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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Genexpression und die Herstellung
von Proteinen unter Verwendung von transformierten Wirtszellen und
rekombinanten DNA-Vektoren. Die Erfindung beschreibt ein Verfahren
zur Expression von Zielproteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Faltungshelferproteine,
welche auch als Chaperone bezeichnet werden, coexprimiert werden.
Die coexprimierten Chaperone werden dabei aus einer Liste von einzelnen
Faltungshelferproteinen ausgewählt und eine Vielzahl von
Kombinationen aus zwei, drei oder mehreren Proteinen gebildet (Chaperon-Toolbox),
die eine Expression gruppierter Chaperone-Gene mit heterologen Genen
für Zielproteine ermöglicht.
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Darüber
hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung von Plasmiden, die
Polynucleotide, die für Faltungshelferproteine (Chaperone)
codieren, umfassen, wobei das Plasmid zur Expression der Faltungshelferproteine
(Chaperone) befähigt ist; und sie betrifft ein Verfahren,
die Faltungshelferproteine-codierenden Polynucleotide auszuwählen
und zwei, drei oder mehrere davon randomisiert zu kombinieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Mit
der voranschreitenden Nutzung von Proteinen als Biokatalysatoren
oder als Pharmaka und der stetig steigenden Anzahl an Sequenzdaten
pro- und eukaryotischer Genome besteht ein zunehmendes Interesse
an leistungsfähigen industriell nutzbaren Expressionssystemen.
Da nur sehr wenige Wirtsstämme für die Expression
zur Verfügung stehen, werden die meisten rekombinanten
Proteine heterolog exprimiert, d. h. das zu exprimierende Zielprotein
stammt nicht aus dem Organismus, der als Wirtsstamm für
die Expression dient. Ein häufig auftretendes Problem bei
der heterologen Produktion rekombinanter Proteine ist die Aggregation des
Zielproteins (Bildung von sog. Inclusion bodies) im Cytoplasma des
Wirtsstamms. Der Grund für die Aggregation sind inkorrekte
inter- und intramolekulare Wechselwirkungen von Proteinketten des
Zielproteins, wobei diese Aggregate in aller Regel biologisch bzw.
biochemisch inaktiv sind. Die Ursachen sind zum Teil bekannt, beispielsweise
kann das Gen des Zielproteins Tripletts von Polynucleotiden (Codons)
enthalten, die für den Wirtsstamm nicht gut oder gar nicht
genutzt werden können. Weitere Probleme können
durch die fehlende Knüpfung von Disulfidbrücken
entstehen oder durch eine zu hohe Expressionsrate des Zielproteins.
Daher wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um die Bildung
von Inclusion bodies zu reduzieren oder sogar zu verhindern. Dazu
zählen beispielsweise das Herabsetzen der Inkubationstemperatur,
die Reduktion der Expressionsrate durch Verwendung entsprechender
Vektoren, die Wahl eines anderen Expressionswirtes, die Veränderung
des Zielgens oder die Coexpression von Faltungshelferproteinen [1].
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Faltungshelferproteine
kommen in allen Zellen vor, sie sind für eine Reihe von
Proteinen zur Ausbildung der richtigen Struktur notwendig. Speziell
bei Zellstress ist die Gefahr des vermehrten Auftretens fehlgefalteter
Proteine besonders groß, daher werden unter diesen Bedingungen
eine Vielzahl sogenannter „Heat shock-Proteine (HSP)” als
Faltungshelfer gebildet. In einigen Fällen sind die biochemischen
Funktionen von Faltungshelferproteinen gut untersucht. So gibt es
in Prokaryoten schon bei der Bildung der wachsenden Polypeptidkette
am Ribosom eine Wechselwirkung mit dem Triggerfaktor Tf, danach
wird die Faltung des Zielproteins von den Faltungshelferproteinen
DnaK und DnaJ kontrolliert und in der Folge steht noch der Proteinkomplex
aus GroEL und GroES bereit, den Faltungsprozess zu lenken (siehe
z. B. Review [2]).
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Führt
man sich vor Augen, wie vielfältig die Wechselwirkungen
neusynthetisierter Proteine mit Faltungshelfern bis zum Erreichen
der endgültigen Struktur sind, ist es nicht überraschend,
dass es bei der heterologen Überexpression von Proteinen
in hohem Ausmaß zu fehlgefalteten Proteinen kommt, die
dann als Proteinaggregate (Inclusion bodies) anfallen oder direkt
degradiert werden. Zur Überwindung dieses Problems wurden
daher die bekannten Systeme bzw. Komponenten an Chaperone ebenfalls
mit exprimiert, um zu versuchen, Proteinaggregate zu vermeiden.
In der Literatur sind Beispiele dafür beschrieben, dass
sowohl die Coexpression von einzelnen Chaperonen wie dem Triggerfaktor
Tf oder von DnaK als auch von Chaperonsystemen, die aus natürlicherweise
ebenfalls zusammenwirkenden Proteinen bestehen, wie dem GroEL/GroES-(GroELS-)System
oder DnaK gemeinsam mit DnaJ zu einer erhöhten Bildung
von löslichem Zielprotein führen können
[3]. Allerdings hat sich auch gezeigt, dass kein Faltungshelferprotein
oder eine Kombinationen von solchen als generelle Lösung
gegen Fehlfaltung angesehen werden kann [4].
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Eine
detaillierte Zusammenstellung, welche Proteine überhaupt
Faltungshelfer-Funktion besitzen, zeigt, dass es verschiedene Gruppen
solcher Proteine mit unterschiedlichen biochemischen Wirkungsmechanismen
gibt, beispielsweise molekulare Chaperone. Dabei handelt es sich
um eine Gruppe verwandter Proteine, die aufgrund ihrer Molekulargewichte
in Klassen oder Familien unterteilt werden können (Heatshock-Proteine
Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90, Hsp 100 oder sHsp). Faltungshelfer-Funktion
findet man auch bei den Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen, (PPIasen)
[5] oder den Dsb-Proteinen (disulfidebond Proteinen), die die Bildung
von Disulfidbrücken katalysieren können [6].
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Bislang
ist aber nicht von allen Faltungshelfer-Proteinen bekannt, inwiefern
sie tatsächlich eine Funktion als Faltungshelfer bei der
Expression heterologer Gene ausüben. Neben solchen Proteinen,
die eindeutig als Faltungshelfer bezeichnet werden können,
wie der Triggerfaktor Tf, DnaK, DnaJ, GroEL oder auch GroES gibt
es Proteine, von denen man nur auf Grund ihrer Sequenzmotive vermuten
kann, dass sie für Faltungshelferproteine codieren (putative
Faltungshelferproteine).
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Versuche
zur Coexpression von Faltungshelfer-Proteinen haben für
das Zielprotein sehr unterschiedliche Ergebnisse gezeigt: Bei der
Verwendung einzelner Faltungshelferproteine zeigt sich, dass es
sowohl positive als auch negative als auch keine Einflüsse
auf die Expression eines Zielproteins gibt. Ergebnisse, die mit einem
Zielprotein gefunden wurden, lassen sich nicht auf andere Proteine übertragen.
Dies trifft auch für die Kombination von mehreren Helferproteinen
zu. Ein genereller und umfassender Ansatz zur Verbesserung der Expression
heterologer Gene durch Coexpression von Faltungshelferproteinen
ist daher bislang nicht verfügbar.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur verbesserten Expression
von einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine, insbesondere mittels
heterogener Expression von rekombinaten Proteinen bereitzustellen.
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Gelöst
wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur verbesserten Expression
von rekombinanten Proteinen, wobei ein für ein rekombinantes
Protein codierendes Expressionsplasmid in Kombination mit wenigstens
zwei für unterschiedliche Chaperone codierenden Nukleotidsequenzen
in einen Wirtsorganismus eingebracht wird und das rekombinante Protein
und die Chaperone coexprimiert werden.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren werden verschiedene
Gene, die für Faltungshelferproteine codieren, aus einer
Vielzahl verfügbarer Gene derart miteinander kombiniert,
dass einerseits verschiedene biochemische Prinzipien von Chaperonen
miteinander kombiniert werden, andererseits die Anzahl der Kombinationen
derart gering gehalten wird, dass im Rahmen einer Verfahrensentwicklung
zur Produktion von Proteinen ein vertretbarer experimenteller Aufwand
erforderlich ist.
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In
einer Ausgestaltung der Erfindung werden die wenigstens zwei für
unterschiedliche Chaperone codierenden Nukleotidsequenzen permutierend
aus einer Gruppe von für Chaperone eines oder unterschiedlicher
Organismen codierenden Nukleotidsequenzen ausgewählt.
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Ein
wesentlicher Schritt zur Realisierung des Ziels, mehrere Gene und
damit mehrere Faltungshelferproteine in eine Produktionszelle einzubringen,
besteht in der Nutzung von Vektoren, die für Faltungshelferproteine
codierende Gene tragen. Um mehrere dieser Gene in Produktionszellen
einzubringen, können verschiedene Wegen beschritten werden,
beispielsweise indem Zellen mit einem einzigen Vektor transformiert
werden, der mehrere inserierte Gene trägt. Alternativ können
aber auch Zellen mit mehreren Vektoren, die jeweils nur ein Gen
oder eine geringere Zahl von Genen tragen, transformiert werden,
so dass man durch die Kombination mehrerer Vektoren in der Folge
zu den gewünschten Kombinationen an Faltungshelfern kommt.
Dies kann beispielsweise durch Klonierung der Einzelchaperone in
verschiedene, miteinander kompatible Vektorsysteme unter Kontrolle
eines oder mehrerer geeigneter, induzierbarer Promotoren erreicht
werden. Die Kompatibilität der Vektorsysteme bezüglich
ihrer ORI (origin of replication) und entsprechender Selektionsmarkergene
ist dabei entscheidend für die Kopienzahl der Plasmide
pro Zelle und die damit verbundenen vergleichbaren Konzentrationen
der entsprechenden Chaperone. Solche Plasmidbibliotheken können
in einem einzigen Schritt transformiert werden, wodurch eine kombinatorische
Zusammenstellung und Coexpression unterschiedlicher Chaperone gewährleistet
wird.
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Zur
Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe
wurde daher eine Genexpressionsbank („Chaperon-Toolbox”)
konstruiert, die in Wirtszellen eine randomisierte Expression einzelner
oder gruppierter Faltungshelfergene mit heterologen Genen für
Zielproteine ermöglicht. Wirtszellen können dabei
pro- oder eukaryotische Zellen sein, also beispielsweise Hefen oder
Pilze, Pflanzen- oder Säugetierzellen oder Zellen einer
Zellkultur, speziell beispielsweise Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Pseudomonas sp., Saccharomyces sp., Pichia sp., Hansenula sp., Schizosaccharomyces
pombe, Corynebacterium sp. oder Aspergillus sp.
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Zur
Konstruktion der Genexpressionsbank wurden folgende Teilschritte
bearbeitet:
- 1. Aufgrund der unterschiedlichen
Funktionen im Faltungsprozeß sollten möglichst
viele verschiedene Faltungshelfer Bestandteil dieser Chaperon-Toolbox
sein. Dazu sollten zunächst durch ein umfassendes „in silico”-Screening
sämtliche Gene identifiziert werden, die für putative
Faltungshelfer in einem Bakterium (in diesem Fall Pseudomonas aeruginosa)
codieren.
- 2. Die identifizierten Gene, die für Faltungshelfer
in diesem Organismus codieren, sollten aus dem Chromosom des Wildtyp-Stammes
P. aeruginosa isoliert und in spezielle Klonierungsplasmide eingebracht
werden.
- 3. Anschließend sollte eine Genexpressionsbank erzeugt
werden. Darin sollten nicht nur eine Vielzahl einzelner Chaperone
und Faltungskatalysatoren vorliegen, sondern vor allem randomisierte
Kombinationen von drei Faltungshelfergenen auf je einem broad-host-range
Expressionsplasmid der Expressionsbank verfügbar gemacht
werden.
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Durch
Coexpressionsversuche mit verschiedenen Zielproteinen aus Pro- und
Eukaryoten sollte schließlich die Nützlichkeit
dieser Genexpressionsbank untersucht werden. Dabei war das Ziel,
die jeweiligen Faltungsmodulatoren oder Kombinationen dieser Proteine,
die zu einer Verbesserung der Ausbeute löslichen, aktiven
Zielproteins führen, zu identifizieren.
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1A bis 1C: Übersicht über
die Klonierungsstrategie zur Erzeugung einer Chaperon-Genexpressionsbank.
Die Abbildung ist in drei Punkte unterteilt. Unter A ist die Amplifikation
und Klonierung der Faltungshelfergene dargestellt. B beschreibt
die Konstruktion von Expressionsvektoren mit einzelnen Chaperone und
C zeigt die Schritte zur Erzeugung von Multisite-Plasmiden, auf
denen drei unterschiedliche Chaperon-Gene auf einem Vektor vorliegen.
Nähere Beschreibungen der Abbildung erfolgen im Text. Die
einzelnen Klonierungsschritte werden nachfolgend detailliert erläutert.
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2:
Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die Aktivität
der löslichen R. erythropolis ADH in E. coli. Der Nachweis
der Enzymaktivität erfolgte durch Einsatz von 10 μl
Protein der löslichen Proteinfraktion, die auf gleiche
Zelldichten eingestellt war. Die Aktivität ist in U/ml
angegeben und die Standardabweichung aus drei voneinander unabhängigen
Messungen durch Fehlerbalken dargestellt. Die Stämme sind
durch die Angabe der Multisite-Plasmid-Nummer benannt (s. Tab. 6).
Durch die Unterteilung in Ergebnisgruppen (K = Kontrolle, bzw. Gruppe
I–III) werden Stämme zusammengefaßt,
die vergleichbare ADH-Aktivitäten aufweisen (LV = Leervektor,
d. h. ein Stamm mit RE-ADH-Vektor und dem Vektor, der in den übrigen
Stämmen jeweils Gene für Faltungshelferproteine
trägt, im Fall des LV-Stamms keine solche Gene trägt).
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3:
Einfluß von einzelnen P. aeruginosa Faltungshelfern auf
die Aktivität der R. ruber ADH in E. coli. Nach Aufschluß und
Fraktionierung der Proteinproben wurde jeweils die Aktivität
im photometrischen Test gemessen. Die Aktivität ist in
U/ml angegeben. Dargestellt sind Mittelwerte aus drei voneinander
unabhängigen Messungen, Standardabweichungen sind durch
Fehlerbalken angegeben. Die in den jeweiligen Stämmen enthaltenen
Faltungshelfer sind angegeben. Durch die Unterteilung in Ergebnisgruppen
(K = Kontrolle, bzw. Gruppe I–IV) werden Stämme
zusammengefaßt, die vergleichbare ADH-Aktivitäten
aufweisen.
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4:
Bestimmung der Esteraseaktivität der katalytisch aktiven
EstAα-Domäne aus P. aeruginosa nach Coexpression
mit verschiedenen Kombinationen von Faltungshelferproteinen. Die
Aktivität der EstAα-Domäne der Esterase
wurde in der löslichen Fraktion der unterschiedlichen Expressionsstämme
bestimmt. Als Kontrolle diente der Stamm mit EstAα und
Chaperon-Leervektor (LV). Die Werte der Aktivitäten sind
Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen. Abhängig
von der ermittelten Aktivität wurden die Stämme
in Ergebnisgruppen unterteilt (K = Kontrolle; I–III). Die
in den Expressionsstämmen enthaltenen Multisite-Expressionsplasmide
sind als Ziffern angegeben; die darin enthaltenen Chaperone sind
in Tab. 6 aufgeführt.
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5:
Einfluß der Coexpression von verschiedenen Faltungshelferkombinationen
auf die Löslichkeit und Aktivität des LipA Proteins
aus S. marcescens. Die Aktivität (A) des löslichen
LipA-Proteins ist für alle untersuchten Stämme
in nkat/OD (580 nm) angegeben. Die Werte stammen aus drei unabhängigen
Messungen, anhand derer die Standardabweichungen berechnet und in
Form von Fehlerbalken angegeben wurden. Als Kontrolle dienten der
Stamm mit Lipase-Expressionsplasmid und Chaperon-Leervektor (LV)
sowie der Stamm BL21(DE3) mit beiden Leervektoren (-). Die Nummer
der Plasmide mit Kombinationen aus Chaperonen und Foldasen ist angegeben
(s. Tabelle 6). In einer durchgeführten SDS-PAGE sind 10 μl
von GZE-Proben aufgetragen. Deutlicher wird die Menge an LipA-Protein
(60 kDa) in einem durchgeführten Zymogrammgel (Daten nicht
gezeigt).
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Durch
Coexpression von Faltungshelfern zusammen mit dem Zielprotein LipA
konnten deutliche Unterschiede zu dem Kontrollstamm BL21(DE3)-LV
aufgezeigt werden. Ausschließlich durch zwei Kombinationen
von Chaperonen und Faltungskatalysatoren, den Kombinationen 6 und
8 (s. Tab. 6), wurde die Aktivität der Lipase nicht beeinflußt
(5, A: Gruppe II). Bei einer Anzahl von acht Coexpressionsstämmen
führte die Expression der jeweiligen Faltungsenzyme zu
einer verringerten Produktion aktiven LipA-Proteins (5;
A: Gruppe I). Mit Hilfe von drei Kombinationen von Faltungshelfern
aus P. aeruginosa konnte eine Verbesserung der Aktivität
festgestellt werden. Bei den Expressionsstämmen, in denen
die Plasmide pEXP-1, pEXP-4 bzw. pEXP-41 vorlagen, konnte die Aktivität
der Lipase LipA im photometrischen Enzymtest um 125% gesteigert werden
(5; A: Gruppe III).
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6:
Bestimmung der lipolytischen Aktivität von CALB durch Umsatz
des Substrates Tributyrin auf Agarplatten. Die erzeugten Expressionsstämme
wurden auf Tributyrin-haltige Platten gepickt und über
Nacht bei 30°C inkubiert. Die Aktivität wird durch
Bildung eines Hofes um die Kolonie herum detektiert. Die Ergebnisse
konnten in zwei unabhängigen Anzuchten verifiziert werden.
Im oberen Teil der Abbildung sind die Nummern der Chaperonkombinationen
aufgeführt, die in den Stämmen vorlagen, die auf
die Tributyrinplatten gepickt wurden (unterer Teil der Abbildung).
Die in den Teststämmen enthaltenen Faltungsmodulatoren
sind durch die Nummern der Expressionsplasmide angegeben (s. Tab.
6).
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7:
Nachweis der Aktivität löslichen CALB-Proteins
nach einer Überexpression in Flüssigmedium. Die
gemessene Aktivität ausgewählter Expressionsstämme
ist in U/ml angegeben. Die in den Stämmen vorliegenden
Chaperonkombinationen sind durch die aufgeführten Zahlen
unter dem Graphen genannt (s. Tab. 6). Die Daten sind Mittelwerte
aus drei unabhängigen Messungen. Die Standardabweichung
ist durch Fehlerbalken angezeigt. Je nach Verhältnis der
Enzymaktivität der Teststämme zur Kontrolle (K)
wurden sie in Ergebnisgruppen zusammengefaßt (I–III).
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8:
Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die relative
Fluoreszenz des Faltungsreporters GFP. Die relative Fluoreszenz
des GFP wurde nach Anregung bei 475 nm pro 1 OD und ml Probe bei
einer Emissionswellenlänge von 515 nm bestimmt. Die Standardabweichungen
aus zwei voneinander unabhängigen Messungen sind durch
Fehlerbalken angegeben. Die in den Teststämmen enthaltenen
pEXP-Plasmide sind durch die Nummern angegeben (s. Tab. 6).
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9:
Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die relative
Fluoreszenz des Faltungsreporters GFP. Die relative Fluoreszenz
des GFP wurde nach Anregung bei 475 nm pro o.D. 1 und ml Probe bei
einer Emissionswellenlänge von 515 nm bestimmt. Die Standardabweichungen
aus zwei voneinander unabhängigen Messungen sind durch
Fehlerbalken angegeben. Die in den Teststämmen enthaltenen
pEXP-Plasmide sind durch die Nummern angegeben (s. Tab. 6).
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10:
Einfluß von Chaperonen und Faltungskatalysatoren aus P.
aeruginosa auf die Stabilität des humanen IF2αb-Proteins.
Zur Bestimmung der Lokalisation und Menge des produzierten Zielproteins
wurden Proteinproben aus dem Kulturüberstand (A) und aus
GZE (B) in einem Western-Blot unter Verwendung eines spezifischen
Antikörpers detektiert. Als Kontrolle wurde Standardprotein
(0,05 μg; S) bzw. der IFN2αb-Expressionsstamm
mit Chaperon-Leervektor (K) aufgetragen. Die coexprimierten Chaperonkombinationen
sind durch Nummern gekennzeichnet (s. Tab. 6).
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Es
wurde überraschend entdeckt, dass Kombinationen von zwei,
drei oder mehreren Faltungshelferproteinen (Chaperonen) zu einer
signifikant verbesserten Expression eines Zielproteins führen
können, auch wenn es sich nicht um natürlicherweise
vorkommende Kombinationen handelt. Kombinationen bedeutet in diesem
Fall, dass mehrere auf willkürlichem kombinatorischem Wege
erzeugte für Faltungshelfer codierende Gene, beispielsweise
zwei oder drei, in einer Zelle gemeinsam mit dem Gen für
ein Zielprotein coexprimiert werden und zusammenwirken. Das erfindungsgemäße
Verfahren, die Konstrukte und Wirtszellen sind geeignet für
die Produktion von Zielproteinen in Standard-Kultursystemen in kleinem
Maßstab sowie für Produktionssysteme in großem
Maßstab, einschließlich und nicht begrenzt auf
Fermentationssysteme, Hohlfaserkultursysteme, Becher- und Kolbensysteme
und Suspensionskultursysteme.
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Die
notwendigen molekularbiologischen Arbeitsmethoden sind dem Fachmann
gut bekannt und in einer Vielzahl von Laborhandbüchern
und Texten nachzulesen, also Protokolle und Verfahren für
die Manipulation von Nukleinsäuren, PCR-Amplifikation von
Nucleinsäuren, Konstruktion von Expressionsvektoren, die Transformation
von Wirtszellen und die Vermehrung transformierter Zellen für
die Produktion von Proteinen; siehe beispielsweise das Standard-Klonierungshandbuch
von Sambrook [7].
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Die
nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
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Beispiel 1
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Identifizierung von Chaperonen (Faltungshelferproteinen)
in Pseudomonas aeruginosa
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Um
für die Konstruktion einer Expressionsbank von Kombinationen
verschiedenster Faltungshelferproteinen eine möglichst
große Heterogenität solcher Proteine einsetzen
zu können, sollten beispielhaft für die Vorgehensweise
alle bekannten definierten und alle putativen Sequenzen eines Mikroorganismus
isoliert und eingesetzt werden. Seit dem Jahr 2000 ist das 6,33
Mbp große Genom des Bakteriums P. aeruginosa vollständig
sequenziert, die Sequenzdaten sind unter www.pseudomonas.com verfügbar
[8]. Diese Datenbank umfaßt 5.570 annotierte Leserahmen
(open reading frames) und wurde für die Sequenzanalyse
von Faltungshelferproteinen zugrunde gelegt. Dabei wurde die Möglichkeit
genutzt, in der Pseudomonas-Datenbank Funktionssuchen durchführen
zu können. So wurde eine umfassende Datenbankanalyse zur
Identifikation von Chaperonen, Hitzeschockproteinen, Peptidyl-Prolyl
cis-trans Isomerasen (PPIasen) und Disulfidbrücken-bildende-Proteine
(Dsb-Proteine) durchgeführt, wobei eine große
Anzahl von Genen identifiziert wurden, deren Genprodukte hohe Sequenzübereinstimmungen
zu bereits beschriebenen, bekannten Faltungshelfern aus anderen
Bakterien aufweisen. Anschließend wurden Sequenzvergleiche
mit der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz
des jeweiligen P. aeruginosa Faltungshelfers durchgeführt,
um die erhaltenen Ergebnisse zu verifizieren. Die auf diese Weise
erhaltenen Gene sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Zusätzlich
zu den molekularen Chaperonen, den Hitzeschockproteinen oder auch
den PPIasen, die bereits in P. aeruginosa annotiert sind, konnten
in im Rahmen dieser Erfindung weitere Leserahmen gefunden werden,
die bisher lediglich als putative Faltungshelferproteine in der
Pseudomonas-Datenbank geführt wurden. Nach einem Homologievergleich
mit ihren ermittelten Aminosäuresequenzen konnte mit Hilfe
einer Funktion, die die Suche nach Proteindomänen erlaubt,
weiter untersucht werden, welche solcher Domänen, die für Chaperone
und Hitzeschockproteine charakteristisch sind, diese putativen Proteine
enthalten.
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Auf
diese Weise konnten sieben weitere Gene für molekulare
Chaperone bzw. Hitzeschockproteine identifiziert werden, welche
in die vorgesehene Chaperon-Coexpressionsbank aufgenommen wurden.
Bei diesen Kandidaten sind unterschiedliche Proteingruppen der molekularen
Chaperone vertreten. So besitzt das putative Protein PA1068 eine
Hsp90-ATPase-Domäne [9], die auch im HtpG-Protein aus E.
coli vorliegt. Zwei weitere orfs (PA2725 und PA3365) weisen eine
AAA-(= ATPase associated with various cellular activities)Domäne
in ihrer abgeleiteten Proteinsequenz auf [10, 11], die in verschiedenen
Hitzeschockproteinen vorkommt. Für den Leserahmen PA3647
konnte gezeigt werden, daß dieser eine OmpH(outer membrane
Protein like)-ähnliche Domäne besitzt. Mit diesem
Kandidaten konnte ein homologes Protein zu dem periplasmatischen Chaperon
Skp aus E. coli identifiziert werden, das in diesem Organismus als
einziges echtes periplasmatisches Chaperon beschrieben ist [12,
13]. Dort ist dieses Chaperon an der Reifung von Proteinen der äußeren Membran
beteiligt [14]. Auch das putative Protein PA3842 weist eine Homologie
von 56% zu einem bereits in Y. pestis beschriebenen Chaperon auf
[15]. Mit dem putativen Protein PA4873 konnte ein mögliches
Chaperon identifiziert werden, das eine Hsp70-Domäne enthält
[16], und eine Ähnlichkeit von 50% zu dem DnaK-Protein aus
R. capsulatus besitzt. Damit konnte neben dem in einem Operon codierten
DnaK-Protein (orf PA4761) ein zweiter Vertreter der Hsp70-Familie
in P. aeruginosa ermittelt werden. Schließlich konnte mit
PA5195 ein putatives homologes Protein zu dem E. coli Protein YrfH
identifiziert werden.
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Ferner
konnten fünf weitere Leserahmen in P. aeruginosa gefunden
werden, die als Proteine der Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen
(PPIasen) angesehen werden. In den meisten Fällen konnte
eine PPIase-Domäne gefunden werden, die für den
FKBP-Typ (FK506-binding Protein) dieser Enzyme charakteristisch
ist [17, 18]. Hierzu zählen die durch die orfs PA3262,
PA3717, PA4558 und PA5254 codierten Proteine. Zwei weitere Gene
konnten über die Möglichkeit, Proteindomänen
zu identifizieren, gefunden werden, deren Genprodukte eine Rotamase-Domäne
aufweisen [17]. Dies sind die orfs PA0699 und PA3871, die beide
Homologien zu bereits beschriebenen und charakterisierten Proteinen
aus anderen Organismen aufweisen. Diese Gene für putative
Chaperone sind in Tabelle 2 aufgeführt.
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Die
für das Dsb-System notwendigen Proteine [19–21]
konnten alle an Hand annotierter Sequenzen identifiziert werden.
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Schließlich
muß noch eine Enzymgruppe erwähnt werden, deren
Mitglieder an der richtigen Faltung und Herstellung von Proteinen
beteiligt sind, die zum Bewegungsapparat von P. aeruginosa gehören.
Zu dieser Gruppe können vier Kandidaten gezählt
werden. Hierbei handelt es sich um die Chaperone CupA2, CupA5 sowie
CupB2 und CupB4. Auch für diese Gruppe konnte mit PA0499
zusätzlich ein Leserahmen identifiziert werden, dessen
putatives Genprodukt eine für pili assembly chaperones
charakteristische Domäne enthält [22]. Die entsprechenden
Gene wurden ebenfalls in die Chaperon-Toolbox aufgenommen.
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Insgesamt
konnten somit 58 unterschiedliche Leserahmen identifiziert werden,
deren DNA-Sequenzen im Anhang zu finden sind. Unter den identifizierten
Leserahmen befinden sich 53 einzelne Faltungshelfergene sowie 5
Operons. Tabelle 1: Annotierte Faltungshelferproteine
in Pseudomonas aeruginosa. Die aufgeführten Gene wurden durch
Sequenzvergleiche identifiziert. Sie gehören zur Gruppe
der Heatschockproteine, Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen, und
der Disulfidbrückenbildenden (Dsb) Proteine, welche insgesamt
als Chaperone bezeichnet werden. Bei diesen bereits annotierten
Open-reading-frames (orf) ist der Genname mit angegeben. Außerdem
sind die Größen der identifizierten Gene [bp]
angegeben. Die Homologien gegenüber bekannten Proteinen
[%] und der Ursprungsorganismus sind genannt.
orf-Nummer | Genname | Gengröße
[bp] | Ähnlichkeit
[%] |
Annotierte
Chaperone und Heatschockproteine |
PA1596 | htpG | 1.905 | 78%
zu HtpG aus E. coli |
PA1801 | clpP | 642 | 86%
zu ClpP aus E. coli |
PA1802 | clpX | 1.281 | 85%
zu ClpX aus E. coli |
PA2614 | lolA | 627 | 51%
zu LolA aus E. coli |
PA2863 | lipH | 1.023 | 57%
zu LipH aus Pseudomonas mendocina |
PA3126 | ibpA | 450 | 67%
zu IbpA aus E. coli |
PA3221 | csaA | 336 | 68%
zu CsaA aus B. subtilis |
PA3810 | hscA | 1.860 | 87%
zu HscA aus E. coli |
PA3811 | hscB | 522 | 80%
zu HscB aus Azotobacter vinelandii |
PA4385 | groEL | 1.644 | 95%
zu GroEL aus A. vinelandii |
PA4386 | groES | 294 | 96%
zu GroES aus A. vinelandii |
PA4760 | dnaJ | 1.134 | 78%
zu DnaJ aus E. coli |
PA4761 | dnaK | 1.914 | 87%
zu DnaK aus E. coli |
PA4762 | grpE | 561 | 63%
zu GrpE aus E. coli |
PA5053 | hslV | 534 | 100%
zu HslV aus E. coli |
PA5054 | hslU | 1.344 | 54%
zu HslU aus E. coli |
PA5128 | secB | 489 | 71%
zu SecB aus E. coli |
PA5193 | yrfI | 894 | 62%
zu YrfI aus E. coli |
| | | |
Annotierte
Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen |
PA0594 | surA | 1.293 | 60%
zu SurA aus E. coli |
PA0837 | slyD | 486 | 65%
zu SlyD aus E. coli |
PA1793 | ppiB | 498 | 77%
zu CypB aus E. coli |
PA1800 | tig | 1.311 | 72%
zu TF aus E. coli |
PA1805 | ppiD | 1.866 | 51%
zu PPIase D aus E. coli |
PA1996 | ppiC1 | 279 | 68%
zu PPIase C aus E. coli |
PA3227 | ppiA | 564 | 73%
zu PPIase A aus E. coli |
PA4176 | ppiC2 | 282 | 67%
zu PPIase C aus E. coli |
PA4572 | fklB | 618 | 67%
zu FklB aus E. coli |
| | | |
Annotierte
Dsb-Proteine |
PA0538 | dsbB | 510 | 51%
zu DsbB aus E. coli |
PA1481 | ccmG | 543 | 67%
zu DsbE aus E. coli |
PA2476 | dsbG | 771 | 71%
zu DsbG aus E. coli |
PA3737 | dsbC | 729 | 58%
zu DsbC aus E. coli |
PA4845 | dsbD | 1.776 | 94%
zu DipZ aus P. aeruginosa |
PA5256 | dsbH | 492 | 51%
zu DsbH aus Burkholderia cepacia |
PA5489 | dsbA | 636 | 82%
zu DsbA aus A. vinelandii |
Tabelle 2: Putative Chaperone in Pseudomonas
aeruginosa. Über spezifische Domänen in der Proteinsequenz konnten
weitere Gene identifiziert werden, die als Kandidaten für
klassische Heatschockproteine und Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen
(PPIasen) angesehen werden können. Neben der Nummer des
orf ist die Größe des Gens [bp] angegeben. Die
für die jeweiligen Faltungshelferproteine charakteristische
Domäne ist ebenfalls angeführt.
orf-Nummer | Gengröße
[bp] | identifizierte
Proteindomäne | Ähnlichkeit
[%] |
Putative
Chaperone und Hitzeschockproteine |
PA1068 | 1.911 | Hsp90-ATPase | 47%
zu HtpG aus E. coli |
PA2725 | 1.884 | AAA-Familie | 51%
zu Hsp100-Region aus Trypanomsoma brucei |
PA3365 | 1.116 | AAA-Familie | 99%
zu AmiB aus P. aeruginosa |
PA3647 | 507 | OmpH-Domäne | 48%
zu Skp aus E. coli |
PA3842 | 351 | CesT-Chaperon Domäne | 56%
zu Chapeon aus Yersinis pestis |
PA4873 | 1.266 | Hsp70-Domäne | 50%
zu DnaK aus Rhodobacter capsulatus |
PA5195 | 396 | S4-Domäne | 67%
zu YrfH aus E. coli |
| | | |
Putative
Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen |
PA0699 | 945 | Rotamase-Domäne | 48%
zu PPIase-Domäne aus Acinetobacter sp. |
PA3262 | 762 | FKBP-Typ
PPIase-Domäne | 62%
zu fkpB-Gen aus E. coli |
PA3717 | 342 | FKBP-Typ
PPIase-Domäne | 66%
zu Rotamase aus Neisseria meningitidis |
PA3871 | 819 | Rotamase-Domäne | 47%
zu NifM aus Azotobacter croococcum |
PA4558 | 441 | FKBP-Typ
PPIase-Domäne | 63%
zu FKBP-Typ PPIase aus E. coli |
PA5254 | 630 | FKBP-Typ
PPIase-Domäne | 51%
zu FklB aus E. coli |
-
Beispiel 2
-
Amplifikation der identifizierten Gene
-
Nach
Identifikation der annotierten und putativen Chaperon-Gene in P.
aeruginosa wurden diese aus dem Chromosom des Wildtyp Stammes PAO1
isoliert werden. Dazu wurden diese Gene mittels PCR amplifiziert.
Die Oligonukleotide zur Amplifikation sämtlicher Gene wurden
so gewählt, daß ein DNA-Fragment erzeugt werden
konnte, welches ein Gen vom Start- bis zum Stop-Codon enthielt.
Außerdem wurde an das 5'-Ende der Primer, die an den stromaufwärts
gelegenen DNA-Bereich binden, eine Topoisomerase-Erkennungssequenz
aus den vier Basen CACC angefügt, wodurch eine spätere
Ein-Schritt-Klonierung mit dem TOPO-Klonierungskit der Firma Invitrogen
(Karlsruhe) ermöglicht werden sollte.
-
Um
die unterschiedlichen Gene und die entsprechenden Operons der Chaperonsysteme
zu amplifizieren, wurden Polymerasekettenreationen durchgeführt.
Dazu wurden für jedes notwendige PCR-Produkt mehrere parallele
Reaktionen angesetzt, zudem wurden in verschiedenen Ansätzen
unter anderem die Annealingtemperatur, die Elongationszeit oder
die Zyklusanzahl variiert. Im Anschluß an die durchgeführten
Reaktionen wurde für jedes PCR-Produkt und jede Reaktionsbedingung
ein Aliquot von 5 μl des Reaktionsansatzes auf ein Agarosegel
aufgetragen und somit die Größe und DNA-Menge
bestimmt.
-
Schließlich
konnten insgesamt 55 Polymerasekettenreaktionen erfolgreich durchgeführt
und die PCR-Produkte in die nachfolgende Klonierungsreaktion eingesetzt
werden.
-
Beispiel 3
-
Klonierung der Chaperon-Gene
-
Zur
Klonierung der entsprechend Beispiel 2 erzeugten PCR-Produkte in
einen geeigneten Klonierungsvektor kann das hier näher
beschriebene „pENTR® Directional
TOPO® Cloning Kit” (Invitrogen,
Karlsruhe) verwendet werden, es sind aber auch andere Systeme genauso
geeignet.
-
Die
hier beschriebene Methode basiert auf dem Einsatz des Enzyms Topoisomerase
I aus dem Virus Vaccinia, das einen der beiden Stränge
der doppelsträngigen DNA an spezifischen Stellen öffnen
kann [23]. Mit Hilfe dieses Einschritt-Klonierungs-Systems wurden
die erhaltenen PCR-Produkte in den Vektor pENTR/SD/D-TOPO eingebracht.
Dieser Vektor besitzt neben den Rekombinationsstellen attL1 und
attL2 ein Kanamycin-Resistenzgen, eine für Bakterien geeignete
Ribosomenbindestelle (RBS) sowie einen ColE1-Replikationsursprung,
welcher eine Replikation mit hoher Kopienzahl in E. coli ermöglicht.
Eine schematische Darstellung der durchgeführten Klonierung
ist in
1 (A.2) gezeigt. Auf diese
Weise wurden alle erzeugten PCR-Produkte in den Zielvektor pENTR/SD/D-TOPO
eingebracht und zur Bestätigung sequenziert. Die hergestellten Plasmide
wurden als pENTR- mit dem jeweiligen Namen des einklonierten Faltungshelfergens (Chaperon-Gens)
bezeichnet, zum Beispiel pENTR-tig. In Tabelle 3 sind unter „pENTR-„ die
erfolgreich hergestellten pENTR-Plasmide durch ein Kreuz (X) markiert. Tabelle 3: Zusammenstellung der erfolgreich
erzeugten pENTR-Plasmide. Die für die weiteren Experimente vorliegenden
Plasmide sind durch ein X gekennzeichnet.
orf | Name | pENTR- |
PA0499 | | X |
PA0594 | surA | X |
PA0699 | | X |
PA0837 | slyD | X |
PA1068 | | X |
PA1481 | ccmG | X |
PA1596 | htpG | X |
PA1793 | ppiB | X |
PA1800 | tig | X |
PA1802 | clpX | X |
PA1805 | ppiD | X |
PA1996 | ppiC1 | X |
PA2129 | cupA2 | X |
PA2132 | cupA5 | X |
PA2476 | dsbG | X |
PA2614 | lolA | X |
PA2725 | | X |
PA2863 | lipH | X |
PA3126 | ibpA | X |
PA3221 | csaA | X |
PA3227 | ppiA | X |
PA3262 | | X |
PA3365 | | X |
PA3647 | skp | X |
PA3717 | | X |
PA3737 | dsbC | X |
PA3810 | hscA | X |
PA3811 | hscB | X |
PA3810&11 | hscAB | X |
PA3842 | | X |
PA3871 | | X |
PA4083 | cupB4 | X |
PA4085 | cupB2 | X |
PA4176 | ppiC2 | X |
PA4385 | groEL | X |
PA4386 | groES | X |
PA4385&86 | groELS | X |
PA4558 | | X |
PA4572 | fklB | X |
PA4651 | | X |
PA4760 | dnaJ | X |
PA4761 | dnaK | X |
PA4760&61 | dnaKJ | X |
PA4762 | grpE | X |
PA4760-62 | grpE-dnaKJ | X |
PA4873 | | X |
PA5053 | hslV | X |
PA5054 | hslU | X |
PA5053&54 | hslVU | X |
PA5128 | secB | X |
PA5193 | yrfI | X |
PA5195 | | X |
PA5254 | | X |
PA5256 | dsbH | X |
PA5489 | dsbA | X |
-
Beispiel 4
-
Konstruktion von Expressionsplasmiden
-
Im
Anschluß an die erfolgreiche Klonierung der Chaperon-Gene
in den pENTR-Vektor konnten die erzeugten Plasmide dazu verwendet
werden, Expressionsvektoren herzustellen. Dabei kann beispielsweise
die „Gateway®”-Technologie
der Firma Invitrogen (Karlsruhe) angewandt werden, ebenso können
aber auch eine Reihe anderer Systeme für diesen Zweck eingesetzt
werden. Dieses System beruht auf Mechanismen der homologe Rekombination,
die für den Bakteriophagen Lambda gut beschrieben sind
[24].
-
Um
diese Klonierungsmethode anwenden zu können, mußte
in den Zielvektor eine Destination-Kassette eingebracht wurde. Diese
Kassette konnte aus dem Vektor pGATRfA (s. Tab. 4) isoliert und über
die Restriktionsschnittstellen KpnI und XbaI in den Vektor pVLT31
(s. Tab. 4) einkloniert werden. Das daraus resultierende Plasmid
wird im Folgenden als pDEST-VLT31 bezeichnet. Der Expressionsvektor
pVLT31 wurde für diese Anwendung ausgewählt, da
er sowohl einen induzierbaren tac-Promotor besitzt, als auch ein
Shuttlevektor ist, der in E. coli ebenso wie in P. aeruginosa und
weiteren Gram negativen Bakterien stabil repliziert werden kann.
So kann die Chaperon-Toolbox später in einem breiten Spektrum
von Expressionsstämmen eingesetzt werden.
-
Durch
die eingebrachte Destination-Kassette erhält der Vektor
zu seiner Tetracyclin-Resistenz (Tcr) eine
zusätzliche Chloramphenicol-Resistenz (Cmr)
und das Gen ccdB, das für einen Gyrasehemmer codiert [25,
26]. Flankierend besitzt dieses DNA-Fragment die beiden Rekombinationsstellen
attR1 und attR2. Für die Konstruktion des pDEST-VLT31-Vektors
mußte der E. coli Stamm DB3.1 verwendet werden. Dieser
kann trotz Expression des ccdB-Gens überleben, da durch
eine Mutation in dem ccdA-Gen, das für die Topoisomerase II
codiert, das CcdB-Protein nicht wirken kann. Nachdem der Zielvektor
pDEST-VLT31 erfolgreich hergestellt werden konnte, wurden Rekombinationsreaktionen
mit den pENTR-Plasmiden (s. Beispiel 3) durchgeführt.
-
Im
Anschluß an die Reaktion wurde ein Aliquot der Ansätze
in den Stamm E. coli TOP10 transformiert und die erhaltenen Klone
weiter untersucht. Da die Expression des ccdB-Gens für
TOP10-Zellen letal ist, wird eine positive Selektion dieser Rekombination
ermöglicht. Um falsch-positive Klone auszuschließen,
wurde zusätzlich auf den Verlust der Cm-Resistenz selektiert,
bevor die Plasmid-DNA isoliert und in Restriktionsanalysen mit den
Enzymen KpnI und XbaI untersucht wurde.
-
So
konnten 47 Expressionsplasmide konstruiert werden, die einzelne
Gene oder Operons von Faltungshelfern aus P. aeruginosa enthielten. Tabelle 4: Übersicht der verwendeten
Vektoren.
Plasmide | genetische
Eigenschaften | Referenz/Quelle |
Vektoren
für E. coli | | |
pDESTTM R4-R3 | Apr, Cmr, ccdB, attR4,
attR3, | Invitrogen,
Karlsruhe |
pDONRTM P4-P1R | Kmr, Cmr, ccdB, attP4,
attP1R | Invitrogen,
Karlsruhe |
pDONRTM P2R-P3 | Kmr, Cmr, ccdB, attP2R,
attP3 | Invitrogen,
Karlsruhe |
pENTR/SD/D-TOPO | Kmr, RBS, attL1, attL2 | Invitrogen,
Karlsruhe |
pET16b | PT7, Plac Apr ColE1, His-Tag | NOVAGEN,
Madison, USA |
pET22b
(+) | PT7Φ10 Apr ColE1
pelB lacI | NOVAGEN,
Madison, USA |
pGATRfA | Cmr Apr ccdB attR1
attR2 | Invitrogen,
Karlsruhe |
Vektoren
mit breitem Wirtsspektrum | | |
pBBR1MCS | Plac PT7 Cmr mob lacZα | [27] |
pBBR1MCS-3 | Plac PT7 lacZα Tcr mob rep | [28] |
pSWgfp | pTZ110
mit promotorlosem gfp | [29] |
pUCPKS | Plac PT7 Apr ColE1-SF
lacZα | [30] |
pVLT31 | lacIq, Ptac, Tcr, mob, rep | [31] |
rekombinante
Plasmide | | |
pBaBIFN1 | Ptac Apr Tcr IF2αColE1 | Fa.
Wacker, München |
pBaBIFN1ΔTcr | Ptac Apr ΔTcr (SalI/NheI)
IF2αColE1 | diese
Arbeit |
pBBL7 | pBBR1MCS
+ XmnI/SmaI-Fragment, 2,8 kb, lipA/H, Plac | [32] |
pDEST-BBRTc-R4R3 | 1,7
kb-ccdB-Kassette aus pDESTTM R4-R3 in SmaI-site
des pBBR1MCS-3 | diese
Arbeit |
pDEST-VLT31 | KpnI/XbaI-ccdB-Kassette
aus pGATRfA in pVLT31 | diese
Arbeit |
pENTR-Chaperon | pENTR/SD/D-TOPO
mit entspr. Chaperongen | diese
Arbeit |
pENTR-Chaperon-3' | pDONRTMP2R-P3 mit Chaperongen; 3'-Position im
Multisite-Vektor | diese
Arbeit |
pENTR-Chaperon-5' | pDONRTMP4-P1 R mit Chaperongen; 5'-Position im
Multisite-Vektor | diese
Arbeit |
pET16b-SMIipA | pET16b-Derivat;
S. marcescens lipA-Gen in NcoI-BamHI einkloniert (aus pLipRB) | [33] |
pET22b-CalB | pET22b-Derivat;
C. antarctica CALB-Gen einkloniert | [34] |
pET19b α-Dom
(His6) | EstA
N-Terminus in pET19b NdeI/XhoI kloniert (N-His6) | [35] |
pET22b-gfp | pET22b-Derivat;
GFP aus pSWgfp in EcoRI/HindIII einkloniert | diese
Arbeit |
pEXP-Chaperon | pVLT31
mit einzelnem Chaperon/system | diese
Arbeit |
pEXP-1
... 42 | pBBR1MCS-3
mit drei Chaperongenen kombiniert | diese
Arbeit |
pRE-ADH | pKA1-Derivat,
re-adh Gen in NdeI/BamHI kloniert | [36] |
pRR-ADH | pKA1-Derivat,
rr-adh Gen über NdeI/BamHI kloniert | [36] |
-
Beispiel 5
-
Herstellung von Multisite-Expressionsplasmiden
-
Damit
ein Zielprotein nacheinander mit mehreren Chaperonen in Kontakt
kommen kann, wurden für die Toolbox Plasmide konstruiert,
mit deren Hilfe die Gene von mehreren Faltungshelfern gleichzeitig
in einer Zelle zusammen mit dem Zielgen coexprimiert werden können,
so dass ein Zielprotein zwei, drei oder mehrere Faltungshelferproteine
in der Zelle vorfindet. Dazu kann beispielsweise das „MultiSite
Gateway® Three-Fragment Vektor
Construction Kit” der Firma Invitrogen eingesetzt werden,
das nach Angaben des Herstellers eine schnelle und effiziente Klonierung
von drei unterschiedlichen DNA-Fragmenten in einen gemeinsamen Vektor ermöglicht.
Ebenso können aber auch andere Vektoren für diesen
Zweck eingesetzt werden. Das dem Kit der Firma Invitrogen zugrunde
liegende System beruht auf dem Prinzip der homologen Rekombination,
das vom Bakteriophagen Lambda abgeleitet wurde. Mit Hilfe dieses
Kits wurde eine Plasmidbank erzeugt, welche die Expression von jeweils
drei unterschiedlichen Faltungshelfergenen erlaubt.
-
Mit
dieser Methode erhält man einen Vektor, in dem die drei
Zielgene in der gewünschten Reihenfolgen hintereinander
angeordnet und lediglich durch die resultierenden attB-Stellen voneinander
getrennt sind. Die erzeugten Expressionsvektoren werden als pEXP
bezeichnet und erhalten fortlaufende Nummern.
-
In
den folgenden Abschnitten 5a) und 5b) wird die Konstruktion der
verschiedenen pEXP-Plasmide im Detail erläutert.
-
5a) Konstruktion der Ausgangsvektoren
für Multisite-Rekombinationen
-
Um
eine Kombination von drei verschiedenen Genen in einem Zielplasmid
erzeugen zu können, mußten zunächst die
notwendigen Ausgangsvektoren konstruiert werden. Dazu mußte
zum einen das Expressionsplasmid pBBR1MCS-3 mit der attR4R3-Destination-Kassette
versehen werden, welches dann als Zielvektor in die Rekombinationsreaktion
eingesetzt werden konnte. Vorteile dieses Plasmides sind, daß es
in verschiedenen Gramnegativen Bakterien repliziert werden kann,
und, daß Gene so einkloniert werden können, daß ihre
Expression durch einen induzierbaren lac-Promotor reguliert werden
kann. Des weiteren mußte die 1.704 bp große Destination-Kassette
aus dem Plasmid pDESTTMR4R3 isoliert werden. Dazu wurden die beiden
Primer ccdBattR4-up und ccdBattR3-dwn (s. Tabelle 5) verwendet.
Nach erfolgreicher Aufreinigung des erhaltenen PCR-Produktes konnte
dieses in die SmaI-Erkennungsstelle des Shuttlevektors pBBR1MCS-3
kloniert werden. Im Anschluß daran wurde das Konstrukt
in E. coli TOP10-Zellen eingebracht und positive Klone auf Tc- und
Cm-haltigem LB-Medium selektioniert. Diese Klonierung war erfolgreich
und in der Folge wurde mit dem Plasmid weiter gearbeitet, in das
die Zielgene unter Kontrolle des lac-Promotors kloniert werden konnten; dieser
Vektor wird im Weiteren pDEST-BBRTc-R4R3 genannt.
-
Neben
dem späteren Zielvektor mußten für die
angestrebten Rekombinationsreaktionen die unterschiedlichen pENTR-Vektoren
erzeugt werden. Die Vektoren, welche die Gene enthalten, die nachher
das mittlere Gen liefern sollten, wurden bereits erfolgreich konstruiert,
sie entsprechen den pENTR-Chaperon-Konstrukten aus Beispiel 3. Bei
diesen Vektoren liegen die klonierten Gene zwischen den att-Stellen
L1 und L2. Für die Konstruktion der beiden weiteren pENTR-Vektoren
mußten die Zielgene mit anderen Erkennungsstellen reamplifiziert
werden. Um die Gene der Chaperone und Faltungskatalysatoren mit
den Sequenzen für attL4 und attR1 klonieren zu können,
mußten sie in den Vektor pDONRTMP4-P1R eingebracht werden.
Damit die Rekombinationsstellen attR2 und attL3 neben den Zielgenen
vorlagen, mußten diese in den Vektor pDONRTMP2R-P3 kloniert
werden. Für beide Klonierungen mußten die Gene
mit entsprechenden Erkennungsstellen amplifiziert, aufgereinigt
und über eine BP-Rekombinationsreaktion in die beiden pDONR-Vektoren
eingebracht werden. Deshalb wurden Primer gewählt, die
teilweise homolog zu Bereichen des bereits vorhandenen pENTR-Vektors
waren und zusätzlich die für die Rekombinationsreaktion
essentiellen att-Stellen aufwiesen. Für die Klonierungen
der Vektoren pENTR-Chaperon-5' mußten die Sequenzen für
attB4 und attB1 an das PCR-Produkt angefügt werden, um
in den Vektor pDONRTMP4-P1R eingebracht werden zu können. Für
die Vektoren pENTR-Chaperon-3' waren es die attB2 und attB3 Erkennungsstellen.
-
Mit
den Primern AttB4-5'-up und AttB1-5'-dwn konnten die PCR-Produkte
amplifiziert werden, die in einer anschließenden Reaktion
in den Vektor pDONRTMP4-P1R eingebracht werden sollten. Die daraus
resultierenden Plasmide wurden als pENTR-5' bezeichnet. Das Primerpaar
AttB2-3'-up und AttB3-3'-dwn wurde zur Konstruktion von pENTR-3'-Plasmiden
eingesetzt.
-
5b) Erzeugen von Expressionsvektoren
-
Mit
den erzeugten pENTR-Plasmiden (s. Beispiel 5a) konnten nun verschiedene
Rekombinationsreaktionen durchgeführt werden. So wurden
beispielsweise die Plasmide pENTR-tig-5', pENTR-dnaKJ und pENTR-clpX-3'
in gleichen molaren DNA-Mengen mit dem Vektor pDEST-BBRTc-R4R3 in
die Klonierungsreaktion eingesetzt. In dieser Reaktion sollten also
die Gene tig-dnaKJ-clpX hintereinander in den Vektor eingebaut werden,
der als pEXP-1 bezeichnet wurde. Beim gerichteten Vorgehen konnten
auf diese Weise 40 Konstrukte hergestellt werden, die eine Kombination
von drei Genen bzw. Operons enthielten (s. Tab. 6). Tabelle
5: Übersicht über die verwendeten Oligonukleotide.
Tabelle 6: Auflistung der erzeugten Multisite-Expressionsplasmide.
Die Plasmide wurden mit fortlaufenden Nummern versehen (pEXP-1–pEXP-40).
Der Genname sowie die Position des Gens auf dem pEXP-Plasmid sind
angegeben.
| Nr. | 5' | Mitte | 3' | | Nr. | 5' | Mitte | 3' |
pEXP- | 1 | tig | dnaKT | clpX | pEXP- | 21 | tig | hslVU | lolA |
pEXP- | 2 | tig | groELS | clpX | pEXP- | 22 | csaA | hslVU | lolA |
pEXP- | 3 | tig | dnaKJ | ppiD | pEXP- | 23 | PA3647 | hslVU | yrfI |
pEXP- | 4 | ppiA | grpEdnaKJ | tig | pEXP- | 24 | PA4873 | hslVU | yrfI |
pEXP- | 5 | ppiA | groELS | tig | pEXP- | 25 | ppiA | hslVU | lolA |
pEXP- | 6 | dnaJ | groELS | tig | pEXP- | 26 | ppiC1 | hslVU | PA3717 |
pEXP- | 7 | dnaJ | dnaKJ | tig | pEXP- | 27 | ppiC2 | hslVU | PA5195 |
pEXP- | 8 | ppiA | dnaKJ | tig | pEXP- | 28 | groES | hslVU | dsbG |
pEXP- | 9 | ppiA | dnaKJ | ppiD | pEXP- | 29 | dnaJ | hslVU | dsbG |
pEXP- | 10 | ppiA | grpEdnaKJ | ppiD | pEXP- | 30 | surA | hscAB | dsbG |
pEXP- | 11 | ppiA | groELS | ppiD | pEXP- | 31 | csa4 | hscAB | ppiD |
pEXP- | 12 | groES | dnaKJ | PA5195 | pEXP- | 32 | PA3647 | hscAB | yrfI |
pEXP- | 13 | csaA | groELS | ppiD | pEXP- | 33 | PA3262 | hscAB | lolA |
pEXP- | 14 | PA3647 | groELS | ppiD | pEXP- | 34 | ppiA | hscAB | lolA |
pEXP- | 15 | PA4873 | groELS | yrfI | pEXP- | 35 | ppiC2 | hscAB | PA5195 |
pEXP- | 16 | ppiC1 | groELS | PA3717 | pEXP- | 36 | groES | hscAB | dsbG |
pEXP- | 17 | ppiC2 | groELS | PA3717 | pEXP- | 37 | csaA | dnaKJ | hslU |
pEXP- | 18 | dsbC | groELS | PA5195 | pEXP- | 38 | tig | groELS | dsbG |
pEXP- | 19 | groES | groELS | PA5195 | pEXP- | 39 | fklB | groELS | dsbG |
pEXP- | 20 | dnaJ | groELS | PA5195 | pEXP- | 40 | surA | groELS | hslU |
Tabelle 6b: Auflistung der erzeugten Multisite-Expressionsplasmide
gem. Tabelle 6 unter Verwendung der orfs der Gene. Die Plasmide
wurden mit fortlaufenden Nummern versehen (pEXP-1–pEXP-40).
Die orfs der Gene sowie die Position des Gens auf dem pEXP-Plasmid
sind angegeben.
Nr | 5' | Mitte | 3' | Nr | 5' | Mitte | 3' |
pEXP-1 | PA1800 | PA4760/61 | PA1802 | pEXP-21 | PA1800 | PA5053/54 | PA2614 |
pEXP-2 | PA1800 | PA4385/86 | PA1802 | pEXP-22 | PA3221 | PA5053/54 | PA2614 |
pEXP-3 | PA1800 | PA4760/61 | PA1805 | pEXP-23 | PA3647 | PA5053/54 | PA5193 |
pEXP-4 | PA3227 | PA4760-62 | PA1800 | pEXP-24 | PA4873 | PA5053/54 | PA5193 |
pEXP-5 | PA3227 | PA4385/86 | PA1800 | pEXP-25 | PA3227 | PA5053/54 | PA2614 |
pEXP-6 | PA4760 | PA4385/86 | PA1800 | pEXP-26 | PA1996 | PA5053/54 | PA3717 |
pEXP-7 | PA4760 | PA4760/61 | PA1800 | pEXP-27 | PA4176 | PA5053/54 | PA5195 |
pEXP-8 | PA3227 | PA4760/61 | PA1800 | pEXP-28 | PA4386 | PA5053/54 | PA2476 |
pEXP-9 | PA3227 | PA4760/61 | PA1805 | pEXP-29 | PA4760 | PA5053/54 | PA2476 |
pEXP-10 | PA3227 | PA4760-62 | PA1805 | pEXP-30 | PA0594 | PA3811 | PA2476 |
pEXP-11 | PA3227 | PA4385/86 | PA1805 | pEXP-31 | PA3221 | PA3811 | PA1805 |
pEXP-12 | PA4386 | PA4760/61 | PA5195 | pEXP-32 | PA3647 | PA3811 | PA5193 |
pEXP-13 | PA3221 | PA4385/86 | PA1805 | pEXP-33 | PA3262 | PA3811 | PA2614 |
pEXP-14 | PA3647 | PA4385/86 | PA1805 | pEXP-34 | PA3227 | PA3811 | PA2615 |
pEXP-15 | PA4873 | PA4385/86 | PA5193 | pEXP-35 | PA4176 | PA3811 | PA5195 |
pEXP-16 | PA1996 | PA4385/86 | PA3717 | pEXP-36 | PA4386 | PA3811 | PA2476 |
pEXP-17 | PA4176 | PA4385/86 | PA3717 | pEXP-37 | PA3221 | PA4760/61 | PA5054 |
pEXP-18 | PA3737 | PA4385/86 | PA5195 | pEXP-38 | PA1800 | PA4385/86 | PA2476 |
pEXP-19 | PA4386 | PA4385/86 | PA5195 | pEXP-39 | PA4572 | PA4385/86 | PA2476 |
pEXP-20 | PA4760 | PA4385/86 | PA5195 | pEXP-40 | PA0594 | PA4385/86 | PA5054 |
-
Nahezu
alle identifizierten Chaperon-Gene konnten aus dem Genom von P.
aeruginosa amplifiziert und in geeignete Vektoren kloniert werden.
Bei den erzeugten Konstrukten konnte die DNA-Sequenz durch Sequenzierungen
verifiziert werden. Ausgehend von diesen pENTR-Chaperon-Plasmiden
wurden die Gene in den Expressionsvektor pDEST-VLT31 eingebracht,
so daß sie in Coexpressionsversuche mit heterologen Zielproteinen
eingesetzt werden können. Zusätzlich wurden, erneut
basierend auf den pENTR-Chaperon-Plasmiden, pENTR-Chaperon-5'- und
pENTR-Chaperon-3'-Vektoren reamplifiziert und kloniert. Durch Einsatz
dieser Plasmide konnten 42 Expressionsplasmide mit Kombinationen
aus jeweils drei Genen von Chaperonen und weiteren Faltungshelferproteinen
konstruiert werden. Diese wurden im Folgenden in Coexpressionsversuche gemeinsam
mit verschiedenen Zielgenen eingesetzt.
-
Vorbemerkung zu den folgenden Beispielen:
-
Im
Folgenden werden mehrere Beispiele für die Expression von
Zielproteinen und der Coexpression von Faltungshelferproteinen (entsprechend
Beispiel 5) aufgeführt. Dazu wurden eine Reihe von Arbeitsschritten
durchgeführt, die für die verschiedenen Beispiele
immer in der gleichen Weise verliefen und hier zusammenfassend beschrieben
sind. Zunächst wurden E. coli Expressionsstämme
hergestellt, in denen sowohl das Zielprotein als auch ein Plasmid
der Genexpressionsbank aus Beispiel 5 (Tabelle 6) enthalten war.
Dazu wurde zunächst das Plasmid mit dem entsprechenden
Zielgen in den E. coli Expressionsstamm eingebracht. Hiervon wurden
elektrokompetente Zellen hergestellt, in die sämtliche
Plasmide der Chaperon-Expressionsbank (Tabelle 6) in separaten Transformationsansätzen
eingebracht wurden. Anschließend erfolgte die Anzucht der Teststämme
in 20 ml Kulturen bei 30 oder 37°C. Kulturen von E. coli
wurden, soweit nicht anders angegeben, in LB-Medium angeimpft und über
Nacht bei 37°C inkubiert. Flüssigkulturen mit
einem Volumen von 5 ml wurden in Reagenzgläsern in einem
Reagenzglas-Rotator (Neolab, Heidelberg), größere
Volumina in Erlenmeyer-Kolben auf einem Inkubationsschüttler
(Unitron, Infors HT, Bottmingen, CH) bei 150 Upm inkubiert, wobei das
Volumen zwischen Kulturvolumen und Volumen des verwendeten Kolbens
1:5 bis 1:10 entsprach. Bakterienstämme mit Plasmid- oder
genomcodierten Resistenzmarken wurden unter Selektionsdruck durch
Zugabe des jeweiligen Antibiotikums kultiviert. Übernachtkulturen
(ÜK) wurden mindestens 16 h bebrütet; Hauptkulturen
wurden aus einer ÜK auf eine OD (580 nm) = 0,05 beimpft.
Zur Induktion einer Überexpression wurden die Kulturen
mit 0,4 mM IPTG induziert und, je nach zu synthetisierenden Zielprotein,
für 3–42 h bei 37°C bzw. 30°C
bis zur Ernte der Zellen weiter inkubiert.
-
Gewinnung von Kulturüberständen
und Gesamtzellextrakten:
-
Zellfreie
Kulturüberstände wurden durch Zentrifugation (15
min, 6.000 Upm, 4°C) gewonnen und im Bedarfsfall sterilfiltriert
(Schleicher & Schüll,
NC45 Membranfilter, 0,45 μm Porendurchmesser). Das Zellsediment
wurde entsprechend einer OD (580 nm) = 15 in 1 ml Zellaufschlußpuffer,
Trispuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0) oder Kaliumphosphatpuffer (100
mM KP, pH 6.0), aufgenommen und anschließend einer Ultraschallbehandlung
unterzogen (Branson-Sonifier W250, 2 min, Leistungszyklus 50%, 20
Watt). Die so erhaltenen Gesamtzellextrakte (GZE) konnten in Enzymtests
eingesetzt, weiter fraktioniert oder bei –20°C
gelagert werden.
-
Fraktionierung von E. coli-Zellen:
-
Die
Zelltrümmer wurden durch eine Zentrifugation für
2 min bei 3.000 Upm aus dem GZE entfernt. Zur weiteren Auftrennung
des GZE in lösliche und nicht-lösliche Fraktionen
wurde für 30 min bei 14.000 Upm zentrifugiert. Die im Überstand
lokalisierten löslichen Proteine (Rohextrakt) wurden direkt
in Enzymtests eingesetzt. Die Lagerung der Proteinproben erfolgte
bei –20°C.
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Beispiel 6
-
Coexpression von Chaperonen mit Alkoholdehydrogenase
aus Rhodococcus erythropolis
-
Um
eine verbesserte Löslichkeit der Alkohol-Dehydrogenase
aus Rhodococcus erythropolis (RE-ADH) zu erreichen, wurde dieses
Enzym in E. coli mit 20 verschiedenen Faltungsmodulatoren entsprechend
Tabelle 6 (Beispiel 5) coexprimiert. Diese 20 verschiedenen Expressionsstämme
wurden dann wie in der Vorbemerkung erwähnt angezogen,
die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Nach Zellaufschluss und Zentrifugation
wurde die Aktivität der löslichen RE-ADH im Rohextrakt
in einem photometrischen Assay gemessen. Dazu wurden 970 μl
100 mM KPi-Puffer (pH 6,0) mit 3 mM p-Cl-Acetophenon,
20 μl 12,5 mM NADH sowie 10 μl Enzymlösung
(Rohextrakt) eingesetzt (Endvolummen 1 ml).
-
In 2 sind
die gemessenen Aktivitäten der RE-ADH aufgetragen, wobei
der Kontrollstamm mit rekombinanter RE-ADH, aber ohne zusätzliche
Faltungshelferproteine zeigt dabei eine Aktivität von ca.
50 U/ml. Im Vergleich dazu können die untersuchten Expressionsstämme
in vier Gruppen unterteilt werden, die jeweils vergleichbare Enzymaktivitäten
aufweisen.
-
Eine
Anzahl von zehn untersuchten Stämmen zeigte im Vergleich
mit der Kontrolle (s. 2, A: K) eine deutliche Verringerung
der Aktivität. Teilweise konnte überhaupt keine
Aktivität detektiert werden (z. B. die Stämme
mit den Multisite-Kombinationen pEXP-5, -9 oder pEXP-24). Als Gruppe
II wurden die Teststämme in 2 zusammengefaßt,
die mit ca. 50 U/ml in etwa die gleiche Enzymaktivität
aufwiesen wie der Kontrollstamm LV. Bei den 16 verbleibenden Stämmen,
in denen Chaperone mit dem Protein RE-ADH erzeugt wurden, konnte
eine signifikant höhere ADH-Aktivität nachgewiesen
werden. Diese war um den Faktor 2 bis 5 höher als bei dem
Kontrollstamm LV. Das beste Ergebnis wurde erzielt, indem mit dem
Vektor pEXP-13 die Gene der Faltungsmodulatoren CsaA, GroELS und
PpiD exprimiert wurden.
-
Beispiel 7
-
Coexpression von Chaperonen mit Alkoholdehydrogenase
aus Rhodococcus ruber
-
In
einem weiteren Beispiel wurde die Verbesserung einer weiteren Alkohol-Dehydrogenase
durch Coexpression von Faltungshelferproteinen untersucht, einem
Enzym aus Rhodococcus ruber (RR-ADH). Die Vorgehensweise entspricht
vollständig der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik, lediglich
das dort beschrieben Gen für RE-ADH wurde durch die RR-ADH
ersetzt. Auch der Enzymtest entspricht dem vorab beschriebenen. Der
RR-ADH-Expressionsstamm mit dem Leervektor (Kontrollstamm) wies
eine Aktivität von ca. 8 U/ml auf (3). Dessen
ADH-Aktivität wurde mit der von Stämmen verglichen,
in denen einzelne Faltungsmodulatoren coexprimiert wurden. Anhand
der ermittelten RR-ADH-Aktivitäten konnten die Stämme
in vier Gruppen unterteilt werden. Die erste Gruppe faßt
die Stämme zusammen, in denen schwache oder keine RR-ADH-Aktivität
gemessen werden konnte. Hier waren die Faltungshelfer SurA, PA0499
sowie DnaKJ in dem RR-ADH-Expressionsstamm enthalten. Enzymaktivitäten,
die mit 6–8 U/ml in der Größenordnung
des Kontrollstamms lagen, wurden durch die Coexpression der Chaperone
IbpA, FklB, PA4873, GroELS und PpiC2 erzielt (3; Gruppe
II). Sechs Chaperonsysteme (3; Gruppe
III) führten zu einer Steigerung der RR-ADH-Aktivität um 25%,
verglichen mit der Kontrolle. Bei diesen Faltungshelfern handelt
es sich um DsbG, PA2725, Skp, PpiD, CsaA sowie HslU. Die deutlichste
Verbesserung der RR-ADH-Aktivität um 45%–65%,
bezogen auf den Kontrollstamm, konnte durch die Chaperone PA3717,
PA5254, HscAB und YrfI erreicht werden.
-
Beispiel 8
-
Coexpressionen von Chaperonen mit dem
katalytisch aktiven Teil der Esterase EstA aus P. aeruginosa
-
Die
Esterase EstA aus dem Bakterium P. aeruginosa ist ein lipolytisches
Enzym, welches bevorzugt kurzkettige Glycerolester von Fettsäuren
hydrolysiert [37]. Bei der Überexpression des katalytisch
aktiven N-Terminus der Esterase EstA (EstAα) aus P. aeruginosa
im heterologen Wirt E. coli BL21(DE3) akkumulierte ein großer
Teil des Proteins in Form von Inclusion bodies. Deshalb wird im
Folgenden das EstAα-Fragment zusammen mit den Faltungsmodulatoren
entsprechend Beispiel 5 exprimiert, um die Löslichkeit
des Proteins zu verbessern. Dabei stammen sowohl das Zielprotein
als auch die coexprimierten Faltungshelferproteine aus demselben
Organismus, P. aeruginosa.
-
Die
Vorgehensweise der Gewinnung der Expressionsstämme und
der Präparation von Rohextrakt entspricht vollständig
der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik, lediglich das dort beschrieben
Gen für RE-ADH wurde durch das Gen für den N-Terminus
der Esterase EstA ersetzt. Die Aktivität der Esterase EstA
wurde mit folgendem Assay bestimmt: Pro Reaktion wurden 1,5 ml Testlösung
[25 μl p-Nitrophenyl-Caproat in 5 ml Ethanol gelöst;
plus 100 ml Puffer (100 mM KPi pH 7,2; 10 mM Mg2SO4)]
mit 5–50 μl Probe vermischt und für 15 min
bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde die OD
(410 nm) der Ansätze im Spektralphotometer bestimmt. Angegeben
werden die Werte als relative Aktivität in U/ml (Extinktionskoeffizient ε =
10400 M–1). Die 4 zeigt
das Ergebnis dieser Aktivitätsmessungen für die
einzelnen Expressionsstämme. Die Aktivität des
Kontrollstammes BL21(DE3)-EstAα-LV betrug 0,25 U/(ml·OD
(580 nm)). Im Vergleich dazu wiesen einige Stämme (4;
Gruppe I) eine leicht bis deutlich verminderte Aktivität
der Esterase auf. Der Expressionsstamm 2, bei dem die Gene tig,
groELS und clpX coexprimiert wurden, zeigte keinen Einfluss auf
die Ausbeute an aktivem Protein, verglichen mit der Kontrolle (4;
Gruppe II). In einer weiteren Gruppe (4; Gruppe
III) konnte eine signifikante Erhöhung der Esterase-Aktivität
durch die Coexpression von Faltungshelferproteinen erreicht werden.
Neben den Plasmiden pEXP-5 (ppiA – groELS – tig)
sowie pEXP-7 (dnaJ – dnaKJ – tig) zeigte auch die
Expression des Vektors pEXP-11 (ppiA – groELS – ppiD)
einen positiven Einfluß auf die Produktion des EstAα-Proteins.
Gegenüber dem Vergleichsstamm lag hier eine Erhöhung
der Aktivität um den Faktor 1,6 vor. Dies bedeutet eine
Aktivität von ca. 0,35–0,4 U/(ml·OD (580
nm)). Am effektivsten war die Produktion der katalytisch aktiven
Domäne der Esterase EstA, wenn das Plasmid mit der Faltungshelferkombination
1 (tig – dnaKJ – clpX) im Expressionsstamm vorlag.
Hier konnte eine Verdopplung der Aktivität im Vergleich
zum Kontrollstamm auf ca. 0,5 U/(ml·OD (580 nm)) erzielt
werden.
-
Beispiel 9
-
Untersuchungen zur Coexpression von Chaperonen
aus P. aeruginosa mit der Serratia marcescens Lipase LipA
-
Das
Enzym LipA aus dem Bakterium S. marcescens besitzt durch seine Zugehörigkeit
zu der Enzymklasse der Lipasen eine besondere biotechnologische
Bedeutung, sie sind wichtige stereoselektive Biokatalysatoren, die
sowohl bei der Veresterung als auch der Spaltung von Lipiden eine
entscheidende Rolle spielen. Bei dem Versuch, die Lipase LipA aus
S. marcescens in großen Mengen zu produzieren, akkumulierte
der größte Teil des Proteins in Form von Inclusion
bodies [38]. Daher wurde im Folgenden die Coexpression von Faltungshelfern
auf die Ausbeute löslicher Lipase im heterologen Wirt E.
coli auswirkt. Die in Coexpressionsversuchen mit den verschiedenen
Expressionsstämmen entsprechend Beispiel 5 produzierten
Proteinproben wurden in Enzymtests untersucht, die folgende Zusammensetzung
hatten: Substratemulsion: 207 mg Natriumdesoxycholat, 100 mg Gummi
arabicum, 90 ml Sörensen Phoshatpuffer pH 8,0 (Lösung
A: 8,9 g/l Na2HPO4, Lösung
B: 0,68 g/l KH2HPO4 [A:B → 17:1]);
30 mg p-Nitrophenyl-Palmitat in 10 ml Isopropanol. Pro Reaktion wurden
2,5 ml Substratemulsion mit 20–100 μl Probe vermischt
und für 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend
wurde die OD (410 nm) der einzelnen Ansätze im Spektralphotometer
gemessen. Dabei entspricht die gemessene OD (410 nm) = 1 einer Lipasemenge
von 0,121 ng bzw. einer Enzymaktivität von 0,161 nkat.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Als Positivkontrolle und Referenz gegenüber den Stämmen, in
denen Chaperone und Foldasen coexprimiert wurden, diente der als
LV bezeichnete Stamm, in welchem neben dem lipA-Expressionsplasmid
ausschließlich der Chaperon-Leervektor in den Zellen vorlag.
Für diesen Stamm konnte eine Lipase-Aktivität
von ca. 0,8 nkat/o.D.580nm detektiert werden
(5; A). Die Negativkontrolle wurde durch den Bakerienstamm
repräsentiert, der beide verwendeten Expressionsplasmide
als Leervektor enthielt und somit kein LipA-Protein erzeugen kann.
Für diesen Stamm konnte keine Umsetzung des Lipase-Substrates
p-Nitrophenyl-Palmitat im durchgeführten Enzymtest festgestellt
werden.
-
Beispiel 10
-
Coexpression von Chaperonen aus P. aeruginosa
mit der Lipase B (CALB) aus der Hefe Candida antarctica
-
In
einem weiteren Beispiel sollte untersucht werden, ob die Coexpression
von Chaperonen auch die Expression der Lipase CALB aus Candida antarctica
verbessern kann. Diese Lipase ist biotechnologisch von besonderer
Bedeutung, da sie eine hohe Enantioselektivität, vor allem
bei der Umsetzung von 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA), aufweist.
Da die Ausbeute von heterolog in E. coli produziertem CALB-Protein
bisher sehr gering ist, sollte untersucht werden, ob die Ausbeute
durch Zugabe von Faltungsmodulatoren erhöht werden kann.
Durch Fusion des Lipase-Gens hinter eine pelB-Signalsequenz kann
die Lipase ins Periplasma der E. coli Zellen transportiert werden.
Auf diese Weise kann in Plattentests untersucht werden, ob die Zellen Lipase
produzieren oder nicht. Deshalb wurden einzelne Kolonien der unterschiedlichen
Stämme auf Tributyrin-Platten überimpft. Die Testplatten
hatten folgende Zusammensetzung: 7,5 ml Tributyrin und 0,75 g Gummi arabicum
ad 15 ml Aqua dest. mischen, das Tributyrin mit Ultraschall (3 min,
75 W, 100%) emulgieren und zu 500 ml autoklaviertem LB-Agar (60°C)
geben [39]. Lipolytische Aktivität zeigt sich durch Bildung
klarer Höfe um die Bakterienkolonie. In 6 sind
drei solcher Tributyrin-Platten gezeigt (A, B und C), auf die unterschiedliche
Expressionsstämme entsprechend Beispiel 5 aufgebracht wurden.
Neben einigen Stämmen, in denen keine oder nur eine sehr
geringe lipolytische Aktivität festgestellt werden konnte,
fallen mehrere Expressionsstämme auf, in denen leicht bis
signifikant mehr Lipase-Aktivität, verglichen mit dem Kontrollstamm,
detektiert werden konnte. Mit den Plasmiden pEXP-18, -19, -28 und
pEXP-33 konnte das beste Ergebnis erzielt werden. Durch die Zugabe
dieser unterschiedlichen Faltungsmodulator-Kombinationen konnte
die Menge aktiver Lipase deutlich gesteigert werden.
-
Neben
diesem Plattenassay wurde der Einfluss der Faltungsmodulatoren mit
löslichen Proteinproben in einem photometrischen Test mit
p-Nitrophenyl-Palmitat als Substrat (s. Beispiel 9) eingesetzt und
die Aktivität in U/ml bestimmt (7). Für
den Kontrollstamm (LV) konnte eine sehr geringe Aktivität
von 0,05 U/ml bestimmt werden. Bei den weiteren zwölf Expressionsstämmen
korrelieren die Ergebnisse aus den beiden Aktivitätstests.
Dabei können einige Stämme identifiziert werden,
die im Enzymtest eine Verbesserung der Aktivität um 60%,
verglichen mit der Kontrolle, aufweisen (7; Gruppe
II).
-
Bei
drei weiteren Stämmen führte die Coexpression
von Chaperon-Kombinationen zu einer Steigerung der CALB-Aktivität
um 180%. Dazu zählt unter anderem der Stamm mit dem Plasmid
pEXP-19, in dem die Faltungsmodulatoren GroES – GroELS – PA5195
coexprimiert wurden. In beiden Enzymtests wies er eine signifikante
Steigerung der lipolytischen Aktivität auf. Die Coexpression
der Chaperone DsbC, GroELS und PA5195 (pEXP-18) führte
bei einer Anzucht auf Agarplatten zu der deutlichsten Steigerung.
Die Inkubation in Flüssigmedium rief eine Verdreifachung
der Aktivität im Vergleich zum Kontrollstamm hervor, was
den Umsatz des Substrates Tributyrin im ersten Enzymtest bestätigte.
-
Die
drei Stämme mit den Multisite-Vektoren pEXP-33, -35 und
-39 zeigen im photometrischen Test eine ebenso schwache Lipase-Aktivität
auf wie der Kontrollstamm (7; Gruppe
I). In dem durchgeführten Tributyrin-Plattentest dagegen
konnte für diese drei Stämme ein deutlich größerer
Hof als bei dem Expressionsstamm mit dem Chaperon-Leervektor festgestellt
werden. Auch für den Stamm mit dem Plasmid pEXP-12 entsprach
der photometrische Aktivitätstest nicht dem Ergebnis der
Tributyrin-Agarplatten. Während auf den Agarplatten mit
Tributyrin als Substrat fast kein Hof um die Kolonie sichtbar wurde,
zeigte sich im pNPP-Test, der mit Flüssigkulturen durchgeführt
wurde, eine Verdopplung der Aktivität.
-
Beispiel 11
-
Coexpression von Chaperonen und Faltungskatalysatoren
mit dem Grün-fluoreszierende Protein (GFP)
-
Das
Grün-fluoreszierende Protein wird in der Wissenschaft unter
anderem als Marker für Faltungsprozesse eingesetzt. Dabei
konnte gezeigt werden, daß GFP durch direkten Einfluß von
Chaperonen seine aktive Konformation erreicht [40, 41]. In diesem
Beispiel wurde daher überprüft, ob Kombinationen
von Faltungshelfer-Proteinen entsprechend Beispiel 5 die Faltung
von GFP verbessern konnten. Als quantitatives Maß für
die Faltung wird die Fluoreszenzemission des GFP-Proteins gemessen.
Es wurde jeweils 1 ml GZE (siehe Vorbemerkung) mit einer Zelldichte,
die einer OD (580 nm) von 1 entsprach, in Viertelmikroküvetten
bei einer Anregungswellenlänge von 475 nm in einem Emissionsbereich
von 490–550 nm vermessen. Die jeweilige Fluoreszenzintensität
als „relative Fluoreszenzemission” wurde aus der
gemessenen Fluoreszenzemission pro Zelldichte, die einer OD von
1 entsprach, und pro 1 ml Zellextrakt oder Zellsuspension berechnet.
Für den Kontrollstamm wurde eine relative Fluoreszenz von
ca. 240 pro ml ermittelt (8; K). Die
Proben wurden vorher auf eine Zelldichte von 1 eingestellt, ermittelt
durch die OD (580 nm). Mit 28 Proben führten die meisten
Chaperon-Kombinationen zu einer Reduktion der Menge an fluoreszierendem,
löslichen Protein (8; Gruppe
I). Durch die Coexpression von sechs Multisite-Expressionsplasmiden
wurde eine vergleichbare Fluoreszenz zum Kontrollstamm ermittelt
(8; Gruppe II). Es konnten aber auch Stämme
identifiziert werden, die mehr aktives GFP produzieren konnten als
die Kontrolle. Hier führte die Expression von Faltungsmodulatoren
zu Werten der relativen Fluoreszenz von 400–500, also einer
Steigerung der Menge aktiven Proteins um 100% in den besten Fällen.
Die effektivsten Multisite-Kombinationen hinsichtlich der GFP-Expression
waren pEXP-1 (Tig, DnaKJ und ClpX), pEXP-40 (SurA, GroELS und HslU),
aber vor allem pEXP-19 (GroES, GroELS und PA5195), pEXP-27 (PpiC2,
HslVU und PA5195) und pEXP-33 (PA3262, HscAB und LolA).
-
Beispiel 12
-
Verbesserung der Produktion von humanem
Interferon α2b
-
Ein
weiteres Zielprotein stellt das menschliche Interferon alpha 2b
(IFNα2b) dar. Dieses Protein wird in der Medizin zur Behandlung
von verschiedenen Krankheiten eingesetzt, wie Hepatitis, Krebsarten
wie beispielsweise Leukämie oder bei AIDS-vermitteltem
Kaposisarkom [42]. Die Produktion einer großen Menge löslichen
Proteins hat demnach eine besondere Bedeutung für die pharmazeutische
Industrie. Zwar kann das IFNα2b-Protein heterolog in E.
coli exprimiert werden, doch werden zum Einen nur geringe Ausbeuten
erzielt und zum Anderen akkumuliert der größte
Teil in Form von Inclusion bodies. Bislang wird dann im Anschluß das IFNα2b-Protein
isoliert, renaturiert und weiter verwendet [43], ein zwar gängiger,
aber kosten- und zeitaufwendiger Prozeß.
-
In
diesem Beispiel wurde daher das menschliche Protein Interferon α2b
mit den entsprechend Beispiel 5 hergestellten Faltungshelferproteinen
coexprimiert. Dabei wurde das IFNα2b-Protein mit einer
N-terminalen Signalsequenz exprimiert, die einen Transport aus dem
Cytoplasma heraus ermöglichen sollte. Als Kontrolle wurde
ein BL21(DE3)- Stamm verwendet, der neben dem Interferon-Expressionsplasmid
den Chaperon-Leervektor pBBR1MCS-3 enthielt (10; K).
Für diesen Stamm konnte gezeigt werden, daß ca.
70% des erzeugten IFNα2b-Proteins im GZE vorlag und 30%
im Medium nachgewiesen werden konnte (s. 10).
-
Von
13 unterschiedlichen Teststämmen führte die Coexpression
von drei Chaperon-Kombinationen dazu, daß keine nachweisbare
IFNα2b-Menge, weder im GZE noch im Kulturüberstand,
detektiert werden konnte (pEXP-10, -13 und pEXP-14; Daten nicht
gezeigt). In weiteren Stämmen führte die zusätzliche
Expression von Faltungsmodulatoren dazu, daß IFNα2b-Protein
nachgewiesen werden konnte. In den meisten Fällen entsprach
die Menge und Verteilung des Zielproteins der des Kontrollstammes,
beispielsweise der Stamm mit dem Multisite-Expressionsvektore pEXP-2
(Tig, GroELS, ClpX). Die Coexpression des Plasmides pEXP-3 (Tig,
DnaKJ und PpiD) führte dazu, daß nur ein sehr
geringer Proteinanteil ins Kulturmedium gelangen konnte und ca.
90% des produzierten IFNα2b-Proteins unlöslich
in Form von Inclusion bodies im Cytoplasma akkumuliert war (10;
3). In zwei weiteren Stämmen mit den Expressionsplasmiden
pEXP-4 bzw. pEXP-12 (s. Tab. 6) war mehr IFN2αb-Protein
nachweisbar als in der Kontrolle. Durch Coexpression beider Vektoren
konnte beobachtet werden, daß der größte
Anteil des IFNα2b-Proteins hier im Kulturmedium vorhanden
war, während nur eine sehr geringe Menge des Proteins im
GZE detektiert werden konnte. Fast das gesamte IFNα2b-Protein
wurde also aus der Bakterienzelle heraus transportiert.
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