DE102007036128A1

DE102007036128A1 - Antibiotische Peptide

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Publication number: DE102007036128A1
Application number: DE102007036128A
Authority: DE
Inventors: Ralf Prof.Dr. Hoffamnn; Patricia Dipl.-Chem. Czihal
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2007-07-23
Publication date: 2009-02-12
Also published as: AU2008280151A1; ES2429108T3; CA2694461A1; CA2694461C; AU2008280151B8; RU2472805C2; US9060513B2; AU2008280151B2; EP2518080B1; JP5688290B2; WO2009013262A1; US20100222268A1; EP2518080A2; EP2170928A1; JP2010534066A; EP2518080A3; RU2010106192A; CN101801995B; US20150315241A1; BRPI0814587A2

Abstract

Diese Erfindung betrifft neuartige antibiotische Peptide insbesondere für die Verwendung in der Medizin. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen und Methoden zum Abtöten von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, und Methoden zur Behandlung mikrobieller Infektionen und eine Methode für das Wirkstoff-Screening. Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate haben folgende allgemeine Formel: Sub1 - X1 N X2 X3 P V Y I P X4 X5 R P P H P - Sub2, wobei X1 einen neutralen oder positiv-geladenen Rest, X2 einen polaren oder positiv-geladenen Rest, X3 einen positiv-geladenen Rest, X4 einen polaren oder positiv-geladenen Rest, X5 ein Prolin oder ein Prolinderivat, Sub1 die freie oder eine modifizierte N-terminale Aminogruppe und Sub2 die freie oder eine modifizierte C-terminale Carboxylgruppe darstellt. Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate besitzen mindestens einen der folgenden Vorteile im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Apidaecinpeptiden: (i) eine höhere Halbwertszeit im Säugetierserum durch eine höhere Proteaseresistenz, (ii) eine gesteigerte antimikrobielle Aktivität gegen einen oder mehrere Bakterienstämme, speziell humane Pathogene, oder Pilze oder andere mikrobielle Infektionen und (iii) sind nicht toxisch für humane Zellen, einschließlich Erythrozyten.

Description

Diese Erfindung betrifft neuartige antibiotische Peptide insbesondere für die Verwendung in der Medizin.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen und Methoden zum Abtöten von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, und Methoden zur Behandlung mikrobieller Infektionen. Die Erfindung beinhaltet weiterhin eine Methode für das Wirkstoff-Screnning.
Das Auftreten ernsthafter Bakterien- und Pilzinfektionen ist ein steigendes Problem trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Antibiotikatherapie. Jedes Jahr gibt es mehr als 40 Millionen Krankenhausaufenthalte in den Vereinigten Staaten von Amerika und mehr als 2 Millionen dieser Patienten infizieren sich im Krankenhaus In 50–60% dieser Fälle sind Antibiotika resistente Bakterien involviert [1]. Diese im Krankenhaus erworbenen Krankheiten (ihren zu schätzungsweise 60.000–70.000 Todesfällen in den USA und bis zu 10.000 Todesfällen in Deutschland [2]. Während resistente Gram-negative Bakterien in den 70iger Jahren ein Hauptproblem darstellten, konnte im letzten Jahrzehnt ein Anstieg der Fälle beobachtet werden, in denen Gram-positive Bakterien, die gegenüber mehreren Antibiotika resistent sind, eine Rolle spielen [3]. Das derzeitige rasante Auftreten resistenter Stämme betrifft sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Pathogene [4]. Hierbei entwickelten sich Resistenzen zuerst in Arten, in denen Einfachmutationen genügten um klinisch wichtige Level zu erreichen z. B. Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa; es folgten Bakterien, in denen multiple Mutationen notwendig waren, wie z. B. E. coli und Neisseria gonorrhoeae. Dies wird hauptsächlich durch den häufigen Einsatz von Fluoroquiologen-Antibitika verursacht [5]. Ein weiterer wichtiger Grund für die Resistenz Gram-negativer Bakterien ist das große Spektrum an Laktamasen in Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae [6]. Nahezu die Hälfte der klinisch relavanten Stämme von Haemophilus ducreyi, der Verursacher von Ulcus molle, trägt Gene, die diesem Bakterium die Resistenz gegen Amoxicillin, Ampicillin und gegen eine Reihe anderer β-Laktame verleihen [7]. Gleichermaßen stieg die Resistenz von Salmonella enterica serovar Typhimurium gegenüber Tetrazyklinen von Null Prozent im Jahr 1948 auf 98% im Jahr 1998 [8].
Dies verdeutlicht die Notwendigkeit der weiteren Suche nach neuen Antibiotika. Induzierbare antibakterielle Peptide repräsentieren ein Forschungsfeld, in dem die heutige Biochemie, Immunologie und Wirkstoffforschung zusammentreffen. Peptidantibiotika, mit einer Größe von 13 bis zu mehr als hundert Aminosäuren, wurden aus Pflanzen, Tieren und Mikroben isoliert [9]. Ein einzelnes Tier besitzt ca. 6–10 Peptidantibiotika, wobei jedes Peptid oft ein komplett anderes Aktivitätsspektrum zeigt [10]. Es ist bekannt, dass die überwältigende Anzahl an antibakteriellen Peptiden einschließlich den gut untersuchten Defensinen, Cecropinen und Magaininen, durch einen "lytischen/ionischen" Mechanismus wirken. Die gemeinsame Vorstellung von allen "lytischen" Peptiden ist ein permeabilisierender Effekt auf die bakterielle Zytoplasmamembran [11, 12, 13]. Eine kationische, amphipathische Struktur, die die Bildung von hydrophilen Ionen-(Protonen-)Kanälen in einer Lipiddoppelschicht erlaubt, ist Grundlage dieser Aktivität. Durch das Austreten von Protonen wird das Membranpotential zerstört und so der Zelltod verursacht, da dieses für viele grundlegende Lebensprozesse notwendig ist. Da die Störung der Membran durch diese Peptide nicht abhängig von der Erkennung chiraler Moleküle ist, wird ein Aminosäureaustausch, der die generelle amphipathische Struktur oder basische Nettoladung nicht aufhebt, funktionell toleriert [14,15]. Peptide, die direkt auf die Bakterienmembran wirken, haben oft in höheren Konzentrationen toxische Effekte auf Säugetiermembranen, was ihre Eignung als zukünftiges Arzneimittel einschränkt. Wird Prolin in die Sequenz der α-helikalen antimikrobiellen Peptide eingefügt, so sinkt, in Abhängigkeit von der Anzahl der Prolin-Reste, die Fähigkeit der Peptide die Cytoplasmamembran von E. coli zu permeabilisieren. Bei dieser Betrachtung ist es verblüffend, dass einige der aktivsten, nativen antibakteriellen Peptide, zumindest in Bezug auf einige Gram-negative Pathogene, zu der Familie der Prolin-reichen Peptide gehören [16].
Solche Nebeneffekte könnten durch andere antimikrobielle Peptide überwunden werden, die ein spezifisches bakterielles Protein oder andere intra oder extrazelluläre Komponenten erkennen, ohne eine Kreuzreaktivität mit Säugetieranaloga zu zeigen. Dies scheint auf Prolinreiche antimikrobielle Peptide, einschließlich Apidaecine, die ursprünglich aus Insekten isoliert wurden, zuzutreffen. Mit der enormen Variation in der Größe und in den biochemischen Eigenschaften, ist es nicht überraschend, dass die Struktur-Wirkungs- und Konformations-Wirkungs-Beziehungen der Fokus der antibakteriellen Peptidforschung ist. Eine komplette Untersuchung des natürlichen, antibakteriellen Peptidrepertoires auf die biologische Stärke ist nicht nur wichtig für generelle biochemische Fragestellungen, sondern ist auch für die pharmazeutische Industrie von anhaltendem Interesse. Trotz der Probleme mit in vitro-Tests von Peptid-basierenden Antibiotika, haben einige natürliche, kationische antibakterielle Peptide schon die klinische Testphase erreicht [17]. Während einige dieser Peptide als topische (örtlich) Mittel in der frühen klinischen Testphase Wirkung zeigten, waren andere in der systemischen Therapie aktiv. Zum Beispiel hat das kationische Protein rBPI 21, das zur parentalen Behandlung von Meningococcaemia eingesetzt wird, kürzlich die dritte Phase der klinischen Prüfung abgeschlossen [17].
Apidaecin, das ursprünglich aus Honigbienen isoliert wurde, gehört zu der Familie der Prolinreichen Peptide und zeigt Ähnlichkeit mit den Sequenzen von Pyrrhocoricin, Drosocin und Formaecin (Tabelle 1) [18]. Die Apidaecine sind 18–20 Aminosäurereste lange Peptide, die nur unmodifizierte L-Aminosäuren mit einem hoch konservierten PRPPHPRI/L C-Terminus und einem relativ hohen Gehalt an Prolin (33%) enthalten. Diese Peptide können einfach mit der Fmoc/^tBu-Strategie an der Festphase synthetisiert werden. Die Peptide inhibieren die Lebensfähigkeit vieler Gram-negativer Bakterien in nanomolarer Dosierung, während Grampositive Bakterien unberührt bleiben. Die tödliche Wirkung tritt nahezu sofort ein und es wurde gezeigt, dass diese unabhängig vom konventionellen "lytischen" Mechanismus ist [19]. Zusätzlich sind Apidaecin-resistente Mutanten oft unvermindert sensitiv gegenüber "Porenformenden" Peptiden. Das D-Enantiomer zeigt keinerlei antibakterielle Wirkung. Das derzeitige Modell ist, dass die stereoselektive Erkennung eines chiralen Zielproteins die Grundlage der antagonistischen Effekte des Apidaecins auf Bakterien darstellt [19]. Die Prolin-reichen Peptide, einschließlich Apidaecin als Mitglied dieser Familie, töten Bakterien nicht nur durch Permeabilisierung ihrer Membran, sondern binden an ein stereospezifisches Zielprotein, welches bis jetzt noch nicht für Apidaecin identifiziert wurde, wobei dies letztendlich zum Zelltod führt. Zudem scheinen Prolin-reiche Peptide, im starken Gegensatz zu AMPs mit definierter Sekundärstruktur wie Mellitin oder Gramicidins, in-vitro nicht toxisch auf eukariotische Zellen zu wirken und sind nicht hämolytisch aktiv. In Säugetierserum wird Apidaecin innerhalb einer Stunde komplett abgebaut. Dabei werden die N- und C-Termini vermutlich durch Amino- und Carboxypeptidasen abgespalten. Ein Abbau erfolgt auch durch Endoproteasen oder alle diese Enzyme. Die zuvor erwähnten Metaboliten verlieren die antimikrobiellen Aktivität mit MHK Werte typischer Weise über 125 μg/mL.
Tabelle 1: Vergleich der Sequenzen von Apidaecin 1a oder 1b (Apis mellifera) [18], Drosocin (Drosphila melanogaster) [20], Formaecin 1 (Myrmecia gulosa) [21] und Pyrrhocoricin (Pyrrhocoris apterus) [22].
Nach wie vor besteht ein Bedarf an neuen antibakteriellen und antimykotischen Verbindungen, neuen antibakteriellen und antimykotischen pharmazeutischen Zusammensetzungen, sowie Methoden, welche diese verwenden, sowie Verbindungen, welche für das Wirkstoff-Screnning genutzt werden können, um neue pharmazeutische Antibiotika zu detektieren.
Eine Aufgabe ist es neue antibiotische Peptide zur Verfügung zu stellen, vorzugsweise mit gesteigerter Stabilität. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine Methode für das Wirkstoff-Screenings zur Verfügung zu stellen.
Die erste Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate mit mindestens 16 Aminosäureresten und der generellen Formel:
gelöst, wobei
X₁ ein neutraler Rest oder ein Rest ist, der eine positive Ladung aufweist oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt, wobei auch nach der Modifizierung mit Sub₁ eine positive Ladung erhalten bleibt. Bevorzugte Reste X₁ sind aus der Gruppe mit neutralen Resten (wie cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin, 3,5-Dinitrotyrosin) oder aus der Gruppe mit positiv geladenen Resten ausgewählt, die Arginin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β- Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Lysin, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin, p-Aminobenzoesäure, und 3-Aminotyrosin enthält;
X₂ ist ein Rest mit einer polaren Seitenkette (wie z. B. Serin, Citrullin oder Glutamin) oder ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette (wie z. B. Lysin oder Arginin, Ornithin oder Homoarginin). Bevorzugte Reste X₂ sind aus der Gruppe ausgewählt, die Serin, Threonin, Citrullin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin, 3,5-Dinitrotyrosin sowie Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithine, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin, p-Aminobenzonsäure und 3-Aminotyrosin enthält;
X₃ ist ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette. Die bevorzugten Reste X₃ sind aus der Gruppe ausgewählt, die Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, p-Aminobenzoesäure, 3-Methylhistidin und 3-Aminotyrosin enthält;
X₄ ist ein neutraler Rest mit einer polaren Seitenkette, beispielsweise Asparagin oder Citrullin, oder ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder ein Rest mit einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette. Die bevorzugten Rest X₄ sind aus den Gruppen ausgewählt, die Asparagin, Homoglutamin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin und 3,5-Dinitrotyrosin sowie Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, p-Aminobenzoesäure, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin und 3-Aminotyrosin enthalten;
X₅ ist Prolin oder ein Prolinderivat, wie cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin oder Pseudoprolin;
Sub₁ stellt die freie N-terminale Aminogruppe der Aminosäure X₁ oder eine Modifikation der N-terminalen Aminogruppe (welche die N-terminale Aminogruppe der Aminosäure X₁ durch Sub₁ ersetzt) mit der generellen Formel NR₁R₂, dar. Sub₁ = NR₁R₂, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander bevorzugt aus Wasserstoff oder aus folgenden Gruppen ausgewählt sind:

(i) einer geradkettigen, verzweigten, zyklischen oder heterozyklischen Alkylgruppe, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl oder Cyclohexyl;
(ii) einer geradkettigen, verzweigten, zyklischen oder heterozyklischen Alkanoylgruppe, wie z. B. Acetyl oder Methanoyl (Formyl), Propionyl, n-Butyryl, Isobutyryl, Pentanoyl, Hexanoyl oder Cyclohexanoyl;
(iii) einer Reportergruppe, wie z. B. Fluorescein, Alexa488 oder Biotin;
(iv) einem Linker, der zusammen mit COR₃ (siehe unten) den N- und C-Terminus verbrückt, um ein zyklisches Peptid zu erhalten, z. B. basierend auf Guanidin, Ethyleneglycololigomere, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin oder Isodesmosine.

₂

₃

₆

₃

₇

₃

₆

₇

₃

COR₃ ist vorzugsweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt:

(i) Carboxyl (R₃ ist eine freie Hydroxylgruppe), ein Ester (R₃ ist eine Alkoxygruppe), ein Amid (R₃ ist ein Amin) oder ein Imid;
(ii) ein Linker, der zusammen mit Sub₁, die N- und C-Termini zu einem zyklischen Peptid verbrückt;
(iii) COR₃ _, worin R₃ entweder ein zusätzlicher Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe die Pro, Ile, Leu, Arg und Val enthält, ausgewählt ist, oder worin R₃ ein Peptid, mit bevorzugt zwei bis drei Aminosäuren ist, wovon mindestens eine Aminosäure aus der Gruppe, die Pro, Ile, Leu, Arg oder Val enthält, ausgewählt ist, wobei diese mit einem Mitglied aus der Gruppe mit Carboxyl (R₃ ist eine freie Hydroxylgruppe), einem Ester (R₃ ist ein Alkohol, wie Methanol, Ethanol, Propanol, iso-Prpoanol oder Butanol), einem Amid (R₃ ist ein Amid) oder ein Imid (R₃ ist ein Alkylamin oder Dialkylamin, wie Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin oder Zyklohexylamin) substituiert ist.
(iv) COR₃ worin R₃ eine zusätzliche, verzweigte Aminosäure ist, um eine Dimer- oder Oligomerstruktur auszubilden, wie beispielsweise Lysin, Hydroxylysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin, Isodesmosin oder eine Kombination aus diesen verzweigten Aminosäuren.

Auf diesem Weg können C-terminale Peptidderivate als Ester (R₃ = Alkoxy), Amid (R₃ = Amid) oder Imid oder ein Peptid, das um weitere Aminosäuren verlängert wurde, die aus der Gruppe, die Pro, Ile, Arg und Val enthält, ausgewählt wurden und ebenfalls wieder am C-Terminus als Ester, Amid oder Imid, modifiziert sind. Weitere Peptidderivate können durch Modifikationen der N-terminalen oder C-terminalen Enden der Peptide gebildet werden. Diese Änderungen können beispielsweise eine zusätzliche Alkyl- oder Alkanoylgruppe (entweder mit einer geraden Kette oder verzweigt, zyklisch oder heterozyklisch) oder eine zusätzliche Guanidinogruppe oder ein zusätzliches Makromolekül oder ein Reporterrest sein, der entweder permanent oder durch eine Verbindung, die unter bestimmten Bedingungen spaltbar ist (wie Disulfidbrücken oder säurelabile Linker), verknüpft ist.
Alle natürlichen Aminosäuren, unnatürlichen Aminosäuren oder Aminosäurederivate (wie z. B. Iminosäuren), welche die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate bilden, können entweder in der L- oder D-Konformation vorliegen.
X₆ und X₇ sind optional zusätzliche Reste. In dem Fall, dass X₆ und X₇ abwesend sind, hat das letzte Prolin (P) in der oben erwähnten Sequenz eine freie C-terminale Carboxylgruppe oder ist mit Sub₂ verbunden.
In dem Fall, in dem mindestens ein Rest X₆ und X₇ vorhanden ist, hat das Peptid beispielsweise eine der folgenden allgemeinen Formeln:
X₆ ist aus Prolin, Prolinderivaten oder einem Rest mit einer positiven Nettoladung oder mit einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette ausgewählt. Bevorzugte Reste X₆ sind aus den Gruppen ausgewählt, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin, Pseudoprolin ebenso wie Arginin, vorzugsweise D-Arginin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Lysin, Arginin, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin oder 3-Aminotyrosin enthalten.
X₇ ist aus Prolin, Prolinderivaten, einen polaren Rest (wie Serin) oder einen hydrophoben Rest ausgewählt. Bevorzugte Reste X₇ sind aus den Gruppen ausgewählt, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin oder Pseudoprolin, Serin, Threonin, 6-Hydroxylysin, Citrullin, Homoserin oder allo-Threonin ebenso Phenylalanin, N-Methylleucin, Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin, tert.-Butylglycin, Cyclohexylalanin, Alanin, β-Alanin, 1-Aminocylcohexylcarbonsäure, N-Methylisoleucin, Norleucin, Norvalin, N-Methylvalin enthält oder es ist eine kurze Peptidsequenz mit vorzugsweise einem bis drei Resten, die bevorzugt ausgewählt sind aus Prolin, Isoleucin oder einem der zuvor erwähnten Reste, oder es ist ein verzweigter Linker, der mehrere Peptideinheiten enthält, wie z. B. Lysin, Hydroxylysin, Omithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin, Isodesmosin.
Die C-terminale Aminosäure ist zum Beispiel das letzte Prolin (P) in der Formel 1, X₆ (in Formel 3) oder X₇ (in Formel 2 und 4).
Die natürlichen Sequenzen des unmodifizierten Apidaecins 1a und 1b gemäß SEQ ID Nr. 1 (GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH) und SEQ ID Nr. 2 (GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH), in denen OH für eine freie Carboxylgruppe am C-Terminus (Sub₁ = NH₂ und Sub₂ = RI-OH oder RL-OH, R3 = -OH) steht, sind nicht Bestandteil der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate besitzen mindestens einen der folgenden Vorteile im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Apidaecinpeptiden:

(i) eine höhere Halbwertszeit in Säugetierserum durch eine höhere Proteaseresistenz und
(ii) eine gesteigerte antimikrobielle Aktivität gegen einen oder mehrere Bakterienstämme, speziell humane Pathogene, oder Pilze oder andere mikrobielle Infektionen und
(iii) die Peptide sind nicht toxisch für humane Zellen, einschließlich Erythrozyten.

Beispiele der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate haben die Sequenzen der SEQ ID Nr. 3 bis 121 (siehe auch Tabelle 2 im Beispiel 1).
Die erfindungsgemäßen Peptide und/oder multimeren Peptidkonstrukte, die modifiziert wurden, um die antimikrobielle oder antimykotische Aktivität zu steigern und das Aktivitätsspektrum auf andere Bakterien oder Pilze zu erweitern und die Stabilität gegen Proteasen und Peptidasen zu verbessern, zeichnen sich durch ihre hohe antibakterielle und/oder antimykotische Wirksamkeit und durch eine gute metabolische Stabilität in Säugetierserum aus.
Geeignete Modifikationen in den Positionen 3 (X₂), 4 (X₃) und 10 (X₄) verbessern die antibakterielle Aktivität der Wildtyp-Apidaecin-Sequenz gegen verschiedene Bakterien, wie weiter unten diskutiert und in den Beispielen gezeigt wird. Die ersten Positionen (Sub₁, X₁, X₂ und X₃) sind voraussichtlich verantwortlich für einen besseren Transport durch die Membran in die Zelle, wohingegen Position 10 (X₄) auch zur Inhibierung des intrazellulären Zielproteins (Taget) beitragen kann. Weiterhin kann der Rest X₂ die N-terminale Peptidsequenz gegen Abbau zusätzlich stabilisieren und so die Halbwertszeit in Serum erhöhen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Beispiele sind Sequenzen mit einem positiv geladenen Rest X₄ (Position 10), wie z. B. die Sequenzen, die aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 9 bis 18, 20 bis 25, 27 bis 31, 34 bis 40, 45 bis 49, 55 bis 56, 64–69, 81–83, 86–91, 97–100, 102–104, 112, 113, 117, 119 ausgewählt sind. Weniger bevorzugte Sequenzen sind Sequenzen mit einem Glutamin an X₄ (Position 10).
Bevorzugte erfindungsgemäße Beispiele, sind Sequenzen mit einem polaren Rest X₂ (Position 3), wie z. B. die Sequenzen, die aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 96, 97 und 101 ausgewählt sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Beispiele sind Sequenzen mit einem positiv geladenen Rest X₃ (Position 4), wie z. B. die Sequenzen, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 10, 68, 95, 97 und 100.
Des Weiteren sind die freie N-terminale Aminogruppe und die C-terminale Carboxygruppe vorzugsweise modifiziert. Denn diese Termini sind anfällig für einen Peptidase- und Proteaseabbau in Serum, Körperflüssigkeiten im Allgemeinen, Gewebe, Organen oder Zellen, was sich kritisch auf die antibiotische Aktivität der Peptide, Peptidderivate und Multimere auswirkt. Eine Steigerung der Proteaseresistenz erhöht die Halbwertszeit der Peptide in Serum.
Zusätzlich erlauben die Modifikationen der Termini das Koppeln der Peptide an andere Gruppen, wie zum Beispiel andere Aminosäuresequenzen (dabei werden eventuell multimere Peptide oder Proteine geschaffen) oder andere Biomoleküle, welche die Funktion eines Carriers oder Labels haben. In einer speziellen Ausführungsform fungiert das Carriermolekül als Target-Molekül, welches in der Lage ist die bakterielle Infektion zu lokalisieren und an das Bakterium zu binden – dadurch wird die antibiotische Substanz in die Nähe der (Bakterien-)Zelle gebracht, um diese bekämpfen oder die Substanz durch die Bakterienmembran in die Bakterienzelle zu bringen. Solche Target-Moleküle sind z. B. Moleküle, die bekanntermaßen an Lipopolysaccharid(LPS)-Moleküle binden, welche die Außenseite der Gram-negativen Bakterien bilden. Bekannte Verbindungen für diese Anwendung sind beispielsweise Ankerpeptide, wie das AcmA-Motif aus Lactobacillus oder ein gegen Lipopolysaccharid gerichteter Antikörper. Die letztere Variante ist bevorzugt, da sie auch einen intrinsischen antibiotischen Effekt hat und deshalb zur Steigerung der Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide genutzt werden kann.
Es ist sehr vorteilhaft, wenn die N-terminale Aminosäure, d. h. Sub₁-X₁, ein Rest aufweist, der unter physiologischen Bedingungen, d. h. im menschlichen Körper positiv geladen ist. Unter physiologischen Verhältnissen sind dabei ein pH-Wert von 6–8 und eine Temperatur von 30–40°C zu verstehen. Diese positive Ladung, entweder an Sub₁ oder an X₁ in den Peptiden oder Peptidderivaten, ist höchstwahrscheinlich notwendig für die antibakterielle Funktion.
Ein Beispiel um die N-terminale Stabilisierung gegen proteolytischen Abbau zu erreichen, ist die Acylierung (Sub₁ = Acyl-NH-), wie z. B. Acetylierung (Sub₁ = Acetyl-NH-), der α-Aminogruppe einer positiv geladenen Aminosäure, wie Ornithin oder Lysin (Sub₁-X₁ = Acyl-Orn oder Acyl-Lys). Diese Acylierung (vorzugsweise Acetylierung) lässt die positive Ladung in der Seitenkette der Aminosäure intakt.
Weitere bevorzugte Beispiele der Erfindung sind Sequenzen mit positiv geladenen Resten an X₁ und X₄ (Position 1 und 10), wie z. B. die Sequenzen aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 12, 13, 16, 18, 21 bis 24, 27 bis 30, 35 bis 40, 64, 65, 66, 81–83, 86–88, 112, 113, 117 und 119 ausgewählt sind.
Weitere bevorzugte Beispiele der Erfindung sind Sequenzen mit Prolin, einem Prolinderivat oder einem positiv geladenen Rest an X₆ (Position 17), wie z. B. die Sequenzen ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 10, 23, 24, 27, 28, 70, 109–113 und 121.
Andere bevorzugte Beispiele der Erfindung sind die Sequenzen mit Prolin, einem Prolinderivat, einem polaren Rest oder einem hydrophoben Rest als X₇ (Position 18) wie z. B. die Sequenzen, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 10, 24, 27–37, 42, 44, 46, 47, 68–77, 83, 93, 94, 96, 107–110, 114 und 115.
Die am meisten bevorzugten Beispiele sind Peptide. die eine positiv geladene Aminosäure in Position 1 (X₁) oder in Position 10 (X₄) (wie Ornithin, Arginin oder Lysin) und einen modifizierten C-Terminus aufweisen, insbesondere die Peptide gemäß SEQ ID Nr. 7–8, 11–13, 20, 21, 22, 25, 38–40, 45 und 65 bis 67.
Ein besonders bevorzugtes Peptid enthält Ornithin in Position 1 (Rest X₁), Arginin in Position 10 (Rest X₄) und Hydroxyprolin in Position 11 (Rest X₅), einen acetylierten N-Terminus und ein C-terminales Amid, wie z. B. SEQ ID Nr. 40.
An Hand der Beispiele sieht man, dass eine kleine Modifikation des C-Terminus zu einem Amid (Sub = -NH₂) die Inhibitoreffekte gegen E. coli und S. typhi signifikant erhöht. Bevorzugte Sequenzen mit einem Amid am C-Terminus sind die SEQ ID Nr. 4, 6, 7, 8, 14, 20, 38 und 39.
Ebenso bevorzugt sind Modifikationen, die den C-terminalen Abbau reduzieren, wie z. B. Methyl, Amid und Prolin an (den) Position(en) 17 (X₆) und/oder 18 (X₇) und/oder am C-Terminus (Sub₂). Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass offenbar die Aminosäuren an Position 17 und 18 ebenfalls sehr wichtig für die antibiotische Wirkung sind. Denn der Austausch einzelner Aminosäuren an diesen Positionen durch Alanin beseitigt die Effektivität im Vergleich zu der antibiotischen Aktivität des Wildtyp-Apidaecins.
Die am meisten bevorzugten Beispiele der Erfindung sind Peptide, welche die folgenden Vorteile erfüllen:

(i) eine gesteigerte Halbwertszeit in Säugetierserum durch eine höhere Proteaseresistenz und
(ii) eine gesteigerte antimikrobielle Aktivität gegen einen oder mehrere Bakterienstämme, besonders humane Pathogene, oder Pilze oder andere mikrobielle Infektionen und
(iii) die Peptide sind nicht toxisch gegenüber humanen Zellen, einschließlich Erythrozyten.

Die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden ist sehr komplex, da sie die Zellmembran durchdringen und in das Zytoplasma eindringen müssen, um ein spezielles intrazelluläres bakterielles Zielmolekül zu inhibieren, ohne jedoch auf Säugetierzellen und Blutzellen toxisch zu wirken. Ein anderer wichtiger Punkt ist die Stabilität der Peptide oder Peptidderivate gegenüber dem Abbau durch Peptidasen oder Proteasen. Daher hat das ideale Peptid eine hohe antibakterielle Aktivität (kleine MHK-Werte), keine Zelltoxizität, keine hämolytische Aktivität und eine Halbwertszeit von mehreren Stunden in Blut. Im Vergleich zu den nativen Apidaecinsequenzen zeigen die besten erfindungsgemäßen Peptidderivate eine mehr als zehnfach höhere antimikrobielle Aktivität. Dies wurde teilweise durch die Amidierung des C-Terminus und durch den Austausch von Gln an Position 10 (X₄) durch einen basischen Rest, bevorzugt Arginin oder Omithin, erreicht. Da die Halbwertszeit dieser Peptide in Serum relativ kurz ist, ist der N-Terminus vorzugsweise modifiziert (Formylierung, Acetylierung und Guanidierung) um den Abbau durch Aminopeptidasen oder Aminoproteasen zu reduzieren. Am N-Terminus ist eine positive Ladung bevorzugt, um eine gute Aktivität zu erreichen. Das Glycin in Position 1 (X₁) der nativen Apidaecinsequenz ist vorzugsweise durch einen basischen Rest wie Arginin, Lysin oder Omithin ersetzt. Besonders bevorzugt ist dabei Omithin, da seine C-terminale Peptidbindung nicht durch Trypsin oder ähnliche Enzyme gespalten wird. Aus demselben Grund wird Arg-17 (X₆) der nativen Apidaecinsequenz vorzugsweise substituiert, um die Spaltung der Peptidbindung zwischen Arg-17 (X₆) und Leu/Ile-18 (X₇) durch Endoproteasen zu reduzieren. Beispiele sind der Austausch von Arg-17 (X₆) durch Omithin oder die N-Methylierung von Leu-18 (X₇), die beide die Serumstabilität mehr als 24-fach erhöhen, nämlich von 15 min auf mehr als 360 min Halbwertszeit. Obwohl keines der Peptide toxisch auf COS-7 Zellen oder rote Blutzellen wirkt, hat der Austausch von Pro-11 (X₅) gegen trans-4-Hyp das Potential mögliche Nebenreaktionen weiter zu reduzieren. Denn polare Austausche reduzieren die Tendenz der Peptide oder Peptidderivate an Säugetierzellmembranen zu binden, ohne dabei die antibakterielle Aktivität herabzusetzen.
Der Ausdruck „Peptid", wie hier verwendet, steht für eine Sequenz von Aminosäuren, die über eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die Aminosäuren bevorzugt aus den zwanzig natürlich vorkommenden Peptid-bildenden Aminosäuren ausgewählt sind und worin die Aminosäuren in der L-Konfiguration oder D-Konfiguration, oder im Fall von Isoleucin und Threonin auch in der D-allo-Konfiguration vorliegen können (nur Inversion an einem der chiralen Zentren).
Der in der Erfindung verwendete Ausdruck Peptidderivat (oder Peptidomimetika) beinhaltet nicht nur Peptide, die am N- oder C-Terminus, wie oben beschrieben, mit Sub₁ und Sub₂ modifiziert sind. Er umfasst zudem Peptide, die durch Substitutionen und/oder Modifikationen von einem oder mehreren Aminosäureresten durch chemische Gruppen verändert wurden, wobei diese chemischen Gruppen andere als die natürlichen Protein-bildenden Aminosäurereste sind, wie z. B. nicht-proteinogene α-Aminosäuren, β-Aminosäuren oder Peptide mit verändertem Rückgrat. Der Begriff „verändertes Rückgrat" bedeutet, dass mindestens eine Peptidbindung ersetzt ist, beispielsweise durch eine nicht spaltbare Bindung, wie eine reduzierte Peptidbindung, eine alkylierte Amidbindung oder eine Thioamidbindung.
Außerdem sind Gruppen geeignet, die eine kovalente Bindung sowohl mit der COOH-Gruppe des vorangegangenen Aminosäurerestes als auch der NH₂-Gruppe des folgenden Aminosäurerestes bilden können, und die daher nicht notwendigerweise die Peptidrückgrat-Struktur aufrecht erhalten, wie Zuckeraminosäure-Dipeptid-Isostere, Azapeptide, 6-Homopolymere, y-Peptide, Y-Lactam-Analoga, Oligo(phenylenethylen)e, vinyloge Sulfonpeptide, poly-N-substituierte Glycine oder Oligocarbamate. Diese Modifikationen sind an Positionen bevorzugt, die anfällig für enzymatischen Abbau sind, besonders an den drei N-terminalen Resten (Positionen 1 bis 3, -X₁-N-X₂) und den zwei C-terminalen Resten (nach Position 16 – X₆-X₇). Daher ist vorzugsweise mindestens eine der Bindungen zwischen X₁-N (z. B. Gly-Asn), N-X₂ (z. B. Asn-Asn), X₂-X₃ (z. B. Asn-Arg), X₆-X₇ (z. B. Arg-Leu oder Arg-Ile) eine nicht spaltbare Bindung. Diese nicht spaltbare Bindung ist vorzugsweise aus der Gruppe der reduzierten Amidbindungen, alkylierten Amidbindungen oder Thioamidbindungen ausgewählt.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate können linear sein, d. h. eine Sequenz, in der die erste und die letzte Aminosäure der Sequenz eine freie NH₂ und COOH-Gruppe besitzen oder durch Sub₁ und Sub₂ modifiziert sind. Alternativ sind die Peptide zyklisch, d. h. die erste und die letzte Aminosäure sind über eine Peptidbindung oder einen Linker verknüpft.
Weitere Bestandteile dieser Erfindung sind die Methoden zur Herstellung der oben erwähnten neuartigen antibiotisch wirksamen Verbindungen.
Die Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung können entweder synthetisch oder, wo anwendbar, rekombinant mit konventionellen Methoden hergestellt werden. Spezielle Ausführungsbeispiele der von Apidaecin abgeleiteten, antibiotischen Peptide oder Peptidderivate werden ausführlich im experimentellen Teil unten offenbart. Vorzugsweise werden die Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung konventionell mit den bekannten Synthesetechniken hergestellt, wie beispielsweise von Merrifield beschrieben [23].
Alternativ können die in dieser Erfindung beschriebenen Peptide aber auch durch rekombinante Techniken hergestellt werden, indem man ein DNA-Fragment, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eines der oben beschriebenen Peptide kodiert kloniert, und in einem Mikroorganismus oder einer Wirtszelle exprimiert. Die kodierenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt werden [24] oder durch seitenspezifische Mutagenese einer existierenden Nukleinsäuresequenz (z. B. Sequenz die das Wildtyp-Apidaecin kodiert) gewonnen werden. Die so hergestellte kodierende Sequenz kann von der RNA (oder DNA) mit entsprechend hergestellten Primern in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit bekannten Techniken amplifiziert werden. Nach Reinigung, beispielsweise mittels Agarose-Gelelektrophorese, wird das PCR-Produkt in einen Vektor ligiert und letztlich die Wirtszelle mit dem entsprechenden rekombinanten Plasmid transformiert. Rekombinante Techniken sind für unterschiedliche Wirtszellen bekannt, beispielsweise E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, Säugerzellen (z. B. CHO (Chinese hamster ovary) oder COS-1 Zellen), Hefezellen (z. B. Saccharomyces, Schizophyllum), Insektenzellen oder virale Expressionssysteme (z. B. Baculovirus System). Die Auswahl weiterer geeigneter Wirtszellen und Methoden zur Transformierung, Kultivierung, Amplifizierung, Screening, Produktherstellung und Reinigung können von jedem, der den Stand der Technik beherrscht, aus der Literatur übernommen werden [25]. Nach konventioneller rekombinanter Herstellung können die Peptide dieser Erfindung aus den Wirtszellen isoliert werden, entweder mit klassischen Zellaufschlusstechniken oder vom Zellmedium mit konventionellen Methoden, z. B. Flüssigchromatographie, insbesondere der Affinitätschromatographie. Das antimikrobielle Peptid kann als einzelnes Peptid oder als Oligomer exprimiert werden. Dabei können die Oligomere mehrere Peptidsequenzen enthalten, die über den N- oder C-Terminus verknüpft sind, oder gar einen N- oder C-terminalen Tag enthalten, der die einfachere Reinigung der rekombinanten Peptide oder Proteinkonstrukte erlaubt. Konventionelle molekularbiologische Techniken und seitenspezifische Mutagenese können eingesetzt werden, um die Sequenz weiter zu verändern und so die gewünschten nicht-nativen Peptidsequenzen zu erhalten. Alle diese rekombinaten Techniken sind dem Fachmann bekannt und wurden bereits für viele antimikrobielle Peptide einschließlich Apidaecin [26], Perinerin [27] und Defensin [28] berichtet.
Es ist auch möglich nicht natürlich vorkommende Aminosäuren gentechnisch in die Peptide einzubringen. Dies wurde ausführlich von Noren et al. und Ellman et al. [29, 30] beschrieben.
Anschließend können die Peptide aus der Wirtszellkultur oder dem in-vitro-Translationssystem isoliert werden. Dies kann mit den üblichen Techniken zur Proteinreinigung und -isolierung erreicht werden, die Stand der Technik sind. Solche Techniken können beispielsweise die Immunadsorption oder Affinitätschromatographie beinhalten. Es ist außerdem möglich, die Peptide während der Synthese mit einem Tag zu versehen (z. B. Histidin-Tag), der eine schnelle Bindung und Reinigung gestattet. Der Tag kann nachträglich enzymatisch abgespalten werden, um die aktive Peptidsequenz zu erhalten.
Falls das Peptid selbst nicht kodiert oder exprimiert werden kann, aber sehr ähnlich zu einem kodierbaren oder exprimierbaren Peptid ist, kann die Methode zunächst auf das ähnliche Peptid angewandt werden, um dieses nachträglich in einem oder mehreren Schritten chemisch oder enzymatisch in das gewünschte Peptid oder Peptidomimetika zu überführen. Einige umfassendere Zusammenstellungen dieser Methoden zur Herstellung der hier beschriebenen Peptide sind in der Literatur beschrieben [31, 32, 33, 34, 35].
Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate können einzeln, in Kombination, als Multimere oder als verzweigte Multimere eingesetzt werden. Sinnvolle Kombinationen der erfindungsgemäßen Peptide umfassen Konkatamere, in denen die erfindungsgemäßen Peptide seriell miteinander oder über Spacer miteinander verknüpft sind, z. B. in der Form eines Peptiddimers oder eines Peptidtrimers usw., indem die einzelnen Peptide aneinander gereiht sind. Dieses Multimer kann aus Peptiden oder Peptidderivaten mit identischen Sequenzen oder verschiedenen Sequenzen gemäß Formel 1 zusammengesetzt sein.
Einzelne Peptide oder Peptidderivate können an ein biokompatibles Protein gekoppelt werden, beispielsweise humanes Serumalbumin, humanisierte Antikörper, Liposomen, Mizellen, synthetische Polymere, Nanopartikel und Phagen. Alternativ können Multimere, in denen die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate individuell kombiniert sind, in der Form von Dendrimeren oder Clustern hergestellt werden, wobei drei oder mehr Peptide an ein Zentrum gebunden sind.
In einer Ausführungsform können mehrere Peptide oder Peptidderivate gemäß oben beschriebener Formel 1 als multimere Konstrukte oder Anordnung hergestellt werden. So können beispielsweise optional Aminosäuren (z. B. Gly-Ser-) oder andere Spacer basierend auf Aminosäuren oder anderen chemischen Verbindungen an den N- oder C-Terminus angehängt werden, um zwei oder mehr Peptide untereinander zu verknüpfen oder an einen Träger zu koppeln. Diese Anordnung kann die Form von einem oder mehreren der oben beschriebenen synthetischen Peptide gekoppelt an ein Trägerprotein annehmen. Alternativ enthält eine Anordnung mehrere Peptide, jedes als multiples antigenes Peptid exprimiert, optional an ein Trägerprotein gekoppelt. In einer weiteren Variante sind die ausgewählten Peptide sequentiell verknüpft und werden als rekombinantes Protein oder Polypeptid exprimiert. In einer Ausführungsform werden mehrere Peptide sequentiell, mit oder ohne Aminosäuren als Spacer dazwischen, verknüpft, um ein größeres rekombinantes Protein zu erhalten. Alternativ kann das rekombinante Protein an ein Trägerprotein fusioniert werden.
In einer anderen Ausführungsform enthalten die multimeren Konstrukte mindestens zwei der oben definierten Peptide (welche dieselben oder unterschiedliche Peptide der Formel 1 sein können), wobei ein Peptid über eine beliebige Aminosäure an die anderen Peptide gekoppelt wird. Eine beliebige Anzahl weiterer Peptide können an beliebige weitere Aminosäuren dieser Peptide angehängt werden. In einer weiteren Ausführungsform einer multimeren Anordnung, welches mindestens zwei Peptide enthält, ist das zweite oder sind die weiteren Peptide an ein verzweigtes Gerüst der anderen Peptide der Grundstruktur gekoppelt. Alternativ ist jedes weitere Peptid kovalent über die Gruppe Sub₁ oder Sub₂ an ein anderes Peptid der Anordnung verknüpft.
In einer anderen Ausführungsform eines multimeren Konstrukts oder einer Anordnung mit mindestens zwei Peptiden, sind mindestens eins oder mehrere Peptide an einen Träger gebunden. In einer anderen Ausführungsform sind ein oder mehrere der genannten Peptide ein synthetisches Peptid, das an ein Trägerprotein fusioniert ist. Weiterhin gibt es die Alternative mehrere der oben beschriebenen Peptide mit oder ohne flankierende Sequenzen sequentiell zu einem linearen Polypeptid zu kombinieren. Die Peptide oder das Polypeptid sind entweder an den gleichen Träger gekoppelt oder unterschiedliche Peptide können individuell als Peptide an das selbe oder unterschiedliche immunologisch inerte Trägerproteine gekoppelt werden.
Geeignete Träger können die Stabilität, die Darreichung oder die Produktion verbessern, oder das Aktivitätsspektrum der Peptide verändern. Beispiele für Träger sind humanes Albumin, Polyethylenglykol oder andere Biopolymere bzw. andere natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Polymere. In einer Ausführungsform, ist die Hauptkomponente vorzugsweise ein Protein oder anderes Molekül, das die Peptidstabilität erhöhen kann. Eine erfahrene Person kann einfach eine geeignete Kopplungseinheit auswählen.
Erwünschte Beispiele einer Multimer-Verbindung im Sinne dieser Erfindung haben die Struktur (Ac-OrnAsnAsnArgProValTyrIleProArgProArgProProHisProArgLeu)₂-Dab und (OrnAsnAsnArgProValTyrIleProArgProArgProProHisProArgLeu)₂-Dab gemäß den SEQ ID Nr. 83 und 119.
In noch einer anderen Ausführungsform sind die Peptide in der Form eines multiplen Antigenpeptides (multiple antigenic Peptide; MAP) angeordnet, die beispielsweise nach dem von Tam et al. [36] beschriebenen „MAP"-Konzept konstruiert werden können. Dieses System nutzt eine zentrale Einheit aus Lysinresten, an die mehrere Kopien des gleichen erfindungsgemäßen Peptids synthetisiert werden [siehe z. B. 37]. Jedes MAP enthält mehrere Kopien eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Peptide. Eine Ausführungsart eines MAP enthält mindestens drei, vorzugsweise aber vier oder mehr Peptide. Ein Fachmann kann einfach eine beliebige Anzahl multimerer Verbindungen gemäß den in obiger Formel identifizierten Peptiden herstellen. Alle derartigen multimeren Arrangements und Konstrukte sollen Bestandteil dieser Erfindung sein.
Weitere Kombinationen in der Form von Multimeren können an der Oberfläche von Partikeln hergestellt werden, wobei die Peptide oder Peptidomimetika an deren Oberfläche präsentiert werden. Der Partikel kann dann als Träger eines Peptids oder Peptidomimetikas fungieren und kann gleichzeitig als detektierbarer Marker wirken. Multimere können beispielsweise durch N-terminale Biotinylierung des N-terminalen Endes der Peptid- oder Peptidomimetika-Ketten und anschließende Komplexbildung mit Streptavidin erhalten werden. Da Streptavidin vier Biotinmoleküle oder -konjugate mit hoher Affinität binden kann, werden mit dieser Methode sehr stabile tetramere Peptidkomplexe erhalten. Multimere können aus identischen oder unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptiden oder Peptidomimetika hergestellt werden. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Multimere zwei oder mehr Peptide oder Peptidomimetika, wobei jede Komponente einen gewissen Anteil zur bioziden Aktivität beiträgt (Zielerkennung, antimikrobielle Aktivität, Reinigung).
Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate in der Medizin oder Pharmazie, z. B. zur Therapie mit einem Antibiotikum oder in einer Zusammensetzung mit antimikrobieller (insbesondere bakteriozider) Aktivität.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide bzw. Peptidderivate oder multimere Konstrukte unabhängig von der Anwesenheit anderer pharmazeutischer aktiver Verbindungen enthält.
Bestandteil dieser Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Pharmazeutikum und/oder zur Herstellung eines Wirkstoffs, der als Antibiotikum eingesetzt werden kann.
Die Peptide können auch einzeln in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Alternativ können ein oder mehrere Peptide, wie oben beschrieben, an eine andere Verbindung fusioniert oder konjugiert werden, um die Pharmakokinetik oder Bioverfügbarkeit zu steigern, ohne dass eine Immunantwort ausgelöst wird. Eine beliebige Anzahl einzelner Peptide oder multimerer Konstrukte können miteinander gemischt werden, um eine einzelne Zusammensetzung herzustellen.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrer Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung. Einmal zusammengestellt, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dem Subjekt (oder Person) direkt verabreicht werden, um mikrobielle (insbesondere bakterielle) Infektionen zu behandeln. Dazu wird dem zu behandelnden Subjekt (oder Person) eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind dazu bestimmt Infektionen eines mit Bakterien oder Pilzen infizierten Säugetiers, wie z. B. des Menschen, zu behandeln. Mindestens ein oder alternativ auch mehrere erfindungsgemäße Peptide oder multimere Konstrukte können zu einer antimikrobiell (insbesondere antibakteriell oder fungizid) wirksamen Zusammensetzung mit einem pharmakologisch vertretbaren Träger oder anderen Komponenten gemischt werden. Für den Gebrauch einer derartigen Zusammensetzung wird das ausgewählte Peptid vorzugsweise synthetisch oder auch rekombinant, wie oben beschrieben, hergestellt.
Die direkte Verabreichung dieser Zusammensetzung erfolgt entweder topisch (oberflächlich auf die Haut) oder in einer anderen Administrationsroute, wie z. B. oral, parenteral, subkutan, sublingual, intraläsional, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, pulmonal oder interstitiell ins Gewebe.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiter geeignete und pharmazeutisch akzeptable Träger, Streckmittel oder Lösungsmittel enthalten und die Form einer Kapsel, Tablette, Pastille, Dragee, Pille, Tropfen, Zäpfchen, Puder, Spray, Impfstoff, Salbe, Paste, Creme, Inhalat, Pflaster, Aerosol oder ähnlichem aufweisen. Als pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe können Lösungsmittel, Streckmittel oder andere flüssige Bindemittel wie Dispersions- oder Suspensionshilfsmittel, oberflächenaktive Agenzien, isotonische Wirkstoffe, Dickungsmittel oder Emulgatoren, Konservierungsmittel, Umhüllungsmittel (encapsulating agent), feste Bindestoffe oder Gleitmittel eingesetzt werden, je nachdem was für die jeweilige Dosierung am Besten geeignet ist und zugleich mit dem Peptid, Peptidomimetika (Pepidderivat), Peptid-Konjugat oder Peptidmimetika-Konjugat kompatibel ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält daher vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" umfasst dabei auch einen Träger zur Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, wie beispielsweise Antikörper oder Polypeptide, Gene oder andere therapeutische Mittel. Der Begriff bezieht sich auf einen beliebigen pharmazeutischen Träger, der selbst nicht die Produktion von Antikörpern auslöst, die für das Individuum, dem die Rezeptur verabreicht wurde, gefährlich sein könnten, und der keine unangemessene Giftigkeit besitzen. Geeignete „pharmazeutisch akzeptable Träger" können große, langsam abbaubare Makromoleküle, wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polylactonsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere und inaktivierte Virusbestandteile sein. Solche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt.
Salze der Peptide oder funktionell äquivalenter Verbindungen können mit bekannten Methoden hergestellt werden, was typischer Weise bedeutet, dass die Peptide, Peptidomimetika, Peptid-Konjugate oder Peptidomimetika-Konjugate mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure zu einem sauren Salz oder mit einer pharmazeutisch akzeptablen Base zu einem basischen Salz gemischt werden. Ob eine Säure oder eine Base pharmazeutisch akzeptabel sind, kann leicht von einem Fachmann in Kenntnis der Anwendung und der Rezeptur festgelegt werden. So sind beispielsweise nicht alle Säuren und Basen, die für ex vivo Anwendungen akzeptabel sind, auch auf therapeutische Rezepturen übertragbar. Abhängig von der jeweiligen Anwendung können pharmazeutisch akzeptable Säuren sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Oxasäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Phosphorsäure und Thiocyansäure, die mit den freien Aminogruppen von Peptiden und funktionell äquivalenten Verbindungen Ammoniumsalze ausbilden. Pharmazeutisch akzeptable Basen, die mit freien Carbonsäuregruppen der Peptide und funktionell äquivalenten Verbindungen Carboxylate ausbilden, beinhalten Ethylamin, Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Isopropylamin, Diisopropylamin und andere Mono-, Di- und Trialkylamine sowie Arylamine. Ferner sind pharmazeutisch akzeptable Lösungsmittel eingeschlossen.
Pharmazeutisch akzeptable Salze können darin zur Anwendung kommen, wie z. B. Salze von Mineralsäuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und vergleichbare; aber auch Salze organischer Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und vergleichbare. Eine ausführliche Diskussion zur pharmazeutisch akzeptablen Inhaltsstoffen findet man in Remington's Pharmaceutical Sciences (hack Pub. Co., N. J., 1991).
Pharmazeutisch akzeptable Träger in den therapeutischen Zusammensetzungen können Flüssigkeiten enthalten, beispielsweise Wasser, Salzwasser, Glycerol und Ethanol. Zusätzliche können Hilfsstoffe zugegeben werden, wie Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, pH puffernde Substanzen und ähnliche Verbindungen können in solchen Mitteln vorhanden sein. Typischer Weise werden die therapeutischen Zusammensetzungen entweder in flüssiger Form oder als Suspension zur Injektion zubereitet, feste Formen zum Auflösen oder Suspendieren in Trägerflüssigkeiten vor der Injektion sind ebenfalls möglich. Liposomen sind auch in der Definition eines „pharmazeutisch akzeptablen Trägers" enthalten.
Zur therapeutischen Behandlung können Peptide, Peptidderivate, Peptid-Konjugate oder Peptidderivat-Konjugate, wie oben beschrieben, produziert und einem Subjekt, das diese benötigt, verabreicht werden. Das Peptid, Peptidderivat, Peptid-Konjugat oder Peptidderivat-Konjugat kann einem Subjekt in beliebiger, geeigneter Form verabreicht werden, vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung, die der Darreichungsform angepasst ist und in einer für die angestrebte Behandlung angemessenen Dosierung vorliegt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können weitere aktive Verbindungen enthalten, beispielsweise konventionelle Antibiotika (z. B. Vancomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin) oder andere antimikrobiell aktive Verbindungen, wie Fungizide, z. B. Intraconazol oder Myconazol. Auch andere Verbindungen, die mit der Infektion einhergehende Symptome wie Fieber (Salizylsäure) oder Hautausschlag lindern, können zugesetzt werden.
Neben der therapeutischen Verwendung zur Behandlung von Infektionen, oder auch bei der biologischen Kriegsführung, ist es weiter möglich, die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate in Desinfektions- oder Reinigungsmitteln (z. B. einer bakterioziden Zusammensetzung) einzusetzen, die zur Desinfektion oder Reinigung von Oberflächen oder Gegenständen verwendet werden können. Ein anderes Anwendungsgebiet sind Verpackungen, wo Peptide an Verpackungsmaterial gebunden oder darin eingebunden werden können, oder als Konservierungsmittel für andere Materialien, die leicht durch Mikroorganismen abgebaut werden können. Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate sind insbesondere zur Verpackung von Lebensmitteln geeignet, da sie weder beim Kontakt noch bei der Aufnahme toxisch wirken.
Ein anderer Bestandteil dieser Erfindung ist eine Methode zur Behandlung von Säugetieren, die mit Mikroben (insbesondere Bakterien oder Pilze) infiziert sind, einschließlich der Verabreichung einer effektiven, therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutisch wirksamen erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Der hier verwendete Begriff „therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet die Menge eines Therapeutikums, d. h. eines erfindungsgemäßen Peptids, Peptidomimetikums, Peptid-Konjugats oder Peptidmimetika-Konjugats, welche die Vermehrung und Kolonienbildung der Bakterien zu reduzieren oder ganz zu verhindern oder einen messbaren therapeutischen oder prophylaktischen Erfolg zu erzielen vermag. Der Effekt kann beispielsweise für Biopsien in Kultur, durch Test der bakteriellen Aktivität oder mit einer anderen geeigneten Methode zur Beurteilung des Umfangs und des Grads einer bakteriellen Infektion bestimmt werden. Die genaue effektive Menge für ein Subjekt hängt von dessen Größe und Gesundheitszustand, der Art und dem Ausmaß der Erkrankung und den Therapeutika oder der Kombination mehrerer Therapeutika ab, die zur Behandlung ausgewählt wurden. Insbesondere die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verwendet werden, um baktierielle Infektionen und/oder biologische oder physische Begleiterscheinungen (z. B. Fieber) zu reduzieren oder zu verhindern. Methoden zur Festlegung der Anfangsdosis durch einen Mediziner sind Stand der Technik. Die festgelegten Dosen müssen sicher und erfolgreich sein.
Die Menge eines erfindungsgemäßen Proteins, Peptids oder Nukleinsäure, die für eine antibakteriell effektive Dosis notwendig ist, kann unter Berücksichtigung des Pathogens, das die Infektion auslöst, der Schwere der Infektion, sowie vom Alter, Gewicht, Geschlecht, allgemeiner physischer Kondition usw. des Patienten festgelegt werden. Die notwendige Menge der aktiven Komponente, um effektiv antibakteriell und antimykotisch ohne nennenswerte Nebenwirkungen wirksam zu sein, hängt von der eingesetzten pharmazeutischen Rezeptur und der eventuellen Anwesenheit weiterer Bestandteile, wie z. B. Antibiotika, Antimykotika und dergleichen, ab. Für die erfindungsgemäßen Einsatzgebiete kann eine effektive Dosis zwischen 0,01 μg/kg und 50 mg/kg liegen, vorzugsweise zwischen 0,5 mg/kg und 10 mg/kg des Peptids, Peptidomimetiks, Pepid-Konjugats oder Peptidomimetik-Konjugats in dem behandelten Individuum.
Anfangsdosen der erfindungsgemäßen Peptide, Peptidomimetiks, Multimere, Peptid-Konjugate oder Peptidomimetiks-Konjugate können optional durch wiederholte Verabreichung verfolgt werden. Die Häufigkeit der Dosierungen hängt von den oben identifizierten Faktoren ab und beträgt vorzugsweise zwischen ein und sechs Dosen pro Tag über einen Behandlungszeitraum von etwa drei Tagen bis maximal etwa einer Woche.
In einer weiteren, alternativen Zusammensetzung werden die erfindungsgemäßen Peptide, Peptidomimetiks, Pepid-Konjugate oder Peptidomimetik-Konjugate oder Mischungen durch eine kontrollierte oder fortwährende Freisetzung aus einer Matrix, die in den Körper des Subjekts eingebracht wurde, verabreicht.
In einer Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch die Haut verabreicht. Diese Art der Gabe ist nicht invasiv und patientenfreundlich, gleichzeitig führt es wahrscheinlich zu einer gesteigerten Bioverfügbarkeit der Verbindung im Vergleich zu einer oralen Aufnahme, insbesondere falls die Verbindung nicht gegenüber dem Milieu im Verdau ungssystem stabil ist oder falls es zu groß ist, um vom Darm effizient aufgenommen zu werden. Die Aufnahme durch die Haut ist beispielsweise in der Nase, der Wange, unter der Zunge, am Zahnfleisch oder in der Vagina möglich. Entsprechende Darreichungsformen können mit bekannten Techniken erreicht werden; sie können zu Nasentropfen, Nasenspray, Einlagen, Filmen, Pflaster, Gele, Salben oder Tabletten verarbeitet werden. Bevorzugt wird der Arzneiträger für die Aufnahme durch die Haut eine oder mehrere Komponenten enthalten, die an der Haut haften und dadurch die Kontaktzeit der Darreichungsform mit der adsorbierenden Oberfläche verlängern, um dadurch die Aufnahme durch Absorption zu steigern.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Verbindungen pulmunal in einer bestimmten Menge verabreicht, z. B. durch einen Inhalator, Zerstäuber, Aerosolspray oder einen Inhalator für trockenes Pulver. Geeignete Formulierungen können durch bekannte Methoden und Techniken hergestellt werden. Eine transdermale oder rektale Zufuhr mag in einigen Fällen genau wie die Verabreichung in das Auge angebracht sein.
Es kann vorteilhaft sein, die erfindungsgemäßen Substanzen durch fortgeschrittene Formen der Arzneimittelgabe (advanced drug delivery or targeting methods) effektiver zu verabreichen. So kann, falls der Verdauungstrakt umgangen werden soll, die Darreichungsform eine beliebige Substanz oder Mischung enthalten, die die Bioverfügbarkeit steigert. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der Abbau reduziert wird, z. B. durch einen Enzyminhibitor oder ein Antioxidants. Stärker bevorzugt ist es, wenn die Bioverfügbarkeit der Verbindung durch eine Zunahme der Permeabilität der Absorptionsbarriere, meist die Schleimhaut, erzielt wird. Substanzen die das Eindringen erleichtern, können auf verschiedene Arten wirken; einige erhöhen die Fluidität der Schleimhaut, während andere die Zwischenräume zwischen den Schleimhautzellen erweitern. Wiederum andere reduzieren die Viskosität des Schleims auf der Schleimhaut. Zu den bevorzugten Aufnahmebeschleunigern gehören amphiphile Substanzen wie Cholinsäurederivate, Phospholipide, Ethanol, Fettsäuren, Ölsäure, Fettsäurederivate, EDTA, Carbomere, Polycarbophil und Chitosan.
Indikationen, für welche die erfindungsgemäßen Peptide, Peptidderivate, Konjugate oder Multimere eingesetzt werden können, sind bakterielle Infektionen mit sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Haemophilus influenzae
Ein weiterer Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit potentiell antibakterieller oder antimykotischer Wirkung, welches folgendes beinhaltet:

(i) Durchführung eines kompetitiven Tests (Assays) mit:
(a) einem Mikroorganismus der gegenüber einem erfindungsgemäßen Peptid, Peptidderivat oder Multimer empfindlich ist,
(b) ein erfindungsgemäßes Peptid oder Peptidderivat,
(c) mindestens eine Verbindung die getestet werden soll, durch in Kontakt bringen von (a) mit (b) und (c); und
(ii) Auswählen einer Testverbindung, die kompetitiv das Peptid oder Peptidderivat vom Mikroorganismus verdrängt.

Dieses Screeningverfahren identifiziert Testverbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder dem multimeren Konstrukt kompetitiv um die Bindung an den unbekannten Rezeptor des Pathogens konkurrieren können. Dadurch können kleine Moleküle, die spezifisch an die gleiche Stelle wie das Peptid binden, effektiv in einem Hochdurchsatzscreening identifiziert werden. Dabei weisen die Testverbindungen voraussichtlich den gleichen Wirkmechanismus wie die Originalpeptidsequenz auf und sind daher auch gegen multiresistente Mikroben aktiv, die durch Apidaeicin oder eine der in dieser Erfindung beschriebenen Analoga abgetötet werden.
Vorzugsweise werden die Testverbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder einem multimeren Konstrukt um die Bindung konkurrieren, danach identifiziert und auf ihre antibakterielle oder antimykotische Wirkung getestet.
In einer Ausführungsform wird die Fluoreszenz nach der Bildung eines Dimers (BIFC; bimolecular fluorescence complementation) in einem kompetitiven Assay gemessen. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung intrazellulärer Proteinwechselwirkungen, was am Beispiel der SH3-Domäne aus der c-Ab1 Tyrosinkinase mit natürlichen und künstlichen Zielmolekülen in E. coli gezeigt wurde [38]. Dieses Testsystem ist sensitiv genug, um sogar die Wechselwirkungen zwischen in E. coli niedrig exprimierten Proteine nachweisen zu können. Es basiert auf der Anlagerung von zwei Fragmenten des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), nachdem die SH3 Domäne an ihren Partner gebunden hat. Sobald diese beiden Proteine aneinander gebunden haben, bilden die beiden Fragmente von YFP einen Komplex, dessen Struktur dem nativen Protein sehr nahe kommt. Dies kann über die beobachtete Fluoreszenz des YFP-Kompexes beobachtet werden, da die einzelnen Fragmente nicht fluoreszieren. Ein ähnliches Konstrukt kann auch entworfen werden, um nach Verbindungen zu suchen, die mit den in dieser Erfindung beschriebenen Peptide und Peptidderivate um die Bindungsstelle konkurrieren. Ein Hochdurchsatzscreening kann einfach von einem Fachmann auf eine Mikrotiterplatte im 386er Format übertragen werden.
In einer anderen Ausführungsform werden die Peptide in einem geeigneten kompetitiven Assay verwendet, um die Fähigkeit der zu testenden Verbindungen, die Peptide kompetitiv von dem unbekannten Rezeptor der Pathogene zu verdrängen, zu ermitteln. Wo gewünscht, können (abhängig von dem gewählten Assay) Mikroorganismen (z. B. Bakterium, Virus oder Pilz), die bekannter Maßen an das oder die ausgewählte(n) Peptid(e) binden, z. B. E. coli oder K. pneumoniae Stämme, direkt oder indirekt auf einer geeigneten Oberfläche immobilisiert werden, z. B. in einem ELISA-Format. Entsprechende Oberflächen zur Immobilsierung sind wohlbekannt. Beispielsweise kann ein inerter Partikel („Bead") verwendet werden. Der Ligand kann aber auch an eine 96er Mikrotiterplatte gebunden sein. Danach werden ausgewählte Mengen der zu testenden Verbindungen und der erfindungsgemäßen Peptide mit den immobilisierten Mikroorganismen in Kontakt gebracht und die Verbindungen ausgewählt, die mit den Peptiden um die Bindung an die Mikroorganismen konkurrieren. Wenn diese Testverbindungen, die mit den Peptiden um die Rezeptorbindung an Bakterien oder Pilze konkurrieren, identifiziert sind, können sie mit weiter auf ihre antibakterielle oder antimykotische Wirkung untersucht werden. Dazu geeignete Methoden werden weiter unten in den Beispielen beschrieben.
In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, dessen Sequenz für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Multimer kodiert. Die für das erfindungsgemäße antibakterielle oder antimykotische Peptid oder multimere Konstrukt kodierende Nukleinsäure steht dabei in operativer Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz, die dessen Expression in der Wirtszelle steuert. Ein weiterer Bestandteil der Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül transfiziert oder transformiert ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Beispiel 1
Festphasenpeptidsynthese
Alle Peptide und Peptidderivate wurden mit der konventionellen Festphasenpeptidsynthese mittels Fmoc/^tBu-Strategie synthetisiert [39]. Die Aminosäurederivate wurden bei der MultiSynTech GmbH (Witten, Deutschland) gekauft. Peptide und Peptidderivate mit freien C-Terminus (COOH-Gruppe) wurden an einem Wang-Harz (Beladungskapazität 1,33 mmol/g) auf Polystyrol-Basis von Merck Biosciences (Schwalbach, Deutschland) synthetisiert. Peptide und Peptidderivate mit C-terminalem Amid (-CONH₂-Gruppe) wurden an einem 4-Methylbenzhydrylamin(MBHA)-Harz (Beladungskapazität 0,64 mmol/g) auf Polystyrol-Basis von Merck Biosciences synthetisiert. Die Peptide und Peptidderivate wurden mit dem multiplen Peptidsyntheseroboter Syro2000 (MultiSynTech GmbH) synthetisiert. Dabei wurden vier Equivalente Aminosäurederivat mit 2-(1-H-benzotriazol-1-yl)tetramethyluronium hexafluorophosphat (HBTU; MultiSynTech GmbH) und N,N'-diisopropylethylamin (DIPEA; Fluka, Buchs, Schweiz) in Dimethylformamid (DMF; Biosolve V. B., Valkenswaard, Niederlande) aktiviert. Als Seitenkettenschutzgruppen wurden Triphenylmethyl (trityl) für Asn, His und Gin, tert.-Butylether für Tyr, Ser und Thr, tert.-Butylester für Asp und Glu, N-Omega-2,2,4,6,8-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl für Arg und βHar und tert.-Butyloxy-carbonyl für Lys und Orn eingesetzt. Die temporäre Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 40% Piperidin in DMF (v/v) für 3 min und erneut mit frischen 40% Piperidin in DMF (v/v) für 10 min abgespalten.
Die N-Termini der Peptide oder Peptidderivate wurden acetyliert, indem zehn Equivalente Essigsäure mit HBTU und DIPEA in DMF aktiviert wurden, wie oben für die Fmoc-Aminosäurederivate beschrieben. Die Guanidierung des N-Terminus der Peptide oder Peptidderivate wurde mit zehn Equivalenten von HBTU und DIPEA in DMF durchgeführt, wie von Gausepohl et al. beschrieben [40].
Nach Beendigung der Synthese der Peptide oder Peptidderivate wurden die Harze sorgfältig mit DMF und DCM gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Harz-gebundenen Peptide wurden von der Festphase mit einer Mischung aus 5% Wasser, 4% m-Kresol, 5% Thioanisol und 2% Ethandithiol (Vol.-%) in Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur für 4 h abgespalten und zugleich die Seitenketten entschützt. Die Peptide und Peptidderivate wurden mit kaltem Diethylether präzipitiert und bei 3000 × G abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit kaltem Ether gewaschen, getrocknet und in 0,1% wässriger TFA (UV-Spektroskopie, Fluka) gelöst. Die Proben wurden bei –20°C gelagert.
C-terminal methylierte Peptide und Peptidderivate, d. h. als CO-OMe-Ester, wurden an einem 4-Hydroxymethylbenzoesäure AM Harz (HMBA-AM Harz, Beladungskapazität 1,1 mmol/g, Novabiochem, Merck-Biosciences, Darmstadt, Deutschland) synthetisiert Die erste Aminosäure wurde manuell als symmetrisches Anhydrid mit 10 Äquivalenten Fmoc-Aminosäurederivat, 5 Äquivalente Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 0,1 Äquivalenten N,N-dimethyl-4-Aminopyridin in DCM an das Harz gekoppelt. Die Beladungskapazität wurde mit dem Piperidin-Fulven-Test bestimmt, in dem die Fmoc-Gruppe mit 50% Piperidin in DMF für 1 h abgespalten und die Extinktion bei 301 nm gemessen wurde [41]. Die typische Beladungskapazität betrug etwa 0,8 mmol/g. Die automatische Synthese wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt. Nach Beendigung der Peptidsynthese wurden die Peptid HMBA-AM Harze gründlich mit DMF und DCM gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Schutzgruppen der am Harz gebundenen Peptide wurden mit 5% Wasser, 4% m-Kresol, 5% Thioanisol und 2% Ethandithiol (Vol.-%) in Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur für 4 h abgespalten. Das Harz wurde mit TFA und DMF gewaschen. Das Harz wurde in DMF gequollen und die Abspaltung des Peptids oder der Peptidderivate vom Harz erfolgte mit DIPEA/MeOH/DMF (1:5:5 bei Vol.-%; 50 mL Lösung pro g Harz), um einen C-terminalen Methylester zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, die Peptide (oder Peptidderivate) wurden mit kaltem Diethylether gefällt und bei 3000 × G abzentrifugiert. Das Pellet wurde zwei Mal mit kaltem Ether gewaschen, getrocknet und in 0,1% wässriger TFA (UV-Spektroskopie, Fluka) gelöst. Die Proben wurden bei –20°C gelagert.
Die abgespaltenen Peptide und Peptidderivate wurden an einem Äkta HPLC System (Amersham Bioscience GmbH, Freiburg, Deutschland) mit einer Jupiter C18-Säule (20 mm × 250 mm, Phenomenex Inc., Torrance, USA) gereinigt, in dem sie mit einem linearen Acetonitrilgradienten eluiert wurden, der typischer Weise bei 5% wässrigem Acetonitril begann und eine Steigung von 1% Acetonitril pro Minute in der Gegenwart von 0,1% TFA als Innenpaar-Regaenz hatte. Die Flussrate betrug 10 mL/min. Die Peptide wurden durch ihre Absorption bei 220 nm detektiert. Die Reinheit der Peptide wurde mittels analytischer RR HPLC (Jupiter C18-Säule, 4,6 mm × 150 mm, Phenomenex Inc., Torrance, USA) und Matrixunterstützte Laser Desorption/Ionisierung mit Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-TOF- MS; 4700 proteomic analyzer, Applied Biosystems GmbH, Darmstadt, Deutschland) bestimmt. Folgende in der Tabelle 2 aufgeführten Peptide wurden synthetisiert: Tabelle 2

I

Cha: Cyclohexylalanin,
Chex: 1-Amino-Cyclohexylcarbonsäure,
Cit: Citrullin,
OMe steht für einen Methylester am C-Terminus (Sub₂ = OR₃ = OMe); MeLeu = N-Methylleucin – ein an der Peptidbindung methyliertes Leucin;
Ac = Acetyl-, For = Formyl- und Guan = Guanido-Gruppen sind Beispiele für modifizierte N-Termini (modifizierte alpha-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure, Sub₁ = Acetyl-NH, Formyl-NH oder Guanido);
βAla und βHar sind Beispiele für beta-Aminosäuren.

Beispiel 2: Serumstabilität
Die Serumstabilitätsstudien wurden als Doppelbestimmung wie von Hoffmann et al. beschrieben, durchgeführt [42]. Von der wässrigen Peptid- oder Peptidderivate-Lösung (0,5 mg/mL) wurden 28 μL zu 0,2 mL frisch gepoolten 25%igen Mausserum (Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen, Deutschland) in Wasser gegeben. Die Mischung wurde unter ständigem Rühren bei 37°C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 0, 0.5, 1, 2, 4 und 6 h wurden die Proteine mit 40 μL 15% wässriger TCA präzipitiert und 20 min bei 0°C gekühlt, bevor sie bei 4°C für 5 min abzentrifugiert wurden (13500 × G). Die Überstande aller Proben (240 μl) wurden mit 1 mol/L wässriger NaOH neutralisiert und sofort bei –20°C gelagert. Die Überstände wurden mittels RP-HPLC mit einem linearen Acetonitrilgradienten und 0,1% TFA als Ionenpaarreagenz analysiert, wie oben beschrieben. Die gesammelten Fraktionen der Hauptpeaks wurden weiter mit Tandem-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/TOF-MS, 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland) im Positiv-Ionenreflektor-Modus mit α-Cyanohydroxyzimtsäure als Matrix (50% CH₃CN in 0,1% wässriger TFA) analysiert, um die Abbauprodukte der Peptide und Peptidomimetika, d. h. die Metaboliten nach verschiedenen Zeitintervallen zu identifizieren. Die Serumkontrollproben bestanden aus 200 μL gepooltem 25% Mausserum in Wasser. Diese wurden ebenfalls, wie zuvor beschrieben, mit 40 μL 15% wässriger TCA präzipitiert. Die Peptidreferenzproben bestanden aus 28 μL Peptidstocklösung, verdünnt in 0,2 mL Wasser und 40 μL 15%ige wässrige Trichloressigsäure (TCA).
Die Serumstabilitätswerte verschiedener Peptide sind in Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3:
Die native (WT) Apidaecin-Sequenz wird von beiden Seiten abgebaut, das heißt es werden N-terminale und C-terminale Reste oder Peptide abgespalten. Deshalb muss die Peptidsequenz gegen Exopeptidasen oder Exoproteasen und Endoproteasen stabilisiert werden. Insbesondere die Bindungen zwischen Arginin an Position 17 und Isoleucin oder Leucin an Position 18 ist anfällig für Endoproteasen. Der Abbau wurde mittels MALDI-MS, durch die Bestimmung der Molekulargewichte der peptidischen Metabolite und Tandem Massenspektren der korrespondierenden Peptide verfolgt. Der N-terminale Abbau resultierte in Sequenzen, die um eine bis zu drei Aminosäuren verkürzt waren.
N-terminale Acetylierungen (SEQ ID Nr. 7, 13, 24 und 32) reduzieren beispielsweise diesen Abbauweg, ohne großen Einfluss auf den C-terminalen Abbau zu haben, signifikant. So wurde zum Beispiel Peptid Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH₂ (SEQ ID Nr. 7) nicht N-terminal abgebaut, jedoch wurde vom C-Terminus entweder das Leucinamid oder die zwei C-terminalen Reste abgespalten (1).
1 zeigt die Menge an Peptid Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH₂ (SEQ ID Nr. 7), die in 25% wässrigem Serum nach 30, 60, 120, 240, und 360 min enthalten ist. Ebenfalls gezeigt sind die zwei detektierten Metabolite Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-OH (SEQ ID Nr. 125 – Abspaltung des C-terminalen Leucinamids) und Ac-ONNRPVYIPQPRPPHP-OH (SEQ ID Nr. 126 – Abspaltung der zwei C-terminalen Reste), die über die Peakflächen der UV- Detektion der RP-HPLC quantifiziert wurden. Ebenso wurde der C-terminale Abbau durch beispielsweise Amidierung des C-Terminus reduziert, was wiederum keinen Einfluss auf den N-terminalen Abbau hatte. Folglich reduziert die Kombination N- und C-terminaler Modifikationen (SEQ ID Nr. 7, 13 and 32) den Abbau durch Exoproteasen oder Exopeptidasen signifikant. Durch die Methylierung der Peptidbindung an Arg17 konnte die C-terminale Spaltung am Arginin 17, d. h. Arg-Leu oder Arg-Ile, effektiv reduziert werden. Bevorzugt wird ein Peptid gegen alle drei möglichen Abbauwege stabilisieren, wie durch Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRMeLeu-NH₂ (SEQ ID Nr. 32) belegt, dessen Halbwertszeit (25% wässriges Serum, 37°C) mehr als 6 h betrug. Die selbe Stabilität wurde ebenfalls für die Sequenz Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH₂ (SEQ ID Nr. 82) durch den Austausch von Arg17 gegen Ornithin erreicht, da Ornithin keine tryptische Spaltstelle darstellt.
Beispiel 3: Antibakterielle Tests
1. Hemmzonentest (Agar-Diffussions-Test)
Die gereinigten, vom Apidaecin-abgeleiteten Peptide und Peptidderivate wurden in Wasser auf eine Endkonzentration von 500 μg/mL verdünnt. Aliqote von 10 μL und die Kontrollen (10 μL Wasser oder Antibiotikalösung) wurden auf eine mit einer in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterienkultur beimpfte Agarplatte getropft Die Platten wurden bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Die Durchmesser der Hemmzonen wurden nach 20 h gemessen. Im Allgemeinen wuchsen die Bakterien auf 1% tryptic soy broth (TSB, Fluka, Neu-Ulm, Deutschland) und 1,2% Agar (Fluka) herangezogen. Alle Tests wurden unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Mit dem Alanin-Scan der nativen Apidaecin-Sequenz konnte verschiedene Reste identifiziert werden, die für die antimikrobielle Aktivität gegen drei verschiedene E. coli-Stämme (2) und K. pneumoniae (3) verantwortlich sind.
2 zeigt die antibakterielle Aktivität der Apidaecin 1a Analoga (Alanin-Scan) gegen verschiedene E. coli Stämme in einem Agar-Platten-Test.
3 zeigt die antibakterielle Aktivität von Apidaecin 1a-Analoga (Alanin-Scan) gegen K. pneumoniae ATCC 10031 in einem Agar-Platten-Test.
Auf der X-Achse der in 2 und 3 gezeigten Diagramme ist die Sequenz des nativen Peptides Apidaecin 1a GNNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID Nr. 1) aufgetragen. Jeder Rest repräsentiert das korrespondierende Peptid dessen Rest gegen Alanin ausgetauscht wurde, zum Beispiel: G an Position 1 steht für ANNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID Nr. 127), N an Position 2 steht für GANRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID Nr. 128), usw..
Die Säulen stellen den Durchmesser der Hemmzone dar. Je größer der Wert auf der Ordinate um so größer die antibakterielle Aktivität des Alanin-modifizierten Peptids.
Mit dem Alanin-Scan wurden alle Positionen bestimmt, die für die antibakterielle Aktivität des Apidaecin 1a verantwortlich sind. Durch den Austausch der Positionen Pro 11 bis Ile18, Arg4, Tyr7 und Pro9 gegen Alanin wurde die antibakterielle Aktivität deutlich reduziert. In weiteren Experimenten wurden spezifische Aminosäurepositionen durch ähnliche Aminosäuren ersetzt, um die Aktivität und Proteaseresistenz zu erhöhen. In den meisten Fällen wurde eine starke Minderung der Aktivität beobachtet. Alle getesteten Stämme beider Bakterienarten reagieren sehr ähnlich auf die unterschiedlichen Mutanten, bei denen jeweils eine Position ausgetauscht wurde, wobei Pro in Position 11 und Arg in Position 17 der nativen Sequenz für die Aufrechterhaltung einer Aktivität zwingend notwendig sind.
2. Wachstumsinhibitionsassay
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der von Apidaecin abgeleiteten Peptide und Peptidderivate wurden in einem minimalen Hemmkonzentrations-Test bestimmt. Dabei wird eine fortlaufende Peptidverdünnung in sterilen 96er Mikrotiterplatte mit rundem Boden (Polystyren, U-Boden, Greiner Bio-One GmbH) und einem Gesamtvolumen von 100 μL pro Vertiefung eingesetzt. Die Bakterien, z. B. E. coli BL21 AI, wurden in Nährboullion (NB, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) bei 37°C über Nacht vermehrt. In jede Vertiefung der 96er Mikrotiterplatte wurden 50 μL der auf 5 × 10⁶ CFU/mL in 1% TSB eingestellten über Nacht herangezogenen Bakterienkultur gegeben. Die gefriergetrockneten Peptide und Peptidomimetika wurden in 1% TSB (tryptic soy broth) oder Wasser gelöst um eine Endkonzentration von 250 μg/mL zu erhalten. 50 μL der Peptid- oder Peptidomimetika-Lösung wurden in die erste Vertiefung jeder Reihe pipettiert und gemischt. 50 μL aus der ersten Vertiefung, die die Peptidlösung enthält, wurden in die zweite Vertiefung transferiert, gemischt und erneut 50 μL in die nächste Vertiefung transferiert, usw.. Dabei wird eine zweifache Verdünnungsserie erhalten, beginnend bei 250 μg/mL in der ersten Vertiefung bis zu 120 ng/mL in der zwölften Vertiefung. Dies ergibt eine Endkonzentration der Peptide oder Peptidomimetika von 125 μg/ml (Vertiefung 1) bis zu 60 ng/mL (Vertiefung 12) in jeder Reihe. Die Platten wurden für 20 h bei 37°C inkubiert. Die Absorption wurde bei 595 nm mit einem TECAN Mikrotiterplatten Spektralfotometer (Tecan, Deutschland) gemessen. Alle Peptide und Peptidomimetika wurden in einer Dreifachbestimmung vermessen. Steriles Wasser wurde als Negativkontrolle eingesetzt. Der MHK-Wert stellt die kleinste Konzentration dar, bei welcher kein Bakterienwachstum nach einer Inkubation bei 37°C für 20 h beobachtet werden kann.
Die MHK-Werte der getesteten Peptide und Peptidderivate gegen Bakterien, die gegenüber mehreren Antibiotika resistent sind, werden in Tabelle 4 zusammengefasst.
Die folgenden mehrfach resistenten Bakterienstämme wurden getestet:

– Eschericha coli 45849 und D31
– Klebsiella pneumoniae 123132 und K6
– Salmonella typhi S5 und Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 700408
– Rhizobium radiobacter (ATCC 15955 bekannt auch als Agrobacterium tumefaciens).

SEQ ID Nr.	Synthese Nr.	E. coli	K. Pneumoniae	S. typhi	E. coli	K. Pneumoniae	S. enterica subsp. Enterica serovar. typhi	R. radiobacter
SEQ ID Nr.	Synthese Nr.	89454	233211	S5	D31	K6, ATCC 700603	G10215 ATCC 700408	ATCC 15955
1	A24 C3				64	64	2
2	A24 C4				32	64	2
7	A18 G5 ac.	1	16	2	4–8	64	0,5–1	< 0,16
8	A18 G5	< 0,25	1	< 0,5	2	16	< 0,25	< 0,16
9	A17 A4	1	8	2	16	16	0,5	< 0,16
11	A18 B4	1	8	< 0,5	8	8	< 0,25	< 0,16
12	A20 B1	1	4	< 0,5	4	4	< 0,25	0,65
13	A20 B1 ac.	2	8	< 0,5	4	8	< 0,25	< 0,16
14	A14 B3				64	8	2
15	A17 B3	1	4	2	64	16	2	0,33
16	A17 B5				128	32	2
17	A14 B4	8	16	16	32	32	4 to 8	0,65
20	A17 B2	1	4	< 0,5	32	8	0,5	0,33
21	A24 C1	< 0,25	4	1	8	8	0,25–0,5	0,65
22	A24 C1 ac.	1	16	1	16	16	1	< 0,16
23	A21 A5	8	16	8	64	32	8	0,65
25	A20 A5	1	16	2	64	16	1	0,65
26	A14 B5	16	32	32	> 128	128	4	2,6
32	A25 D5 Orn ac.	8	> 64	32	64	> 128	8	1,3
33	A25 D5 Gly				32	> 128	8
34	A26 C2	4	32	8	8	32	4 to 8	1,3
35	A26 C5 Orn	16	32	16	8	16	4 to 8	2,6
36	A26 C3 Orn ac.	4	32	16–32	8	64–128	4 to 8	1,3
37	A26 C4	16	16	16	8	32	8	10,5
38	A18 G6	0,5	2	< 0,5	2	4	2	1,3
39	A18 G6 ac.	1	4	< 0,5	4	16	4	0,33
40	A26 B2 ac.	1	4	< 0,5	8	16	4	0,33
41	A26 B4 ac.	4	32	8	> 128	128	8	5,25
43	A26 B5				> 128	> 64	> 64
44	A26 B3				128	64	4
45	A26 B2	1	4	< 0,5	8	4	2	0,65
46	A26 C5 Orn ac.	32	32–64	32	16	32–64	8	10,5
47	A26 C3 Orn	4	32	32	8	32–64	8	1,3
48	A27 B6	4	32	4	64	128	16	1,3
49	A27 B5	2	64	4	32	128	8	1,3
50	A27 B4				> 128	> 128	32

Die SEQ ID Nr. 1, 2 stellen die Wildtyp-Sequenzen zum Vergleich dar. SEQ ID Nr. 4, 19, 26, 32, 33, 41, 43, 44 und 50 sind weniger bevorzugte Beispiele der Erfindung (mit Q als X₄ – in Position 10). Die anderen gezeigten SEQ ID Nr. sind erfindungsgemäß bevorzugte Peptide oder Peptidderivate. Am meisten bevorzugte Beispiele sind die SEQ ID Nr. 7–8, 11–13, 20–22, 25, 39, 40, 45, 65 und 67.
Die Amidierung des C-Terminus resultiert nicht nur in besserer antibakterieller Aktivität, d. h. niedrigere MHK-Werte, sondern reduziert auch den C-terminalen Abbau durch Exoproteasen.
Ebenso reduziert eine Acetylierung der N-terminalen Aminogruppe den N-terminalen Abbau, wie oben beschrieben. Jedoch reduziert die N-terminale Acetylierung die MHK-Werte für einige getestete Bakterienstämme (z. B., SEQ ID Nr. 21 im Vergleich zu SEQ ID Nr. 22 und SEQ ID Nr. 38 im Vergleich zu SEQ ID Nr. 39), was darauf hindeutet, dass der N-terminale Rest eine Ladung tragen sollte. Infolgedessen wurde Glycin in der X₁ Position durch Reste ausgetauscht, die eine positiv geladene Seitenkette haben, zum Beispiel Lysin (z. B. SEQ ID Nr. 21), Arginin und Ornithin (z. B. SEQ ID Nr. 12). Diese N-terminal modifizierten Peptide, die an der X₁ Position einen Rest mit positiv geladener Seitenkette haben, zeigten bessere MHK-Werte als die acetylierten Wildtyp-Apidaecin-Sequenzen. Ein weiterer wichtiger Rest für die Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität ist der Austausch von Glutamin an Position 10 (Rest X₄) mit einem Rest, der eine positiv geladene Seitenkette trägt, wie zum Beispiel Ornithin (z. B. SEQ ID Nr. 12 und 13), Lysin (z. B. SEQ ID Nr. 21 and 22) oder Arginin (z. B. SEQ ID Nr. 38 and 39). Dieser Austausch an Position 10 (Rest X₄) gegen einen Rest, der eine positive geladene Seitenkette trägt, reduziert nicht die Proteaseresistenz, da die darauf folgende Position ein Prolin enthält, das die proteolytische Spaltung der N-terminalen Peptidbindung durch Endoproteasen effektiv reduziert. Die Substitution des Prolins in Position 11 (Rest X₅) durch Hydroxyprolin hat weder einen Einfluss auf die MHK-Werte innerhalb der Fehlergrenze des Tests, noch reduziert es die Proteaseresistenz der N-terminal liegenden Peptidbindung. Während dieser Austausch durch Hydroxyprolin weder einen Effekt auf die MHK-Werte noch einen Effekt auf die Serumstabilität hat, reduziert die höhere Polarität zusätzlich die Zelltoxizität und die Hämolyse, da polarere Peptide schwächer an Zellmembranen binden. Deshalb beinhaltet ein sehr bevorzugtes Peptid Ornithin an Position 1 (Rest X₁), Arginin an Position 10 (Rest X₄) und Hydroxyprolin an Position 11 (Rest X₅) ist am N-Terminus acetyliert und ein C-terminales Amid, wie z. B. SEQ ID Nr. 40. Des Weiteren wurde die Peptidbindung zwischen Position 17 und 18, d. h. Arg und Leu/Ile der Originalsequenz beispielsweise durch N-Methylierung (z. B. SEQ ID Nr. 33, 34) modifiziert, um seine Protease- und Peptidaseresistenz zu erhöhen. Alternativ wurde Arginin an Position 17 (Rest X₆) durch basische Reste ersetzt, die für eine Protolyse nicht anfällig sind, wie z. B. Ornithin (z. B. SEQ ID Nr. 38).
Die MHK-Werte der getesteten Peptide und Peptidderivate gegenüber verschiedenen Bakterienspezies sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Die folgenden Bakterienstämme wurden getestet:

– Eschericha coli 1103, 10233, BL 21 AI, DC 2,
– Klebsiella pneumoniae 681,
– Micrococcus luteus ATCC 10240,
– Mycobacterium vaccae
– Bactillus subtilis 347.

SEQ ID Nr.	Synthese Nr.	E. coli	E. coli	M. luteus	E. coli	E. coli	K. Pneumoniae	Myco bacterium	B. subtilis
		10233	BL 21 AI	ATCC 10240	1103	DC 2	681	vaccae	347

1	A24 C3	1,95	0,98	31,25	1,95	3,91	15,62	> 125	> 125
2	A24 C4	1,95	0,98	31,25	7,81		62,5		> 125
7	A18 G5 ac.		0,49	3,91	1,95	3,9	1,95	125	> 125
8	A18 G5		0,24	7,84	1,95–0,95	0,98	1,95	125	> 125
9	A17 A4		0,49	1,95	3,9	1,95	3,9	125	> 125
11	A18 B4	3,91	0,49	1,95	3,9	0,98	1,95	125	125
12	A20 E1	0,98 1, 95	0,98	1,95	3,91		7,81		62,5
13	A20 B1 ac.	1,95	1,95	1,95	3,81		3,91		125
14	A14 B3		0,49	0,98	0,98	7,81	15,62
15	A17 B3		0,98	1,95	1,95	3,9	3,9	125	> 125
16	A17 B5		0,98	3,91
17	A14 B4		0,98	0,98	1,95	31,25	31,25
20	A17 52		0,49	1,95	3,9	1,95–3,91	3,9	125	> 125
21	A24 C1		1,95–3,91	1,95–0,98
22	A24 C1 ac.		1,95	1,95
23	A21 A5	3,91	1,95–3,91	0,12	7,81		62,5		125
25	A20 A5		3,91	1,95
26	A14 B5		3,91	1,95	3,91	7,81	15,62
32	A25 D5 Orn ac.	31,25	15,63	7,81	31,4		> 125		> 125
33	A25 D5 Gly	15,63	15,63	31,25	62,5		> 125		> 125
38	A18 G6	1,95	1,95	1,95	3,91	0,98	1,95	125	62,5
39	A18 G6 ac.	1,95	1,95	0,98	3,91	0,98	3,9	125	125
40	A26 B2 ac.	1,95			3,91		3,91		125
45	A26 B2	1,95–3,91			7,81		7,81		62,5
62	A18 A1		1,95	7,81
63	A18 A1 ac.		3,91	3,91
65	A18 A2 ac.		0,98	0,98	1,95	7,81	7,81	62,5	125
66	A18 A5		1,95	1,95	3,9	1,95	3,9	125	62,5
67	A18 A5 ac.		3,91	1,95	3,9	3,9	3,9	125	125
68	A18 B1		7,81	0,24	3,9	7,81	31,25	125	> 125
69	A20 B4		7,81	0,24
70	A21 A6		15,63	0,49
71	A25 D3 Orn		31,25	3,91
72	A25 D4 Orn		> 125	7,81
73	A25 D6 Orn		62,5	7,81
74	A25 E1 Orn		> 125	7,81
75	A25 E2 Orn		> 125	7,81
76	A25 D3 Gly		62,5	15,63
77	A25 D4 Gly		> 125	31,25
78	A25 D6 Gly		125 62, 5	31,25
79	A25 E1 Gly		> 125	62,5
80	A25 E2 Gly		> 125	15,63
83	A29 C4 ac.	31,25	1,95	1,95			125		15,6
84	A29 C5 for	1,95	1,95	3,91			62,5		> 125
85	A29 C5 guan	1,95	0,24	15,63			31,25		> 125
86	A28 A3		3,91	0,98					62,5
88	A30 C1 guan	1,95	0,98	1,95			7,81		62,5
89	A17 A5		1,95	15,63
90	A17 B1		0,98	7,81
91	A17 B4		1,95	7,81
92	A17 C1		3,91	31,25
102	A20 A6		1,95	1,95
103	A20 A6 ac.		1,95	3,91

Die Wildtypsequenzen (SEQ ID Nr. 1, 2) sind als Vergleichsproben aufgerührt. Die SEQ ID Nr. 26, 32, 33, 62, 63 und 70–80 sind weniger bevorzugte Beispiele der Erfindung (mit Q als X₄ – Position 10). Die anderen gezeigten SEQ ID Nr. sind erfindungsgemäß bevorzugte Peptide oder Peptidderivate.
Generell ist die gemessene antibakterielle Aktivität im MHK Test für die getesteten Peptidsequenzen sehr ähnlich zu den in Tabelle 4 gezeigten und nachfolgend diskutierten Daten. Kurz zusammengefasst, ist die Amidierung des C-Terminus erwünscht, da sie die MHK-Werte signifikant für die getesteten Bakterien reduziert. Die Acetylierung des N- Terminus reduziert den N-terminalen Abbau durch Peptidasen oder Proteasen, wie zuvor beschrieben. Die besten MHK-Werte wurden für Peptide oder Peptidderivate erhalten, die eine positiv geladene Gruppe am N-terminalen Ende der Peptide tragen. Deshalb ist es von Vorteil Glycin an Position 1 durch Lysin (z. B. SEQ ID Nr. 21 und 22), Arginin oder Ornithin (z. B. SEQ ID Nr. 7 und 8) zu substituieren, d. h. Reste, die eine positiv geladene Seitenkette tragen. Ornithin ist dabei bevorzugt, da es keine tryptische Spaltstelle einbringt. Diese N-terminal acetylierten Peptide zeigten bessere MHK Werte als die acetylierten Wildtyp Sequenzen. Ein anderer weiterer wichtiger Rest zur Verbesserung der antibakteriellen Aktivität ist der Austausch von Glutamin an Position 10 (Rest X₄) gegen einen Rest mit einer positiv geladenen Seitenkette, wie zum Beispiel Ornithin (z. B. SEQ ID Nr. 12 und 13), Lysin (z. B. SEQ ID Nr. 21 und 22) oder Arginin (z. B. SEQ ID Nr. 38 und 39). Dieser Austausch verringert nicht die Proteaseresistenz, da die folgende Position ein Prolin enthält, welches die proteolytische Spaltung der N-terminalen Peptidbindung effektiv reduziert. Eine Alternative zur N-terminalen Acetylierung ist die Guanidierung (z. B. SEQ ID Nr. 88), diese ist ebenfalls sehr effektiv und erweitert zusätzlich die Aktivität auf B. subtilis, der sowohl gegenüber der Wildtypsequenz des Apidaecins als auch gegenüber den meisten anderen Analoga resistent ist. Der Austausch von Prolin an Position 11 (Rest X₅) durch Hydroxyprolin reduziert weder die MHK-Werte noch die Proteaseresistenz, reduziert aber als polarere Aminosäure weiter die Zelltoxizität und die hämolytische Aktivität. Dem entsprechend enthält ein bevorzugtes Peptid Ornithin an Position 1 (Rest X₁), Arginin oder Ornithin an Position 10 (Rest X₄) und Hydroxyprolin an Position 11 (Rest X₅), einen acetylierten oder guanidierten N-Terminus und ein C-terminales Amid, wie zum Beispiel SEQ ID Nr. 40 und 103.
Interessanter Weise wird durch einige Modifikationen eine Aktivität gegen B. subtilis erhalten, die nicht bei den nativen Wildtyp-Apidaecinpeptiden beobachtet wurde. Das gemeinsame Merkmal dieser Sequenzen mit einer Aktivität gegen B. subtilis ist ein positiv geladener N-Terminus, d. h. eine freie Aminogruppe oder ein guanidierter N-Terminus, ein Arginin oder Ornithin an Position 10 (Rest X₄) und vorzugsweise ein Ornithin an Position 1 (Rest X₁) der Apidaecin 1b Sequenz (Leucin an Position 18 – z. B. SEQ ID Nr. 12, 38, 45, und 66). Die korrespondierenden homologen Apidaecin 1a Peptide (Isoleucin an Position 18) waren nicht gegen B. subtilis aktiv. Dieselben Sequenzmodifikationen (geladener N-Terminus, ein Arginin oder Ornithin an Position 10 und ein Ornithin an Position 1) der Apidaecin 1a Sequenz erweiterte die Aktivität auf M vaccae (SEQ ID Nr. 65).
Beispiel 4: Untersuchung der Toxizität an humanen Zellen
1. Hämolysetest
Um bestimmen zu können, ob die in der Erfindung beschriebenen Peptide und Peptidderivate auf Zellen toxisch wirken, wurden verschiedene Peptide und Peptidomimetika aus Beispiel 1 oben, eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle auf ihre hämolytische Aktivität untersucht. Die hämolytische Aktivität wurde an humanen Erythrozyten untersucht [43]. Von dem Leipziger Universitätskrankenhaus (Leipzig, Deutschland) wurde ein humanes Erythrozyten-Konzentrat in Natriumchlorid-Adenin-Glukose-Mannitol-Puffer zur Verfügung gestellt. Die Erythrozyten wurden bei 1000 G abzentrifugiert und drei Mal mit dem zehnfachen Volumen an kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) gewaschen. Die Erythrozyten wurden auf eine Endkonzentration von 1% in PBS verdünnt. Einhundert Mikroliter dieser humanen Erythrozytensuspension wurden in jede V-förmige Vertiefung einer 96er Polypropylen-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One GmbH) pipettiert. In jede Position wurden dann 100 μL der in PBS gelösten Peptide hinzugefügt, um eine Verdünnungsreihe von 600 μg/mL bis zu 4,8 μg/mL in sieben Verdünnungsstufen zu erhalten. Die Mikrotiterplatte wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 1000 G zentrifugiert. Einhundert Mikroliter des Überstands wurden in eine 96er Polystyrol-Mikrotiterplatte mit Flachböden überführt (Greiner Bio-One GmbH) und die Absorption bei 405 nm in einem Mikrotiterplatten-Spektrometer (Tecan) bestimmt, um die Freisetzung der Hämgruppe, auszuwerten. PBS und 0,1% Triton X-100 wurden als Negativ- bzw. -Positivkontrolle eingesetzt. Der Hämolysegrad wurde mit der folgenden Gleichung bestimmt [44]: (EPeptid – EPBS)/(ETriton – EPBS) × 100% mit E = Extinktion bei 405 nm
Alle Hämolysetests wurden zweifach durchgeführt. 4 und Tabelle 6 zeigen das arithmetische Mittel von drei unabhängigen Experimenten.
4 zeigt das Ergebnis des hämolytischen Tests für die Peptide A30 C1 guan. (SEQ ID Nr. 88), A18 G6 ac. (SEQ ID Nr. 39) und A17 A6 (SEQ ID Nr. 6), sowie PBS und TritonX-100^® (p-tert-Octylphenoxy)polyethoxyethanol) als Kontrollen.

Die Ergebnisse für weitere Peptide und Peptidderivate sind in Tabelle 6 zusammengefasst: Tabelle 6

Seq. ID Nr.	Synthese Nr.	Hämolysegrad [%]
1	A24 C3	0,9
2	A24 C4	0,8
38	A18 G6	1,0
39	A18 G6 ac.	1,4
23	A21 A5	1,1
24	A21 A5 ac.	0,9
83	A29 C4 ac.	1,3
84	A29 C5 FA	0,8
33	A25 D5 Gly	0,6
88	A30 C1 guan.	1,3
	Triton X-100^®	100

Keines der geprüften Peptide zeigte irgendeine hämolytische Aktivität bis zu einer Konzentration von 600 μg/mL, das heißt sogar bei einer 100 bis 1200 fachen höheren Konzentration als die beobachten MHK-Werte. Die Hämolyseraten aller Peptide betrugen relativ gesehen zum Triton X-100^® nur etwa 1%, was innerhalb der Fehlergrenzen dieses Tests liegt. Das nicht-ionische Tensid Triton X-100^® wurde als Positivkontrolle eingesetzt, da es rote Blutzellen in dem Versuchsaufbau innerhalb einer Stunde komplett zerstört. Dieser Zelltest zeigt, dass die Peptide und Peptidderivate in hohen Konzentrationen im Blut eingesetzt werden können, ohne Nebeneffekte auf die roten Blutzellen zu haben.
Zusammengefasst kann man sagen, dass alle getesteten Peptide und Peptiderivate die Eigenschaft eines idealen antimikrobiellen Präparats besitzen, das keinerlei hämolytische Aktivität bei einer 100 fachen Konzentration des MHK-Wertes zeigen sollte.
2. COS Zellen
COS-7 Zellen wuchsen in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (Cellgro, Meidatech Inc., Herndon, VA, U. S. A.) mit 10% fötalem Rinderserum bei 37°C in einer 10% CO₂ Atmosphäre. 24 Stunden vor der Peptidzugabe wurden die Zellen (5 × 10³ Zellen/Vertiefung) in eine 24er Kulturplatte überführt und inkubiert. Die Peptide wurden in 0,5 mL Wasser gelöst und in 1 mL Medium zu einer Endkonzentration von 60, 200 und 600 μg/mL überführt (Zweifach-Bestimmung). Die Platten wurden für weitere 24 h bei 37°C in einer 10% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Das Medium wurde abgenommen und das Experiment wurde durch die Zugabe von 100 μL Trypsin – Ethylenediamintetraacetat (EDTA) (0,25% Trypsin/0,1% EDTA in Hank's ausgeglichener Salzlösung; Cellgro) gestoppt. Die behandelten Proben und die Kontrollproben wurden geerntet, mit PBS gewaschen und mit kaltem, 70% wässrigem Ethanol für 2 h fixiert. Die Zellen wurden dann in PBS, das 10 μg/mL Propidiumiodid (PI) und 250 μg/mL RNAse enthält, resuspendiert und anschließend 30 min bei 37°C inkubiert. Die Nekrose/Apoptose-Raten wurden mittels Durchflusszytometrie an einem Guava^® EasyCyte^TM Mini System (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) bestimmt.
Diese Studie untersucht den Effekt der getesteten Peptide und Peptidderivate (Zweifachbestimmung) auf den Zellzyklus der COS-7 Zellen bei verschiedenen Konzentrationen, das heißt den Anteil der Zellen in den G1, S und G2/M – Phasen, sowie den Anteil der nekrotischen und apoptotischen Zellen. Die Daten wurden relativ zum Leerwert (ohne Peptid und Peptidderivat) und zu einer Lösung von 10% DMSO, das die Zellen komplett zerstört, bewertet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Wie in der vorhergehenden Tabelle gezeigt, hat keines der Peptide oder Peptidderivate einen detektierbaren Einfluss auf den Zellzyklus (DNA-Verteilung), da sich alle Werte in der Fehlergrenze der beiden Leerwerte befanden, selbst bei der höchsten Konzentration von 600 μg/mL. Bedeutend ist, dass weder Nekrose noch Apoptose im Vergleich zum Leerwert erhöht waren. Diese Daten beweisen in Kombination mit der hämolytischen Aktivität (Tab. 6), dass die untersuchten Peptide und Peptidderivate nicht zytotoxisch auf zellulärer Ebene sind, selbst bei Konzentrationen bis 600 μg/mL, was mehr als das Hundertfache der MHK-Werte darstellt. Tabelle 7

Seq.-ID Nr	Peptide	Konzentration [μg/mL]	Nekrose und Apoptose	G1	S1	G2/M
			%	%	%	%
8	A18 G5	600	11	39	26	24
		600	15	38	26	21
		200	17	47	26	9
		200	16	43	27	14
		60	18	44	29	9
32	A25 D5 Orn ac	600	10	35	28	27
		600	13	42	28	17
		200	29	29	27	15
		200	18	37	32	13
		60	18	39	29	14
45	A26 B2	600	11	40	25	23
		600	16	43	27	14
		200	20	49	26	6
		200	18	50	24	9
		60	18	45	25	13
23	A21 A5	600	11	40	27	22
		600	11	38	28	24
		200
		200	19	39	29	13
		60	20	40	28	13
Kontrol.	blank		12	35	28	25
	blank1		23	33	33	10
	blank2		17	41	22	20
	10% DMSO 1	10% (v/v)	0	0	0	0
	10% DMSO 2	10% (v/v)	0	0	0	0

Abkürzungen:

Die folgenden Abkürzungen werden durchgehend für die Bezeichnung der Aminosäuren verwendet:

A	Ala	Alanin
	βAa oder bAla	beta-Alanin, beta-Aminopropionsäure
R	Arg	Arginin
	Har	Homoarginin
	βHar oder bHar	beta-Homoarginin
	Cha	Cyclohexylalanin
	Chex	1-Amino-cyclohexylcarbonsäure
	Dab or Dbu:	Diaminobuttersäure
D	Asp	Asparaginsäure
N	Asn	Asparagin
	Cit	Citrullin
C	Cys	Cystein
	GABA	Gamma (γ)-aminobuttersäure
Q	Gin	Glutamin
E	Glu	Glutaminsäure
G	Gly	Glycin
H	His	Histidin
	Hyl	δ-Hydroxylysin
I	Ile	Isoleucin
L	Leu	Leucin
	MeLeu	N-Methylleucin
K	Lys	Lysin
M	Met	Methionin
0	Orn	Ornithin
P	Pro	Prolin
	3Hyp	3-Hydroxyprolin in cis oder trans
	4Hyp	4-Hydroxyprolin in cis oder trans
	3^cHyp	cis-3-Hydroxyprolin
	3^tHyp	trans-3-Hydroxyprolin
	4^cHyp	cis-4-Hydroxyprolin
	4^tHyp	trans-4-Hydroxyprolin
F	Phe	Phenylalanin
T	Thr	Threonin
	tertGly	tert.-Butylglycin
Y	Tyr	Tyrosin
S	Ser	Serin
W	Trp	Tryptophan
V	Val	Valin

Weitere Abkürzungen umfassen die folgenden:

Ac:: Acetyl,
Api:: Apidaecin,
AMP:: Antimikrobielle Peptide,
BSA:: Rinderserumalbumin,
CFU:: Kolonie-formende Einheit,
DCM:: Dichloromethan,
DMF:: Dimethylformamid,
EDTA:: Ethylenediamintetraacetat,
ESI:: Elektrosprayionisierung,
DIPEA:: N,N'-Diisopropylethylamin,
For:: Formyl (Methanoyl),
Fmoc:: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl,
Guan:: Guanidino-Gruppe,
HBTU:: 2-(1-H-Benzotriazol-1-y1)-tetramethyluronium hexafluorophosphat,
HPLC:: Hochleistungflüssigkeitschromatographie (high perfomance liquid chromatography),
HMBA:: 4-Hydroxymethylbenzoesäure,
MALDI:: Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (Matrix-assisted laser desorption/ionization),
Me:: Methyl,
MeCN:: Acetonitril,
Me: OH: Methanol,
MHK:: Minimale Hemmkonzentration,
MS:: Massenspektrometrie,
NB:: Nährboullion,
OMe:: Methylester
PBS:: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung,
PI:: Propidiumiodid,
RP:: Umkehrphase (Reversed-Phase),
RT:: Raumtemperatur,
tBu:: tert.-butyl,
TCA:: Trichloressigsäure
TFA:: Trifluoressigsäure,
TOF:: Flugzeit (time of flight),
TSB:: tryptisch gespaltene Sojanährboullion (Tryptic soy broth),
UV:: Ultraviolett.

Literatur:
Die folgende Nichtpatentliteratur wird in der Anmeldung zitiert:

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Peptid oder Peptidderivat mit mindestens 16 Resten und der folgenden allgemeinen Formel
worin X₁ ein neutraler Rest oder ein Baustein ist, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt; X₂ ein Rest mit einer polaren Seitenkette oder ein Baustein ist, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette. trägt; X₃ ein Rest ist, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt; X₄ ein neutraler Rest mit einer polaren Seitenkette, bevorzugt jedoch nicht Glutamin, oder ein Baustein ist, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt; X₅ Prolin oder ein Prolinderivat ist; Sub₁ die freie N-terminale Aminogruppe der Aminosäure X₁ oder eine modifizierte N-terminale Aminogruppe darstellt; Sub₂ die freie C-terminale Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure oder eine modifizierte C-terminale Carboxylgruppe darstellt; wobei die nativen Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 (GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH) und SEQ ID No. 2 (GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH) nicht enthalten sind.
Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 1, welches mindestens einen zusätzlichen Rest X₆ und/oder X₇ in Sub₂ enthält, wobei X₆ ausgewählt ist aus Prolin oder einem Prolinderivat oder einem Baustein, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt und wobei X₇ ausgewählt ist aus Prolin oder einem Prolinderivat oder einem polaren Baustein oder einem hydrophoben Baustein.
Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Rest X₁ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin, 3,5-Dinitrotyrosin, N-Methylleucin, N-Methylisoleucin, tert.-Butylglycin, β-Alanine, Norleucine, Norvaline, N-Methylvalin, 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Aminoisobutansäure, 3-Aminoisobutansäure, Aminovaleriansäure, 2-Aminopimelinsäure, Pipecolsäure, Iodo-Tyrosin, 3,5-Diiodo-Tyrosin, 3,5-Dibromo-Tyrosin, β-Cyclohexylalanin, p-Aminobenzoesäure, ε-Aminocapronsäure, 3,4-cis-Methanoprolin, Phenylglycin, 3,4-Dehydroprolin, 4-Amino-5-Cyclohexyl-3-hydroxypentansäure, O-Phosphotyrosine, O-Sulfotyrosine, Aminoethylpyrrolcarbonsäure, 4-Aminopiperidin-4-Carbonsäure, α-Aminoadipinsäure, Homoprolin, Homophenylalanin, p-Fluoro-Phenylalanin, 3,4-Dichloro-Phenylalanin, p-Bromo-Phenylalanin, p-Iodo-Phenylalanine und p-Nitro-Phenylalanin sowie Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobutansäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin und 3-Aminotyrosin enthalten.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rest X₂ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Serin, Threonin, Homoserin, allo-Threonin und Citrullin, sowie Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobutansäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Omithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin und 2,6-Diaminohexinsäure enthalten.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Rest X₃ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobutansäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Lysin, Arginin, Omithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin und 3-Amino-Tyrosin enthalten.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Rest X₄ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Asparagin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin, 3,5-Dinitrotyrosin und Citrullin, sowie Arginin, Lysine, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobutansäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminipropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin und 3-Amino-Tyrosin enthalten.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der Rest X₆ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin oder Pseudoproline, sowie Arginin, bevorzugt D-Arginin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobutansäure, β-Homoarginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminipropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Lysin, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, Histidin, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin, 3-Aminotyrosin enthalten.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Rest X₇ ausgewählt ist aus den Gruppen, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin, Pseudoproline, Serin, Threonin, Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin, 3,5-Dinitrotyrosin, 6-Hydroxylysin, sowie Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin, Alanin, 1-Amino-Cyclohexylcarbonsäure, N-Methylleucin, N-Methylisoleucin, tert-Buylglycin, β-Alanin, Norleucin, Norvalin, N-Methylvalin, 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Aminoisobutansäure, 3-Aminoisobutansäure, Aminovaleriansäure, 2-Aminopimelinsäure, Pipecolsäure, Tryptophan, Iodo-Tyrosin, 3,5-Diiodo-Tyrosin, 3,5-Dibromo-Tyrosin, β-Cyclohexylalanin, p-Aminobenzoesäure, ε-Aminocapronsäure, 3,4-cis-Methanoprolin, Phenylglycin, 3,4-Dehydroprolin, 4-Amino-5-cyclohexyl-3-hydroxypentansäure, O-Phosphotyrosin, O-Sulfotyrosin, Aminoethylpyrrolecarbonsäure, 4-Aminopiperidin-4-carbonsäure, α-Aminoadipinsäure, Homoprolin, Homophenylalanin, p-Fluoro-Phenylalanin, 3,4-Dichlorophenylalanin, p-Bromo-Phenylalanin, p-Iodo-Phenylalanin, p-Nitro-Phenylalanin enthalten, oder aus einer kurzen Peptidsequenz oder einem verzweigten Linker, der mehrere Peptideinheiten enthält.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 3 bis 121.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei mindestens eine der Peptidbindungen des Peptidrückgrats durch eine nicht spaltbare chemische Bindung ersetzt ist.
Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 10, wobei die Bindung zwischen X₆–X₇ eine nicht spaltbare chemische Bindung ist.
Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die nicht spaltbare chemische Bindung ausgewählt ist aus einer reduzierten Amidbindung, einer alkylierten Amidbindung oder eine Thioamidbindung.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, hergestellt durch chemische Synthese oder mittels rekombinanter Methoden.
Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, welches mit einem Protein verbunden oder an ein Polymer gekoppelt ist.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, welches an einen Träger gebunden ist.
Multimer, in dem mindestens zwei Peptide oder Peptidderivate miteinander verbunden sind, wobei mindestens eines der Peptide oder Peptidderivate ein Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche mindestens ein Peptid, Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 enthält.
Ein Verfahren zur Behandlung einer mikrobiellen, bakteriellen oder Pilz-Infektion, bei der man eine Menge eines Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 einem Säugetier, welches die genannte Infektion aufweist, verabreicht
Verwendung eines Peptids, Peptidderivats oder Multimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 als Antibiotikum, in einem Desinfektions- oder Reinigungsmittel, als Konservierungsmittel oder in einem Verpackungsmaterial.
Verwendung nach Anspruch 18 zur Behandlung von mikrobiellen, bakteriellen oder Pilz-Infektionen oder Verunreinigungen mit Mikroben, Bakterien oder Pilzen.
Ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die vorrausichtlich eine antimikrobielle, bakterizide oder antimykotische Wirkung aufweist, welche folgendes umfasst: (i) Durchführung eines kompetitiven Assays mit: (a) einem Mikroorganismus der gegenüber einem Peptid, Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 empfindlich ist; (b) einem Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15; und (c) mindestens einer zu testenden Substanz durch in Kontakt bringen von (a) mit (b) und (c); sowie (ii) Auswahl einer Testsubstanz, welche kompetitiv die Bindung des Peptids oder Peptidderivats an den Mikroorganismen verdrängt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die ausgewählte Substanz anschließend weiter auf eine antimikrobielle oder antimykotische Verwendung getestet wird.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Mikroorganismus eine Spezies ist, die einer der Gattungen ausgewählt aus Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti und Haemophilus influenzae angehört.
Nukleinsäure codierend für ein Peptid oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
Wirtszelle, welche mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 24 transfiziert oder transformiert ist.