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Die
vorliegenden Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen und
Hilfsmittel, die marines Kollagen enthalten, zur Hemmung von Matrix-Metallo-Proteasen
sowie die Verwendung marinen Kollagens zur Herstellung von Zubereitungen
zur Behandlung und Therapie von Erkrankungen, die durch Matrix-Metallo-Proteasen
vermittelt sind.
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Die
Matrix-Metallo-Proteasen (Matrix-Metallo-Proteinasen/Matrix-Metallo-Peptidasen/MMP)
bilden eine Enzym-Familie, die in verschiedenen Zellen gebildet
wird und die für
die extrazelluläre
Degradation von Makromolekülen
verantwortlich ist. Der Name "Matrix-Metallo-Proteasen" ist darauf zurückzuführen, daß die katalytische
Aktivität
der Proteasen auf einem Zinkatom im katalytischen Zentrum beruht
und die strukturelle Stabilität
des Proteins durch Kalium gewährleistet
wird.
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MMPs
werden in vier verschiedene Klassen eingeteilt, wobei diese Einteilung
unter anderem aufgrund der Domänenstruktur
und bevorzugter Substrate erfolgt, so daß beispielsweise Kollagenasen
und Gelatinasen unterschieden werden.
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Aufgabe
der MMPs ist die Hydrolyse von Komponenten der extrazellulären Matrix
wie Kollagenen, Gelatine, Nektinen, Lamininen, Elastin und Core-Proteinen
der Proteoglykane. Sie spielen daher bei den physiologischen Prozessen
der Gewebeumwandlung, beispielsweise in der Embryonalentwicklung,
dem Wachstum, aber auch in der Wundheilung und in pathobiologischen
Prozessen eine entscheidende Rolle.
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Während MMPs
unter "normalen
Bedingungen" in
Haut, Gewebe und Gelenken praktisch nicht oder nur in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden
können,
treten sie bei Verletzungen der Haut und bei Erkrankungen wie Rheuma
und Arthritis verstärkt
auf. Darüber
hinaus konnte ihre Wirkung bei der Tumorbildung und Metastasierung
verschiedener Tumore gezeigt werden. So ist beispielsweise die MMP
13 bei zahlreichen Malignomen hochreguliert.
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Neben
der Behandlung der zuvor genannten MMP-vermittelten Erkrankungen
wie Rheuma und Arthritis, die bei einer Vielzahl älterer und
zunehmend auch jüngerer
Patienten auftreten, stellt auch die Heilung von Wunden, in denen
naturgemäß erhöhte MMP
13-Konzentrationen nachgewiesen werden können, seit jeher ein Problem
dar. Dieses gilt umsomehr für
chronische Wunden, wobei unter chronischen Wunden solche verstanden
werden, die nach 6 – 8
Wochen keine Tendenz zur Heilung zeigen und unter denen nach aktuellen
Schätzungen
ca. vier Millionen Menschen in Deutschland leiden, wobei jährliche
Behandlungskosten in Höhe
von zwei bis drei Milliarden Euro anfallen.
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Ein
wichtiger Faktor bei der Ausbildung dieser chronischen Wunden ist,
wie bereits erwähnt,
ein starkes Ungleichgewicht zwischen der Proteasekonzentration (MMP-Konzentration)
im Wundsekret und der Konzentration der korrespondierenden Proteasehemmer
(TIMP-Konzentration). Normalerweise erfolgt die Regulierung der
MMPs, die nach der Sekretion zunächst
aktiviert werden, durch die TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases).
Bei einer Störung
dieses empfindlichen Gleichgewichts liegt jedoch ein Überschuß an Proteasen
vor, der nicht nur neu gebildetes, zur Wundheilung und zum Wundschluß erforderliches
Gewebe sofort wieder abbaut, sondern auch gesundes Gewebe angreift
und lysiert und Wachstums faktoren deaktiviert, wodurch es zu einer
kontinuierlichen, teilweise schleichenden Verschlechterung der Wunde
kommt.
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Studien
zur Wundheilung haben gezeigt, daß dagegen in MMP-13-defizienten Wunden
die Wundheilung in starkem Maße
gefördert
und beschleunigt ist.
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Eine
stärkere
Hemmung und eine geringere Aktivität bzw. Konzentration der MMPs,
insbesondere der MMP 13, wäre
somit ein geeigneter Ansatzpunkt für die Behandlung chronischer
Wunden sowie arthritischer und rheumatischer Erkrankungen.
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In
vitro können
MMPs durch Chelatbildner wie EDTA inhibiert werden, die das Zink
des katalytischen Zentrums oder das strukturell relevante Kalium
binden oder blockieren. Darüber
hinaus sind zahlreiche pharmakologische Präparate bekannt, die die Aktivität der MMPs
hemmen. Allerdings sind diese Hemmer oft wenig spezifisch, so daß sie neben MMPs
auch andere Enzyme beeinflussen oder sogar eine zytotoxische oder
toxische Wirkung auf den gesamten Organismus ausüben.
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Eine
alternative, im Stand der Technik bekannte Behandlungsmethode für chronische
Wunden ist beispielsweise die Applikation von kollagenhaltigen Wundauflagen,
wodurch den in der Wunde sezernierten Proteasen ein alternatives
Substrat angeboten wird und die abbauenden Enzyme kompetitiv gehemmt
werden sollen.
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Ein
Problem dieser Behandlung ist, daß die Proteasen eine mangelnde
Spezifität
gegenüber
den verwendeten Kollagenauflagen aufweisen und die Aktivität der MMPs
durch den Kollagenüberschuß nur unzureichend
gehemmt wird. Ein weiteres Problem ist, daß diese Kollagenauflagen meist
aus Rindersehnen oder Häuten
gewonnen werden. Bei dieser Kollagenquelle besteht die latente Gefahr
und bei Verbrauchern immer noch die verbreitete Angst, daß die Wundauflagen
BSE-Erreger (BSE = Bovine Spongioforme Enzephalopathie) enthalten
könnten. Mit
der Auswahl alternativer Quellen wie z.B. Pferd oder Schwein kann
diese Problematik zwar weitgehend umgangen werden, aber auch hier
besteht das Restrisiko einer Infektion mit TSE-Erregern (TSE = Transforme
Spongioforme Enzephalopathie).
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher, eine pharmazeutische Zubereitung
oder ein pharmazeutisches Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen, das die Aktivität der MMPs
hemmt und die Wundheilung und chronisch entzündliche Erkrankungen verbessert,
ohne dabei die inhärente
Gefahr einer Infektion mit Erregern einer spongioformen Enzephalopathie
zu tragen, toxische Wirkungen zu zeigen oder andere unerwünschte Arzneimittelwirkungen
aufzuweisen.
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Überraschenderweise
hat sich gezeigt, daß pharmazeutische
Zubereitungen, die aus marinen Organismen gewonnenes Kollagen (marines
Kollagen), insbesondere aus Chondrosia reniformis gewonnenes Kollagen,
enthalten, eine stark hemmende Wirkung auf die MMP-Aktivität und insbesondere
auf MMP 13 ausüben,
so daß pharmazeutische
Präparate
auf Basis dieses Kollagens zur Behandlung MMP-vermittelter Erkrankungen
eingesetzt werden können.
Ein Vergleich zu handelsüblichen
Kollagenzubereitungen (z.B. aus bovinem oder porcinem Kollagen)
zeigte keine Aktivitätsbeeinträchtigung
der Proteasen gegenüber
dem Kontrollexperiment. Marines Kollagen gemäß der vorliegenden Erfindung
wird dabei als Kollagen definiert, das aus marinen Schwämmen (Porifera)
oder anderen marinen Organismen ohne Nervensystem gewonnen worden
ist.
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Ein
weiterer Vorteil dieser Zubereitungen mit marinem Kollagen ist,
daß der
Quellorganismus kein Nervensystem besitzt, so daß die Gefahr einer Übertragung
von TSE-Erregern und eine damit einhergehende Infektion völlig ausgeschlossen
ist.
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Weiterhin
besitzen die erfindungsgemäßen Zubereitungen
nur ein sehr geringes allergenes Potential und die Zubereitungen
können
vom Organismus vollständig
abgebaut werden.
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Wie
bereits dargelegt, hemmen Zubereitungen mit aufbereitetem marinen
Kollagen, das vorzugsweise aus Schwämmen, und besonders bevorzugt
aus Chondrosia reniformis, gewonnen worden ist, die Aktivität von MMPs
signifikant (s. 1). Die Abnahme der Konzentration
und somit der Aktivität der
MMPs zeigt sich dabei bereits eine Stunde nach Applikation der Zubereitung.
Die Zugabe weiterer Inhibitoren ist nicht erforderlich, da im Gegensatz
zu den bekannten Präparaten
die Kollagenpräparate der
vorliegenden Erfindung MMPs hinreichend inhibieren und binden.
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Das
für die
pharmazeutischen Zubereitungen der vorliegenden Erfindungen verwendete
Kollagen wird durch Extraktion der Kollagenfraktion aus Chondrosia
reniformis und anschließende
Reinigung des Extraktes gewonnen, wobei eine Kollagenlösung erhalten
wird.
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In
einer Ausführungsform
liegt die pharmazeutische Zubereitung als sterile Kollagenlösung vor. Die
Lösung
kann sowohl zur Wundbehandlung als auch zur intrakorporalen Anwendung,
z.B. zur Injektion in das Gelenk bei Gelenkerkrankungen wie Arthrose,
verwendet werden.
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Zur
Wundbehandlung können
beispielsweise handelsübliche,
kollagenfreie Wundauflagen mit der erfindungsgemäßen Kollagenlösung getränkt werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
sieht vor, daß das
Kollagen aus der dargestellten Lösung
durch Veränderung
des pH-Wertes oder durch Zugabe von Ethanol oder anderer geeigneter,
physiologisch akzeptabler Lösemittel
zur Herstellung eines Kolloids oder einer Dispersion ausgefällt wird.
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Die
Viskosität
des erhaltenen Kolloids oder der Dispersion kann durch Reduktion
der Lösemittel, z.B.
durch Entfernung im Vakuum oder durch Zentrifugation, oder durch
Viskositätsmodifikatoren
wie PVP (Polyvinylpyrrolidon), Polyacrylaten oder Cellulosederivaten,
wie z.B. Carboxymethylcellulose (CMC), Hydroxyethylcellulose (HEC),
Hydroxyethylpropylcellulose (HEPC) oder Methylcellulose (MC), eingestellt
werden, so daß ein
Gel oder eine hochviskose Lösung
entsteht.
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Sowohl
die Dispersion oder das Kolloid als auch das Gel können dann
zur Wundbehandlung oder als Injektion in ein Gelenk zur Arthrosetherapie verwendet
werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
sieht vor, daß das
gereinigte Kollagen aus der Lösung
ausgefällt, getrocknet
und zu einem Granulat verarbeitet wird, das in Zubereitungen wie
Cremes und Salben oder Wundauflagen eingearbeitet wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die erfindungsgemäßen Zubereitungen
poröse Schwämme, die
ein marines Kollagen enthalten, bevorzugt Kollagen, das aus Chondrosia
reniformis gewonnen und gemäß dem Verfahren
nach Beispiel 1 aufbereitet wurde, wobei Wundauflagen zur Hemmung
der MMPs, die den Wundschluß beschleunigen,
besonders bevorzugt allein aus marinem Kollagen bestehen.
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Die
Kollagenzubereitungen der vorliegenden Erfindung können dabei
neben anderen Wirk- und Hilfsstoffen zusätzlich mindestens einen weiteren, die
MMPs nicht hemmenden Wirkstoff enthalten, beispielsweise nichtsteroidale
Antirheumatika wie Acetylsalicylsäure oder Ibuprofen und/oder
Antibiotika.
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Zur
Herstellung der Wundauflagen wird eine aus Chondrosia reniformis
extrahierte und gemäß der Vorschrift
aus
DE 10 2005
008 416 A1 (siehe Beispiel 1) aufgearbeitete Kollagenlösung gefriergetrocknet,
wobei ein poröser
Kollagenschwamm entsteht. Der so erhaltene Kollagenschwamm kann
in flächige
Stücke
entsprechender Größe zerteilt
und bis zur Verwendung steril verpackt gelagert werden. Um die Lagerfähigkeit
des Produktes zu verbessern und um einer Infektion im Produkt verbliebene
Erreger vorzubeugen, können
der Kollagenlösung
antimikrobielle Wirkstoffe zugesetzt, die verpackten Einheiten bestrahlt
(Dosis: 25 kGy) und/oder mit Ethylenoxid begast werden.
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Die
Vorteile der so erhaltenen Wundauflagen sind, daß von ihnen keinerlei Infektionsgefahr
mit TSE-Erregern ausgeht und die im Wundexsudat vorhandenen MMPs,
insbesondere MMP 13, deaktiviert und die Wundheilung gefördert werden.
Die Deaktivierung der MMPs ist dabei zum einen auf eine kompetitive
Hemmung des Substrats zurückzuführen, da das
in den Wundauflagen vorhandene marine Kollagen entweder bevorzugt
oder aber langsamer als das natürliche
Substrat abgebaut wird, zum anderen darauf, daß in die Auflage aufgenommenes
Exsudat gebunden und die MMP 13 immobilisiert wird, so daß ein "Rückfluß" zur Wundoberfläche und somit der Abbau neu
gebildeter Strukturen verhindert und die Wundheilung verbessert
wird.
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Wie
aus 1 ersichtlich, ist eine deutliche Verminderung
der Aktivität
der MMP 13 bereits 60 min nach Zugabe des Kollagens zu beobachten, während bei
handelsüblichen
Kollagenzubereitungen eine deutlich höhere Aktivität der MMP
13 und keine Veränderung
gegenüber
dem Kontrollexperiment zu sehen ist. Die hier gezeigte schnelle
und effiziente Aktivitätsminderung
der MMP 13 ist aber, wie bereits oben beschrieben, eine der Grundvoraussetzungen, um
die Wundheilung bei chronischen Wunden einzuleiten. Die Zugabe eines
weiteren Inhibitors der MMP 13, z.B. eines unspezifischen Chelatbildners,
ist bei den erfindungsgemäßen Zubereitungen
nicht erforderlich.
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Die
Immobilisierung der MMPs in der Kollagenmatrix kann in einer weiteren
Ausführungsform dadurch
verstärkt
werden, daß wundseitig
eine semipermeable Membran auf dem Kollagenschwamm angeordnet ist,
die die Aufnahme von Exsudat in den Schwamm gestattet, den Rückfluß von Exsudat
und Abbauprodukten aber verhindert.
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Ein
weiterer Vorteil der so dargestellten Wundauflagen ist ihr aufgrund
der hohen Reinheit geringes allergenes Potential und die vollständige biologische
Abbaubarkeit auch in der Wunde.
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Neben
Kollagenschwämmen
können
mittels modifizierter Verfahren wie Ausstreichen und Trocknen auch
Kollagenfilme hergestellt werden.
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Darüber hinaus
ist die Beschichtung von geeigneten Trägermaterialien wie Folien und
Textilgewebe mit Kollagenfilmen und -schwämmen möglich, wobei die Folien und
Gewebe sowohl eine undurchlässige
als auch eine semipermeable Rückschicht bilden
können.
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Eine
weitere Ausführungsform
sieht vor, daß die
Rückschicht
zusätzlich
auf eine der zuvor beschriebenen Auflagen aufgebracht wird, wobei
bevorzugt die Fläche
der Rückschicht
größer als
die Fläche
des Kollagenschwammes ist und die überstehenden Bereiche mit einem
hautverträglichen
Haftkleber beschichtet sind, so daß die Wundauflage auf der Haut über der
Wunde fixiert werden kann.
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Die
oben genannten erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zubereitungen und Hilfsmittel können
weiterhin Konservierungsstoffe und antimikrobiell wirksame Verbindungen
(z.B. Silbersulfadiazin, Biguanide, Polyhexanid, Nitroxolin, Octenidin, Taurolidin,
Chlorhexidin, Benzalkonium-Halogenide und pharmakologisch akzeptable
Salze oder Derivate der genannten Verbindungen), Viskositätsmodifikatoren
(z.B. Polyvinylpyrrolidon oder Acrylate), Wachstumsfaktoren und
andere Wundheilungsfaktoren, Hautschutzmittel (Fettsäuren, Fettsäureester) und
dergleichen enthalten.
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Darüber hinaus
ist eine weitere Sterilisierung der Produkte mittels Strahlung (25
kGy), durch Begasung mit Ethylenoxid oder mit anderen geeigneten und
dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Mitteln vorgesehen.
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In
den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
dargestellt.
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Beispiel 1: Kollagenaufbereitung
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Nach
dem in der
DE
10 2005 008 416 A1 beschriebenen Verfahren wurde ein in
einem sauren Medium (pH 3) ausgefälltes Kollagenpräzipitat
aus Chondrosia reniformis durch Filtration vom Medium abgetrennt
und die Feuchtigkeit auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt von etwa
84 Gew.-% reduziert. Anschließend
wurden 121 Gramm der Kollagenrohmasse unter zweistündigem Rühren in
1300 ml einer wäßrigen 0,5
%-igen (v/v) H
2O
2-Lösung suspendiert und
der pH der Lösung
mittels einer 5 N NaOH-Lösung auf
einen Wert von 12,4 eingestellt, um die Kollagenfasern in Lösung zu
bringen. Die resultierende Kollagenlösung wurde zur Entfernung unlöslicher
Bestandteile filtriert und anschließend unter kräftigem Rühren in
2600 ml Ethanol (Konz. 98 %) oder, abweichend von der
DE 10 2005 008 416 A1 ,
in eine HCl-Lösung
mit einem pH von 0-3 gegeben und während der Zugabe in den Grenzen
von 0-3 gehalten, wobei das Kollagen mit einer weißen oder
leicht gelblichen Farbe in faseriger Form ausfiel. Die Kollagenfasern
wurden durch Filtration vom Medium abgetrennt, von anhaftender Feuchte
befreit und anschließend
unter Rühren
in 300 ml Reinstwasser homogen suspendiert. Der pH der Suspension
wurde mit einer 5 N HCl-Lösung
auf einen Wert von 6,5 eingestellt. Die so erhaltene Kollagenlösung hatte
eine Kollagen-Konzentration von 2,8 Gew.-%.
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Alle
Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
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Um
gemäß einer
alternativen Ausführungsform
eine sterile Kollagenlösung
zu erhalten, wurden sämtliche
Objekte, die mit dem Kollagen in Kontakt kommen, vor ihrer Verwendung
mit einer 0,5 %-igen (v/v) H2O2-Lösung gespült und die
gefällten Kollagenfasern
nicht in Wasser, sondern in 300 ml einer wäßrigen 0,5 %-igen (v/v) H2O2-Lösung suspendiert.
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Beispiel 2:
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Aus
der in Beispiel 1 hergestellten Zubereitung wird unter Verwendung
von Verdickern (z.B. PVP (Polyvinylpyrrolidon), Polyacrylaten oder
anderen, dem Fachmann bekannten Creme- und Salbenbasen) eine Creme
oder Salbe zur kutanen Anwendung hergestellt, die bei Applikation
in einer Wunde die MMPs hemmt und den Wundschluß fördert.
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Ein
besonderer Vorteil dieser Zusammensetzung ist der noch in der Salbe
verbliebene Wasserstoffperoxidanteil der Kollagenlösung, der
zum einen die Haltbarkeit der Zubereitung erhöht und zum anderen in der Wunde
eine antiseptische Wirkung entfaltet.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die Kollagenlösung
kurzzeitig erhitzt oder mit einem Reduktionsmittel oder Katalysator
versetzt werden, um das Restperoxid zu zerstören.
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Beispiel 3:
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Die
nach Beispiel 1 hergestellte Kollagenlösung wird mit 0,55 Wasserstoffperoxidlösung oder mit
Reinstwasser auf eine Kollagenkonzentration von 1-2% eingestellt.
In der bevorzugten Ausführung
wird die Kollagenkonzentration auf 1 Gew.-% und der pH Wert auf
6,1 eingestellt. Die Lösung
wird in einer Schale ausgebracht und gefriergetrocknet. Der so erhaltene
Kollagenschwamm kann als Wundauflage zur Behandlung schlecht heilender
oder chronischer Wunden verwendet werden.
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Beispiel 4:
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden der Kollagenlösung
vor der Gefriertrocknung antibiotische oder antimikrobielle Wirkstoffe
zugesetzt.
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Dazu
wird der nach Beispiel 1 hergestellten Kollagenlösung unter starkem Rühren eine
zuvor in 0,5 %-iger (v/v) H2O2-Lösung oder Reinstwasser gelöste antimikrobielle
Substanz zugesetzt bis der Kollagengehalt 1 Gew.-% beträgt. Die
Konzentration der antimikrobiellen Sustanz liegt zwischen 0,5 – 2 Gew.-%
bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens. Vorzugsweise ist die
antimikrobielle Substanz Polyhexamethylenbiguanid-Hydrochlorid (Polymerisationsgrad
= 12-18) mit einer Konzentration von 1 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht
des Kollagens. Die so hergestellten antimikrobiellen Lösungen bzw.
Dispersionen werden in eine Schale gegeben eingefroren und anschließend gefriergetrocknet.
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Beispiel 5:
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
wird eine antimikrobielle Wundauflage durch Imprägnierung mit einer antimikrobiellen
Substanz hergestellt.
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Dazu
werden nach Beispiel 3 hergestellte Kollagenschwämme mittels im Stand der Technik
bekannter Verfahren (z.B. Beschichten oder Besprühen) mit einer antimikrobiell
wirksamen Substanz imprägniert.
Hierbei wird eine konzentrierte wässrige oder alkoholische Lösung (10-50%)
einer antimikrobiellen Substanz hergestellt und durch Sprühen oder Beschichten
auf den Kollagenschwamm aufgebracht, so daß eine Konzentration der antimikrobiellen
Substanz von 0,5–2
Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens erhalten wird.
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In
einer bevorzugten Ausführung
wird eine wäßrige oder
eine ethanolische Polyhexamethylenbiguanid-Hydrochlorid-lösung (20
Gew.-%) durch Sprühen
auf den Kollagenschwamm in einer Konzentration von 50 μl Lösung pro
Gramm Kollagenschwamm aufgebracht, so daß eine Polyhexamethylenbiguanid-Hydrochlorid-Konzentration von
1 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens erhalten wird.
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Beispiel 6:
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Die
Versuche zur Bestimmung der Hemmung der MMP-13 durch die erfindungsgemäßen Kollagenzubereitungen
wurden wie folgt durchgeführt.
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1. Probenvorbereitung
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Für die Experimente
zur Hemmung der MMP-13 wurde aus lyophilisierten Proteinstandards eine
Lösung
mit einer Konzentrationen 2000 pg/mL hergestellt.
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Aus
den gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellten Zubereitungen sowie aus handelsüblichen
Kollagenauflagen wurden mit einer 8 mm Biopsie-Stanze (Stiefel Laboratorium
GmbH, Offenbach, Germany) Stücke
einheitlicher Größe (je 0,5
cm2) ausgestanzt und in 24-Well-Zellkulturplatten überführt. Jede
Probe wurde in 1 mL Proteinlösung
aufgenommen und anschließend
für 24
h auf einem Schüttler
(ThermoStar, BMG Labtech GmbH, Offenburg) bei 37°C inkubiert. Die Abnahme des Überstandes
zur Kontrolle der MMP-13-Konzentration erfolgte nach 0, 1, 8 und
24 h, wobei die Proben sofort bei –20°C bis zur Messung eingefroren
wurden. Als Kontrollexperiment wurden Proben ohne Kollagenzubereitung
gemessen.
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2. Bestimmung der MMP-13-Konzentration
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Die
Matrix-Metalloproteinase-13-Konzentration wurden mit Hilfe Enzym-markierter
Immunosorbent-Assays (Quantikine pro-MMP-13 Immunoassay DM1300, R&D Systems GmbH,
Wiesbaden) quantifiziert. Die Bestimmung der MMP-Konzentration erfolgte
im Plattenreader (Fluostar, BMG Labtech GmbH, Offenburg) durch Messung
der optischen Dichte (OD) bei 450 nm (Referenzwellenlänge: 620 nm).
Anschließend
konnte die Enzymkonzentration anhand einer „lin-log" Auftragung (OD bzw. Fluoreszenz – lineare
Skala; Konzentration – Logarithmische Skala)
mittels 4-Parameter-Fit
berechnet werden. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen,
die erhaltenen Werte gemittelt und der Standardfehler berechnet.
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Die
MMP-13-Konzentration wurde für
jeden Mess-Zeitpunkt durch zwei bis vier unabhängige Ansätze bestimmt. Die einzelnen
Messungen erfolgten in Doppelbestimmung. Die in 1 angegebenen Konzentrationen
sind die gemittelten Werte aus jeweils 4, 6 bzw. 8 Messdaten unter
Berücksichtigung des
Standardfehlers. Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde
eine einfache Varianzanalyse (ANOVA one way) durchgeführt.