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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung eines linearen Zusammenhangs
zwischen der Stoffmenge einer chemischen Substanz in einer lichtstreuenden
Matrix und dem von dem Streulicht der Probe hervorgerufenen Messsignal.
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Wird
die Intensität
J des von einer Probe mit hinreichend dicker Schicht zurückgestreuten
Streulichtes nach der Einstrahlung mit diffusem Licht der Intensität I
o (von oben auf die Probe) gemessen und werden
die beiden Intensitäten
als Remissionswert R
∞ verknüpft, wobei
gilt
so folgt nach der Theorie
von Kubelka-Munk ein linearer Zusammenhang zwischen dem transformierten
Remissionswert
und dem Absorptionskoeffizienten
a der Probe sowie eine umgekehrte Proportionalität zwi schen der transformierten
Messgröße
und dem Streukoeffizienten
s mit:
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Der
Absorptionkoeffizient a entspricht dabei dem in der Probe absorbierten
Anteil der einfallenden Intensität;
analog entspricht der Streukoeffizient s dem Anteil der in der Probe
gestreuten Intensität.
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In
der Theorie nach Kubelka und Munk kann Licht innerhalb einer Probe
nur gestreut oder absorbiert werden. Damit wird die auf die Probe
eingestrahlte Lichtintensität
I0 zu dem Anteil aI0 absorbiert
und zum Anteil sI0 gestreut. Somit gilt
unter der Voraussetzung, dass lediglich Absorption und Streuung
erfolgt: I0 =
aI0 + sI0 = I0(a + s) Gleichung
2 und es folgt die folgende Beziehung: s = (1 – a)
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Die
Kubelka/Munk-Gleichung besitzt nur Gültigkeit, wenn innerhalb der
Probe gleich viel Licht entgegen der Einstrahlrichtung des Lichtes
wie in der Einstrahlrichtung des Lichtes gestreut wird. Nur dann
ergibt sich mit (1) ein linearer Zusammenhang zwischen der Kubelka/Munk
transformierten Messgröße
und dem Absorptionskoeffizienten
a, der seinerseits ein Maß für die Konzentration
eines Stoffes in einer Probe darstellt. Bei der Einstrahlung mit
diffusem Licht ist nach Rayleigh diese Bedingung gegeben, und daher
wird die Bestrahlung mit diffusem Licht als Grundlage für die Ableitung
der Kubelka/Munk benötigt.
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Daneben
wird die in der Probe gestreute Intensität durch die Dichte der Probe,
die mittlere Partikelgröße sowie
durch die Verteilung der Partikelgröße beeinflusst.
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Wird
mit gerichtetem statt diffusem Licht eingestrahlt, weil eine diffuse
Einstrahlung nicht möglich oder zu
umständlich
ist, ist nicht in jedem Fall sichergestellt, dass gleich viel Licht
entgegen der Einstrahlrichtung des Lichtes wie in der Einstrahlrichtung
des Lichtes gestreut wird. Ist aber diese Bedingung nicht gegeben, kann
die Kubelka/Munk-Formel auch nicht angewendet werden bzw. das nach
(1) transformierte Messsignal zeigt keine lineare Korrelation mit
dem Absorptionskoeffizienten a der Probe.
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Dies
hat zur Folge, dass in Messanordnungen zur photometrischen Bestimmung
der Konzentration eines Stoffes in einer Probe entweder sichergestellt
werden muss, dass die Probe diffus beleuchtet wird oder dass in
Kauf genommen werden muss, dass der Messung und insbesondere der
nachfolgenden Auswertung kein linearer Zusammenhang des transformierten
Messsignals mit der Konzentration des gesuchten Stoffes in der Probe
zugrunde gelegt werden kann.
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Es
ist also Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben,
durch das die photometrische Bestimmung einer Stoffkonzentration
in einer Probe vereinfacht werden kann.
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Diese
Aufgabe wird durch das Verfahren mit den in Anspruch 1 aufgeführten Merkmalen
gelöst.
Die Unteransprüche
betreffen vorteilhafte Varianten und Ausführungsformen der Erfindung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zum Kalibrieren einer Streulichtmessvorrichtung zur Bestimmung von
Stoffanteilen in Proben weist dabei die folgenden Schritte auf:
Zunächst wird
eine Mehrzahl von Referenzproben mit einem bekannten Anteil eines
zu messenden Stoffes mit Licht bestrahlt und ein transformierter
Messwert KM aus der gestreuten Intensität bestimmt. Dabei kann für KM insbesondere
gelten:
wobei der Remissionswert
R der Quotient aus zurückgestreuter
und auf die Probe einfallender Intensität (für einen bestimmten Messquerschnitt)
ist und k einen Kalibrierungsfaktor darstellt. Nachfolgend wird
k so lange variiert, bis sich ein linearer Zusammenhang zwischen
KM und und dem Anteil des zu messenden Stoffes ergibt, der in einer
festen Relation mit dem Quotienten aus Absorptionskoeffizient a
und Streukoeffizient s der Probe steht.
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Da
der Absorptionskoeffizient a bzw. der Streukoeffizient s unmittelbar
mit der Menge der in der Probe vorhandenen zu messenden Substanz
zusammenhängt,
eröffnet
das geschilderte Vorgehen eine vorteilhafte Möglichkeit zur schnellen Auswertung
von photometrischen Messungen. Die geschilderte Linearisierung erlaubt
es dabei, aus dem an realen Proben gemessenen transformiertem Messwert
KM durch einfache Interpolation schnell den in der realen Probe
vorhandenen Anteil der zu messenden Substanz zu bestimmen. Insbesondere
bei zeitkritischen Anwendungen wie beispielsweise der In-Situ-Analytik
zur Zusammensetzung von Tabletten durch eine optische Messung von
Granulaten insbesondere im IR-, NIR-, UV- oder sichtbaren Spektralbereich
oder im Rahmen einer Dünnschicht-Chromatographie
lässt sich
das beschriebene Verfahren vorteilhaft anwenden, ohne dass zu einer
schnellen Auswertung eine große
Rechenleistung benötigt
wird.
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Ein
weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass
sich durch die Anpassung des Wichtungsfaktors k die Möglichkeit
eröffnet,
auch floureszierende Proben zu Untersuchen oder auch die Farben
von Proben reproduzierbar zu charakterisieren.
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Ferner
erübrigt
sich durch das erfindungsgemäße Verfahren
die Notwendigkeit, diffuses Licht zur Beleuchtung der Probe zu erzeugen,
da die Einstrahlungscharakteristik durch die Anpassung des Wichtungsfaktors
k berücksichtigt
werden kann. Die Verwendung von bspw. Ulbrichtkugeln zur Erzeugung
diffusen Lichtes wird somit überflüssig, so
dass das erfindungsgemäße Verfahren
auch für
Proben verwendet werden kann, die die Analysevorrichtung beispielsweise
auf einem Fließband
passieren.
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Dabei
kann das Verfahren zur Kalibrierung für verschiedene Lichtwellenlängen, beispielsweise
in Verbindung mit einem Dioden-Array-Spektrometer, zur Anwendung
kommen.
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Nachfolgend
soll neben dem theoretischen Hintergrund ein Ausführungsbeispiel
der Erfindung in Verbindung mit den Figuren kurz erläutert werden.
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Es
zeigen:
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1 Eine
schematische Darstellung der Interaktion des (gerichteten) eingestrahlten
Lichtes (Io) mit fünf dargestellten virtuellen
Probeschichten; und
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2 die Ergebnisse einer exemplarischen
Kalibrationsmessung
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Zunächst soll
für die
gerichtete Remission in der Probe ein neuer Ausdruck abgeleitet
werden:
Vom Anteil (1 – a)
der nicht absorbierten, also gestreuten Lichtintensität soll per
Definition der Anteil k in entgegengesetzter Richtung der Einstrahlung
gestreut werden. Es gilt: q ≡ k(1 – a)
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Der
in der Probe in Einstrahlrichtung gestreute Anteil ergibt sich damit
zwangsläufig
aus dem Restlicht zu: p ≡ (1 – k)(1 – a)
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Die
Variable k steht damit für
einen Wichtungsfaktor der Streustrahlung. Bei k-Werten zwischen
0.5 und 1 wird eine größere Lichtintensität entgegen
der Einstrahlrichtung als in Einstrahlrichtung gestreut. Wird innerhalb
der Probe diffus in alle Richtungen gleich gestreut, wird k = 1/2
und es gilt so für
p = q die Bedingung der Kubelka/Munk-Theorie. Für diesen Fall geht die neue
Formel in den von Kubelka und Munk abgeleiteten Ausdruck [1] über.
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Die
Frage, wie viel Licht die Probe nach oben (entgegengesetzt der Einstrahlrichtung)
verlässt,
kann geometrisch gelöst
werden. Dargestellt ist das Problem in 1.
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1 zeigt
schematisch die Interaktion des (gerichteten) eingestrahlten Lichtes
(Io) mit fünf dargestellten virtuellen
Probeschichten. Der Anteil q von 10 wird
nach oben gestreut, der Anteil p wird in Einstrahlrichtung nach
unten gestreut. Die Intensität
des nach oben abgestrahlten Streulichtes, berechnet aus der Reflexion
von fünf
virtuellen Schichten, berechnet sich zu: J = qI0 +
pq2I0 + 2p2q3I0 +
5p3q4I0 +
(9 + 5)p4q5I0 + ... +.
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Die
graphische Auswertung führt
zu folgender Reihe, die gegen einen Grenzwert konvergiert, der nur vom
Absorptionskoeffizienten a (und vom Wichtungsfaktor k) abhängt:
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Aus
dieser Beziehung folgt, nach dem Absorptionskoeffizienten a aufgelöst, die
neue Transformationsformel für
den Remissionswert R:
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Der
Vorteil der hier beschriebenen Linearisierungsmethode für Remissionsmessungen
in streuenden Proben liegt darin, dass weder diffuses Licht zur
Einstrahlung benötigt
wird noch der Streukoeffizient der Probe zur Auswertung bekannt
sein muss. Trotzdem wird eine lineare Abhängigkeit zwischen (transformiertem) Messsignal
und dem Absorptionskoeffizienten erhalten.
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Die
Art der probeninternen Streuung wird durch den Abgleich der Messwerte
mit Formel (1) vorgenommen. Dazu werden die Remissionswerte einer
Kalibrationsmessung solange mit verschiedenen k-Werten verknüpft, bis
als Ergebnis eine Gerade vorliegt. Aus dem Geradenausgleich der
Messwerte mittels linearer Regression wird ein Maß für die Güte der Ausgleichsgerade
gewonnen. Dies kann der Korrelationskoeffizient oder die Summe der
quadrierten Abweichungen zwischen den Messwerten und den über die
lineare Regression ermittelten Geradengleichung sein.
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Beim
Einsatz eines Dioden-Array Spektrometers kann neben dem k-Wert noch
die Absorptionswellenlänge
variiert werden. Damit wird ein dreidimensionales Feld erstellt,
das aus den k-Werten (zwischen 0 und 1 liegend), den verschiedenen
Wellenlängen
im Messbereich und dem resultierenden Gütegrad der linearen Regression
besteht. Für
einen k-Wert bei einer Wellenlänge
ist die lineare Regression optimal. Der so gefundene k-Wert beschreibt die
Gewichtung der probeninternen Streuung und liefert damit eine Matrixcharakteristik
der Probe. Diese wird zur quantitativen Bestimmung des Analyten
(der zu bestimmenden Zielsubstanz) in dieser Probenmatrix herangezogen.
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Es
wird also das Wissen aus der Theorie benutzt, um die Messwirklichkeit
mit dieser Theorie richtig zu beschreiben bzw. es wird angenommen,
das eine Nichtlinearität
bei Kubelka/Munk-transformierten Messwerten ihre Ursache in der
nicht diffusen Streuung innerhalb der Probe hat. Dieses Wissen wird
benutzt, um durch den Abgleich der Messwerte mit verschiedenen k-Werten
die Formel zu finden, die einen linearen Zusammenhang zwischen (transformierten)
Messwerten und der Probeabsorption zeigt. Ist die richtige Formel (aus
dem Experiment) gefunden, können über den
entsprechenden k-Wert
Aussagen zur gerichteten Streuung innerhalb der Probe gemacht werden.
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Das
Vorgehen wird nachfolgend anhand einer Coffein-Bestimmung mittels Dünnschichtchromatographie (DC)
erläutert.
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Vermessen
wurden (auf eine lichtstreuenden DC-Platte) verschiedene Coffein-Mengen
im Bereich 1 ng bis 1000 ng im Wellenlängenbereich von 271.5 bis 279.8
nm. Der Datensatz wurde für
verschiedene k-Werte ausgewertet und über ein Polynom zweiten Grades
angeglichen; das Ergebnis der Messung und des Kurvenfits ist in
den
2a–
2c dargestellt.
Bei einem k-Wert von k = 0.5 hängt
die in
2a dargestellte Ausgleichsfunktion
in einer für
Kubelka/Munk-Auswertungen typischen Art und Weise durch. Für einen
k-Wert von k = 0.9 ergibt sich eine gekrümmte Kurve, vgl.
2c.
Nur der k-Wert von
k = 0.68 zeigt eine Gerade; der entsprechende Graph findet sich
in
2b. Damit ist für dieses DC-Plattenmaterial die Streuwichtung bestimmt. Weitere
Messungen zeigen bei diesem Plattenmaterial nur dann eine lineare
Abhängigkeit
zwischen transformiertem Messsignal und Probe-Absorption, wenn folgende
Formel benutzt wird:
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Diese
Formel kann nachfolgend unter Verwendung des auf die vorstehende
Weise ermittelten Faktors k einfach zur Bestimmung des Coffeinanteils
unbekannter Proben herangezogen werden, indem für ein gemessenes KM auf der
wie oben beschrieben linearisierten Kurve der entsprechende Wert
für a aufgesucht wird.
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Für viele
Anwendungen in der Farbenindustrie, der Bekleidungsindustrie, der
Drucktechnik, der pharmazeutischen Analytik (NIR-Messungen von Granulaten)
und nicht zuletzt der Dünnschicht-Chromatographie erleichtert
ein linearer Zusammenhang zwischen Streulichtintensität und Absorptionskoeffizient
die Arbeit oder macht Mehrkomponentenrechnungen erst möglich.
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Ebenso
kann das Verfahren vorteilhaft zur Kalibrierung einer Vorrichtung
zur Durchführung
einer Mehrkomponentenanalyse, im Rahmen eines chemometrischen Verfahrens,
einer Principal Component Anlalysis (PCA) oder einer Multi Linear
Regression verwendet werden.
und dem Absorptionskoeffizienten a der Probe sowie eine umgekehrte Proportionalität zwi schen der transformierten Messgröße
und dem Streukoeffizienten s mit:
