DE102005036529A1 - Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines Objektes - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines in einer Objektebene befindlichen Objektes (5) bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Abbildungssystem wie einem Mikroskop, wobei zusammen mit dem Objekt (5) eine Markierung (3) abgebildet wird, und wobei aufeinanderfolgende Abbildungen der Markierung (3) verglichen und bei einer Abweichung der jeweiligen Markierungen (3) eine Kompensation dieser Abweichung im aufzunehmenden Objektbild vorgenommen wird. Die Markierungen (3) können auch zur Fokussierung verwendet werden.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines in einer Objektebene befindlichen Objektes bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Abbildungssystem. Insbesondere behandelt die Erfindung ein Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines auf einem Objektträger befindlichen Objektes bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Mikroskop. Weiterhin betrifft die Erfindung eine für dieses Verfahren geeignete Markierungsplatte.
• Bei der mikroskopischen Beobachtung von Objekten, wie lebende Zellen oder Mikroorganismen, über einen längeren Zeitraum (mehrere Minuten bis mehrere Tage) tritt häufig das Problem auf, dass sich die Lage eines Objekts im Bild und häufig auch bezüglich der Fokusebene selbst bei unbeweglichen Objekten ändert. Diese Lagenänderung des Objekts ist bedingt durch die nur endliche mechanische und thermische Stabilität des Mikroskops, insbesondere da einige veränderliche Wärmequellen auf das Mikroskop einwirken (wie die Präparattemperierung, starke Lampen, die Elektronik im Stativ selbst und andere mehr). Aus den über einen längeren Zeitraum gewonnen Einzelbildern (zum Beispiel im zeitlichen Abstand von einigen Minuten) werden im allgemeinen Zeitrafferfilme hergestellt, bei denen dann die Instabilität des Gerätes, also des Mikroskops oder allgemeiner des Abbildungssystems, als vermeintliche (zuckende) Bewegung des Objekts störend bzw. irreführend sichtbar wird. Grundsätzlich ist der Vergleich aufeinanderfolgender Objektbilder erschwert, wenn sich die Lage des Objekts in Bild- und/oder Fokusebene ändert.
• Zur Kompensierung dieser Artefakte, also der scheinbaren Objektbewegungen aufgrund der mechanisch/thermischen Instabilität des Abbildungssystems, sind mechanisch-konstruktive Maßnahmen, wie thermische Isolierung, Materialauswahl, etc. vorgeschlagen worden, die jedoch mit hohem Aufwand verbunden sind und letztlich nur unzureichende Wirkung zeigen. Darüberhinaus besteht die Möglichkeit, bei motorisch angetriebenen Mikroskopen über im Gerät angebrachten Weggeber oder Temperatursensoren und einer gerätespezifischen Tabelle temperaturbedingte Verschiebungen elektromechanisch zu kompensieren. Auch diese Maßnahme ist mit hohem Aufwand verbunden und das Ergebnis erweist sich letztlich als unzureichend.
• Häufig werden viele Objekte wie Zellen während eines Versuchs beobachtet, die sich zwar auf demselben Präparatträger, aber nicht notwendig im selben Gesichtsfeld bzw. Fokus befinden. Über einen motorischen Tisch können die Zellen zyklisch abgefahren werden, so dass neben der eigentlichen statischen mechanisch/thermischen Instabilität des Gerätes (Mikroskops) auch Positionierfehler des Motortisches im Objektbild störend sichtbar werden.
• Wenngleich im folgenden der Anmeldegegenstand am Beispiel eines Mikroskops als Abbildungssystem beschrieben werden soll, ist die Erfindung nicht auf ein solches Abbildungssystem beschränkt.
• Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine lagegetreue Abbildung eines Objekts bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Abbildungssystem zu realisieren, so dass etwaige mechanische/thermische Instabilitäten des Abbildungssystems sowie etwaige mechanische Positionierfehler keinen oder einen möglichst geringen Einfluß auf die Lage des Objektes im Objektbild ausüben können.
• Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung und gemäß Anspruch 5 gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Markierungsplatte ist Gegenstand des Anspruchs 9. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieser Markierungsplatte ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
• Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird zusammen mit dem Objekt (mindestens) eine Markierung abgebildet, wobei aufeinanderfolgende Abbildungen der Markierung verglichen und bei einer Abweichung der jeweiligen Markierungen eine Korrektur bzw. Kompensation dieser Abweichung im aufzunehmenden Objektbild vorgenommen wird.
• Da Objekt und Markierung einander zuzuordnen sind, können die jeweiligen Markierungen als Referenz der bei wiederholter Bildaufnahme entstehenden Objektbilder verwendet werden. Eine Abweichung der jeweiligen Markierungen voneinander weist auf ein Artefakt hin, das durch die oben angesprochenen Instabilitäten oder Positionierfehler des Abbildungssystems verursacht ist. In diesem Fall wird eine Korrektur vorgenommen, so dass die Markierungen in aufeinan derfolgenden Objektbildern wieder zur Deckung kommen. Bei unbeweglichen Objekten wäre nach dieser Korrektur das Objekt in sämtlichen Objektbildern an der gleichen Stelle, während bei beweglichen Objekten (zum Beispiel wachsende Nervenzellen) die tatsächliche Bewegung des Objektes ohne die angesprochenen Artefakte beobachtbar ist.
• Die Markierungen lassen sich mit bildanalytischen Methoden lokalisieren und deutlich vom Objekt unterscheiden. In jedem Gesichtsfeld sollten sich nur einige wenige Markierungen befinden, so dass bei in der Praxis auftretenden Verschiebungen durch Mikroskop oder Tisch (im allgemeinen < 30 μm) keine Mehrdeutigkeit bezüglich der Markierungen auftritt. Da zu jedem Objektbild gleichzeitig auch ein Bild (mindestens) einer Markierung aufgenommen wird, ist die Position des Objekts relativ zu einer Markierung, aber im Rahmen der Eindeutigkeit absolut auf dem Objektträger, bekannt. In Zusammenhang mit der bereits erwähnten Abbildung eines auf einem Objektträger befindlichen Objekts ist es sinnvoll, wenn eine Markierung auf dem Objektträger verwendet oder zu diesem Zweck aufgebracht wird.
• Die genannte Korrektur bzw. Kompensation der Verschiebung wird vorzugsweise dadurch vorgenommen, dass das nachfolgende Objektbild softwaretechnisch verschoben wird. Eine solche softwaretechnische Verschiebung ist an sich bekannt und soll daher im Rahmen dieser Anmeldung nicht näher erläutert werden.
• Weiterhin kann es sinnvoll sein, die genannte Korrektur vorzunehmen, indem die Objektebene bzw. der Objektträger verschoben wird. Durch Verschiebung der das Objekt tragenden Objektebene bzw. des das Objekt tragenden Objektträgers können beim erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere größere Abweichungen (typischerweise 20 μm) der aufgenommenen Markierungen kompensiert werden. Bei Mikroskopen mit Motortisch kann eine solche Verschiebung durch Nachpositionieren des Tisches erfolgen. Insbesondere bietet sich eine solche Nachpositionierung bei Positionierfehler des Motortisches an.
• Vorzugsweise werden softwaretechnische Verschiebungen bei kleinen Abweichungen (typischerweise 2 μm) der Markierungen vorgenommen. Es können aber auch beide Methoden im Sinne einer Grob- und Feinkompensierung zum Einsatz kommen.
• Die erfindungsgemäße Markierungsmethode löst auch das Problem einer Fokusverschiebung, wobei hierzu zur Bildaufnahme jeweils auch auf eine Markierung fokussiert wird. Hierzu ist es sinnvoll, Markierungen zu verwenden, die durch ein Autofokussierungsverfahren vollautomatisch lokalisierbar sind. Wiederum können durch diesen zweiten Aspekt der Erfindung mechanisch/thermische Instabilitäten oder Positionierfehler des Abbildungssystems, die zu Verschiebungen der Objektebene aus der Fokusebene führen, kompensiert werden. Hierzu sei angemerkt, dass für mikroskopische Anwendungen der genannten Art bereits Fokusverschiebungen von 1/4 μm Auswirkungen im Objektbild haben können. Eine Nachführung des Fokus ist folglich von großer Wichtigkeit.
• Häufig erfolgt die Untersuchung von Objekten wie lebenden Zellen mittels Fluoressenzmikroskopie. Die zu untersuchenden Objekte sind in der Regel licht- und wärmeempfindlich. Die vorliegende Erfindung gemäß zweiten Aspekt ermöglicht, dass die Autofokussierung nicht auf das Objekt hin, sondern auf die Markierung hin erfolgen kann. So wird das Objekt von Licht- und damit Wärmeeinwirkung verschont.
• Im Allgemeinen fallen die Fokusebenen von Objekt und Markierung nicht zusammen. In diesem Fall wird zunächst auf die Markierung fokussiert und anschließend um die Differenz der Fokusebenen korrigiert und dann das Objekt aufgenommen. Dies stellt bei motorisierten Mikroskopen kein Problem dar, da die Genauigkeit der Relativbewegung des Fokus über kleinere Distanzen (< 10 μ) bei diesen Mikroskopen sehr hoch ist (< 0.2 μm). Auch wenn sich beispielsweise die Markierung auf der Rückseite eines Objektträgers befindet, kann die Lage der Fokusebene jeweils um die Trägerdicke (oder eine andere vorgegebene Distanz) korrigiert werden.
• Es erweist sich als sinnvoll, wenn die Markierung mit einem anderen Abbildungsverfahren und/oder in einem anderen Spektralbereich als das Objekt abgebildet wird. Hierdurch kann vermieden werden, dass das Objekt beim Anfahren oder Suchen der Markierung bei der Einstellung der Fokussierung die bildanalytische Auswertung stört oder selbst ausbleicht oder belastet wird. In der Mikroskopie stehen hier verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung: Abbildung des Objekts in Fluoreszenz, Abbildung der Markierungen im Auflicht oder im Durchlicht (niedrige Beleuchtungsintensität), verschiedene Kontrastierverfahren oder Untersuchung in verschiedenen Spektralbereichen. Dementsprechend können die Markierungen in einem Kontrastierverfahren abgebildet werden, wozu sich in Glas geätzte Markerungen oder dünne auf Glas aufgebrachte strukturierte Markierungen eignen, oder mittels einer Abbildung in Durchlicht- oder Auflichtbeleuchtung, wozu sich beispielsweise aufgedampfte Markierungen (beispielsweise aus Aluminium) eignen. Grundsätzlich lassen sich farbige Markierungen einsetzen, die in einem anderen Spektralbereich als das Objekt abgebildet werden, wobei sich hier Markierungen eignen, die in einem vorgegebenen Spektralbereich reflektieren (bei Auflichtbeleuchtung) oder einen bestimmten Spektralbereich absorbieren (bei Durchlichtbeleuchtung).
• In der Regel ist es sinnvoll, die Fokuseinstellung über die Markierung vorzunehmen (zweiter Aspekt der Erfindung) und anschließend die Markierung abzubilden, um Verschiebungen kompensieren zu können (erster Aspekt der Erfindung).
• Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Markierungsplatte mit einer oder mit mehreren Markierungen geeignet. Im Falle der mikroskopischen Untersuchung kann beispielsweise eine solche Markierungsplatte zusammen mit einem Objektträger verwendet werden. So ist es beispielsweise denkbar, eine dünne Markierungsplatte auf oder unter den Objektträger anzubringen. Ist die Markierungsplatte auf dem Objektträger angebracht, so werden die zu untersuchenden Objekte auf die Markierungsplatte aufgebracht, ist hingegen die Markierungsplatte unter dem Objektträger befestigt, so werden die zu untersuchenden Objekte auf den eigentlichen Objektträger aufgebracht. Bevorzugt ist in diesem Zusammenhang, wenn der Objektträger selbst als Markierungsplatte ausgestaltet ist. Für nicht allzu hohe Anforderungen hat es sich als sinnvoll erwiesen, den Objektträger auf der Rückseite (Unterseite) mit den Markierungen zu versehen, wenn die Vorderseite (Oberseite) für die Objekte vorgesehen ist. So kann die einleitende Fokussierung zunächst auf die auf der Unterseite des Objektträgers befindlichen Markierungen hin vorgenommen werden und anschließend die Fokusebene um einen vorbestimmten Be trag (im wesentlichen die Plattendicke des Objektträgers) korrigiert werden, um die Fokusebene in die zu untersuchenden Objekte zu legen. Da die Markierungen in einer anderen Fokusebene als die zu untersuchenden Objekte liegen, findet eine gewisse optische Trennung der Markierungen vom Objekt statt. Je größer der Abstand der Fokusebenen von Markierung und Objekt ist, desto größer ist die jeweils notwendige Verschiebung durch den motorischen Trieb. Für hohe Anforderungen ist es darum sinnvoll, Markierung und Objekt im wesentlichen in dieselbe Ebene zu bringen (z.B. Zelle liegt auf einem Präparatträger).
• Es ist zweckmäßig, wenn die Markierungen auf der Markierungsplatte bzw. dem Objektträger derart verteilt sind, dass in jedem Gesichtsfeld einer Objektabbildung sich nur einige wenige, vorzugsweise ein bis drei Markierungen befinden. Es zeigt sich, dass in der Regel eine Markierung im Gesichtsfeld ausreichend ist. Durch eine geringe Anzahl von Markierungen im Gesichtsfeld vermeidet man eine Mehrdeutigkeit bezüglich der Markierungen bei den in der Praxis auftretenden geringen Verschiebungen durch das Mikroskop (thermomechanische Verschiebung) bzw. den Mikroskoptisch (Positionierfehler des Motortisches), die sich im allgemeinen unterhalb von 20 μm bewegen.
• Zur Verwendung bei Mikroskopen mit stark vergrößernden Objektiven (zum Beispiel 60 x) müssen die Markierungsplatten bzw. Objektträger mit Markierungen typischerweise in einem Abstand von 50 bis 200 μm, insbesondere zwischen 100 und 150 μm versehen sein. Das lineare oder matrixförmige Aufbringen von Markierungen in einem Abstand von etwa 100 μm kann beispielsweise durch ein Lithographieverfahren vorgenommen werden. Als Markierungen bieten sich Kreise oder Kreuze an oder allgemein Geometrien, die leicht autofokussierbar sind. In dem genannten Beispiel liegen typische Abmessungen solcher Markierungen im Bereich von 10 μm.
• Die in der vorangegangenen und der nachfolgenden Beschreibung genannten Merkmale der Erfindung sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung oder in anderen Kombinationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar. Insofern ist die vorliegende Offenbarung nicht als beschränkend zu verstehen.
• Im Folgenden sollen die Erfindung und ihre Vorteile anhand eines in den Figuren illustrierten Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
• 1 zeigt schematisch eine Anordnung zur erfindungsgemäßen lagegetreuen Abbildung eines auf einem Objektträger befindlichen Objektes und
• 2 zeigt schematisch eine als Objektträger ausgestaltete erfindungsgemäße Markierungsplatte in Draufsicht
• 1 zeigt schematisch ein Objektiv 1 im Frontbereich, beispielsweise das Objektiv 1 eines inversen Mikroskops zur Untersuchung von Zellen als Objekte 5. 2 bezeichnet den Präparatträger (Objektträger) aus Glas. Auf dem Objektträger 2 befinden sich Markierungen 3. 4 bezeichnet eine wässrige Lösung, die in 1 angedeutet ist. Zur Untersuchung von Zellen 5 in wäßriger Lösung 4 zu wissenschaftlichen Zwecken werden in der Regel inverse Mikroskope eingesetzt, die eine Beobachtung der Objekte 5 von unten ermöglichen.
• Aufgrund der begrenzten mechanischen und thermischen Stabilität eines Mikroskops kommt es zu Verschiebungen der Objekte 5, selbst bei unbeweglichen Objekten 5, wobei sich diese Verschiebungen störend auswirken, wenn mehrere Bildaufnahmen über einen bestimmten Zeitraum hinweg erfolgen. Ist der Objektträger 2 auf einem motorischen Mikroskoptisch gelagert, ist es möglich, die zu untersuchenden Zellen 5 zyklisch abzufahren, wobei bei dieser Untersuchungsmethode zusätzlich Positionierfehler des Motortisches bei wiederholten Bildaufnahmen der Zellen 5 sichtbar werden. Typischerweise liegen die durch die genannten Effekte verursachten Verschiebungen in einem Bereich < 20 μm. Während sich die genannten Verschiebungen in der Objektebene in einer Folge von Abbildungen als vermeintliche zuckende Bewegungen des Objekts äußern, bewirken Fokusverschiebungen eine unscharfe Objektabbildung, die in jedem Fall zu vermeiden ist. Hier wirken sich bereits Verschiebungen vom 1/4 μm negativ aus.
• In dem hier vorgestellten Ausführungsbeispiel wird zu Beginn der Zelluntersuchung zunächst die Fokusebene eingestellt. Diese geschieht durch Autofokussierung auf eine oder mehrere der Markierungen 3. In 1 sind Lichtstrahlen 6 dargestellt, die auf die Ebene der Markierungen 3 fokussiert sind. Es ist ersichtlich, dass die Fokusebene der Markierungen 3 nicht mit derjenigen der Objekte 5 übereinstimmt. Dies stellt insbesondere bei motorisierten Mikroskopen kein Problem dar, da hier die Genauigkeit der Relativbewegung des Fokus über kleinere Distanzen (< 10 μm) sehr hoch ist (< 0.2 μm). Die Verschiebung der Fokusebene von der Markierungsebene in die Objektebene kann vollautomatisch erfolgen. Es ist zweckmäßig, wenn der Fokussiervor gang bei wiederholter Bildaufnahme eines Objekts 5 jeweils erneut durchgeführt wird.
• Bei der wiederholten Bildaufnahme des Objekts 5 wird die Position im Bildfeld aufgrund der beschriebenen Instabilitäten und/oder Positionierfehler in der Regel verändert sein. Durch Aufnahme einer oder mehrerer Markierungen 3 kann die Abweichung zum vorherigen Bild bestimmt werden. Hierzu stehen bekannte bildanalytische Methoden zur Verfügung. Anschließend wird auf die Ebene des Objekts 5 fokussiert, ein Bild des Objekts 5 aufgenommen und das Bild anschließend anhand der bestimmten Verschiebung der Markierungen 3 softwaretechnisch verschoben. Diese softwaretechnische Verschiebung eignet sich insbesondere bei kleinen Verschiebungen. Bei größeren Verschiebungen kann es notwendig sein, vor der Aufnahme des Objektbildes den Mikroskoptisch nachzupositionieren, um die Verschiebung zu kompensieren. Nach dieser Nachpositionierung des Mikroskoptisches erfolgt dann die Aufnahme des Objektbildes.
• Das geschilderte Vorgehen erlaubt die Aufnahme von Zellen 5 wiederholt über einen längeren Zeitraum ohne die geschilderten störenden Artefakte.
• Wie in 1 schematisch dargestellt, korrespondiert der Abstand der Markierungen 3 in etwa mit dem Abstand der zu untersuchenden Zellen 5. Genauer gesagt beträgt die Anzahl der Markierungen zwischen 1 und 3 je Sehfeld einer Kamera, mit der die Untersuchung durchgeführt wird. Bei stark vergrößenden Objektiven, zum Beispiel 60x, ist ein Abstand der Markierungen 3 von 100 μm geeignet.
• Die Markierungen 3 liegen vorzugsweise derart auf dem Objektträger 2, dass der Bildeindruck der Zellen 5 nicht gestört wird. Dies kann dadurch erzielt werden, dass die Markierungen 3 deutlich außerhalb der Präparatebene, im vorliegenden Beispiel auf der Rückseite des Glasträgers 2 mit einer Dicke von etwa 170 μm, liegen. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die Abbildung der Markierungen in einem anderen Spektralbereich oder einem anderen mikroskopischen Kontrastverfahren als das Bild des Objekts 5 selbst aufgenommen werden (zum Beispiel Markierung 3 im Durchlicht, Zelle 5 in Fluoreszenz oder Markierung 3 im Phasenkontrast, Zelle 5 in Fluoreszenz oder schließlich Markierung 3 in einem anderen Spektralbereich als Zelle 5).
• 2 zeigt schematisch einen Objektträger 2 mit aufgebrachten Markierungen 3 in Draufsicht. Die Markierungen 3 sind als Kreuze auf die Rückseite oder Oberseite des Glasträgers aufgebracht. Selbstverständlich ist auch die Verwendung einer Markierungsplatte möglich, die auf den Objektträger 2 aufgebracht wird. Bei den oben beschriebenen Untersuchungsbedingungen wird ein Abstand der Markierungen 3 von 100 μm gewählt. Als Verfahren zum Aufbringen solcher Markierungen 3 sind Lithographieverfahren geeignet. Vorteil der Kreuzform ist die Möglichkeit, leicht auf die Markierung 3 zu autofokussieren.

Claims (15)

1. Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines in einer Objektebene befindlichen Objektes (5) bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Abbildungssystem wie einem Mikroskop, wobei zusammen mit dem Objekt (5) eine Markierung (3) abgebildet wird, und wobei aufeinanderfolgende Abbildungen der Markierung (3) verglichen und bei einer Abweichung der jeweiligen Markierungen (3) eine Kompensation dieser Abweichung im aufzunehmenden Objektbild vorgenommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine auf einem Objektträger (2), auf den das Objekt (5) aufgebracht wird, befindliche Markierung (3) verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompensation der Verschiebung vorgenommen wird, indem das nachfolgende Objektbild softwaretechnisch verschoben wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompensation der Verschiebung vorgenommen wird, indem die Objektebene bzw. der Objektträger (2) verschoben wird.
5. Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines in einer Objektebene befindlichen Objektes (5) bei wiederholter Bildaufnahme mit einem Abbildungssystem wie einem Mikro skop, wobei zusammen mit dem Objekt (5) eine Markierung (3) abgebildet wird, und wobei zur Bildaufnahme des Objektes (5) jeweils auf die Markierung (3) fokussiert wird und, falls die Fokusebenen von Objekt (5) und Markierung (3) nicht übereinstimmen, vorher der Fokus um die Differenz der Fokusebenen korrigiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (3) mit einem anderen Abbildungsverfahren als das Objekt (5) abgebildet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (3) in einem anderen Spektralbereich als das Objekt (5) abgebildet wird.
8. Markierungsplatte zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer oder mehreren Markierungen (3).
9. Markierungsplatte nach Anspruch 8, die als Objektträger (2) ausgestaltet ist.
10. Markierungsplatte nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung(en) (3) sich auf der Ober- oder Rückseite des Objektträgers (2) befindet bzw. befinden.
11. Markierungsplatte nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (3) als eine in die Markierungsplatte geätzte Marke ausgebildet ist.
12. Markierungsplatte nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (3) als aufgedampfte Marke ausgebildet ist.
13. Markierungsplatte nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (3) als eine einen vorgegebenen Spektralbereich reflektierende oder transmittierende Marke ausgebildet ist.
14. Markierungsplatte nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen (3) derart verteilt sind, dass im Gesichtsfeld der Abbildung des Objektes (5) eine bis drei Markierungen (3) vorhanden sind.
15. Markierungsplatte nach einem der Ansprüche 8 bis 14, die zur Verwendung mit einem Mikroskop mit stark vergrößerndem Objektiv (1) bei einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 geeignet ist, wobei der durchschnittliche Abstand der Markierungen (3) zwischen 50 und 200, insbesondere zwischen 100 und 150, insbesondere etwa 100 μm beträgt.