DE102007062441A1 - Mobiles Schnelltestsystem für die Nukleinsäureanalytik - Google Patents
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein mobiles Gerätesystem für die Gendiagnostik. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus den Schritten Amplifikation der Nukleinsäuren mittels der Rapid-PCR-Technologie, Überführung eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts in ein einzelsträngiges DNA-Fragment und Nachweis der Nukleinsäuren auf einem Lateral-Flow-Teststreifen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Reaktionskavität, die vorzugsweise aus einer dünnen Folie besteht, Einlass- und Auslassöffnungen für die Reaktionskavität, mindestens einen Lateral-Flow-Teststreifen, einen beheizbaren Probenblock, der mit einem miniaturisierten Kühlkörper verbunden ist und Sichtfenster zum Ablesen des Ergebnisses. Verfahren und Vorrichtung sind dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation und der Nachweis der Nukleinsäuren in einem Gerätesystem erfolgt und dieses Gerätesystem während des Betriebs keine externe Spannungsquelle benötigt, sondern mittels einer Batterie oder eines Akkumulators betrieben wird.
Description
- Gegenstand der Erfindung ist ein mobiles Gerätesystem für die Gendiagnostik.
- Stand der Technik
- Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben wie Serum, Plasma, Blut, Tupferproben oder Organabriebe zum Nachweis infektiöser Erreger hat in den letzten Jahren enorm an Bedeutung gewonnen. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV sind weltweit auf dem Vormarsch. Darüber hinaus sind auch bakterielle Infektionen wieder auf dem Vormarsch, u. a. auch als Ergebnis beginnender klimatischer Veränderungen. Das Auftreten neuer, tödlich verlaufender Infektionskrankheiten mit einem extrem hohen Infektiösitätspotential (SARS, Vogelgrippe) zeigt immer deutlicher, dass eine schnell und vor Ort durchführbare Diagnostik entscheidend für die Verhinderung von Epidemien sein wird. Darüber hinaus spielen einfach handhabbare und relativ preiswerte diagnostische Systeme, vor allem für Entwicklungsländer, ebenfalls eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung der Ausbreitung von Infektionskrankheiten. Die derzeitig vor allem für die Detektion viraler Infektionskrankheiten (HIV, HCV, HBV) eingesetzten Tests basieren mehrheitlich auf der Durchführung von REAL-TIME-PCR's. Diese Tests sind an extrem teure gerätetechnische Voraussetzungen gebunden sowie auch an teure Reagenzien. Die Durchführung dieser Methoden kann nur durch geschultes Fachpersonal in Speziallaboratorien erfolgen. Eine Vor-Ort-Diagnostik ist nicht möglich. Neue Generationen von integrativen Systemlösungen (Kombination von Nukleinsäureisolierung, Amplifikation und Chipdetektion) für eine mobile Vor-Ort-Diagnostik befinden sich in der Entwicklung, nicht aber in einem Stadium der erfolgreichen Vermarktung. Darüber hinaus fokussieren diese Systeme auch oftmals auf den Bereich der militärischen Diagnostik und sind auch in Analogie zu den „klassischen REAL-TIME-PCR"-Verfahren sehr teuer, sowohl geräte- als auch reagenzienseitig.
- Die so-genannte Rapid-PCR-Technologie erlaubt die Durchführung von Amplifikationsreaktionen innerhalb von nur wenigen Minuten und ist damit deutlich schneller als Standard-PCR-Verfahren. Für die miniaturisierte Gerätelösung wird die Erfindung durch eine neuartige Reaktionskavität (consumable) gelöst. Im Bereich der PCR-consumables sind ver schiedene Methoden zu deren Herstellung bekannt. Am meisten verbreitet ist das Herstellungsverfahren durch Spritzguss. Die so hergestellten consumables sind in einer Vielzahl von Formen und Anordnungen kommerziell verfügbar. Diese Gefäße verfügen jedoch alle über eine sehr dicke Wandstärke (ca. 0,2 mm–0,35 mm), welche einem guten Wärmetransfer, von dem beheizten Probenblock in die Probe, als ein sehr großer Widerstand entgegen steht. Werden diese Gefäße verwendungsgemäß in einem Thermocycler benutzt, heizt sich der in den Geräten befindliche Probenblock mit einer Geschwindigkeit von bis zu 5°C/s auf. Die resultierende Geschwindigkeit in der Probe wird jedoch durch die Gefäße erheblich vermindert, so dass die Probe (im Gefäß befindlich) nur mit ca. 1,5–2°C/s aufgeheizt wird. Selbst als „dünnwandig" (minimale Wandstärke von ca. 0,19 mm; Eppendorf Produktkatalog 07–08, S. 200) angebotenen Gefäße vermögen es nicht, diesen Zustand erheblich zu verbessern. Die technischen Voraussetzungen (heizen und kühlen) für eine schnelle Abarbeitung der Temperaturen in der PCR sind technisch realisiert, werden jedoch durch das verwendete consumable in seiner Effektivität stark beeinträchtigt.
- Übliche in der PCR verwendeten Probenvolumina liegen im Bereich von 5–50 μl. Die durch Spritzguss hergestellten Gefäße besitzen am Boden ihre maximale Wandstärke, so dass eine Temperierung und die Durchführung einer PCR Reaktion von geringen Volumina 1–10 μl (welche sich am Boden der Gefäße sammeln) nur sehr ungenau und langsam durchzuführen ist.
- Die verwendeten metallischen Probenblöcke (Aluminium, Silber) in Thermocyclern mit den sehr großen Wärmekapazität sorgen ferner dafür, dass schnelle Temperaturwechsel in der Probe auch bei der Verwendung von starken Heizelementen unmöglich zu realisieren sind. Die Schnelligkeit von bestehenden Systemen am Markt, die auf der Basis von metallischen Probenblöcken und Spritzguss consumables arbeiten, stößt damit an objektive Grenzen. Daraus folgt aber auch, dass eine miniaturisierte mobile Variante auf der Basis der erläuterten Standardtechnik bisher völlig undenkbar war, da die verwendeten elektrischen Leistungen einen Batteriebetrieb und die Vielzahl der benötigten Einzelkomponenten eine zumutbare Dimension überschreiten.
- Andere Systeme basieren auf verschiedenen Techniken, um diesen Einschränkungen entgegenwirken zu können. Als das bekannteste kommerziell verfügbare schnelle PCR System sei hier der LightCycler von Roche Molecular Biochemicals genannt (cat. No. 1909339 und cat. No. 2011468). Dieses System beruht auf der Verwendung von sehr dünnen Glaskapillaren als PCR-consumable und führt eine Temperierung mittels heiser Luft durch, welche die Kapillare umströmt. Diese Kapillaren können ein Volumen von 10–20 μl aufnehmen und zeichnen sich durch ihre große Oberfläche aus, die einen guten Wärmetransfer ermöglicht. Diese große Glasoberfläche adsorbiert jedoch Komponenten von Standard PCR-Ansätzen und lässt somit die Reaktion inaktiver werden. Um diesen Effekt zu kompensieren, müssen z. B. verschiedene Carrier Moleküle usw. eingesetzt werden (
EP 1133359 ). Als ein weiterer Nachteil stellt sich hierbei ebenfalls die Handhabung der sehr dünnen Kapillare und deren Preis heraus. Eine Miniaturisierung und an eine einfache Handhabung der Gefäße ist jedoch weiterhin unmöglich. - Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein neuartiges mobiles gendiagnostisches Schnelltestsystems (Kombination von Hardware und Reagenzien) zu entwickeln, welches einfach zu bedienen sein soll, eine extrem schnelle diagnostische Aussage ermöglicht und sowohl in Hinblick auf das Gerät als auch in Hinblick auf den durchzuführenden Test preiswert ist. Damit soll auch die Möglichkeit gegeben sein, die Diagnostik von Infektionskrankheiten in Entwicklungsländern ohne qualitative Einschränkungen durchführen zu können.
- Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
- Die Erfindung löst die beschriebene Problematik in idealster Weise durch die einfache und synergistische Kombination eines Gerätesystems zur Durchführung spezifischer Amplifikationsreaktionen und einer einfachen Nachweis-Chemie zur Detektion eines spezifischen Amplifikationsereignisses, wobei das Gerätesystem in Form eines sog. handheld-Systems vorliegt und damit nicht nur miniaturisiert sondern auch mobil zu betreiben ist, d. h. ohne die Notwendigkeit einer externen Spannungsquelle, sondern mittels eines Batteriebetriebes.
- Die Erfindung basiert dabei auf der Nutzung der so-genannten Rapid-PCR-Technologie.
- Die Erfindung löst die bestehenden Probleme eines miniaturisierten handheld-Rapid-PCR-Thermocycler in Kombination mit einem Detektionsmodul wie folgt:
Die Erfindung basiert auf einer neuartigen Anordnung und Konzeption von Heizelementen und Probenblock, welche sich für einen mobilen Einsatz in Leistung und Größe eignen, in Kombination mit einem völlig neuartigen consumable (Reaktionskavität für die Amplifikationsreaktion) mit einem erheblich verbesserten Wärmetransfer. Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass das neuartige consumable so optimiert wird, dass das größte Problem, der physikalische Widerstand für eine effektive PCR-Temperierung, überwunden werden kann. Ein optimaler Wärmeübergang ist dann vorhanden, wenn eine Probe direkt auf den Probenblock bzw. temperierten Medium ohne störende Materialien und zusätzliche Wärmeübergänge aufgegeben werden kann. Eine solche Realisierung verbietet sich bisher aus Gründen der Kontamination. - Eine nur minimale Störung des Wärmeübergangs wäre dann gegeben, wenn eine extrem dünne Schicht eines bioverträglichen Materials eingesetzt werden könnte. Dies wird mit der Erfindung dadurch gelöst, dass eine extrem dünnschichtige PP-Folie eingesetzt wird. Diese Folie wird dabei in eine gewünschte Geometrie gelegt bzw. gefaltet und formstabil verschweißt. Diese spezifische Geometrie zeichnet sich dadurch aus, dass sie am Boden für das einfüllbare Probenvolumen des Amplifikationsansatzes eine möglichst große flache Oberfläche besitzt. Diese große Fläche dient als Wärmeübergangsfläche zum beheizten Probenblock. Durch die ultradünne Folie wird einem Wärmeübergang ein minimaler Widerstand entgegengesetzt und ermöglicht es so innerhalb der Probe eine Heizrateneffektivität vom Probenblock auf die Probe von fast 100% zu realisieren.
- Als einzusetzenden Probenblock wird ein durch eine Batterie betriebenes Pelltierelement genutzt, welches mit einem miniaturisierten Kühlköper verschraubt ist. Die verwendete Geometrie des Probenblocks zeichnet sich als Gegenstelle des consumables ebenfalls durch eine maximale Oberfläche aus. Das Volumen und somit auch die Kapazität des Probenblocks ist erfindungsgemäß auf ein absolutes Minimum reduziert. Der Probenblock kann damit theoretisch mit einer Heizrate von 15°C/s geheizt werden. Die Geometrie des consumables ist erfindungsgemäß so gewählt worden, dass durch einen leichten Andruck von oben und ausgenutzte physikalische Effekte eine starke Anpressung an den Probenblock realisiert und so ebenfalls ein gleichmäßiges Heizen mit diesen Geschwindigkeiten begünstigt und realisiert wird.
- Damit sind die Voraussetzungen gegeben, eine Amplifikationsreaktion mit einem kleinen mobilen Gerät unter Verwendung von einer normalen Batterie zu realisieren sowie eine ultraschnelle Reaktion durchzuführen. Dem Fachmann ist aber klar, dass allein mit einer miniaturisierten und mobilen Möglichkeit der Durchführung der PCR-Reaktion keine mobile vor-Ort-Diagnostik durchgeführt werden kann. Das System benötigt dazu auch die Detektion einer erfolgten spezifischen Targetamplifikation.
- Dabei muss die Detektion integrierter Bestandteil des Gesamtsystems sein.
- Diese Kombination von Amplifikation und Detektion wird überraschenderweise durch die Erfindung ganz einfach mittels der Verwendung von dem Fachmann bekannten sogenannter Lateral-Flow-Teststreifen realisiert. Obwohl beide Technologien (Rapid-PCR und Lateral-Flow-Streifen) als Standard-Techniken existieren, existiert keine Verknüpfung beider Technologien in Form eines integrativen Gesamtsystems. Dieses wird aber durch die Erfindung ermöglicht.
- Die Durchführung von Gentests mittels so-genannter Lateral-Flow-Streifen wird bisher in unterschiedlicher Form propagiert. Eine Möglichkeit (Offenlegungsschrift 1020060099022 A; Method and kit for rapid and Accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis) nutzt Lateral-Flow-Verfahren dazu, um Nukleinsäuren zu detektieren. Dieses Verfahren bedient sich der Technologie der Hybridisierung von Nukleinsäuren an einer festen Phase. Dabei werden spezifische Fängernukleinsäuren auf dem Teststreifen immobilisiert und mit einzelsträngigen Targetnukleinsäuren hybridisiert. Dieser Prozess erfordert dabei aber die Überführung eines doppelsträngigen DNA-Fragmentes (als Ergebnis einer spezifischen Amplifikationsreaktion) in ein einzelsträngiges DNA-Fragment. Der Prozess muss dazu im Anschluss an eine PCR-Reaktion durchgeführt werden. Eine weitere schnelle Nachweismethodik, welche sich auch dem Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels eines Teststreifens bedient und kommerziell angeboten wird, basiert im Gegensatz zur obigen Patentschrift auf einem völlig anderen Prinzip. Hierbei erfolgt die Durchführung der PCR-Reaktion mit einem biotinylierten Primer und einem nicht-biotinylierten Primer. Nach Durchführung der PCR liegt ein PCR-Produkt vor, welches an einem Ende Biotin-markiert ist. Der Nachweis nutzt einen Teststreifen (z. B. Fa. Millenia), der zwei getrennte Bindungsstellen enthält. Eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung des Biotin-markierten DNA Stranges und eine FITC-Bindungsstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens.
- Der Nachweis des PCR-Produktes realisiert sich dadurch, dass man nach durchgeführter PCR den PCR-Ansatz denaturiert und mit einer zum Biotin-markierten DNA-Strang komplementären Sonde hybridisiert. Die Sonde ist FITC markiert.
- Zum Nachweis wird der PCR-Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen. Nach der Testbeschreibung bindet sich der biotinylierte DNA-Strang an die Streptavidin-Bindungsstelle des Streifens. Der Nachweis erfolgt über die FITC-Markierung der mit dem DNA-Strang hybridisierten Sonde. Es bildet sich ein typisches Signal in Form eines Streifens aus. Dieses Signal soll der spezifische Nachweis des Amplifikationsproduktes sein. Das Verfahren kombiniert aber nicht die Hybridisierung der Sonde mit dem Prozess der PCR, sondern führt dies als separaten Verfahrensschritt durch. Das Verfahren hat aber eine grundsätzliche und dramatische Fehlerquelle.
- Die Detektion der nachzuweisenden Zielnukleinsäure ist nicht spezifisch. Die Ursache liegt darin, dass während der PCR entstandene Artefakte, z. B. Primer-Dimere, natürlich auch spezifisch an die Streptavidin-Bindungsstelle des Teststreifens binden und damit auch wie ein spezifisches PCR-Produkt eine positive Reaktion hervorrufen können.
- Aus diesen Darstellungen folgt, dass es zwar applikative Lösungen zur Durchführung von Gentests auf Streifen gibt, diese aber neben der Amplifikation auch noch der Denaturierung des Amplifikationsproduktes bedürfen und damit eine direkte Kombination von Amplifikation und Detektion nicht zulassen. Darüber hinaus, wie im Beispiel 2 gezeigt, sind bestimmte Verfahren nicht spezifisch und sehr problematisch in Hinblick auf die Erzeugung von falschpositiven diagnostischen Ergebnissen.
- Eine neuartige und sehr elegante Möglichkeit basiert auf einer in die Amplifikationsreaktion integrierten Sondenhybridisierung zwischen Amplifikat und spezifischer Hybridisierungssonde. Der Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses erfolgt dann auf einem Teststreifen. Damit ist erstmals die Möglichkeit gegeben, ohne eine weitere Manipulation (Denaturierung doppelsträngiger DNA) und unter Umgehung der schon dargestellten Amplifikationsprobleme zu arbeiten und damit die Amplifikations/Hybridisierungsreaktion direkt mit dem Nachweis auf einem Teststreifen kombinieren zu können. Der Nachweis eines Amplifikations-Hybridisierungsproduktes erfolgt dadurch, dass ein Amplifikationsprimer und die spezifische Hybridisierungssonde am 3'-Ende mit einem Markierungs-Molekül versehen sind (z. B. Biotin und FITC). Die Amplifikationsreaktion erfolgt unter Standardbedingungen. Dabei folgt der eigentlichen Amplifikationsreaktion ein Denaturierungsschritt zur thermischen Strangtrennung des während der PCR generierten Amplifikationsproduktes. Nach Denaturierung wird der PCR-Reaktionsansatz auf die Hybridisierungstemperatur der Sonde abgekühlt. Während dieses Schrittes bindet die Hybridisierungssonde spezifisch an den komplementären DNA-Strang des Amplifikationsproduktes. Dieser Strang trägt dabei die Biotin-Markierung, die durch den Biotin-markierten Primer in das PCR-Produkt eingebaut wurde. Nach Durchführung der Amplifikations-Hybridisierungsreaktion wird der Reaktionsansatz auf den Teststreifen übertragen. Auf dem Teststreifen kann der Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses wie folgt erfolgen: Der Teststreifen trägt z. B. in einer Ausführungsvariante zwei getrennte Bindungsstellen; eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung der Biotin-markierten Amplifikationsprodukte und eine FITC-Bindungsstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens. Darüber hinaus enthält der Teststreifen eine Zone mit konjugierten Nachweispartikeln (z. B. anti-FITC-Goldpartikel). Nach In-Kontaktbringen des PCR-Ansatz mit einem solchen Teststreifen können folgende Bindungsereignisse auftreten:
- 1. Alle FITC-markierten Nukleinsäuren (nicht hybridisierte FITC-markierte Hybridisierungssonde bzw. Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde) binden im unteren Probenauftragsbereich des Teststreifens an Goldpartikel, die mit anti-FITC-Antikörpern beschichtet sind.
- 2. Im weiteren Verlauf des Teststreifens befindet sich die Streptavidin-Bindungsstelle. An diese Bindungsstelle können sich folgende Nukleinsäuren binden: (a) die Biotin-markierten Primer, (b) die Biotin-markierten DNA-Stränge und (c) die Hybridisierungsprodukte zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde.
- Ein Nachweissignal kann aber nur dann sichtbar werden, wenn das spezifische Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridiserungssonde vorliegt, da nur dieses Produkt auch mit dem Nachweissystem (FITC- anti- FITC-Goldpartikel) gekoppelt ist.
- 3. Im weiteren Verlauf des Teststreifens binden dann noch überschüssige mit anti-FITC-Antikörpern beschichte Goldpartikel, welche als Kontrolle zur Funktionsfähigkeit des Teststreifens dienen.
- Diese Ausführungsvariante ist, wie schon erwähnt, sehr elegant und birgt nicht die potenzielle Gefahr von falsch-positiven Signalen. Sie ist damit sie für das erfindungsgemäße mobile Nachweissystem die zu favoritisierende Variante der Nutzung eines Lateral-Flow-Teststreifens.
- Die erfindungsgemäße Kombination von Amplifikation und Detektion mittels Lateral Flow Teststreifen in einem mobilen batteriebetriebenen handheld-Gerät wird wie folgt gelöst:
Sowohl das für die Amplifikations/Hybridisierungsreaktion erfindungsgemäß eingesetzte consumable (Reaktionskavität) als auch der Teststreifen werden hintereinander angeordnet in eine Reaktionskartusche verbracht. In dieses miniaturisierte System wird ein Verschlusssystem für das consumable integriert. - Dabei existiert für das consumable (Reaktionskavität für die Amplifikations-Hybridisierungsreaktion) eine Einlassöffnung und Auslassöffnung. In die Einlassöffnung erfolgt die Zuführung des initial hergestellten Reaktionsgemisches (zu untersuchende Nukleinsäure, dNTP's, Primer, Hybridisierungssonde sowie Amplifikationspuffer). Die Einlassöffnung wird durch einen in das Gerät integrierten Glühdraht verschweißt. Der Glühdraht wird dabei durch einen einfachen Druckmechanismus zur Einlassöffnung bewegt. Nach erfolgter Amplifikations/Hybridisierungsreaktion wird der Reaktionsansatz über die Auslassöffnung auf den Teststreifen überführt. Aus einem separaten Reservoir wird dann nachfolgend ein Laufpuffer ebenfalls auf den Testreifen zugeführt. Das Reservoir für den Laufpuffer befindet sich ebenfalls in der Kartusche. Nach Beendigung der Testreifen-Reaktion wird das diagnostische Ergebnis von einer Sichtzone abgelesen. Die Reaktionskartusche, welche das Amplifikationsmodul und den Teststreifen sowie das Reservoir für den Laufpuffer enthält, ist ein Einwegartikel. Diese wird für jede Reaktion neu in das Basis- Gerät eingelegt und nach Testlauf verworfen.
- Mit der erfindungsgemäßen Kombination von rapid-PCR und Detektion des Amplifikationsereignisses mittels eines mobilen und batteriebetriebenen handheld-Systems ist erst mals die Voraussetzung für eine ganz einfache und preiswerte gendiagnostische Vor-Ort-Analyse gegeben. Dabei ist das handheld-Gerät natürlich sehr viel preiswerter als die bisher vorgeschlagenen hochaufgerüsteten Gerätesysteme, insbesondere für militärische Anwendungen. Dies soll auch die Nutzung von gendiagnostischen Schnelltests in Entwicklungsländern universell ermöglichen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Durchführung einer extrem schnellen Amplifikationsreaktion ermöglicht. Die nachfolgende Detektion auf einem Testsreifen ist ebenfalls sehr schnell und robust. Damit stellt die Erfindung eine wirkliches Schnelltestsystem dar.
- Ausführungsbeispiele:
- Die Erfindung wird anhand von zwei Figuren näher erläutert. Im Anhang sind die Prinzipskizzen für das erfindungsgemäße Mittel dargestellt. Die Zeichnungen gelten dabei nicht als Limitierung für andere Ausführungsformen.
1 zeigt die schematische Darstellung der Kartusche.2 zeigt die schematische Darstellung des Gerätes (Spannungsquelle und Reaktionskartusche). -
- A
- Einlassöffnung
- B
- Consumable für die Amplifikations-'Hybridisierungsreaktion
- C
- Auslassöffnung und Verbindung zwischen Consumable und Teststreifen
- D
- Reservoir für Laufpuffer
- E
- Auslassöffnung vom Reservoir für Laufpuffer mit Zuführung zum Testsreifen
- F
- Teststreifen
- G
- Sichtfenster für die Detektion des Nachweissignals auf dem Teststreifen
- H
- Batterie als Spannungsquelle
- I
- Heiz/Kühlelement
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
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- - EP 1133359 [0006]
Claims (16)
- Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mittels eines mobilen Gerätesystems mit folgenden Schritten: • Amplifikation der Nukleinsäuren mittels der Rapid-PCR-Technologie • Überführung eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts in ein einzelsträngiges DNA-Fragment (Denaturierung) • Nachweis der Nukleinsäuren auf einem Lateral-Flow-Teststreifen, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation und der Nachweis der Nukleinsäuren in einem Gerätesystem erfolgt und dieses Gerätesystem während des Betriebs keine externe Spannungsquelle benötigt, sondern mittels einer Batterie oder eines Akkumulators betrieben wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Teststreifen spezielle Fängernukleinsäuren immobilisiert sind und der Nachweis der zu bestimmenden Nukleinsäuren durch die Hybridisierung mit den Fängernukleinsäuren auf dem Teststreifen erfolgt.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Reaktion mit einem biotinylierten Primer und einem nicht-biotinylierten Primer durchgeführt wird und der Teststreifen zwei getrennte Bindungsstellen enthält, eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung des Biotin-markierten DNA Stranges und eine FITC-Bindungsstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens, wobei der Nachweis der Nukleinsäuren dadurch erfolgt, dass das denaturierte Amplifikationsprodukts mit einer zum Biotin-markierten DNA-Strang komplementären FITC-markierten Sonde hybridisiert, der PCR-Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Schritte: • während der Amplifikation mit einem markierten Amplifikationsprimer erfolgt eine Hybridisierung mit einer spezifischen markierten Sonde • nach Denaturierung wird der PCR-Reaktionsansatz auf die Hybridisierungstemperatur der Sonde abgekühlt, wobei die Hybridisierungssonde spezifisch an den komplementären DNA-Strang des Amplifikationsproduktes bindet und dieser DNA- Strang die Biotin-Markierung trägt, die durch den Biotin-markierten Primer in das PCR-Produkt eingebaut wurde • Überführung des Amplifikations-Hybridisierungs-Ansatzes und eines Laufpuffers auf den Teststreifen, wobei der Teststreifen zwei getrennte Bindungsstellen trägt, eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung der markierten Amplifikationsprodukte und eine Bindungsstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens sowie eine Zone mit konjugierten Nachweispartikeln (z. B. anti-FITC-Goldpartikel).
- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Markierung des Amplifikationsprimers und der spezifischen markierten Sonde Biotin und/oder FITC eingesetzt wird.
- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung des Amplifikationsprimers und der spezifischen markierten Sonde am 3'-Ende erfolgt.
- Vorrichtung zur zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend: • eine Reaktionskavität zur Durchführung einer Amplifikation von Nukleinsäuren mittels der Rapid-PCR-Technologie • Einlass- und Auslassöffnungen für die Reaktionskavität • mindestens einen Lateral-Flow-Teststreifen, • einen beheizbaren Probenblock, der mit einem miniaturisierten Kühlköper verbunden ist • Sichtfenster zum Ablesen des Ergebnisses dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskavität und der Teststreifen in einer Reaktionskartusche hintereinander angeordnet sind und die Vorrichtung während des Betriebs keine externe Spannungsquelle benötigt, sondern mittels einer Batterie oder eines Ackumulators betrieben wird.
- Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Reservoir und eine Auslassöffnung für Laufpuffer umfasst.
- Vorrichtung nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie verschließbare Verbindungskanäle zwischen Reaktionskavität, Teststreifen und Laufpuffer-Reservoir enthält.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskavität aus einer Kunststoff-Folie, vorzugsweise aus Polypropylen, besteht.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskavität eine große flache Oberfläche und ein minimales Volumen dadurch besitzt, dass die Folie in einer gewünschten Geometrie formstabil verschweißt und durch einen leichten Andruck von oben an den Probenblock gepresst wird.
- Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der beheizbare Probenblock, der mit einem miniaturisierten Kühlköper verbunden ist, ein Batterie betriebenes Pelltierelement darstellt.
- Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der beheizbare Probenblock mit einer Heizrate von bis zu 15°C/s geheizt wird.
- Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Einlassöffnung durch einen in das Gerät integrierten Glühdraht verschweißt wird.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein miniaturisiertes, mobil zu betreibendes handheld-Gerät handelt.
- Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskartusche, welche das Amplifikationsmodul und den Teststreifen sowie das Reservoir für den Laufpuffer enthält, ein Einwegartikel ist.
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