DE102005034629A1

DE102005034629A1 - Vorrichtung und Verfahren zum mechanischen Aufschluss von Zellen

Info

Publication number: DE102005034629A1
Application number: DE102005034629A
Authority: DE
Inventors: Ingo Jänich; Siegfried Prof. Dr. habil. Jahn; Doreen Sparborth; Elke Sieber
Original assignee: FRANKENFOERDER FORSCHUNGSGESELLSCHAFT MBH fur BETRIEBSWIRTSCHAFT ERNAEHRUNG und OEKOLOGISCHEN LANDBAU; FRANKENFOERDER FORSCHUNGSGMBH; Frankenforder Forschungsgesellschaft Mbh fur Betriebswirtschaft Ernahrung und Okologischen Landbau; Dr Hielscher GmbH
Current assignee: Frankenfoerder Forschungsgesellschaft Mbh Fuer De; ETG Entwicklungs und Technologie GmbH
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2005-07-19
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2025-07-20
Also published as: DE102005034629B4

Abstract

Der Anwendungsbereich der Erfindung umfasst das rein mechanische Einwirken auf die Zellen, um diese schonend zu perforieren oder zu öffnen. Der Öffnungsvorgang wird durch mikromechanische Bauteile vollzogen. DOLLAR A In einem Ausführungsbeispiel werden zwei gleichlaufende oder gegenläufige Walzen mit Stacheln/Nadeln oder klingenartigen Körpern im Größenbereich von Mikrometern dazu verwendet, beim Passieren der Zellen in diese hineinzustechen. Dabei sind die spitzen Körper für das mechanische Öffnen auf der Walze so angeordnet, dass möglichst alle Zellen beim Passieren erreicht werden können. DOLLAR A In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine Scheibe mit Löchern versehen. Der Durchmesser dieser Löcher wird nach der Größe der biologischen Zellen gewählt, welche aufgeschlossen werden sollen. Um den Aufschluss zu bewerkstelligen, werden diese Löcher mit scharfen Zacken/Klingen versehen. Beim Transport der biologischen Zellen durch die Löcher werden diese Zellen aufgeschlitzt, aufgerissen oder aufgeschnitten. Die Lochscheibe befindet sich in einer Art Durchflusszelle. Für den Transport sorgt eine geeignete Pumpvorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum mechanischen Aufschluss von Zellen mit den im Oberbegriff der Ansprüche 1 und 37 und genannten Merkmalen.

Anwendungsbereich der Erfindung ist die Gewinnung von bestimmten Inhaltsstoffen bzw. die Einschleusung von Stoffen in mikroskopisch kleine Zellen und Mikroorganismen, ohne diese Stoffe in ihren Gebrauchseigenschaften zu verändern. Dies ist relevant für die moderne Pharmaforschung und -entwicklung, da dadurch qualitativ hochwertige Produkte wie Antibiotika, Hormone, Vitamine und Enzyme sowie Nukleinsäuren gewonnen werden können. Ebenso interessant sind sekundäre Inhaltsstoffe, die bestimmte Mikroorganismen zu ihrem Schutz vor negativen Umwelteinflüssen bilden. Des Weiteren werden so gewonnene Substanzen zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Kosmetika eingesetzt.

Mikroorganismen sind mikroskopisch kleine, einzellige, niedere Lebewesen, die in den verschiedensten Lebensräumen verbreitet sind. Sie zeichnen sich durch besondere Eigenschaften aus, durch die sie zu bevorzugten Zielobjekten der Biochemie und Genetik wurden. Dazu zählen der große Reichtum an chemischer Reaktionsfähigkeit, eine sehr schnelle Vermehrung und leichte Handhabung aber auch die hohe Anpassungsfähigkeit in Bezug auf ihren Stoffwechsel.

Die mikrotechnologisch zu behandelnden Mikroorganismen sind in Form und Größe sehr unterschiedlich (Tabelle 1). Es können kugel-, stäbchen- und spiralförmige unterschieden werden. Manche Arten haben auch eine unregelmäßige Form.

Tabelle 1: Form und Größe von Mikroorganismen

Die intensive Forschung und Entwicklung in der Gentechnologie ermöglichte gerade in den letzten Jahren die Herstellung und Anwendung einer Vielzahl von Produkten aus Mikroorganismen. Als Beispiel der intensiven Forschung sei die Entwicklung eines gentechnischen Verfahrens genannt, das umweltschonend Chitosan in definierter Qualität für medizi nische Anwendungen liefert. Ferner kommt Insulin, das früher ausschließlich den Bauchspeicheldrüsen geschlachteter Schweine entnommen wurde, heute zum größten Teil von umprogrammierten Bakterien oder Säugerzellen.

Viele dieser zu isolierenden Substanzen sind jedoch innerhalb der Zelle lokalisiert, so dass der Zellaufschluss den ersten notwendigen Schritt bei der Aufbereitung des Produktes darstellt. Die intrazellulären Wertstoffe müssen aus der Zelle ins umgebende, meist wässrige Medium entlassen werden. Dem steht jedoch die Zellhülle als Diffusionswiderstand entgegen. Insbesondere große, geladene Moleküle bereiten bei der Ausschleusung Schwierigkeiten. In einigen Fällen reicht es schon, die Zellwand leicht zu schädigen, so dass das Zielprodukt aus dem Cytoplasma oder dem periplasmatischen Raum ins Medium diffundieren kann. In anderen Fällen ist es notwendig, die Zelle mit mechanischen Zellaufschlussmethoden zu öffnen.

Die enzymatischen Wirkstoffe können als Endo-Enzyme aus den Zellen im Sinne der Erfindung oder als in Lösung befindliche Exo-Enzyme angereichert oder aufgereinigt weiter verarbeitet werden. Das sind anspruchsvolle und kostspielige Prozesse. Umso wichtiger ist es, durch die Auflockerung und Öffnung der Zellwände die Ausbeute zu erhöhen.

Alle Zellaufschlussmethoden unterliegen jedoch bestimmten Anforderungen. So darf beim Zellaufschluss keine Produktbeschädigung oder Denaturierung auftreten. Ein hoher Aufschlussgrad soll erreicht und das Produkt nicht verunreinigt werden. Die Zellbruchstücke sollen gut abtrennbar sein und der Zellaufschluss soll mit geringem Energieaufwand erfolgen.

Nach dem Stand der Technik lassen sich Zellaufschlussverfahren in chemische, biologische und physikalische Methoden einteilen.

Chemische Methoden zur Freisetzung intrazellulärer Stoffe haben oft spezifische Wirkungen gegen einzelne Bestandteile der Zellwand. Sie führen häufig lediglich zu einer Permeabilisierung der Zellwand, so dass intrazellulär gelöste Stoffe aus der Zelle herausdiffundieren können. Als Beispiele seien Verfahren genannt, die Säuren oder Basen, Lösungsmittel, Detergenzien, Chelatbildner oder Antibiotika verwenden.

Biologische Methoden verwenden Enzyme, Phagen oder die Autolyse. Sie sind im Allgemeinen selektiv und werden unter sehr milden Bedingungen durchgeführt.

Physikalische Methoden werden in nichtmechanische und mechanische unterteilt. Nichtmechanische Verfahren zum Zellaufschluss basieren auf einem osmotischen Schock, auf Gefrieren/Auftauen, Trocknen oder einer Dekompression. Elektroporation und der Mikrowellenaufschluss finden ebenso Anwendung. French-Presse, Hochdruckhomogenisator, Huges- oder X-Presse, Kugelmühle, Potter-Homogenisator, Ultraschall bzw. Vibrationsmühle sind Beispiele von mechanischen Vorrichtungen zum Zellaufschluss. Bei Anwendung mechanischer Methoden zum Zellaufschluss reißen die entstehenden Spannungen und Dehnungen die Zellwände der Mikroorganismen auseinander. Als Zellbeanspruchungsarten durch Kräfte sind die Druck- und Scherbeanspruchung sowie die Prall- und Scherbeanspruchung durch ein fluides Medium bekannt.

DE 38 18 237 offenbart einen Homogenisator für den Aufschluss von Mikroorganismen zur Verbesserung des Aufschlussgrades. Der Homogenisator weist eine Homogenisierdüse auf, die eine Kammer mit Zu- und Ablauf umfasst, wobei zwischen Zu- und Ablauf ein Ringspalt ausgebildet ist, dessen Stärke durch einen gegenüber einem feststehenden Düsenteil verstellbaren Stempel einstellbar ist. Der Ringspalt weist zulaufseitig eine umlaufende Messerkante auf, an die sich ablaufseitig eine hierzu konzentrische Ringausnehmung anschließt. Die Hintereinanderschaltung von Messerkante und Ringausnehmung bewirkt dabei eine Erhöhung des Aufschlussgrades.

Die DE 29 18 212 offenbart ein Verfahren und eine Einrichtung zum Aufschließen von Zellen aus Biomassen durch Erwärmen und Entspannen. Die Biomasse wird dabei gegebenenfalls unter Druck auf Temperaturen über dem Verdampfungspunkt von Wasser durch Friktion gebracht und danach in die Atmosphäre oder in einem Unterdruck entspannt.

Mit den in der Praxis schon vorhandenen Aufschlussverfahren werden die Zellen und deren Inhaltsstoffe so stark beansprucht, dass eine nachteilige Beeinflussung stattfindet und flüchtige Substanzen z.B. Proteome gar nicht oder nur sehr umständlich gewonnen werden können.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, welches ein rein mechanisches Einwirken auf die Zellen ermöglicht, wobei diese schonend geöffnet und die enthaltenen Substanzen schonender extrahiert werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 (Vorrichtungsanspruch) sowie des Anspruchs 37 (Verfahrensanspruch) im Zusammenwirken mit den Merkmalen im Oberbegriff gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten.

Dazu ist in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Aufschluss von Zellen mindestens ein Durchsatzelement mit Zwischenräumen zum Durchsatz der Zellen angeordnet, wobei das mindestens eine Durchsatzelement Mittel zur Perforation der Zellwände aufweist.

Das mindestens eine Durchsatzelement umfasst in einem Ausführungsbeispiel mindestens zwei Walzen, die auf ihrem Umfang mit Mitteln zur Perforation von Zellwänden versehen sind.

Die Mittel zur Perforation von Zellwänden sind an dem vom Walzenmittelpunkt entfernten Ende spitz ausgebildet.

Die Walzen sind in ihrem Mittelpunkt drehbar und/oder austauschbar gelagert. Sie sind in einer Reihe oder einem zweidimensionalen Feld oder dreidimensional, jeweils mit einem Abstand zueinander, angeordnet. Die Walzen sind vorteilhafterweise in ihrer Position zueinander verstellbar ausgebildet.

Vorteilhaft erlaubt dies, die Walzenabstände entsprechend der unterschiedlichen Morphologie der zu perforierenden Zellen zu variieren. Der Durchmesser der Walzen liegt im Bereich von 1mm bis 200mm.

Die Mittel zur Perforation von Zellwänden sind in einem Ausführungsbeispiel Nadeln oder Stacheln oder Kanülen oder klingenartige Körper. Sie weisen eine Größe auf, die im Mikrometerbereich liegt und erlauben es, die Zellwände zu perforieren, ohne die Zelle zu zerstören.

Die Erfindung betrifft demnach eine Vorrichtung mit deren Hilfe biologische Zellen durch mikromechanische Technik geöffnet werden. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es, dass der Zellinhalt bei dem Öffnungsvorgang nicht durch Hitze, Druck, Elektrizität, chemische oder enzymatische Stoffe beeinträchtigt wird.

Mit Hilfe der neuen Technologie „Mikrosystemtechnik" lassen sich Aufschlussverfahren erfindungsgemäß erstmals auf kleinstem Raum verwirklichen und den Aufschluss zum Beispiel in kleinen Sensoren vollziehen.

Die Länge der Walzen liegt im Bereich von 1mm bis 300mm.

Die Walzen sind in einen weiteren Ausführungsbeispiel zu ihrem Antrieb jeweils mit einem Motor verbunden. Die Motoren der Walzen sind bevorzugt getrennt in ihrer Geschwindigkeit und Drehrichtung steuerbar/regelbar.

Zur Erhöhung des Durchsatzes umfasst die Vorrichtung in einem Ausführungsbeispiel eine Pumpe, die die Zellen durch die Durchsatzelemente, in denen sie perforiert werden, hindurchpumpt.

Die Mittel zur Perforation von Zellwänden sind äquidistant auf dem Umfang der jeweiligen Walze ausgebildet. Auf zwei aneinandergrenzenden Walzen sind sie bevorzugt auf Lücke stehend ausgebildet.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst das mindestens eine Durchsatzelement mindestens eine Lochscheibe, die mindestens eine Öffnung aufweist.

Die mindestens eine Öffnung umfasst Mittel zur Perforation von Zellwänden, die als Zacken oder Klingen ausgebildet sind und auf der Innenwand der Öffnung angeordnet sind, wobei die spitzen Enden der Zacken oder Klingen in Richtung des Öffnungsinneren zeigen. Die Zacken oder Klingen weisen eine Größe von 1μm bis 10μm auf. Die Größe der mindestens einen Öffnung liegt im Bereich der Größe der Zellen, bevorzugt im Bereich von 1μm bis 300μm.

Diese geringe Größe der Mittel zur Perforation und der Öffnungen erlaubt es vorteilhaft, die Zellen gezielt und ohne deren Zerstörung zu Öffnen. Die Größen können entsprechend der Dimension der zu öffnenden Zellen verändert werden. Dies ermöglicht es vorteilhaft, die Vorrichtung an veränderte Anforderungen anzupassen.

Bevorzugt ist die mindestens eine Öffnung als Röhre ausgebildet ist. Der Durchmesser der Lochscheibe liegt im Bereich von 1mm bis 50mm. Die Lochscheibe ist austauschbar ausgebildet. Mehrere Lochscheiben können zweidimensional oder dreidimensional zueinander positioniert in der Vorrichtung angeordnet sein. Dies hat der Vorteil, dass der Durchsatz entsprechend erhöht werden kann. Die Durchsatzelemente sind bevorzugt in einem Gehäuse angeordnet, die Zellen liegen in einer Suspension vor.

Entsprechend umfasst das Verfahren zum Aufschluss von Zellwänden folgende Schritte:

– Bewegen mindestens einer Zelle durch mindestens ein Durchsatzelement hindurch, welches Mittel zur Perforation von Zellwänden aufweist;
– Perforieren der Zelle durch mindestens ein Mittel zur Perforation von Zellwänden während des Durchsatzes durch das mindestens eine Durchsatzelement.

Das Bewegen einer Zelle durch mindestens ein Durchsatzelement hindurch erfolgt in einem Ausführungsbeispiel mittels des Pumpens mindestens einer Pumpe auf einer Seite des Durchsatzelements.

Das Verfahren umfasst ferner den Schritt des Anpassens der Abstände der Walzen bzw. den Schritt des Anpassens der Größe der Löcher an den Querschnitt der Zellen. Dies erlaubt es das Verfahren an die unterschiedliche Morphologie der Zellen anzupassen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren liefern eine neue Qualität des Zellaufschlusses. Es können bisher nicht erreichbare Stoffe zugänglich gemacht werden. Mit diesem Verfahren sind neue Produkte denkbar. Produkte mit einem höheren Verwertungsgrad können erzeugt werden.

Die Effizienz ist gegenüber bisherigen Verfahren deutlich höher. Alle Zellen einer Suspension werden dem Zellaufschluss unterworfen.

Diese Technik ist auch für die Massenproduktion geeignet.

Eine Weiterverarbeitung kann auf dem bisherigen Stand der Technik erfolgen, so dass eine nahtlose Einfügung in die bisherigen Produktionstechnologien möglich wird.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Es zeigen:
1 Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Aufschluss von Zellen in einem ersten Ausführungsbeispiel.
2 Eine Lochscheibe als Durchsatzelement der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Aufschluss von Zellen in einem zweiten Ausführungsbeispiel.
3 Ein Loch der Lochscheibe aus 2 mit Mitteln zur Perforation von Zellwänden.
Der Öffnungsvorgang wird durch mikromechanische Bauteile vollzogen wie:

A) Einstechen in die Zellen durch spitze Bauteile,
B) Zerreißen der Zellwände partiell oder ganzer Zellen durch geeignete mechanische Konstruktionen,
C) Aufschlitzen der Zellen durch klingenähnliche Bauteile.

1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Aufschluss von Zellen 1 in einem ersten Ausführungsbeispiel, Die Vorrichtung umfasst ein Gehäuse 2 und mindestens ein Durchsatzelement 3 mit Zwischenräumen zum Durchsatz der Zellen 1. Das mindestens eine Durchsatzelement 3 weist Mittel zur Perforation der Zellwände 5, 5a auf.
In dem gezeigten bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das mindestens eine Durchsatzelement 3 durch mindestens zwei Walzen 4 realisiert. Die Walzen 4 sind gegeneinander drehbar und austauschbar.
Die Mittel zur Perforation der Zellwände 5 sind an dem vom Walzenmittelpunkt entfernten Ende spitz ausgebildet und auf der gesamten Oberfläche der Walzen 4 angeordnet. In der vorliegenden Ausgestaltung sind die Mittel zur Perforation der Zellwände 5 als Nadeln, Stacheln oder Kanülen 5a ausgebildet. Sie können auch klingenartige Körper sein. Gemeinsam ist den Mitteln zur Perforation 5, dass sie geeignet sind, die Wände der Zellen 1 zu perforieren. Kanülen sind zusätzlich in der Lage, noch Zusatzstoffe in die Zellen einzubringen. Die Zusatzstoffe können der Kanüle über die Walze zugeführt werden. Die Mittel zur Perforation von Zellwänden 5 weisen eine Größe auf, die im Mikrometerbereich liegt, bevorzugt zwischen 1 und 100μm. Sie sind bevorzugt äquidistant auf der Oberfläche der Walze 4 ausgebildet, können aber auch mit unterschiedlichen Abständen zueinander angeordnet sein. Die Mittel zur Perforation 5 können einzeln unterschiedlich lang ausgebildet sein. Auf zwei aneinandergrenzenden Walzen 4 sind sie bevorzugt zueinander auf Lücke stehend ausgebildet. Sie sind bevorzugt in ihrer Position zueinander verstellbar angeordnet. Dies ermöglicht es, die Walzenabstände entsprechend der Größen der zu perforierenden Zellen 1 anzupassen. Auch können die Durchsatzelemente 3 in ihrer Position im Gehäuse 2 variierbar ausgestaltet sein.
Die Walzen 4 sind bevorzugt mit Motoren verbunden. Es können alle Walzen 4 mit einem einzigen Motor, Gruppen von Walzen 4 mit verschiedenen Motoren oder jede Walze 4 mit einem separaten Motor verbunden sein. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die Walzen 4 jeweils mit einem Motor verbunden, der es erlaubt, die Walzen gegenläufig anzutreiben. Durch den gegenläufigen Betrieb werden die Zellen 1 durch das Durchsatzelement 3 hindurchbewegt, wie durch den Pfeil angedeutet. Die Walzen können sowohl in ihrer Drehrichtung als auch in ihrer Drehgeschwindigkeit separat steuerbar/regelbar ausgebildet sein.
Bevorzugt weist die Vorrichtung zum Aufschluss von Zellen 1 eine Pumpe 6 auf einer Seite des Durchsatzelements 3 auf. Die Pumpe 6 bewirkt, dass die Zellen 1 durch das Durchsatzelement 3 hindurchströmen und dort durch die Mittel zur Perforation 5 perforiert werden.
In einen weiteren Ausführungsbeispiel kann die Beförderung der Zellen durch Ultraschall, mittels Schallwellen einer Sonotrode, erfolgen.
Auch die sich drehenden Walzen allein können in einem Ausführungsbeispiel eine Förderbewegung bewirken.
Es können auch mehrere Durchsatzelemente 3 oder mehrere Walzen 4 zweidimensional oder dreidimensional in der Vorrichtung angeordnet sein. So kann ein Durchsatzelement 3 in einem weiteren Ausführungsbeispiel aus mehreren Reihen einer Vielzahl von Walzen 4 bestehen, wobei die Reihen vertikal oder horizontal nebeneinander in dem Gehäuse 2 angeordnet sind. Durch ein solches Durchsatzelement 3 wird die Ausbeute von perforierten Zellen 1 erhöht.
1 zeigt somit einen Öffnungsvorgang nach dem oben angeführten Punkt A. Zwei gleichlaufende oder gegenläufige Walzen 4, welche mit Stacheln/Nadeln 5a oder klingenartigen Körpern im Größenbereich von Mikrometern, 1–100μm versehen sind, – im Nachfolgenden "strukturierte Walzen" genannt – stechen beim Passieren der Zellen 1 in diese hinein. Dabei sind die spitzen Körper für das mechanische Öffnen auf der Walze 4 so angeordnet, dass möglichst alle Zellen 1 beim Passieren erreicht werden können. Der Transport der Zellsuspension erfolgt bei gleichlaufenden strukturierten Walzen 4 zum Teil durch die Sogwirkung der Walzen 9 selbst. Ansonsten wird bei gegenläufigen strukturierten Walzen 4 die Zellsuspension hindurchgepumpt. Des Weiteren werden zum Transport Hilfstechnologien wie z.B. Schallwellen, je nach Anwendungsfall, eingesetzt.
Die gesamte Vorrichtung befindet sich in einer Art Durchflusszelle. Ferner sind die strukturierten Walzen zueinander verstellbar, d.h. der Abstand lässt sich einstellen. Zur Vorbereitung des Zellaufschlusses gehört die Herstellung der notwendigen optimalen Zelldichte und ein eventuelles Vorsortieren der Zellen 1. Das Vorsortieren kann in einem Ausführungsbeispiel durch vorgeschaltete Walzen 4 ohne Mittel zur Perforation 5 erfolgen. Als weitere Möglichkeiten seien auch das Zentrifugieren und Filtrieren genannt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel sind in der Vorrichtung Durchsatzelemente 3 mit unterschiedlich großen Zwischenräumen, hier der Abstand der Walzen 4, zum Durchsatz ausgestattet. Diese Durchsatzelemente 3 können nebeneinander oder hintereinander zur größenmäßig selektiven Perforation von Zellen 1 angeordnet sein.
Die Genauigkeit bzw. Toleranz entspricht dem derzeitigen Stand der Fertigungstechnik und liegt vorzugsweise auf die Fertigung des Durchmessers bezogen, im Bereich von 20–80 nm, bevorzugt bei ca. 50 nm, bei der Oberflächengüte/Rauigkeit ebenfalls im Bereich von 20–80 nm, bevorzugt bei ca. 50 nm. Der Durchmesser der strukturierten Walzen selbst liegt in einem Bereich von 1 mm bis 200 mm und bei der Länge mit ca. 1 mm bis 300 mm.
Nach dem aktuellen Stand der Fertigungstechnik können z.B. Metall, Glas und Kunststoffe bearbeitet werden. Gegenwärtige und in Entwicklung befindliche Beschichtungsverfahren erlauben ebenfalls eine Kombination dieser Materialien.
Die Mikrotechnik im Sinne des Erfinders macht die Gewinnung von Inhaltsstoffen aus Mikroorganismen schonender und effektiver als mit anderen Aufschlussverfahren wie Hochdruckextraktion oder Enzymbehandlung möglich. Es entfallen während des Aufschlussprozesses eine Temperaturerhöhung, eine Druckerhöhung und eine deutliche Veränderung im sauren und basischen Milieu. Die nach diesem Verfahren gewonnenen Inhaltsstoffe von Mikroorganismen haben keine prozessbedingten Schäden infolge Temperatur- und pH-Wert-Erhöhungen oder Druck. Der mikrotechnische Aufschluss von Zellwänden im Sinne der Erfindung ermöglicht einen wesentlich besseren Zugang zu den Zellinhaltsstoffen. Diese wie Enzyme und sekundäre Inhaltsstoffe können in größeren Mengen effektiver gewonnen werden. Das trifft auch für Proteine mit gentechnischen Veränderungen zur medizinischen Behandlung zu. Wenn sich an die Primärgewinnung von Mikroinhaltsstoffen mit Hilfe des Zellwandaufschlusses im Sinne der Erfindung eine Aufbereitung anschließt, kann diese zu größeren Mengen qua litativ hochwertiger Produkte führen. Der neue mikrotechnische Aufschluss von Mikroorganismen gestattet eine höhere Ausbeute an Zellinhaltsstoffen von 5 bis 10 Prozent im Vergleich zu bisherigen Verfahren. Die Prozessbedingungen für Temperatur, pH-Wert und Druck werden zugunsten der Zellinhaltsstoffe nachhaltig verbessert.
Wie in 2 gezeigt, sind in einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante die Durchsatzelemente 3 durch mindestens eine Scheibe 8 realisiert. Die Scheibe 8 weist eine Vielzahl von Öffnungen 9 auf (im Nachfolgenden "Lochscheibe" genannt), die wiederum mit Mitteln zur Perforation 5 ausgestattet sind, siehe 3. Die Mittel zur Perforation 5 sind bevorzugt auf der Innenwand der Öffnung 9 angeordnet. Sie sind als Zacken oder Klingen 5b ausgebildet. Die Spitzen Enden der Zacken oder Klingen 5b zeigen in Richtung des Lochinneren.
Nach dem aktuellen Stand der Fertigungstechnik können z.B. Metall, Glas und Kunststoffe bearbeitet werden. Gegenwärtige und in Entwicklung befindliche Beschichtungsverfahren erlauben ebenfalls eine Kombination dieser Materialien.
Dieses Ausführungsbeispiel erlaubt einen Öffnungsvorgang nach oben angeführten Punkten B und C. Es zeichnet sich durch Öffnungen 9 einer Lochscheibe 8 aus. Um den Aufschluss zu bewerkstelligen, werden diese Öffnungen 9 mit scharfen Zacken/Klingen 5b versehen. Die Größe der Öffnungen 9 und die der Zacken/Klingen 5b werden den jeweiligen Größen der biologischen Zellen 1 angepasst, welche aufgeschlossen werden sollen. Die Größe der Zacken 5b liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10μm und der Durchmesser der Öffnungen 9 liegt im Bereich von 1 bis 300μm. Die Öffnungen 9 sind bevorzugt als Röhren ausgebildet.
Die Länge und Dicke der Lochscheibe 8 variiert mit dem Anwendungsfall. Der Durchmesser der Lochscheibe 8 liegt im Bereich von 1 bis 100 mm. Die Lochscheibe 8 wird in einer Art Durchflusszelle montiert und ist austauschbar. Es können beliebig viele Lochscheiben 9 parallel oder in Reihe angeordnet werden, um einen größeren Durchsatz oder eine bessere Effizienz zu erlangen.
Beim Transport der biologischen Zellen 1 durch die Öffnungen 9 werden diese Zellen 1 aufgeschlitzt, aufgerissen oder aufgeschnitten. Für den Transport sorgt eine geeignete Pumpvorrichtung. Um den Transport und das Aufschlitzen, Aufreißen oder Aufschneiden effizienter zu gestalten, werden Ultraschallwellen je nach Aufgabenstellung von 20 kHz bis 1,6 MHz eingesetzt.
Zur Vorbereitung des Zellaufschlusses gehört die Herstellung der notwendigen optimalen Zelldichte und ein eventuelles Vorsortieren der Zellen.
Ein weiterer Vorteil dieser rein mechanischen Aufschlusstechnik liegt in der Möglichkeit, biologische Zellen 1 aufzuschließen, welche sich bisherigen Verfahren teilweise oder ganz entzogen haben wie biologische Zellen 1 mit sehr festen Zellwänden und solche mit sehr kleinen Durchmessern z.B. Algen mit 3 bis 5μm Durchmesser und sehr fester Zellwand. Diese können erfindungsgemäß mechanisch aufgeschlossen werden.
Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die hier dargestellten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist es möglich, durch Kombination und Modifikation der genannten Mittel und Merkmale weitere Ausführungsvarianten zu realisieren, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Insbesondere können alle Angaben zu den Maßeinheiten nach der Sammlung von Erfahrungen im Fertigungs- und Aufschlussprozess weiter als vorgegeben variieren.

1: Zellen
2: Gehäuse
3: Durchsatzelement
4: Walze
5: Mittel zur Perforationa Mittel zur Perforation eines ersten Ausführungsbeispiels b Mittel zur Perforation eines zweiten Ausführungsbeispiels
6: Pumpe
7: Fließrichtung der Zellen
8: Lochscheibe
9: Loch

Claims

Vorrichtung zum mechanischen Aufschluss von Zellen (1) mit Zellwänden, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Durchsatzelement (3) mit Zwischenräumen zum Durchsatz der Zellen angeordnet ist, wobei das mindestens eine Durchsatzelement (3) Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Durchsatzelement (3) mindestens zwei Walzen (4) umfasst, die auf ihrem Umfang mit Mitteln zur Perforation von Zellwänden (5) versehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) an dem vom Walzenmittelpunkt entfernten Ende spitz ausgebildet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Walzen (4) in ihrem Mittelpunkt drehbar und/oder austauschbar gelagert sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Walzen (4) in einer Reihe oder einem zweidimensionalen Feld oder dreidimensional, jeweils mit einem Abstand zueinander, angeordnet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Walzen (4) in ihrer Position zueinander verstellbar ausgebildet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Toleranz des Durchmessers der Walzen (4) zwischen 20 und 80 Nanometern liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Toleranz des Durchmessers der Walzen (4) bei 50 Nanometern liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächengüte bzw. Rauigkeit der Walzen (4) bei 50 Nanometern liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Walzen (4) im Bereich von 1 mm bis 200 mm liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Walzen (4) im Bereich von 1 mm bis 300 mm liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Walzen (4) zu ihrem Antrieb mit mindestens einem Motor verbunden sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Motoren der Walzen (4) getrennt in ihrer Geschwindigkeit und Drehrichtung steuerbar/regelbar sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) Nadeln oder Stacheln oder Kanülen (5a) oder klingenartige Körper sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) eine Größe aufweisen, die im Mikrometerbereich liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) eine Größen von 1μm bis 100μm aufweisen.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) äquidistant auf dem Umfang der jeweiligen Walze (4) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) auf zwei aneinandergrenzenden Walzen (4) auf Lücke stehend ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Durchsatzelement (3) mindestens eine Lochscheibe (8) umfasst, die mindestens eine Öffnung (9) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Öffnung (9) Mittel zur Perfo ration von Zellwänden (5) umfasst, wobei die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) Zacken oder Klingen (5b) sind.
Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) auf der Innenwand der Öffnung (9) angeordnet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zacken oder Klingen (5b) spitze Enden aufweisen, die in Richtung des Öffnungsinneren zeigen.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zacken oder Klingen (5b) einen Freiraum im Inneren der Öffnung (9) lassen, der in der Größenordnung des Querschnitts der Zellen (1) liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zacken oder Klingen (5b) einen Freiraum im Inneren der Öffnung (9) lassen, der kleiner als der Querschnitt der Zellen (1) ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Zacken oder Klingen (5b) eine Größe von 1μm bis 10μm aufweisen.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der mindes tens einen Öffnung (9) im Bereich der Größe der Zellen (1) liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der mindestens einen Öffnung (9) im Bereich von 1μm bis 300μm liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Öffnung (9) als Röhre ausgebildet ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Lochscheibe (8) im Bereich von 1 mm bis 100 mm liegt.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Lochscheibe (8) austauschbar ausgebildet ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Lochscheiben (8) zweidimensional oder dreidimensional zueinander positioniert angeordnet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchsatzelemente (3) in einem Gehäuse (2) angeordnet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchsatzelemente (3) in dem Gehäuse (2) variabel angeordnet sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (1) in einer Suspension vorliegen.
Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Pumpe (6) umfasst, die die Zellen durch das Durchsatzelement (3) hindurchpumpt.
Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Ultraschallquelle umfasst, die die Zellen durch das Durchsatzelement (3) hindurchbewegt.
Verfahren zum Aufschluss von Zellwänden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: – Bewegen mindestens einer Zelle (1) durch mindestens ein Durchsatzelement (3) hindurch, welches Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) aufweist; – Perforieren der Zelle (1) durch mindestens ein Mittel zur Perforation von Zellwänden (5) während des Durchsatzes durch das mindestens eine Durchsatzelement (3).
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewegen der mindestens einen Zelle (1) durch mindestens ein Durchsatzelement (3) hindurch mittels des Pumpens mindestens einer Pumpe (6) auf mindestens einer Seite des Durchsatzelements (3) erfolgt.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewegen der mindestens einen Zelle (1) durch mindestens ein Durchsatzelement (3) hindurch mittels der Beschallung durch Ultraschall auf mindestens einer Seite des Durchsatzelements (3) erfolgt.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach mindestens einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren gemäß der Vorrichtung nach den Ansprüchen 2 bis 18 ferner den Schritt des Drehens der Walzen (4) durch mindestens einen mit den Walzen (4) verbundenen Motor beinhaltet.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ferner den Schritt des gleichgerichteten oder entgegengerichteten Drehens der Walzen (4) durch jeweils ein mit den Walzen (4) verbundenen Motor beinhaltet.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach mindestens einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ferner den Schritt des Anpassens der Abstände der Walzen (4) an den Querschnitt der Zellen (1) umfasst.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren gemäß der Vorrichtung nach den Ansprüchen 19 bis 31 ferner den Schritt des Anpassens der Größe der Löcher (9) an den Querschnitt der Zellen (1) umfasst.