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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren zur Amplifikation
von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, die ein Gemisch
verschiedener Zellen oder ein Gemisch von Zellen mit verunreinigenden Komponenten
enthalten, bei dem solche Zellen in einer Lyselösung (A)
lysiert werden und das Lysat unmittelbar anschließend für
die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure amplifizierenden
Verfahrens eingesetzt werden kann.
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Heutzutage
besteht ein hoher Bedarf an schnellen analytischen Verfahren, mithilfe
derer genetisches Material untersucht und gegebenenfalls Personen
zugeordnet werden kann. Voraussetzung für ein solches Analyseverfahren
ist, dass das genetische Material in Form isolierter DNA oder RNA
dem Analyseverfahren in einer Weise zugänglich gemacht
wird, dass eine analysierbare Menge des genetischen Materials in
einer Reinheit zur Verfügung gestellt wird, die ausreicht,
um das genetische Material analysieren zu können. Eine
solche Analyse findet heutzutage üblicherweise mithilfe
einer Polymerasekettenreaktion (PCR) statt, durch die das genetische
Material amplifziert wird.
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Bereits
die PCR selbst stellt ein analytisches Verfahren dar, da durch Auswahl
spezifischer Primer das Vorhandensein entsprechender Sequenzen auf
der isolierten Nukleinsäure identifiziert werden kann,
andererseits kann auch das Amplifikat aus der PCR weiter analytisch
untersucht werden.
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Es
ist wünschenswert, ein kostengünstiges zeitsparendes
Verfahren für eine solche Analyse anzuwenden, da häufig
größere Mengen verschiedener Proben gleichzeitig
bearbeitet werden müssen. Die Polymerasekettenreaktion
ist unter geeigneten Bedingungen eine hochselektive und sensitive
Methode, kann jedoch bei der Wahl ungeeigneter Bedingungen oder
Puffersysteme zu unerwünschten Ergebnissen führen.
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Die
WO 03/102184 A1 beschreibt
ein Verfahren zum Abtrennen nukleinsäurehaltiger Zellen
aus einer Mischung verschiedener Zellen oder von Zellen mit Verunreinigungen
durch Zugabe eines die Zellen „aggregierenden” Mittels
(„flocculating agent”), das bevorzugt an eine
feste Oberfläche gebunden ist und das anschließende
Isolieren von Nukleinsäuren aus den gewonnenen Zellen.
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Die
US 5,523,231 beschreibt
die Isolierung von Nukleinsäuren durch unspezifische Anlagerung
der Nukleinsäuren an zugesetzte Kügelchen großer
Oberfläche („Beads”) durch Kühlen
der Probe und anschließendes Ablösen der Nukleinsäure
von den Kügelchen.
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Die
WO 2006/103094 offenbart
ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischem
Material, wobei durch Einsatz von stickstoffhaltigen Verbindungen
in dem Lysepuffer eine verbesserte Ausbeute an Nukleinsäuren
erhalten wird.
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Es
war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles Verfahren
zur genetischen Analyse biologischer Proben bereitzustellen, in
denen Zellen im Gemisch mit anderen Zellen oder mit Verunreinigungen
vorliegen, das einfach und schnell durchzuführen ist, bei
dem ohne Wechsel des Puffersystems das zu untersuchende genetische
Material isoliert werden und ein analytisches Verfahren wie beispielsweise
eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden kann.
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Diese
Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch
1 und eine Lyselösung (A) gemäß Anspruch
4, wobei bevorzugte Ausführungsformen in den Unteransprüchen
wiedergegeben sind.
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Die
Lyselösung (A) der vorliegenden Erfindung ist auf Basis
eines Niedrigsalzpufferlösung, die (a) wenigstens ein nichtionisches
Tensid enthält, welches die Lyse der Zellwand der zu untersuchenden
biologischen Probe unterstützt und Proteinaggregate auflöst.
Hierfür ist grundsätzlich jedes nichtionische
Tensid geeignet, welches keinen negativen Einfluss auf die zu untersuchenden
Nukleinsäuren hat, bevorzugt werden Tween 20, Tergitol,
Triton X-100; Brij-58 und Nonidet-P40 verwendet.
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Die
Konzentration des nichtionischen Tensids in der eingesetzten Lyselösung
(A) beträgt zwischen 0,05 und 5%, bevorzugt zwischen 0,1
und 2%, weiter bevorzugt zwischen 0,2 und 0,8%
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Bestandteil
(b) der Lösung (A) ist wenigstens ein als Binde- und Verdickungsmittel
wirkendes Polymer. Das Polymer wird eingesetzt, um eine Inhibition
der nachfolgenden analytischen Verfahren durch durch das unspezifische
Komplexieren von potentiellen Inhibitoren zu verhindern. Derartige
polymer-basierende Binde- und Verdickungsmittel sind in der Fachwelt
bekannt. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind jedoch Polyvinylpyrrolidon,
Polyoxazolin, Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol; Luvitec (BASF),.
Dieses Polymer wird in die Lösung (A) in einer Konzentration
im Bereich von 0,05 bis 0,5%; bevorzugt 0,1%–0,2% eingesetzt.
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Als
weiterer Bestandteil (c) kann in die Lyselösung eine Proteinase
eingesetzt werden, bevorzugt wird eine thermophile Proteinase eingesetzt,
besonders bevorzugt eine thermophile Proteinase, ausgewählt
aus Proteinase K oder Subtilisin. Ganz besonders bevorzugt wird
eine thermophile Proteinase K in der Lyselösung verwendet.
Die Proteinase wird bevorzugt in einer Menge eingesetzt, dass sie
0,5 bis 10 μUnits, bevorzugt 1,5 bis 4 μUnits
(internationale Einheiten) pro Milliliter Lyselösung bereitstellt.
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Weitere
Bestandteile der Lösung (A) ist eine pH Puffersubstanz
mit der Konzentration von 10–20 mM aus der Gruppe Tris;
MOPS; HEPES; oder Phosphat. Der pH Wert wird bevorzugt auf 7,5–11
eingestellt. Besonders bevorzugt liegt der pH bei 9.0.
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Zusätzlich
kann zur Inaktivierung von Nukleinase ein Chelator für
divalente Kationen eingesetzt werden. Diese Chelatoren werden in
Konzentrationen von 1 mM eingesetzt und werden aus der Gruppe EDTA
und EGTA gewählt.
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In
dem Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuren werden in Schritt
(i) zunächst die nukleinsäurehaltigen Zellen aus
Blut angereichert. Hierzu stehen dem Fachmann verschiedene Verfahren
zur Verfügung, die als solche in der Fachwelt grundsätzlich
bekannt sind.
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Zu
solchen geeigneten Verfahren zählen beispielsweise das
Lysieren oder Zerstören unerwünschter Zellen im
Gemisch, die Zugabe von Oberflächen, an die die zu lysierenden
Zellen oder die verunreinigenden Komponenten absorbieren oder binden,
Filtration, Sedimentation, eine Selektion oder durch Zentrifugation, oder
eine Kombination von mehreren dieser Verfahren, ohne auf diese beschränkt
zu sein. Das bevorzugte Ziel dieses Schrittes (i) ist es, die Zellen,
die genetisches Material enthalten, von sonstigen Zellen oder verunreinigenden
Komponenten zu trennen, bzw. sie gegenüber den sonstigen
Komponenten anzureichern.
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Als
Ausgangsmaterialien, die in das erfindungsgemäße
Verfahren eingesetzt werden können, dienen Proben, die
neben nukleinsäurehaltigen Zellen noch andere Zellen oder
sonstige verunreinigende Komponenten beinhalten. Beispiele für
solche biologische Proben sind Vollblut, „Buffy Coats”,
Gemische aus Blut mit anderen Materialien, wie z. B. Gewebe, Sperma,
Lymphe, Urin, Fäkalien oder ähnliches, sowie Stanzen
aus sogenannten Blutkarten. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist besonders geeignet, wenn es bevorzugt ist, die Zellen,
die genetisches Material tragen, von anderen Zellen oder verunreinigenden
Komponenten abzutrennen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der
Erfindung wird Blutproben zunächst ein Erythrozyten-Lysepuffer
(B) zugesetzt, so dass die Erythrozyten in der Probe lysiert werden.
Anschließend werden die verbliebenen weißen Blutzellen
durch Zentrifugation aus dem Lyseansatz abgetrennt. Der Überstand
wird verworfen und die weißen Blutkörperchen stehen
der weiteren Bearbeitung unmittelbar zur Verfügung.
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Der
Lysepuffer (B) dient ausschließlich der Lyse von in Blut
enthaltenen Erythrozyten. Hierfür kann jeder in der Fachwelt
bekannte Erythrozyten- Lysepuffer verwendet werden, ohne dass die
Erfindung hierdurch beschränkt wird. Bevorzugt wird als
Lysepuffer ELB1 (320 mM Saccharose; 50 mM Tris/Cl pH 7.5; 5 mM MgCl2; 1% Triton X-100) oder ELB2 (155 mM NH4Cl; 10 mM; KHCO3)
eingesetzt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Probe
mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht, an die die zu
lysierenden Zellen adsorbieren oder binden. Die übrigen
Bestandteile der Probe werden danach durch ein Separationsverfahren
weitgehend entfernt. Die Probe wird hierfür mit geeigneten
Oberflächen in Kontakt gebracht, an die die Zellen adsorbieren
oder binden. Beispiele für Oberflächen, die hierfür
geeignet sind, sind kleine Kügelchen, sogenannte Beads,
beispielsweise aus Glas, Silica, Polymeren oder beschichtete Beads,
bevorzugt magnetische Beads. Es ist aber auch möglich die
Oberflächen der Verbrauchsmaterialien wie z. B. Reaktionsgefäße,
-Filter, Filtersäulen, Spin-Filtersäulchen, Membranen,
Fritten, Glasfasergewebe, Schalen, Röhrchen, (Pipetten)Spitzen
oder Wells von Multiwellplatten für die Bindung zu modifizieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden magnetische
Beads verwendet.
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Bei
der Erythrozytenlyse kann eine Oberfläche in Form von modifizierten
Magnetpartikeln eingebracht werden. Die weißen Blutzellen
adsorbieren an die Oberflächen und können durch
Magnetseparation angereichter werden.
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Kügelchen,
die für das vorliegende Verfahren geeignet sind, können
jeden Typ von bisher bekannten magnetischen Kügelchen umfassen,
bei denen ein magnetischer Kern mit einer Glas- oder Polymerbeschichtung überzogen
ist, und auf ihrer Oberfläche Gruppen tragen, die eine
unspezifische Anlagerung oder Bindung von nukleinsäurehaltigen
Zellen an die Kügelchen ermöglichen. Bevorzugt
können solche Kügelchen eingesetzt werden, die
auf ihrer Oberfläche hydrophil sind, beispielsweise Säuregruppen
tragen, bevorzugt Carbonsäuregruppen, Phosphorsäuregruppen
oder Schwefelsäuregruppen oder deren Salze, insbesondere
bevorzugt Carbonsäuregruppen oder deren Salze, wobei die
genannten Gruppen unmittelbar an die Oberfläche gebunden
sein können, oder Teil des die Oberflächenbeschichtung
bildenden Polymers sein können, über Spacer-Moleküle
an die Oberfläche gebunden sein können, oder Teile
einer Verbindung sein können, die an die Oberfläche
der Kügelchen gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
tragen die Kügelchen auf ihrer Oberfläche eine
insgesamt schwach negative Gesamtladung, da bei Vorliegen solcher
Bedingungen die Zellen besonders wirksam gebunden werden. Eine neutrale
bis schwach positive Ladung der Kügelchen ist ebenfalls
möglich, wenn auch für das vorliegende Verfahren
nicht bevorzugt. Beispiele für geeignete carboxylierte
Polymere, die als Beschichtungsmaterial für die Kügelchen
geeignet sind und eine für die Erfindung geeignete Oberfläche
bereitstellen sind in der deutschen Patentanmeldung
DE 10 2005 040 259.3 im Detail
beschrieben. Beispiele für Verbindungen, die an die Oberfläche
gebunden sein können, sind Glycin, Hydrazin, Asparaginsäure,
6-Aminocapronsäure, NTA (Nitrilotriacetic acid), ,Polyacrylsäure
(PAA), Glycerin, Diglyme (Diethylene Glycol Dimethyl Ether), Glyme
(Dimethoxyethane), Pentaerythritol, Toluol, oder Kombinationen davon,
ohne auf diese beschränkt zu sein. Ebenfalls bevorzugte
magnetische Kügelchen sind solche, wie sie in der deutschen
Patentanmeldung
DE 10 2005
058 979.9 beschrieben sind. Solche geeigneten magnetischen Kügelchen
sind auf dem Markt erhältlich.
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Weitere
Beispiele geeigneter Beads sind Silicabeads, wie z. B. MagAttract
Suspension-B, MagAttract Suspension-G (alle von Qiagen).
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Die
Zellen werden mit den magnetischen Kügelchen ausreichend
lange in Kontakt gebracht, d. h. über eine Zeitdauer, die
ausreicht, um die Zellen an die Kügelchen binden/sich anlagern
zu lassen. Eine solche Zeitdauer sollte mindestens 30 s, bevorzugt
mindestens 1 min, weiter bevorzugt mindestens 3 min sein.
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Nach
der Anlagerung/Bindung der Zellen an die magnetischen Partikel lassen
sich die Zellen durch Anlegen eines Magnetfeldes an das Gefäß,
in dem sich die Zellen mit den Kügelchen befinden, aus
dem die Zellen umgebenden Medium sammeln, bzw. abtrennen. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird ein Magnet außen
an das Gefäß angelegt, in dem sich die Zellen
und die Magnetkügelchen befinden und der verbleibende Rest
der Probe wird aus dem Gefäß entfernt, beispielsweise
abgegossen oder mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung entfernt,
beispielsweise mit Hilfe einer Pipette abgezogen. Die Magnetpartikel
mit den Zellen können optional in einem geeigneten Waschmedium
resuspendiert und dadurch gewaschen werden, wonach wiederum ein
Magnetfeld an das Gefäß angelegt wird und das
Waschmedium wiederum aus dem Gefäß entfernt wird.
Das vorliegende Verfahren stellt dadurch einen besonders schonenden
Umgang mit den Zellen bereit.
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Nach
der Anreicherung der zu lysierenden nukleinsäurehaltigen
Zellen in Schritt (i) werden diese Zellen in Schritt (ii) mit einer
Lyselösung (A) in Kontakt gebracht, die oben detailliert
beschrieben ist. Nach Kontakt der Zellen mit der Lyselösung
(A) wird dieser Lyseansatz in Schritt (iii) für eine Zeitdauer
von 1 Minute bis 3 Stunden, bevorzugt 2 Minuten bis 1 Stunde, weiter
bevorzugt 5 bis 20 min bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis
unterhalb 100°C, bevorzugt bei wenigstens 60°C,
weiter bevorzugt bei wenigstens 70°C und besonders bevorzugt
zwischen 75 und 80C inkubiert. Alternativ lässt sich eine
zweistufige Inkubation vornehmen. So könnte beispielsweise
erst 10 min bei 56°C und nachfolgend 5 min bei 80°C
inkubiert werden.
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Nach
dem Inkubationsschritt (iii) kann in einem optionalen Schritt (iv)
der Lyseansatz zentrifugiert werden, um unlösliche Zellbestandteile
von den Nukleinsäuren zu trennen, jedoch ist ein solcher
Schritt nicht notwendigerweise erforderlich. Wenn wie oben beschrieben
Magnetpartikel bei der Erythrozytenlyse zum Einsatz kommen, kann
man vor der Entnahme des Lysats zur nachfolgenden Nachweisreaktion
eine Magnetseparation vornehmen, um den Übertrag an Magnetpartikeln
zu vermeiden.
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Beads
können im Ansatz verbleiben sollten jedoch bevorzugt möglichst
nicht in die Nachweisreaktion verschleppt werden. DNA und RNA liegt
frei im Lysat vor, denn das Lysat hat keine Eigenschaften, die eine Nukleinsäurebindung
an die Beads unterstützen.
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In
einem weiteren Schritt (v) werden die so erhaltenen Nukleinsäuren
mit einem die Nukleinsäuren amplifizierenden Verfahren
vervielfacht. Solche Verfahren sind in der Fachwelt gut bekannt
und für die Erfindung nicht limitierend. Ein bevorzugtes
Beispiel für ein solches Verfahren ist eine Polymerasekettenreaktion (PCR), gegebenenfalls
mit einer vorgeschalteten reversen Transkription (RT-PCR). Die Amplifikation
kann mit spezifischen oder unspezifischen Primern erfolgen. Durch
die Verwendung mit spezifischen Primern kann entweder eine oder
mehrere spezifische Gensequenz(en) aus dem genetischen Material
heraus verstärkt werden, oder bei Verwendung von spezifischen
Primern gemäß internationalem Standard ein genetischer
Fingerabdruck erstellt werden. Darüber hinaus können
auch unspezifische Primer verwendet werden, wenn ein Vergleich einer bekannten
Probe mit einer unbekannten Probe durchgeführt wird, um
den Ursprung der unbekannten Probe zu erforschen.
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Die
für das Verfahren verwendeten Komponenten können
in Form eines Kits bereitgestellt werden, was die Durchführung
des Verfahrens vereinfacht. Ein solcher Kit enthält wenigstens
die Lyselösung (A) oder deren Ausgangsmaterialien, also
die Komponenten (a), (b) und (c) und gegebenenfalls den Niedrigsalzpuffer und
eine Anleitung wie und in welchen Mengenverhältnissen diese
zusammenzugeben sind, und bevorzugt entweder einen Lysepuffer (B)
oder eine feste Oberfläche, an die entweder die zu lysierenden
Zellen oder verunreinigende Komponenten adsorbieren oder binden.
Außerdem kann der Kit Komponenten enthalten, die für die
Durchführung einer PCR geeignet sind.
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Ein
Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist es, dass in wenigen Schritten
aus einem Zellgemisch oder einem Gemisch aus verunreinigenden Komponenten
mit Zellen, die genetisches Material tragen, genetisches Material
in einer Qualität erhalten werden kann, so dass es unmittelbar
in einem Amplifikationsverfahren eingesetzt werden kann. Dies erlaubt
das gleichzeitige Behandeln einer großen Probenmenge verschiedener Proben
zum Untersuchen des darin enthaltenen genetischen Materials, beispielsweise
in der Forensik, bei der Identifikation von Personen oder der Zuordnung
von Proben, die genetisches Material enthalten, zu Personen, von
denen dieses Material stammt.
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Ein
weiterer Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass aufgrund
der wenigen Bearbeitungsschritte eine Verunreinigung der Proben
minimiert werden kann, da insbesondere die gesamte Aufarbeitung der
Proben in denselben Gefäßen erfolgt, so dass ein Überführen
der zu analysierenden Proben nicht erforderlich ist.
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Abbildungen
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1 Ergebnisse
einer H18 Real Time PCR: Dargestellt sind die gemittelten C(t) Werte
von jeweils vier unabhängigen Präparationen mit
einer Variante an Lösung (A).
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2 β-Actin
Real Time PCR Ergebnisse von zwei verschieden Spender Blutproben
(Donor 1 und 2) mit verschiedenen Anticoagulantien nummeriert von
1–6 im Vergleich zu QIAamp Blood Mini präparierten
Kontrollen (nur mit Anticoagulant 1 durchgeführt; markiert
als „1 QA”).
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Legende
der Anticoagulantien/Blutsammelsysteme: 1) Sarstedt (Monovette)
EDTA KE/9 mL; 2) Sarstedt (Monovette) Li-Heparin LH/7,5 mL; 3) Sarstedt
(Monovette) Coagulation 9 NC/10 mL; 4) B-D Vacutainer K2E 18 mg/10
mL; 5) B-D Vacutainer 9NC 0,105 M/9 mL; 6) B-D Vacutainer K3E 15%
0,12 mL/10 mL
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Beispiele
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Beispiel 01 Blut Protokoll im Zweischritt-Verfahren
mit Zentrifugation
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Blut
wird mit einem Erythrozyten Lysepuffer versetzt – wodurch
die roten Blutzellen sofort lysieren. Weiße Blutzellen
bzw. deren Zellkerne und/oder Mitochondrien werden mittels Zentrifugation
präzipitiert. Nach den Waschen der Sediment werden diese
mittels Lösung (A) lysiert. Das Lysat kann direkt in PCR
Reaktionen eingesetzt werden.
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Bei
der praktischen Durchführung werden 200 μl Blut
zusammen mit 600 μl Erythrozytenlysepuffer (106 mM Saccharose,
16 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,6 mM MgCl
2 0,33%
Triton X-100) in ein 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben.
Nach dem Verschließen wird das Gefäß 5-mal „über
Kopf” gewendet, um die Flüssigkeiten zu vermischen.
Nun wird das Gefäß für 20 Sekunden bei
10000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das
Sediment wird mit 400 μl Waschpuffer (80 mM Saccharose,
12,5 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,25 mM MgCl
2 0,25% Triton
X-100) resuspendiert und erneut durch Zentrifugation (20 sec bei
10000 × g) präzipitiert. Nun wird das Sediment
in Lösung (A) resuspendiert und bei 80°C und 1400
rpm für 5 min in einem Eppendorf Thermomixer inkubiert.
Das Lysat ist fertig und kann direkt eine PCR eingesetzt werden. Rezepturen der Lösung (A)
A1 | A2 | A3 | G7 |
0,1%
PVP | 0,1%
PVP | 0,1%
PVP | - |
- | 0 , 45% Tween-20 | 0,45%
Tween-20 | 0,2%
Tween 20 |
0,45%
NP-40 | - | 0,45%
NP-40 | 1
mM EGTA |
10
mM Tris pH 7,5 | 10
mM Tris pH 7,5 | - | 1
mM EDTA |
1
mM EDTA | 1
mM EDTA | 1
mM EDTA | 20
mM Tris pH 10.5 |
Die Lösungen
werden komplettiert durch die Zugabe von 0,5 μl Proteinase
K auf 200 μl Puffer |
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Quantitative PCR (spezifisch für
das humane H18 Gen)
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Die
für H18 spezifische Real Time PCR wurde mit 12,5 μl
QIAGEN QuantiTect Probe PCR Mastermix, 0,10 μl H18 Forward
Primer (100 μM), 0,10 μl H18 Reverse (100 μM),
0,05 μl H18 Probe (100 μM), 8,75 μl bidest.
Wasser und 4,0 μl Lysat-Aliquots durchgeführt.
Die Temperaturzyklen waren 15 Minuten bei 95°C und 40 × (15
Sekunden 95°C, 1 Minute bei 60°C). Die Amplifikation
wurde jeweils mit Eluaten von 4 einzelnen Nukleinsäurepräparationen
durchgeführt.
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Ergebnis
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Die
Ergebnisse der Real Time PCR in 1 beweisen
deutlich, dass die Methode sehr gut funktioniert. Ein Aspekt bezüglich
der Zusammensetzung des Lösung (A) scheint das Einhalten
des pH-Wert Bereichs zu sein. Bei einer ungepufferten Lösung
(A)-Variante (A3) wird das Ergebnis deutlich schlechter, während
sich bei pH 10,5 (A4) das Ergebnis deutlich verbessert.
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Beispiel 02 Blut Protokoll im Zweischritt-Verfahren
mit MagBeads
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Blut
wird mit einem Erythrozyten Lysepuffer versetzt, der gleichzeitig
Magnetpartikel mit carboxylierten Oberflächen enthält.
Die roten Blutzellen lysieren sofort und die weißen Blutzellen
bzw. deren Zellkerne und/oder Mitochondrien binden an die Magnetpartikel
und werden mittels Magnetseparation angereichert. Nach dem Waschen
der an die Magnetpartikel gebundenen Zellen/Zellfraktionen werden
diese mittels Lösung (A) lysiert. Das Lysat kann nach Magnetseparation
direkt in PCR Reaktionen eingesetzt werden. Als Vergleichsprozedur
wurde das QIAamp Blood Mini Protokoll (QIAGEN GmbH; Hilden) nach
Handbuchangaben durchgeführt.
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Bei
der praktischen Durchführung werden 200 μl Blut
zusammen mit 600 μl Erythrozytenlysepuffer (106 mM Saccharose,
16 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,6 mM MgCl2 0,33%
Triton X-100) und 60 μl carboxylierten Magnetpartikel (50
mg/ml) in ein 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben.
Nun lässt man das Gefäß für
2 min auf einem Eppendorf Thermomixer bei 1400 rpm schütteln.
Das Röhrchen wird in ein Magnetseparations-Gestell gestellt
und der Überstand nach vollständiger Separation
der Magnetpartikel verworfen. Das Magnetsediment wird nach Zugabe
von 500 μl Waschpuffer (80 mM Saccharose, 12,5 mM Tris/Cl
pH 7.5, 1,25 mM MgCl2 0,25% Triton X-100)
durch kurzes vortexen resuspendiert und erneut wird der Überstand
nach Magnetseparation verworfen. Nun wird das Sediment in 75 μl
Lösung (A) (0,1% PVP, 0,45% Tween-20, 0,45% NP-40, 10mM
Tris/CL pH 7,5, 1 mM EDTA) und 0,5 μl Proteinase K resuspendiert
und bei 80°C und 1400 rpm für 5 min in einem Eppendorf
Thermomixer inkubiert. Das Lysat ist fertig und kann direkt eine
PCR eingesetzt werden. Vor der Entnahme wird das Röhrchen
bevorzugt auf ein Magnetseparations-Gestell platziert, um ein Transfer
von Magnetpartikeln in die PCR zu vermeiden.
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Quantitative PCR (spezifisch für
das β-Actin Gen)
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Die
für β-Actin spezifische Real Time PCR wurde mit
12,5 μl QIAGEN QuantiTect Probe PCR Mastermix, 0,10 μl β-actin
Forward Primer (100 μM), 0,10 μl β-Actin
Reverse Primer (100 μM), 0,05 μl β-Actin
Probe (100 μM), 8,75 μl bidest. Wasser und 4,0 μl
Lysat-Aliquots durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren
15 Minuten bei 95°C und 40 × (15 Sekunden 95°C,
1 Minute bei 60°C). Die Amplifikation wurde jeweils mit
Eluaten von 4 einzelnen Nukleinsäurepräparationen
durchgeführt.
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Ergebnisse
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Die
Konzentration der präparierten DNA ist vergleichbar mit
den mit QIAamp gereinigten Proben. Die Schwankungen der ermittelten
Konzentration sind bedingt durch die Blutspender und das verwendete
Blutsammelröhrchen mit dem unterschiedlichen Anticoagulant
als „normal” zu bewerten. Neben dem zeitlichen Vorteil
in der Durchführung zeigt die im Sinne der Erfindung vorgestellte
Methode vergleichbare Ergebnisse zu etablierten Referenzmethoden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 03/102184
A1 [0005]
- - US 5523231 [0006]
- - WO 2006/103094 [0007]
- - DE 102005040259 [0023]
- - DE 102005058979 [0023]