamin-Partikel
(Fa. Microparticles GmbH oder Sigma Aldrich). Die mit diesen Farbstoffen beladenen
mikrometergroßen Partikel emittieren aber typischerweise
unterhalb 700 nm. Außer dem sind Polystyrol-Partikel, die
mit Farbstoffen unbekannter Struktur dotiert sind, unter der Handelsbezeichnung
FluoSpheres (Fa. Invitrogen) verfügbar, jedoch ohne Herstellerangaben
zu den Farbstoffstrukturen. Diese Farbstoffe zeigen aber relativ
schmale und strukturierte Emissionsbanden und eine starke Überlappung
von Absorption und Fluoreszenz (resonante Emission) und sind damit
nicht als spektrale Fluoreszenzstandards geeignet. Auch für viele
andere Applikationen als Fluoreszenzintensitätsstandards
ist diese große Überlappung von Absorption und
Emission ungünstig, da sie schon bei vergleichsweise geringen
Farbstoffbeladungsdichten zu einer Konzentrationsabhängigkeit
der Emissionsspektren aufgrund von Reabsorption führt.
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Streuende spektrale Fluoreszenzstandards
und Fluoreszenzstandards zur Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute
von streuenden und fluoreszierenden Systemen bzw. zur Überprüfung
von dafür eingesetzten Messverfahren und -aufbauten
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Generell
spielt die Messung von Fluoreszenz in streuenden Systemen eine große
Rolle für bioanalytische und medizinische Applikationen
der Fluorometrie (z. B. Fluoreszenzmessungen in streuendem Gewebe und
Monitoring von biologischen Prozessen bei prozessanalytischen Applikationen)
und für viele Applikationen in der Materialforschung und
-analytik (z. B. Charakterisierung von anorganischen Festkörperleuchtstoffen oder
Phosphoren, Nanoleuchtstoffen in OLEDs oder lumineszenzaktivierten
photonischen Kristallen). Dabei kann es sich hinsichtlich der Streueigenschaften
sowie des Spektralbereichs von Absorption und Emission und der spektralen Überlappung
von Absorption und Fluoreszenz um stark variierende Systeme handeln.
Beispiele sind u. a. anorganische und polymere Matrices (z. B. dotierte
Sol-Gel-Gläser oder Polymethylmethacrylat(PMMA)-Komposite,
Polystyrol-Partikel etc.) mit vergleichsweise geringer Streuung
bis zu stark streuenden Systemen mit denselben Bestandteilen, deutlich
streuende YAG:Ce-Systeme und optisch dichte Phosphore oder Farbstoff-beladene
Cellulose.
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Auch
für die Charakterisierung der Fluoreszenzeigenschaften
von streuenden und fluoreszierenden Systemen nimmt die Relevanz
des NIR-Spektralbereichs zu. So ist beispielsweise für
fluorometrische Untersuchungen an Geweben mit Verfahren der optischen
Bildgebung, z. B. für die Frühdiagnostik von krankheitsspezifischen
Veränderungen auf molekularer Ebene insbesondere der Spektralbereich
von ca. 650 bis 900 nm relevant. Hierfür werden als Standards
sogenannte Phantome eingesetzt, die aus einem NIR-Fluorophor und einem
festen oder flüssigen streuenden Medium bestehen. Dieses
Medium besteht dabei im Allgemeinen aus einer Matrix mit bekanntem
Brechungsindex und einem Streuer, dessen Streueigenschaften z. B. über
den Brechungsindex (Brechungsindexunterschied Matrix – Streuer)
und/oder seine Größe (z. B. im Falle von Partikeln)
kontrolliert und variiert werden können. Typischerweise
werden Fettemulsionen oder in eine Flüssigkeit oder feste
Polymermatrix eingebrachte Mikropartikel aus SiO2,
PMMA oder Polystyrol als Streuer verwendet. Dabei werden die Absorption-,
Fluoreszenz- und Streueigenschaften der Standards möglichst
auf die zu vermessenden Proben angepasst. Dies gilt in gleichem
Maße z. B. auch für Standards für die
Bestimmung der Fluoreszenz- oder Photolumineszenzquantenausbeute
von anorganischen oder anorganisch-organsichen Hybridmaterialien
wie LED- und OLED-Systeme. Die für den NIR-Bereich eingesetzten
Fluorophore sind typischerweise symmetrische Cyaninfarbstoffe wie
Indocyanine Green (ICG) oder IR-125, Diethylthiatricarbocyaniniodid
(DTTCI), und IR-140, die sich jedoch durch strukturierte Absorptions-
und Emissionsbanden auszeichnen sowie einen großen Überlappungsbereich
von Absorption und Fluoreszenz. Solche resonant emittierenden Systeme
sind sehr anfällig für innere Filtereffekte (Reabsorption).
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Es
sind außerdem fluoreszierende und streuende Systeme bekannt,
die aus einer flüssigen oder festen Matrix, einem Fluorophor
und Partikeln bestehen. Dabei können für einen
gegebenen Fluorophor durch die Wahl der Partikelgröße
und der Differenz der Brechungsindices von Matrix und Partikelmaterial
die Streueigenschaften bestimmt und kontrolliert gesteuert werden.
Solche Systeme bilden die Basis für streuende Fluoreszenzstandards
z. B. für die Überprüfung von Fluoreszenzmessungen
an streuenden und fluoreszierenden Systemen. Auch hier sind streuende
und fluoreszierende Systeme auf der Basis von Emittern mit breiten
unstrukturierten Absorptions- und Emissionsbanden und vergleichsweise
geringer spektraler Überlappung erwünscht.
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Es
gibt bislang kaum Standards und Messmethoden für die Charakterisierung
von Fluoreszenzmesssystemen für Messungen an streuenden
und fluoreszierenden Systemen. Die in der optischen Bildgebung als Phantome
empfohlenen fluoreszierenden und streuenden Standards basieren alle
auf symmetrischen oder asymmetrischen Cyaninen, die sich durch schmale
und strukturierte Absorptions- und Emisisonsbanden und eine deutliche Überlappung
von Absorption und Fluoreszenz auszeichnen und somit empfindlich
auf innere Filtereffekte (Reabsorption) reagieren. Zudem gibt es
keine Systeme, bei denen für einen breitbandig absorbierenden
und im NIR emittierenden Farbstoff über die Fluorophorkonzentration
bzw. -beladungsdichte, die Partikelgröße und -konzentration
und die Wahl des Matrix- und des Partikelmaterials die Absorptions-,
Fluoreszenz- und Streueigenschaften systematisch und kontrolliert
variiert werden können.
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Fluoreszenzmarker
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Ein
stetig wachsendes Anwendungsgebiet von Fluoreszenzfarbstoffen sind
Fluoreszenzmarker und Reaktivfarbstoffe z. B. für die Fluoreszenzmarkierung
und/oder den fluorometrischen Nachweis von funktionellen Gruppen
und von nicht-fluoreszenten oder nur im UV-Bereich fluoreszierenden
Analyten wie (Bio)Makromolekülen, Metallionen oder Anionen.
Solche Systeme können auch modular aufgebaute Sensormoleküle
darstellen, die z. B. aus einem targetspezifischen Liganden und
einem daran kovalent gebundenen Chromophor bestehen. in zunehmendem
Maße werden auch partikuläre Label eingesetzt.
Diese partikulären Marker bestehen aus einer Vielzahl an
Fluorophoren, die entweder in nano- oder mikrometergroße
organische oder anorganische Partikel eingebaut sind (gekapselte
Chromophore) oder an die Oberflächen solcher Partikel gebunden
sind. Die Partikel können dann weiter funktionalisiert
werden, z. B. entweder mit targetspezifischen Liganden bzw. Oberflächenfunktionalitäten
oder mit chemischen Gruppen für die kovalente Anbindung
an Analyte wie (Bio)Makromoleküle. Auch für solche
Applikationen im Bereich der Fluoreszenzanalytik gewinnt der NIR-Spektralbereich
zunehmend an Bedeutung. inzwischen sind auch etliche Label und Marker
für den NIR-Spektralbereich verfügbar, bei denen
es sich typischerweise um Rhodamine, BODIPY-Farbstoffe, Porphyrine,
Phthalocyanine und insbesondere um Cyanine und um Hemicyanine handelt.
Diese oftmals auf typische Anregungswellenlängen von Fluoreszenzmesssystemen
hinsichtlich ihrer Absorption angepassten Verbindungen zeichnen
durch schmale, stark überlappende und strukturierte Absorptions-
und Emissionsbanden aus und mit zunehmend langwellig verschobener
Lage von Absorption und Emission durch eine zunehmend geringer werdende
Fluoreszenzquantenausbeute in polaren Lösungsmitteln sowie
eine abnehmende Fluoreszenzlebensdauer.
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Vorteilhaft
für viele Applikationen als Fluoreszenzmarker wäre
ein NIR-Fluorophor mit im Gegensatz zu den bereits genannten Verbindungen
vergleichsweise breiten, unstrukturierten Absorptions- und Emissionsbanden,
einem möglichst geringen spektralen Überlappungsbereich
von Absorption und Fluoreszenz in Kombination mit einer vergleichsweise
hohen Fluoreszenzquantenausbeute (bevorzugt ≥ 20%) in vielen
verschiedenen Matrices und möglichst auch in Matrices unterschiedlicher
Polarität. Darüber hinaus ist eine möglichst
große photochemische und thermische Stabilität
wünschenswert.
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Beschreibung der Erfindung
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Fluoreszenzfarbstoff
bereitzustellen, der im Nahinfrarot (NIR) Spektralbereich absorbiert
und emittiert und der als Fluoreszenzstandard möglichst für
eine Vielzahl der vorstehend beschriebenen Kalibrierungszwecke geeignet
ist. Die Verbindung sollte möglichst glatte und unstrukturierte
sowie breite Absorptionsbanden und insbesondere möglichst
glatte und unstrukturierte sowie breite Emissionsbanden geringer
Steilheit aufweisen bei einer möglichst geringen Überlappung
der Absorptions- und Fluoreszenzbanden und einer möglichst
hohen Fluoreszenzquantenausbeute (vorzugsweise ϕf ≥ 20%). Die Verbindung sollte
idealerweise eine moderate Emissionsanisotropie r in einem polaren
protischen Lösungsmittel wie Ethanol zeigen (vorzugsweise
r ca. 0,15–0,20) und in den applikationsrelevanten Matrices
eine ausreichende photochemische und thermische Stabilität
besitzen. Des Weiteren sollten die genannten Eigenschaften möglichst
sowohl in Lösung als auch in festen Matrices bestehen sowie
in polarer aprotischer, in polarer protischer als auch in unpolarer
Umgebung.
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Diese
Anforderungen werden gelöst durch die Verwendung einer
(asymmetrisch substituierten) Verbindung nach der allgemeinen Formel
(I) als NIR-Fluoreszenzstandard,
worin
B und B' unabhängig voneinander einen Wasserstoff-, Methyl-,
Ethyl-, Phenyl-, Naphthyl-, Benzoxazol-, Benzimidazol-, Benzthiazol-
oder Indolrest bedeuten; X, X' und X'' unabhängig voneinander
einen Methyl-, Ethyl- oder Phenylrest bedeuten; Z ein Stickstoff-
oder Kohlenstoffatom und A
– ein
beliebiges Anion bedeutet. Dabei können ein oder mehrere
Wasserstoffreste der Formel (I) sowie der besagten Reste substituiert
sein. Geeignete Substituenten hierfür sind solche, die
einen möglichst geringen Effekt auf die Elektronendichteverteilung
des konjugierten Systems aufweisen, beispielsweise kurze Alkylreste,
insbesondere Methyl-, Ethyl-, Propyl-, oder Isopropylreste; Alkoxyreste,
insbesondere Methoxy- oder Ethoxyreste; sowie Substituenten, die durch
eine verzweigte oder unverzweigte Alkylkette, insbesondere eine
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, oder Isopropylkette, elektronisch von
dem konjugierten Elektronensystem entkoppelt sind, wie z. B. Sulfonsäure-
oder Carboxylgruppen, Halogenatome, insbesondere Chlor, Methoxy-
oder Ethoxyreste, NHS-, Aldehyd-, Thiol-, und Aminogruppen.
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Als
Anion A– kommen beliebige negativ
geladene Gegenionen in Frage, beispielsweise Halogenide, Nitrat,
Nitrid, Sulfat, Sulfit, Phosphat, Chlorat (ClO3 –), Perchlorat (ClO4 –), Tetrafluoroborat (BF4 –), Triflat (CF3SO3 –)
etc.
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Die
Asymmetrie der erfindungsgemäßen Verbindung nach
Formel (I) wird vorteilhaft dadurch erhöht, dass die Reste
B und B' einerseits und/oder X und X'' andererseits unterschiedlich
gewählt sind. Diese Asymmetrie und der dadurch induzierte
Charge-Transfer-Charakter ist Voraussetzung für die günstigen
Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften dieser Verbindungen.
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Insbesondere
bevorzugt ist, dass in Formel (I) die Reste B oder B' einen Wasserstoff-
oder Benzoxazolrest bedeuten, vorzugsweise B einen Benzoxazolrest
und B' einen Wasserstoffrest. Ferner ist bevorzugt, dass die Reste
X, X' und X'' jeweils einen Ethyl- oder Phenylrest bedeuten, insbesondere
X einen Ethylrest und X' und X'' jeweils einen Phenylrest.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung bedeutet in Formel
(I) Z ein Stickstoffheteroatom.
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Besonders
vorteilhafte spektrale Charakteristika zeigt die Verbindung gemäß Formel
(II)
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Die
erfindungsgemäße Verbindung gemäß Formel
(I), deren Fluoreszenzeigenschaften vorliegend erstmalig untersucht
wurden, zeichnet sich durch Absorptions- und Emissionsspektren des
Farbstoffs im Nahinfrarotbereich aus, die für NIR-Fluorophore
ungewöhnlich breit, glatt und unstrukturiert sind. Dies
gilt in besonderem Maße für die Emissionsspektren.
Dies gilt überraschenderweise sowohl in polarer als auch
in relativ unpolarer Umgebung sowie in Lösungen oder in
festen Matrices. Dabei weist der Farbstoff eine für einen NIR-Fluorophor
relativ geringe spektrale Überlappung zwischen Absorptions-
und Emissionsbande auf, wodurch Reabsoptionseffekte stark minimiert
werden. Demgegenüber zeigen strukturverwandte symmetrische Verbindungen
strukturierte Absorptions- und Emissionsbanden und eine große Überlappung
zwischen Absorption und Emission und sind damit für die
hier vorgesehenen Applikationen als Fluoreszenzstandards ungeeignet.
Des Weiteren ist der erfindungsgemäße Farbstoff
durch eine vergleichsweise hohe Fluoreszenzquantenausbeute in polaren
Lösungsmitteln als auch in festen Matrices gekennzeichnet.
Bemerkenswert ist ferner die vergleichsweise hohe Stabilität
des Farbstoffs in luftgesättigter Lösung und in
festen Matrices.
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Diese
attraktiven spektroskopischen Eigenschaften bilden die Grundlage
für die erfindungsgemäße Verwendung des
Farbstoffs für verschiedene nachfolgend dargestellte Applikationen
als Standard. Dabei wird vorliegend unter dem Begriff ”Standard” oder ”Fluoreszenzstandard” jeglicher
referenzieller Einsatz eines fluoreszierenden Mediums verstanden,
ungeachtet dessen, ob gerätespezifische Beiträge
oder der Linearitätsbereich eines Detektorsystems des Photolumineszenzmesssystems
ermittelt werden sollen oder eine Aussage über die quantitative
Fluoreszenzintensität oder Streuintensität einer
Probe oder das Vorhandensein einer fluoreszierenden Quelle getroffen
werden soll oder dergleichen.
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Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Verbindung
nach Formel (I) als spektraler Fluoreszenzstandard zur Ermittlung
einer Emissions- und/oder Anregungskorrekturfunktion eingesetzt
wird, welche gerätespezifische spektrale Beiträge
eines zu kalibrierenden Lumineszenzmesssystems enthält.
Bezüglich dieser Verwendung wird auf die im Abschnitt ”Anregungs-
und Emissionsstandards” gemachten Ausführungen
verwiesen. Die für einen NIR-Fluorophor ungewöhnlichen
spektralen Eigenschaften des neuen Farbstoffs ermöglichen
die Bestimmung der Emissionskorrektur für den Spektralbereich
von ca. 650 bis 950 nm und die Bestimmung der Anregungskorrektur
für den Spektralbereich von ca. 450 bis 780 nm. Dazu kann
der Quotient aus dem korrigierten (geräteunabhängigen)
Fluoreszenzspektrum des Farbstoffs und dem gerätespezifischen
Farbstoffrohspektrum bestimmt werden, der z. B. mit konventionellen
Fluoreszenzspektrometern (beispielsweise 0°/90°-Messgeometrie
für die konventionelle Fluorometrie, 45°/0°-Messgeometrie
für die bispektrale Fluoreszenz), Mikrofluorometern und
spektral aufgelöst messenden Fluoreszenzmikroskopen (wide
field Mikroskope und konfokale Laser Scanning Mikroskope (CLSM)
oder anderen Imaging-Systemen) gemessen werden kann. Die Anregung
des Fluoreszenzstandards kann in Lösung oder in festen
Matrices mit üblichen rot emittierenden Lasern erfolgen.
Vorzugsweise wird auch eine statistische, wellenlängenabhängige Unsicherheit
(Messunsicherheitsbilanz) für die Kalibrierung eines Lumineszenzmesssystems
in diesem Spektralbereich erstellt, sofern der Beitrag der gerätespezifischen
Messunsicherheit für das zu kalibrierende Lumineszenzmesssystem über
Wiederholmessungen und die Ermittlung der Standardabweichung für
diese Messungen vom Anwender berücksichtigt wird.
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Nach
einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die
Verbindung nach Formel (I) als spektraler Fluoreszenzstandard in
Kombination mit weiteren aufeinander abgestimmten spektralen Fluoreszenzstandards
eingesetzt wird, deren Fluoreszenzspektren zusammen einen vorbestimmten
Spektralbereich abdecken. Auf diese Weise kann eine rückführbare
Kalibrierung des gesamten UV/vis/NIR-Spektralbereichs eines Lumineszenzmesssystems
erfolgen, indem die mit den einzelnen Fluoreszenz sandards ermittelten
Einzelkorrekturkurven miteinander verknüpft werden, wie
vorausgehend im Abschnitt „Anregungs- und Emissionsstandards” beschrieben.
Idealerweise sollten die Schnittpunkte benachbarter Spektren ausreichend
hohe Fluoreszenzintensitäten aufweisen, um so die Verknüpfung
der Einzelkorrekturkurven zu einer Gesamtkorrekturfunktion mit möglichst
geringer Messunsicherheit zu gewährleisten. Details zu
einer bevorzugten rechnerischen Vorgehensweise der Spektrenverknüpfung
sowie vorteilhafte Kombinationen der Farbstoffe sind in
DE 10 2004 044 717
A beschrieben.
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Gemäß einer
weiteren Ausgestaltung wird die Verbindung nach Formel (I) als NIR-Fluoreszenzquantenausbeutestandard
zur Ermittlung der Fluoreszenzquantenausbeute einer Probe eingesetzt.
Dabei ist die Fluoreszenzquantenausbeute definiert als das Verhältnis
der von einer Probe emittierten Anzahl von Photonen zu der von der
Probe absorbierten Photonenanzahl. Auch hier wird auf die Ausführungen
im vorstehenden Abschnitt „Fluoreszenzquantenausbeutestandards” verwiesen.
Insbesondere wird zur Ermittlung der Fluoreszenzquantenausbeute
einer Probe die spektrale Strahldichte bzw. Emissionsintensität
der Verbindung gemäß Formel (I) als Referenz mit
bekannter Fluoreszenzquantenausbeute gemessen und mit der der Probe
direkt verglichen. Die besondere Eignung der vorliegenden Verbindung
für diese Verwendung resultiert aus ihrer relativ hohen
Fluoreszenzquantenausbeute (> 20%
in Ethanol), sowie der vergleichsweise geringen spektralen Überlappung
der Absorptions- und Emissionsbande. Demgegenüber weisen
bekannte NIR-Fluorophore deutlich geringere Fluoreszenzquantenausbeute
von unter 10% auf.
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Weiterhin
kann die Verbindung nach Formel (I) mit Vorteil als spektraler Standard
zur Überprüfung der spektralen Geräteperformance
und/oder der Langzeitstabilität der spektralen Gerätecharakteristika
eines Lumineszenzmesssystems für den NIR-Spektralbereich
eingesetzt werden sowie zur regelmäßigen Überprüfung der
spektralen Sensitivität (s. Abschnitt ”Standards
zur Überprüfung der spektralen Geräteperformance,
der Langzeitstabilität der spektralen Gerätecharakteristika
und der spektralen Sensitivität”). Die regelmäßige Überprüfung
der Performance eines Lumineszenzmesssystems ist notwendig, um beispielsweise
den durch die Alterung von optischen und optisch-elektronischen
Bauteilen bedingten Gerätedrift zu erfassen und eine Vergleichbarkeit
der an verschiedenen Tagen durchgeführten Messungen von
relativen Fluoreszenzintensitäten zu ermöglichen.
Die Verfügbarkeit solcher Standards ist außerdem
unerlässlich für die im Rahmen von Laborakkreditierungen
nach ISO 17025 notwendige regelmäßige
Durchführung von Geräteüberprüfungen.
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Eine
weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegende Ausgestaltung
betrifft die Verwendung der Verbindung nach Formel (I) als Standard
zur Ermittlung und Überprüfung des Linearitätsbereichs
eines Lumineszenzdetektionssystems (s. vorstehenden Abschnitt „Standards
zur Bestimmung des Linearitätsbereichs von Lumineszenzdetektionssystemen”).
Dabei wird der Bereich eines Detektors bestimmt, in dem die von
diesem angezeigte Intensität linear mit der eingestrahlten
Intensität zunimmt, also der Bereich, in welchem eine zuverlässige
quantitative Aussage über eine Konzentration eines Chromophors
in einer Probe möglich ist. Voraussetzung dafür,
dass die Emissionsspektren bei Extinktionen bis ca. 0,1 in einer
1-cm-Küvette noch konzentrationsunabhängig sind,
ist wiederum eine möglichst geringe spektrale Überlappung
der Absorptions- und Fluoreszenzbande. Zudem sind auch hier glatte,
unstrukturierte Emissionsspektren, die einen möglichst
großen Emissionspektralbereich abdecken, sowie eine hohe
Quantenausbeute von Vorteil. Sämtliche Kriterien werden
von der Verbindung nach Formel (I) erfüllt. Er ist daher
zur Bestimmung der Linearität von Fluoreszenzmesssystemen
im Bereich des diagnostischen NIR-Fensters geeignet.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Anwendung wird die Verbindung nach Formel (I)
in einer flüssigen oder festen lichtstreuenden Matrix als
streuender spektraler Standard und als streuender Quantenausbeutestandard
eingesetzt (s. Abschnitt „Streuende spektrale Fluoreszenzstandards
und Fluoreszenzstandards zur Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute
von streuenden und fluoreszierenden Sytemen bzw. zur überprüfung
von dafür eingesetzten Messverfahren und -aufbauten”).
Als Matrix wird eine streuende Flüssigkeit, insbesondere
eine Dispersion oder Emulsion, oder eine streuende feste Matrix,
insbesondere eine Polymermatrix, verwendet. Die eigentlichen Streuer
sind beispielsweise Mikropartikel aus SiO2,
PMMA oder Polystyrol, die in die feste Matrix eingebracht oder in
der Flüssigkeit dispergiert werden. Grundsätzlich
kommen sowohl für die Matrix als auch für die
Streuer alle bekannten und geeigneten Systeme in Frage. Ein großer
Vorteil des erfindungsgemäß eingesetzten NIR-Farbstoffes
für die Anwendung als ”streuender spektraler Fluoreszenzstandard
und Fluoreszenzquantenausbeutestandard” sind wiederum die
glatten, breiten und unstruk turierten Absorptions- und Emissionsbanden
und der gegenüber bekannten Systemen deutlich geringere
Spektralbereich der Überlappung von Absorption und Emission.
Die in Matrices unterschiedlicher Polarität durchgeführten
Untersuchungen zeigen zudem, dass der Fluorophor gemäß Formel
(I) nicht nur in polarer Umgebung, wie Ethanol, sondern auch in
relativ unpolaren Matrices, wie PMMA oder PS seine glatten, breiten
und unstrukturierten Absorptions- und Emissionsbanden beibehält.
Außerdem sind die bislang erhaltenen Fluoreszenzquantenausbeuten
in allen Fällen ausreichend für eine Applikation
als Fluoreszenzstandard auch in solchen streuenden Systemen.
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Es
ist ferner bevorzugt vorgesehen, die Verbindung nach Formel (I)
als Oberflächenmarkierung oder eingekapselte Dotierung
von Partikeln mit Partikeldurchmessern im Bereich von Nanometern
bis Mikrometern einzusetzen, d. h. zwischen ca. 10 nm und 1000 μm.
Als Matrixmaterial für die Partikel kommen insbesondere organische
Polymere, wie Polystyrole oder Polymethylmethacrylate, Polyacrylamide,
Polylactide, Polyisopren, Polyacrylnitril und Polyester in Frage
sowie anorganische Polymere wie Silica, Silikone und Sol-Gel-Netzwerke und
anorganisch-organische Hybridsysteme. Neben massiven Partikeln können
auch partikuläre Hohlkörper, sogenannte ”hollow
spheres” Einsatz finden. Dabei erfolgt, wie im Abschnitt ”Fluorophor-dotierte
Partikel im Nano- und Mikrometerbereich” diskutiert, die
Einkapselung des Fluorophors je nach Polymermaterial und Fluorophor
entweder durch Quellung oder Einpolymerisation. Oberflächen-Dotierungen
hingegen können durch Anbindung des Fluorophors an Oberflächenfunktionalitäten
der Partikel hergestellt werden. Während die Einkapselung
des Fluorophor den Vorteil seines Schutzes vor äußeren
Einflüssen aufweist, werden die optischen Eigenschaften
der Fluorophore im Fall der Oberflächen-Dotierung nicht
von der Polymermatrix bestimmt, sondern system- bzw. anwendungsspezifisch
von der jeweiligen Mikroumgebung des Farbstoffs. Im Falle des eingekapselten
Fluorophors gereicht wiederum zum Vorteil, dass seine Fluoreszenzeigenschaften
und insbesondere die vorteilhafte Form der Emissionsbande nur wenig
von der Polarität der Matrix beeinflusst werden und seine
glatten, breiten und unstrukturierten Absorptions- und Emissionsbanden
erstaunlicherweise auch in relativ unpolaren Matrices wie PS beibehalten
werden.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Anwendung der Verbindung
gemäß Formel (I) stellt ihre Verwendung als (molekularer
oder partikulärer) Fluoreszenzmarker dar (siehe vor stehenden
Abschnitt ”Fluoreszenzmarker”). In diesem Zusammenhang
kann die entsprechend funktionalisierte oder in funktionalisierten
Systemen wie Partikeln gekapselte Verbindung z. B. zur Markierung
und zum fluorometrischen Nachweis funktioneller Gruppen (z. B. auf
Oberflächen, an (Bio)Makromolekülen) und von nicht
oder nur im UV-Bereich fluoreszierenden Analyten, insbesondere (Bio)Makromolekülen
eingesetzt werden. Dabei kann der erfindungsgemäße
Fluoreszenzfarbstoff insbesondere auch in Form eines modular aufgebauten
Sensormoleküls Einsatz finden, für den Nachweis
von Analyten wie z. B. Metallionen, Anionen, und Biomolekülen,
wobei er kovalent oder nicht-kovalent an einem weiteren Molekül,
beispielsweise einem targetspezifischen Liganden, gebunden vorliegt. Wahlweise
kann der Farbstoff auch in Form eines partikulären Labels
eingesetzt werden, wobei er in nano- oder mikrometergroße
organische oder anorganische funktionaliserte oder funktionalisierbare
Partikel eingebaut (gekapselt) oder an die Oberflächen
solcher Partikel gebunden vorliegt. Die Partikel können
dann weiter funktionalisiert sein, z. B. entweder mit targetspezifischen
Liganden bzw. Oberflächenfunktionalitäten oder
mit chemischen Gruppen für die kovalente Anbindung an Analyte.
Die Eignung der Verbindung gemäß Formel (I) als
Fluoreszenzmarker ergibt sich wiederum aus ihren im Gegensatz zu
den bekannten Verbindungen vergleichsweise breiten, unstrukturierten
Absorptions- und Emissionsbanden, ihren geringen spektralen Überlappungsbereich
von Absorption und Fluoreszenz in Kombination mit ihrer vergleichsweise
hohen Fluoreszenzquantenausbeute in vielen verschiedenen Matrices
unterschiedlicher Polarität. Darüber hinaus ist
auch in diesem Zusammenhang ihre große photochemische und
thermische Stabilität von Vorteil.
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Eine
weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegende Anwendung
der erfindungsgemäßen Verbindung betrifft ihre
Verwendung als integral auslesbaren Fluoreszenzintensitätsstandard.
Die Eignung des NIR-Farbstoffs hierzu resultiert wiederum aus seiner
vergleichsweise großen spektralen Trennung von Absorption
und Fluoreszenz (vergleichsweise großer Stokes-Shift).
Diese Anwendung dient zur Referenzierung der Intensität
(in der Regel durch Quotientenbildung) von kürzer wellig
emittierenden Fluoreszenzfarbstoffen. Letztere können z.
B. Bestandteil eines analytsensitiven Sensorsystems oder Fluoreszenzassays
sein. Dabei wird der Quotient aus analytsensitivem Signal zum analytinsensitiven
Standardsignal gebildet, um so beispielsweise Signalschwankungen
zu erfassen, die auf Fluktuationen der Anregungslichtintensität
zurückzuführen sind. Voraussetzung dafür
ist, dass das analytsensitive System und der Standard bei derselben
Anregungswellenlänge angeregt werden können, spektral
aber deutlich getrennte Emissionsbereiche aufweisen. In diesem Fall kann
der NIR-Farbstoff außerdem als Geräte- und/oder
Kalibrierstandard für das zum Auslesen des Signals des
integral messenden Fluoreszenzmesssystems verwendet werden, d. h.
als so genannter ”Day-to-Day-Intensitätsstandard”.
Geräte, die hiermit überprüft werden
können, sind beispielsweise Fluoreszenzmesssysteme, die
einen Anregungskanal und zwei oder mehrere integral detektierende
Emissionskanäle aufweisen. Im Gegensatz zur Applikation
als spektraler Fluoreszenzstandard stellt die Applikation als Intensitätsstandard
für integral messende Fluoreszenzmesssysteme keine besonderen
Anforderungen an die spektrale Form der Emissionsbande. Hier ist
insbesondere eine hohe Stabilität wichtig und die Anpassung
an den Spektralbereich des analytsensitiven Systems.
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Sämtliche
der vorstehenden Kalibrierungsanwendungen können für
konventionelle (spektral aufgelöst oder integral messende)
Fluoreszenzspektrometer (Fluorometer) beliebiger Messgeometrie (beispielsweise 0°/90°-Messgeometrie
für die konventionelle Fluorometrie, 45°/0°-Messgeometrie
für die bispektrale Fluoreszenz), Mikrofluorometer sowie
spektral aufgelöst messende Fluoreszenzmikroskope (etwa
Wide-Field-Mikroskope und konfokale Laser-Scanning-Mikroskope (CLSM)
oder andere Imaging-Systeme) sowie für Ramanspektrometer
Einsatz finden. Darüber hinaus eignet sich der NIR-Fluorophor
gemäß Formel (I) als Standard für optische
bildgebende Geräte (Imaging-Geräte), für
integral messende konfokale und wide-field-Mikroskope, insbesondere
für In-vivo-Fluorescence-Imaging verwendete Fluoreszenzgeräte,
und für faseroptische Fluoreszenzsensoren etc.
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Aufgrund
der für einen NIR-Fluorophor relativ geringen Überlappung
der Absorptions- und Fluoreszenzspektren und der von der Polarität
der Matrix nur gering beeinflussten Spektrenform kann dieser neue NIR-Standard
für alle Typen von Messsystemen, die für Photolumineszenzmessungen
an Lösungen, an festen Systemen und an Partikeln ausgelegt
sind, sowie für verschiedene Formate, beispielsweise Küvetten,
Mikrotiterplatten, Slides und Filme, und für verschiedene
Messgeometrien (z. B. 0°/90°-Messgeometrie und 45°/0°-Messgeometrie)
eingesetzt werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur
rückführbaren Kalibrierung eines Photolumineszenzmesssystems,
insbesondere eines Fluoreszenzmesssystems, umfassend einen Fluoreszenzstandard
gemäß Formel (I), insbesondere gemäß Formel
(II), sowie sein spektral korrigiertes Fluoreszenzspektrum in tabellarischer
Form (relative oder normierte Fluoreszenzintensität als
Funktion der Wellenlänge), in computerlesbarer Form und/oder
eine Angabe einer Internetseite, auf welcher das korrigierte Fluoreszenzspektrum
abrufbar ist. Dabei wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter
dem Begriff korrigiertes Fluoreszenzspektrum ein Emissions- oder
Anregungsspektrum verstanden, das in einem rückführbar
kalibrierten Lumineszenzmesssystem unter definierten Messbedingungen
erhalten wurde. Durch Korrektur der gerätespezifischen
Beiträge des kalibrierten Messsystems ist das korrigierte
Fluoreszenzspektrum geräteunabhängig. Vorzugsweise
handelt es sich um ein von einer autorisierten Behörde
zertifiziertes Spektrum.
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Optional
kann das Kit eine Mehrzahl weiterer Fluoreszenzstandards umfassen
sowie spektral korrigierte Fluoreszenzspektren von diesen in tabellarischer
Form, in computerlesbarer Form und/oder eine Angabe einer Internetseite,
auf welcher die korrigierten Fluoreszenzspektren abrufbar sind,
wobei die Fluoreszenzstandards derart spektral aufeinander abgestimmt
sind, dass ihre spektral korrigierten Fluoreszenzspektren zusammen
einen vorgegebenen Spektralbereich abdecken. Ein solches Kit kann
grundsätzlich eine Mehrzahl unterschiedlicher Emissionsstandards
und deren spektral korrigierte Emissionsspektren zur Erstellung
einer Gesamtkorrekturfunktion für den Emissionskanal (Emissionskorrekturfunktion)
enthalten als auch eine Mehrzahl unterschiedlicher Anregungsstandards
und deren korrigierte Anregungsspektren zur Erstellung einer Gesamtkorrekturfunktion
für den Anregungskanal (Anregungskorrekturfunktion) umfassen.
Bevorzugt umfasst das Kit sowohl Emissions- als auch Anregungsstandards,
sowie deren spektral korrigierte Emissions- und Anregungsspektren
in elektronischer Form auf einem Datenträger bzw. über
das Internet abrufbar. Die Verbindung gemäß Formel
(I) kann sowohl als Emissionsstandard als auch als Anregungsstandard
eingesetzt werden. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung
umfasst das Kit ferner einen Programmalgorithmus zur Berechnung
von Teilkorrekturfunktionen und/oder eine Angabe einer Internetseite,
auf welcher der Algorithmus abrufbar ist. Es ist ferner bevorzugt
vorgesehen, dass das Kit zu jedem korrigierten Fluoreszenzspektrum
einen geräteunabhängigen spektralen Messunsicher heitsverlauf
in computerlesbarer Form umfasst. Auch hier ist optional oder zusätzlich
möglich, die Angabe einer Internetseite bereitzustellen,
auf welcher die Messdaten zusammen mit den spektralen Messunsicherheitsverläufen
abrufbar sind. Letztere ermöglichen die Erstellung eines
Gesamtmessunsicherheitsverlaufs für die Gesamtkorrekturfunktion,
wodurch eine wellenlängenabhängige Messunsicherheitsbilanz
für das zu kalibrierende Lumineszenzmesssystem bestimmt
werden kann. Das Kit kann ferner eine Anweisung zum bestimmungsgemäßen
Gebrauch der Kitkomponenten und/oder eine Angabe einer Internetseite,
auf welcher die Anweisungen abrufbar sind, enthalten. Die Anweisung
enthält beispielsweise Angaben zu den Messbedingungen und
Geräteeinstellungen und dergleichen. Der erfindungsgemäße
NIR-Farbstoff sowie das diesen enthaltende Kit versetzt einen Benutzer
in die Lage, eine Kalibrierung des Messsystems im NIR-Spektralbereich
durchzuführen. Im Falle eines Kits, das eine Kombination
des erfindungsgemäßen NIR-Farbstoffs mit weiteren
abgestimmten Standards enthält, kann eine Emissionskorrektur über
den gesamten UV/vis/NIR-Spektralbereich bis zur einer Wellenlänge
von etwa 900 nm und eine Anregungskorrektur bis etwa 700 nm zuverlässig
und reproduzierbar durchgeführt werden. Gegenüber bekannten
Kombinationen wird somit der kalibrierbare Wellenlängenbereich
in Richtung des NIR-Bereichs erweitert. Insbesondere ermöglicht
die Abstimmung der einzelnen Fluoreszenzstandards die Erzeugung
einer Gesamtkorrekturfunktion für das Gerät in
bislang nicht verfügbarer Qualität.
-
Weitere
vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der übrigen
Unteransprüche.
-
Die
Erfindung wird nachfolgend in einem Ausführungsbeispiel
anhand der Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
-
1:
normiertes und korrigiertes Absorptions- und Emissionsspektrum der
Verbindung gemäß Formel (II) in Ethanol;
-
2:
normiertes und korrigiertes Absorptions- und Emissionsspektrum der
Verbindung gemäß Formel (II) in Polystyrol; und
-
3:
normierte und korrigierte Absorptions- und Emissionsspektren eines
Sets von Fluoreszenzstandards enthaltend die Verbindung gemäß Formel
(II).
-
Eine
Lösung der Verbindung gemäß Formel (IIa)
mit Perchlorat (ClO4 –)
als Anion A– (OTAVA Ltd.) in Ethanol
wurde fluoreszenzspektrometrisch vermessen.
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1 zeigt
das normierte und korrigierte Absorptionsspektrum (links) und das
normierte und korrigierte Emissionsspektrum (rechts) des neuen NIR-Farbstoffs
in ethanolischer Lösung bei einer Anregungswellenlänge
bei 590 nm. Es ist erkennbar, dass die Verbindung in dem polaren
Lösungsmittel (Ethanol) für einen NIR-Farbstoff
ungewöhnlich breite glatte und unstrukturierte Banden sowie
eine geringe spektrale Überschneidung der Absorptions-
und Emissionsbanden aufweist.
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Es
wurden ferner Polymerpartikel mit Polystyrol (PS) als Polymermatrix
mit der Verbindung gemäß Formel (IIa) mit Perchlorat
(ClO4 –)
als Anion A– beladen und ebenfalls
fluoreszenzspektrometrisch vermessen. 2 zeigt
das normierte und korrigierte Emissionsspektrum (rechts) des neuen
NIR-Farbstoffs in den PS-Partikeln bei Anregung im langwelligsten
Absorptionsmaximum. Es ist überraschend, dass die in polarer Umgebung
(1) beobachteten breiten, glatten und unstrukturierten
Banden sowie die geringe spektrale Überschneidung der Absorptions-
und Emissionsbanden auch in der relativ unpolaren Matrix erhalten
bleiben. Überraschend ist auch die vergleichsweise hohe
Fluoreszenzquantenausbeute von beispielsweise ≥ 22% in Ethanol.
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Für
die Kalibrierung des gesamten UV/vis/NIR-Spektralbereichs eines
Lumineszenzmesssystems zur Ermittlung seiner Emissions- und/oder
Anregungskorrekturfunktion, welche gerätespezifische spektrale
Beiträge des Lumineszenzmesssystems enthalten, müssen
eine Mehrzahl von Fluoreszenzstandards miteinander kombiniert werden,
deren Emissions- bzw. Absorptionsbanden sich spektral ergänzen.
Als Beispiel wurde ein Set von sieben Fluoreszenzstandards (Emissionsstandards)
A bis G untersucht, das ein Biphenylderivat (A), ein Naphthalinderivat
(B), zwei Coumarinderivate (C und D), ein Oxazinderivat (E), ein
Styrylderivat (G) sowie die Verbindung gemäß Formel
(IIa) (F) umfasste.
3 zeigt die spektral korrigierten
und normierten Emissionsspektren der Standards A bis G (oben) sowie
die korrigierten und normierten Anregungsspektren der Standards
(unten). Die Verbindungen A–F und wurden als Lösung
in Ethanol und Verbindung G in Acetonitril vermessen. Es ist erkennbar,
dass sämtliche Standardemissionsspektren einen breiten
und unstrukturierten Bandenverlauf mit nur jeweils einem Maximum
und keinen Schultern oder Unstetigkeiten in dem, für die
Kalibrierung verwendeten Spektralbereich aufweisen. Ferner wurde
bei der Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe Wert auf möglichst
große Wellenlängenabstände zwischen den
Maxima der Emissionsspektren und denen der dazugehörigen
Absorptionsspektren gelegt (Stokes-Shift), um die nochmalige Absorption
einmal emittierter Photonen aufgrund der Überlappung von
Absorptions- und Emissionsbanden zu vermeiden. Wichtig ist ferner, dass
die Standards so gewählt sind, dass die Einzelspektren
an den Überschneidungspunkten eine ausreichende Intensität
aufweisen, damit auch in diesen Bereichen eine möglichst
geringe Unsicherheit bei der Korrektur des Messsystems entsteht.
Vorzugsweise werden zur Kalibrierung des Lumineszenzmesssystems
Teilkorrekturfunktionen durch Quotientenbildung aus den (unkorrigierten)
gemessenen Fluoreszenzspektren der Standards und den entsprechenden
korrigierten Fluoreszenzspektren der Standards gebildet und zu einer
Gesamtkorrekturfunktion rechnerisch beispielsweise gemäß dem
in
DE 10 2004
044 717 A1 be-schriebenen Verfahren verknüpft,
welche die gerätespezifischen spektralen Beiträge
enthält. Diese Gesamtkorrekturfunktion erlaubt die spektrale
Korrektur eines breiten Spektralbereichs des Messsystems.
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Der
neue NIR-Farbstoff kann für die o. g. Standardapplikationen
je nach Fluoreszenzmessmethode und Fluoreszenzmesssystem in nahezu
beliebiger Form eingesetzt werden, beispielsweise in Lösung
(z. B. in Küvetten, Mikroküvetten oder Mikrokanal strukturen),
in nanometer- oder mikrometergroßen Polymerpartikeln (Einbau
z. B. durch Quellen oder Einpolymerisieren, Partikelmatrix z. B.
PS; Einsatz z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie), in Polymerblöcken
oder -scheiben beliebiger Größe und Dicke (Einbau
z. B. durch thermische oder photochemische Polymerisation im Falle
von PMMA; Einsatz z. B. für die Fluorometrie, Mikrofluorometrie, Fluoreszenzmikroskopie
und die optische Bildgebung) oder in Filmen bzw. Schichtsystemen
(z. B. mittels Spin Coating erzeugte Filme auf Substraten wie Objektträgern
aus Polymer oder Glas, Sol-Gel-Systeme oder (selbsttragende) Filme.
Beispiele für Einsatzgebiete für letztere Systeme
sind u. a. die Fluoreszenzmikroskopie und andere Imaging-Methoden,
die bispektrale Fluoreszenz (Colorimetrie) und alle für
Fluoreszenzuntersuchungen an Oberflächen geeigneten Messmethoden
und die Fluoreszenzsensorik z. B. mit faseroptischen Systemen. Der
neue NIR-Farbstoff kann für die Erzeugung von transparenten
fluoreszierenden festen Systemen in feste Matrices direkt als molekulares
System eingebracht werden oder für die Erzeugung von fluoreszierenden
Systemen mit definierten, kontrollierbaren Streueigenschaften als
molekulares System in Gegenwart von partikulären Systemen
wie nanometer- oder mikrometergroßen organischen, anorganischen
und organisch-anorganischen Polymerpartikeln oder als partikuläres
System in Form von Farbstoff-dotierten nanometer- oder mikrometergroßen
Polymerpartikeln. Die Fluoreszenz- und Streueigenschaften dieser
Systeme können dabei kontrolliert und variiert werden über
die Farbstoffkonzentration bzw. Farbstoffbeladungsdichte, die Partikelgröße
sowie über den Brechungsindex des Partikelmaterials und
den Brechungsindex der Matrix. Auch der Einsatz in Lösung
bzw. Suspension in Gegenwart von streuenden nanometer- oder mikrometergroßen
Partikeln zur Erzeugung einer definierten Streuung ist denkbar.
Diese Applikationsbreite in Kombination mit den interessanten optischen
Eigenschaften des neuen NIR-Farbstoffs ist Voraussetzung für
die Generierung von neuen ”streuenden” Fluoreszenzstandards
(spektrale Fluoreszenzstandards; Fluoreszenzquantenausbeutestandards),
also Systemen mit definierten Fluoreszenz- und Streueigenschaften,
zur Überprüfung von Fluoreszenzmesssystemen, die
für Untersuchungen an fluoreszierenden und streuenden Systemen
eingesetzt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102004044717
A [0009, 0012, 0037]
- - DE 1020040447717 A [0011]
- - EP 1696224 A [0012]
- - DE 102004044717 A1 [0057]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - EN ISO/IEC
17025 [0003]
- - D. Pfeifer et al., J. Fluoresc. 2006, 16, 581 [0009]
- - SRM 1940 [0009]
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Maroncelli, Appl. Spectrosc. 1998, 52, 1179 [0011]
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- - U. Resch-Genger et al., J. Fluoresc. 2005, 15, 347 [0016]
- - NIST SRM 1932 [0017]
- - Standard F36915 [0017]
- - ASTM E 578-83 [0018]
- - ISO 17025 [0039]
