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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Mikrowellen-gestützten Präparation
von Proben, mit zumindest einem Mikrowellengenerator, einer Mikrowellenkammer
zur Aufnahme von zumindest einer zu prozessierenden Probe und mit
einer Behälteranordnung
für zumindest
zwei Behälter
für Flüssigkeiten zum
Umgeben der zu prozessierenden Probe(n) innerhalb der Mikrowellenkammer.
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Die
Präparation
biologischer Proben wird beispielsweise für den Zweck einer elektronenmikroskopischen
Untersuchung durchgeführt.
Hierbei werden Mikrowellen zum Anregen und Beschleunigen der Fixations-,
Substitutions-, Infiltrations- und Polymerisationsprozesse verwendet.
Dadurch kann die Gesamtzeit der Präparationsprozesse deutlich
reduziert werden.
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Ein
Mikrowellen-gestütztes
Gerät zur
Extraktion von Substanzen aus einem Ausgangsmaterial ist in
US 5,620,659 beschrieben.
Eine Anzahl von Probenbehälter
wird in einem Karussell-artigen Drehtisch montiert und als Ganzes
in eine Multi-Mode-Kammer gestellt. Leitungen aus jedem Probenbehälter führen in
einen Sammelbehälter,
der zusätzlich abgepumpt
werden kann, um eine Kontamination der Multi-Mode-Kammer durch entwichene
Gase zu vermeiden.
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US 6,875,583 offenbart ein
Gerät zur
schnellen mikrowellenunterstützten
Fixierung von Gewebe. Biologische Präparate werden in einer als
Fixiermittel dienenden Formalin-Lösung in das Mikrowellenfeld einer
Multi-Mode-Kammer positioniert. Die Mikrowellenleistung ist regelbar.
Die Temperatur wird durch Umpumpen und Kühlen der Fixierlösung außerhalb des
Mikrowellenfeldes kontrolliert.
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Das
Umpumpen und Kühlen
von Reagenzien während
der Prozessierung von biologischen Präparaten weist den Nachteil
auf, dass der Reagenzienaustausch mit hohem Aufwand verbunden ist.
Es müssten
Ventile, Pumpen, Vorrats- und Abfallbehälter vorgesehen werden. Deshalb
ist in
US 6,875,583 die
Verwendung der offenbarten Erfindung auf einen speziellen Prozessschritt
beschränkt.
Außerdem
ist mit einer derartigen Anordnung ein relativ hoher Chemikalienverbrauch
verbunden, da ja nicht nur das Prozessgefäß gefüllt sein muss, sondern zusätzlich auch
der gesamte Kühlkreislauf.
Austausch und Erneuerung von Reagenzien müssen auch Waschschritte für den Kühlkreislauf
umfassen.
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Multi-Mode-Mikrowellenkammern,
also Kammern nach Art eines Haushaltsmikrowellenofens mit relativ
großen
Kammerabmessungen weisen große lokale
Inhomogenitäten
der Mikrowellenintensität
(so genannte „hot
spots" und „cold spots") auf. Daher sind
Vorrichtungen zur Homogenisierung des Mikrowellenfeldes notwendig
um definierte und reproduzierbare Prozessbedingungen zu schaffen.
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In
den US-Patenten
US 4,681,740 und
US 5,459,302 wird die Anordnung
von Reaktionsgefäßen in einem
Mikrowellenfeld, das sich in einem Wellenleiter ausbildet, offenbart.
Die Aufnahme für
ein Reaktionsgefäß ist so
ausgebildet, dass sich das untere Ende des Gefäßes im Wellenfeld befindet
und das obere Ende aus dem Wellenleiter herausragt. Der herausragende
Teil ist durch ein Rohr umgeben, das den Austritt von Mikrowellen
verhindert. Die Temperatur des Reaktionsgefäßes kann durch ein Pyrometer überwacht
werden.
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In
den US-Patenten
US 6,753,517 ,
US 6,917,023 und
US 6,744,024 werden Geräte zur mikrowellenunterstützten chemischen
Synthese offenbart. Die Reagenzien befinden sich in einem mikrowellentransparenten
Reaktionsgefäß, das innerhalb des
inneren Freiraumes eines als Zylinderring geformten Mikrowellenresonators
positioniert ist; jedoch befindet sich die Probe nicht in dem eigentlichen
Wellenleiter, der ringartig den Freiraum umschließt. Durchbrechungen
der inneren Wellenleiterwand bewirken, dass Mikrowellenstrahlung
zum Reaktionsgefäß gelangt.
Dadurch wird eine vergleichsweise homogene Verteilung des Mikrowellenfeldes über den Bereich,
in dem die Reaktion abläuft,
erreicht, jedoch bedarf diese Anordnung einer zusätzlichen
aufwändigen
Abdichtung der Mikrowellenstrahlung nach außen. Die Temperatur im Reaktionsgefäß wird durch
einen Sensor kontrolliert und durch Regelung der Mikrowellenleistung
oder durch Kühlen
der Außenschale
des Reaktionsbehälters
mit Hilfe eines Gas- oder Flüssigkeitsstromes
gesteuert.
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Die
beschriebenen Methoden zur Mikrowellen-unterstützten Präparation erfordern, wenn die Proben
nacheinander in verschiedenen Flüssigkeiten zu
prozessieren sind, einen manuellen Austausch der Reagenzien und
sind daher arbeitsintensiv. In konventionellen Gewebeprozessoren
dauert die Prozessierung der Proben je nach Protokoll mehrere Stunden
(z.B. 24h) bis Tage. Die Proben sind somit erst nach dieser langen
Wartezeit für
Untersuchungen im Elektronenmikroskop verfügbar.
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Daneben
ist es bei der Prozessierung von Proben in einer Sequenz von Flüssigkeiten
bekannt, diese Flüssigkeiten
in einen Drehtisch-Träger – ein sogenanntes
Karussell – zu
stellen, und in einem Prozessgerät
wird die Probe nacheinander in die im Karussell befindlichen Proben
getaucht. Hierzu ist eine übliche
Vorgangsweise, dass das Karussell unterhalb der Probe so gedreht
wird, dass die zu verwendende Flüssigkeit
unter der Probe positioniert wird, und dann das Karussell als ganzes
angehoben wird, bis die Probe eintaucht. Dann kann der gewünschte Prozessschritt
stattfinden, bei Bedarf auch zusätzlich
unter Verwendung einer Heizung od.dgl. Danach wird das Karussell
abgesenkt, weitergedreht usw. Diese Vorgangsweise ist im Zusammenhang
mit Mikrowellenstrahlung wenig vorteilhaft, da ein Karussell zum
Einbringen in einen Wellenleiter zu sperrig ist, oder es müsste das
gesamte Karussell in einen Wellenleiter gebracht werden (ähnlich wie
in
US 5,620,659 ), wobei
aber auch die nicht benutzten Flüssigkeiten
von der Mikrowellenstrahlung betroffen würden.
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Aufgabe
der gegenständlichen
Erfindung ist es, ein Gerät
zur Verfügung
zu stellen, mit dem die Proben rasch und mit verringertem Handhabungsaufwand
in wechselnden Prozessfluiden innerhalb einer Mikrowellenkammer
prozessiert werden können.
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Diese
Aufgabe wird von einem Gerät
der eingangs genannten Art gelöst,
bei welchem die Mikrowellenkammer als Wellenleiter ausgebildet ist,
der
- – zumindest
eine Öffnung
erster Art zum Einbringen der zumindest einen Probe und
- – zumindest
eine Öffnung
zweiter Art aufweist, durch die zumindest ein Flüssigkeitsbehälter bei festgehaltener
Probe in die Mikrowellenkammer reversibel einbringbar ist,
wobei
ein in die Mikrowellenkammer eingebrachter Flüssigkeitsbehälter zumindest
eine Probe umgibt.
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Durch
diese Lösung
gelingt die Verbindung einer Prozessierung von Proben in mehreren
Flüssigkeiten
mit der Möglichkeit,
ein homogenes und reproduzierbares Mikrowellenfeld zuzuschalten,
wodurch eine schnelle, vorzugsweise automatisierte, Probenprozessierung
mit wenigen Benutzereingriffen ermöglicht wird.
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Im
Gegensatz zu bekannten Mikrowellengeräten, die nur eine Öffnung besitzen,
durch die Flüssigkeiten
in die Reaktionskammer eingebracht werden können, sieht die Erfindung das
getrennte Einbringen von Probe und Prozessierflüssigkeit in die Mikrowellenkammer
vor. Somit können
Proben in der Kammer ortsfest platziert werden, die in den wechselnden
Flüssigkeiten
prozessiert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Wellenleiter als Mono-Mode-Wellenleiter ausgebildet, was die Homogenität und Reproduzierbarkeit zusätzlich verbessert.
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In
vorteilhafter Weise ist zumindest ein Verschlussmittel vorgesehen,
mittels dessen die zumindest eine Öffnung erster Art im Betrieb
der Vorrichtung mikrowellendicht abschließbar ist. Dadurch wird nicht
nur eine Kontamination der Umgebung mit Mikrowellenstrahlung vermieden,
es wird auch die Homogenität
und Stabilität
des Mikrowellenfelds im Hohlleiter deutlich verbessert. Dabei kann
das Verschlussmittel mit einer Haltevorrichtung für die Probe(n)
verbunden sein, wodurch sich eine eindeutige Positionierung der Proben
innerhalb des Wellenleiters ergibt und zugleich ausgeschlossen ist,
dass der Wellenleiter versehentlich unverschlossen bleibt.
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An
der Öffnung
zweiter Art kann günstiger Weise
ein Abschwächerrohr
vorgesehen sein, das den Austritt von Mikrowellenstrahlung verhindert,
sodass das Innere der Mikrowellenkammer ohne Deckel od.dgl. zugänglich ist
und der Transport des Flüssigkeitsbehälter in
die Kammer hinein und aus dieser heraus sich deutlich vereinfacht.
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Zur
Positionierung der Behälter
ist eine Behälteranordnung
mit einer Anzahl von Aufnahmeöffnungen
zum entnehmbaren Halten je eines Flüssigkeitsbehälters besonders
zweckmäßig, wobei
die Lage der Behälteranordnung
(z.B. stufenweise) zwischen Positionen verstellbar ist, bei denen
sich jeweils ein anderer Flüssigkeitsbehälter in
einer Entnahmeposition nächst
einer Öffnung
zweiter Art befindet, sowie eine Zuführvorrichtung, die dazu eingerichtet
ist, einen Flüssigkeitsbehälter aus
der Entnahmeposition zu entnehmen, in den Wellenleiter einzubringen
und zu späterem
Zeitpunkt in die Entnahmeposition zurück zu stellen. Die Behälteranordnung kann
mittels einer um eine Achse drehbare Drehtischvorrichtung sein,
auf der Aufnahmeöffnungen entlang
eines Kranzes positionierbar sind. Darüberhinaus ist es von Vorteil,
beispielsweise wenn mit flüchtigen
und/oder giftigen Flüssigkeiten
hantiert wird, wenn seitens der Behälteranordnung für zumindest
einen Teil der Aufnahmeöffnungen
je ein Deckel vorgesehen ist, mit denen in den Aufnahmeöffnungen
gehaltene Flüssigkeitsbehälter unabhängig von einander
verschließbar
sind. Eine Öffnungsvorrichtung
kann hierbei zum Öffnen
des Deckels des in der Entnahmeposition befindlichen Flüssigkeitsbehälters vorgesehen
sein.
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In
einer einfachen Geometrie können
die Öffnungen
erster Art und zweiter Art einander jeweils gegenüber liegen,
wobei die Öffnung
zweiter Art an der Unterseite des Wellenleiters angeordnet ist.
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Zur
Erhöhung
der Sicherheit, insbesondere wenn entzündliche Flüssigkeiten zum Einsatz kommen,
ist ein an der Mikrowellenkammer angebrachtes Absaugrohr günstig, über das
Gase in der Mikrowellenkammer abgesaugt werden können. Mittels eines zusätzlichen,
an der Mikrowellenkammer oder dem Absaugrohr vorgesehenen Gassensors
kann die Gaszusammensetzung in der Mirowellenkammer überwacht
werden; dadurch kann beim Überschreiten
eines Grenzwertes, beispielsweise der Konzentration einer bestimmten
Gaskomponente, die Mikrowellenimmission abgeschaltet werden. Weiters
kann ein an der Mikrowellenkammer vorgesehenen Temperatursensor,
insbesondere IR-Sensor, vorgesehen sein, um die Temperatur der in
der Mikrowellenkammer befindlichen Probe(n) zu überwachen.
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Zur
Steigerung der Prozesszuverlässigkeit ist
eine weitgehende Automatisierung der Vorrichtung günstig – insbesondere
wenn alle Bewegungsachsen motorisiert und die Bewegungen zentral
von einer Steuereinheit steuerbar sind. Dies kann durch eine Steuereinheit
zum zentralen Steuern der motorgestützten Bewegungen geleistet
werden, insbesondere des Einbringens und Herausbewegens der Flüssigkeitsbehälter in
den bzw. aus dem Wellenleiter. Die Steuereinheit kann auch zur Steuerung
der Intensität
der Mikrowellenemission eingerichtet sein und auf diese Weise die
Prozesstemperatur für
jeden Flüssigkeitsbehälter regulieren,
der in den Wellenleiter eingebracht ist. Außerdem kann durch eine permanente
Auf/Ab-Bewegung
mit kleiner Amplitude (d.h. innerhalb des Homogenitätsbereichs
des Mikrowellenfeldes im Wellenleiter) während der Mikrowelleneinwirkung
eine gute Durchmischung der Flüssigkeiten
und einen raschen Austausch der Flüssigkeitsrandschichten an der
Probe(n) erreicht werden. Zu diesem Zweck kann die Steuereinheit
dazu eingerichtet sein, eine wiederholte Auf/Ab-Bewegung der zumindest einen Probe dieser
Art während
der Mikrowelleneinwirkung zu steuern.
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Weitere
Beispiele für
Gestaltungsmöglichkeiten
des offenbarten Geräts,
sowie bevorzugte Ausführungsformen
sind nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben. Die Figuren
zeigen jeweils:
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1 eine
schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung in
einer Schnittansicht, bei der Gefäße mit verschiedenen Flüssigkeiten
aus einem drehbaren Karussell in den Hohlleiter gehoben werden,
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2 eine
Variante des Karussells mit einzeln geöffneten Gefäßen,
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3 eine
zweite Ausführungsform
der Erfindung mit horizontaler und vertikaler Bewegung der Gefäße, und
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4 eine
dritte Ausführungsform
der Erfindung mit einer Gasabsaugung an dem Hohlleiter.
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Die
hier gezeigten Ausführungsformen
sind als Beispiele zu verstehen und stellen keine Beschränkung der
Erfindung auf die vorgestellten Ausführungen dar.
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1 zeigt
ein erstes bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der Erfindung, eine Vorrichtung zur Mikrowellen-gestützten Präparation
von Proben, insbesondere biologischer Proben. Ein Hohlleiter 2 ist
als Mono-Mode-Leiter beispielsweise in Form eines Rechteckleiters
ausgebildet, in dem sich von einem Magnetron 1 erzeugte
Mikrowellen einer bestimmten Mode darin ausbreiten, wobei sich im
Wesentlichen eine stehende Welle mit im zeitlichen Mittel konstanter
Energieverteilung in dem Hohlleiter 2 ausbildet. Im Bereich
eines Maximums der Energieverteilung besitzt der Hohlleiter zwei
vertikal gegenüber
liegende Öffnungen 7a, 8a.
An diese Öffnungen
sind Rohre 7, 8 angesetzt, die Mikrowellenaustritt
verhindern. Das obere Rohr 7 ist zu diesem Zweck mit einem
Deckel 3 verschlossen, der derart ausgebildet ist, dass weder
durch ihn selbst noch durch den Spalt 3a zum Rohr 7 Mikrowellen
austreten können.
Das untere Rohr 8 ist als Abschwächungsrohr ausgebildet, das über seine
Länge eine
substantielle Abschwächung (z.B.
60 dB) bewirkt, so dass aus der (in der Figur nach unten weisenden) äußeren Öffnung des
Rohres 8 keine Mikrowellen in nennenswertem Umfang austreten
können.
Daher kann dieses Rohr auch während
des Mikrowellen-Betriebs geöffnet
bleiben und ermöglicht
somit auf einfache Weise die Einbringung von Gefäßen für einen automatisierten Prozess.
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In
den Deckel 3 ist ein Halteelement 4 eingesetzt,
durch das Körbchen 5 mit
biologischen Proben im Bereich des Hohlleiters gehalten werden,
wobei sowohl das Halteelement selbst als auch die Probenkörbchen aus
Mikrowellen-transparentem Material bestehen. Unterhalb des Rohres 8 ist
ein Karussell 11 angeordnet, durch dessen Drehung mehrere
Behälter 9 mit
Flüssigkeiten 10 unter
das Rohr 8 positionierbar sind. Die in je einem Flüssigkeitsbehälter befindliche
Flüssigkeit
kann z.B. je ein anderes Reagenz zur Prozessierung der Proben sein.
Die Karussellachse ist im Gerät
ortsfest gelagert, kann jedoch bei Bedarf als Ganzes dem Lager 12 entnommen werden;
in der auf dem Lager 12 montierten Position kann das Karussell 11 durch
einen Motor 13 bewegt (gedreht) werden. Ein Hebearm 14,
der aus Mikrowellen-transparentem Material besteht, kann über eine
mit Hilfe eines Motors 16 angetriebene Spindel 15 nach
oben bewegt werden und auf diese Weise das jeweils unter dem Rohr 8 positionierte
Gefäß in den
Hohlleiter einbringen. Neben Kunststoffen können bearbeitbare Keramiken
(z.B. Marcor®)
als Materialien für
den Hebearm 14 zum Einsatz kommen. In der obersten Position
des Hebearmes tauchen die Körbchen 5 mit
den Proben vollständig
in die Flüssigkeit 10 ein.
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Die
auf dem Karussell 11 befindlichen Gefäße 9 können unterschiedliche
Reagenzien 10 enthalten und können nacheinander oder in beliebiger
Reihenfolge in die Mikrowellenkammer gehoben werden, damit das in
die Mikrowellenkammer eingebrachter Gefäß (und somit die darin gehaltene
Flüssigkeit)
das Körbchen 5 umgibt.
Die Bewegungen werden durch eine Steuereinheit 17 gesteuert.
Die Steuereinheit 17 kontrolliert außerdem die Mikrowellenemission
und misst über
einen IR-Sensor 6 die Temperatur der Flüssigkeiten. Auf diese Weise
wird eine kontrollierte Erwärmung
der Proben und Reagenzien in der Kammer geregelt. Die Steuereinheit 17 kann
durch den Benutzer so programmiert werden, dass jedem Arbeitsschritt
eines der Reagenzien 10 und/oder eine spezifische Einwirkdauer
und Einwirktemperatur zugeordnet wird. Diese Programme werden durch
die Steuereinheit 17 automatisch abgearbeitet. Die Steuereinheit 17 kann
die Gefäße 9 wegen
der besonderen geometrischen Anordnung über den Hebearm 14 auch
während
der Mikrowelleneinwirkung bewegen. Dies wird vorteilhaft dazu ausgenützt um mit
Hilfe einer Auf/Ab-Bewegung mit geringem Hub einen permanenten Austausch
der mit den Proben in unmittelbarem Kontakt stehenden Flüssigkeitsrandschichten
zu erreichen. Dadurch kann eine verbesserte Homogenität und kürzere Zeitdauer
der Präparationsprozesse
erreicht werden.
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Die
Steuereinheit steuert wie bereits erwähnt die Leistung der Mikrowelle
während
jedes einzelnen Arbeitsschrittes; die Leistung kann von der Steuereinheit
auch so geregelt werden, dass eine vorgegebene Temperatur in dem
Flüssigkeitsgefäß 9 erreicht wird.
Bei Bedarf kann bei ausgewählten
oder allen Schritten anstelle jeweils konstant gehaltener bzw. (z.B.
im Falle der Regelung auf einen bestimmten Temperaturwert) stetiger
Leistung auch ein gepulster (d.h. intermittierender) Betrieb der
Mikrowelle eingesetzt werden. Zwischen den Einzelschritten wird
in der Regel die Mikrowellenleistung abgeschaltet.
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Bezugnehmend
auf 2 ist eine vorteilhafte Ausführungsform des Karussells 11 so
gestaltet, dass die im Karussell befindlichen Gefäße 9 durch Deckel 24 verschließbar sind.
Jeder Deckel 24 wird durch eine Feder 25 über eine
Zugstange 26 geschlossen gehalten. Zusätzlich kann am Deckel eine elastische
Auflage 27 angebracht sein, um einen guten Verschluss durch
den Deckel zu gewährleisten. Auf
diese Weise wird die Abdampfrate der Flüssigkeiten 10 minimiert
und sowohl die Füllmenge über längere Zeit
konstant gehalten als auch die Belastung der umgebenden Atmosphäre mit giftigen,
brennbaren oder korrosiven Dämpfen
stark reduziert. Vorteilhaft wird das Karussell in dieser Ausführungsform
in einen Karussell-Träger 28,
der mit dem Lager 12 drehbar verbunden und nicht entnehmbar
ist, und das die Deckel tragende eigentliche Karussell 11 getrennt.
Das Karussell 11 mit den geschlossenen Gefäßen 9 kann
dann durch den Benutzer vom Karussell-Träger 28 getrennt
und gefahrlos zu einem Abzug transportiert werden, wo die Gefäße 9 befüllt und entleert
werden.
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Wie
unmittelbar verständlich
ist, muss in der gezeigten Ausführungsform
der am Karussell 11 befindliche Deckel 24 geöffnet werden,
bevor ein Gefäß 9 durch
den Hebearm 14 zur Aufnahme des Probenkörbchen 5 bewegt werden kann.
Dies geschieht günstiger
Weise durch einen Stössel 29,
der durch einen Motor 30 z.B. über einen Exzenter betätigt wird (andere
Betätigungsweisen
wie z.B. über
eine Spindel oder eine andere geeignete mechanische Kopplung sind
natürlich
ebenso möglich).
Die Bewegungen des Motors 30 werden ebenfalls durch die
Steuereinheit 17 kontrolliert, so dass in einer koordinierten Bewegungsabfolge
das Gefäß 9 mittels
Karussell 11 positioniert wird, dann der Deckel 24 geöffnet wird und
anschließend
das Gefäß 9 mit
Hilfe des Hebearms 14 in die Kammer transportiert wird.
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3 zeigt
die schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung, bei
der das Karussell 311 nicht unmittelbar unter dem Rohr 8 positioniert
ist. Vielmehr werden die aus dem mit dem Hebearm 314 aus
dem Karussell 311 entnommenen Gefäße 9 über einen
weiteren Transportmechanismus 318 – zum Beispiel mit einer Spindel 319a – unter
das Rohr 8 transferiert. Der Transportmechanismus 318 ist
durch einen Motor 319 betrieben, der durch die Steuereinheit 17 kontrolliert
wird. Das vertikale Anheben des Hebearms erfolgt über eine
mit Hilfe eines Motors 316 angetriebene Spindel 315 in der 1 entsprechender
Weise.
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4 zeigt
die schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform der Erfindung, die
von der ersten Ausführungsform
abgeleitet ist, jedoch auch mit der zweiten Ausführungsform kombiniert werden
kann. Anstelle des oberen Rohres 7 der ersten Ausführungsform
ist die oberen Öffnung 7a durch ein
Rohr 47 mit einer Öffnung
abgeschlossen, an der wiederum ein weiteres Rohr 40 angebracht
ist. Durch das Rohr 40 können in der Mikrowellenkammer
entstehende Dämpfe
mit Hilfe eines Lüfters 41 abgesaugt
und über
einen Schlauch 42 einem Abluftsystem zugeführt werden.
Die Kombination der Rohre 47, 40 mit dem Deckel 43 ist
ebenfalls wieder so ausgeführt,
dass der Austritt von Mikrowellen durch exponentielle Abschwächung verhindert
wird; gegebenenfalls muss ein geometrisch angepasstes Haltemittel 44 verwendet
werden. In dieser Ausführungsform
kann zusätzlich
ein Gassensor 46 eingesetzt werden, der die Atmosphäre in der
Kammer überwacht
und bei Überschreiten
eines Grenzwertes zum Abschalten der Mikrowellenemission führt.