DE102005026133A1

DE102005026133A1 - Verfahren zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität von Substanzen

Info

Publication number: DE102005026133A1
Application number: DE200510026133
Authority: DE
Inventors: Katinka Jung; Thomas Herrling
Original assignee: GEMATRIA TEST LAB GmbH
Current assignee: GEMATRIA TEST LAB GmbH
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2005-06-01
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2025-06-02
Also published as: DE102005026133B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität von Stoffen oder Stoffgemischen, insbesondere Rohstoffen oder Fertigprodukten, mittels Messung der Reduktion von mindestens einem Testradikal mit mindestens einer antioxidativen Substanz, gekennzeichnet durch DOLLAR A a) mindestens eine Messung einer zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I als ein Maß für die Anzahl der freien Testradikale N bei unterschiedlichen Einwaagen w¶n¶(n = 1, 2, ...) der zu testenden antioxidativen Substanz, DOLLAR A b) Erzeugung mindestens eines ersten Datensatzes zur Bestimmung eines ersten, dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeit t¶r¶ aus der zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten (t¶m¶(m = 1, 2) gemessenen Signalintensitäten I für die jeweiligen Einwaagen w¶n¶(n = 1, 2, ...) der zu testenden antioxidativen Substanz [I(t) = I¶wn¶(t)], DOLLAR A c) Erzeugung mindestens eines zweiten Datensatzes zur Bestimmung eines zweiten, statischen Parameters in Form der charakteristischen Einwaage w¶c¶ aus dem funktionellen Zusammenhang der gemessenen Signalintensitäten I der jeweiligen Einwaagen w¶n¶(n = 1, 2, 3, ...) der zu testenden antioxidativen Substanz am Zeitpunkt t¶r¶[I¶(t=tr)¶ = f(w)], und DOLLAR A d) Erzeugung mindestens eines dritten Datensatzes zur Bestimmung eines dritten, zweidimensionalen Parameters in Form der Antioxidative Power AP, der als zeitabhängiges, quantitatives Maß zur Evaluierung der antioxidativen Aktivität einer antioxidativen Substanz ein ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 20.

Oxidative Prozesse, die in lebenden Organismen ablaufen, resultieren in der Bildung von hochreaktiven freien Radikalen. Diese Radikale beeinflussen und beschleunigen den Alterungsprozess von Organismen und beeinträchtigen die Gesundheit. So sind vermutlich Radikale die Ursache für Arteriosklerose und Krebs.

Es ist seit langem bekannt, dass bestimmte antioxidativ wirkende Substanzen, die Fähigkeit besitzen, die durch Radikale bewirkten Kettenreaktionen zu unterbrechen und Radikale zu deaktivieren.

In der biologischen Forschung, Medizin, Pharmazie und Lebensmitteltechnologie wird dabei zunehmend das antioxidative Potential von natürlich vorkommenden Antioxidantien untersucht. Als eine reichhaltige Quelle von antioxidativ wirksamen Substanzen stellen dabei Pflanzen dar, insbesondere Gemüsepflanzen und medizinischen Kräuter.

Zur Einschätzung der antioxidativen Wirksamkeit von Substanzen werden eine Vielzahl von analytischen Verfahren und Messmethoden eingesetzt. Generell beruhen die Messverfahren auf der Fähigkeit von Antioxidantien, freie Radikale zu deaktivieren.

Die bisher bekannten Verfahren nutzen organische Radikale, die entweder während des Messprozess selbst generiert werden oder als semistabile hochreaktive freie Radikale der zu untersuchenden Substanz zugeführt werden (Schlesier et al., Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods, Free Radical Research, 2002, 36: 177–187). Die Verfahren unterscheiden sich im Wesentlichen durch den Prozess der Radikalbildung oder Radikalreduktion.

Drei Testverfahren (TEAC I, TRAP, PCL) messen die Verzögerung der Radikalbildung (Oxidation) und bestimmen die Verzögerungszeit (Lag-Phase) als Parameter zur Charakterisierung der antioxidativen Aktivität. Sie bestimmen die Verzögerung (delay) der Radikalgenerierung sowie das Vermögen Radikale zu deaktivieren bzw. zu reduzieren.

So wird in dem TEAC I – Assay (Trolox equivalent antioxidant capacity I – assay) die Oxidation von ABTS durch H₂O₂ und Metmyoglobin zum ABTS^•- Radikals in Gegenwart der antioxidativ wirksamen Substanz photometrisch bei 734 nm vermessen. In Abhängigkeit von der Konzentration und Reaktivität des eingesetzten Radikalfängers wird die Oxidation von ABTS verzögert und das antioxidative Potential der Substanzen durch Bestimmen der lag Phase ermittelt.

Im TRAP Assay (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter) wird die Fluoreszenz von R-Phycoerythrin mit ABAP als Radikalbildner gequencht. Durch Zugabe von Antioxidantien wird die Zersetzung von R-Phycoerythtrin inhibiert und das antioxidative Potential durch Messung der Lag-Phase bestimmt.

Beide Assays basieren somit auf der Messung der Verzögerung der Oxidation der freien Radikale durch Zugabe von Antioxidantien. Die lag Phase dient als Parameter für die antioxidative Kapazität einer Substanz. Die Verzögerung der Radikalbildung als auch die Fähigkeit als Radikalfänger können somit eingeschätzt werden.

Im Gegensatz dazu analysieren die anderen Verfahren (TEAC II, TEAC III, DPPH, DMPD) die Fähigkeit der Antioxidantien, ein Radikal direkt zu reduzieren. Hierbei wird die Abnahme der Absorption eines Radikals in Gegenwart einer antioxidativ wirksamen Substanz ermittelt.

Der TEAC II – Assay (Trolox equivalent antioxidant capacity II – assay) basiert auf der Bildung eines ABTS^•- Radikals durch Filtern einer ABTS Lösung durch MnO₂ Pulver. Die bei dem Filterprozess hergestellte Lösung des ABTS^•- Radikals wird mit dem Antioxidant vermischt und die antioxidative Aktivität durch Messen der Absorptionsabnahme bei 734 nm unter Verwendung der Gleichung [% antioxidative Aktivität = ((E_ABTS•- – E_Standard)/E_ABTS•-) × 100] bestimmt.

Beim DPPH Assay (Diphenyl Picryl Hydrazyl) wird das freie 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Radikal wird durch das Antioxidant reduziert. Die antioxidative Wirkung der vermessenen Substanz wird durch Messung der veränderten Absorption des Radikals ermittelt. Der DPPH Assay wird zur Evaluierung der antioxidativen Aktivität von Lebensmitteln sowie in jüngster Zeit zur Quantifizierung von Antioxidantien in komplexen biologischen Systemen verwendet. Die DPPH Methode ist auf flüssige und feste Systeme anwendbar und ist nicht eingeschränkt auf die Bestimmung der antioxidativen Aktivität einer spezifischen Substanz sondern zur Gesamtaktivität einer Probe.

Üblicherweise wird der DPPH Assay mittels Messung des Extinktionskoeffizienten in einem VIS-Spektrophotometer durchgeführt, welches mit einer starken Absorption bei 517 nm verbunden ist. Das freie Radikal weist eine violette Farbe auf, die ins gelbliche wechselt, sobald das freie Elektron des Radikals mit einem Wasserstoffatom von einem Radikalfänger unter Bildung von DPPH-H abreagiert. Die sich ergebene Entfärbung steht in einem stöchiometrischen Verhältnis zur Zahl der eingefangenen Elektronen.

Eine akkuratere Methode der Messung von antioxidativen Aktivitäten insbesondere von farbigen und trüben Substanzlösungen stellt die Elektronen Spin Resonanz (ESR) Spektroskopie dar, bei der direkt ein Signal des Elektrons des freien Radikals gemessen wird.

Antioxidantien in Lebensmitteln sind in der Regel wasserlöslich oder fettlöslich und reagieren in unterschiedlicher Weise mit freien Radikalen. Die Reaktionszeit der Antioxidantien mit Radikalen variiert stark. So kann die Zeitdauer der Assays im Minuten- bzw. Stundenbereich liegen.

In der Mehrzahl der in der Literatur beschriebenen Assays reagiert das freie Radikal mit der gesamten Probe solange, bis ein stationärer Zustand der Reaktion (Steady-State) erreicht ist. Dieser Prozess kann z.B. im Falle der DPPH Methode bis zu 6 Stunden in Abhängigkeit von der molekularen Struktur der antioxidativen Substanz und dem verwendeten Lösungsmittel dauern.

Daher wird in den meisten Publikationen als Endpunkt der Bestimmung der antioxidativen Aktivität eines unbekannten Antioxidants einer Probe der Wert betrachtet, bei dem der Wert des Anfangssignals eines Radikals sich um 50% reduziert hat.

Dieser Ansatz weist jedoch eine Reihe von Nachteilen auf. Zum einen führen die verschiedenen in vitro Testsysteme zu unterschiedlichen Ergebnissen, wodurch ein einfacher Vergleich der antioxidativen Aktivität von Substanzen bestimmt mit unterschiedlichen Assays nicht möglich ist.

Zum anderen ist eine lange Messzeit von mehreren Proben einer unbekannten antioxidativen Substanz notwendig. Ein Minimum von drei Messungen mit jeweils unterschiedlichen Einwaagen bis zum Erreichen des Steady-State-Zustandes muss durchgeführt werden, um eine funktionelle Reduktionskurve des Radikalsignals als Funktion der eingewogenen Masse darstellen zu können. Die aus diesen Messungen gewonnen Werte zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität wie der Wert der Antiradical Power (ARP) gibt lediglich Informationen über die antioxidative Kapazität der Substanz aber nicht über die Reaktivität, die über die Reduktionskinetik beschrieben wird.

Da aggressive freie Radikale, bedingt durch ihre hohe Reaktivität, zumeist sehr kurzlebig sind, werden zu ihrer Deaktivierung reaktive virulente Antioxidantien nötig. Es ist deshalb nicht angebracht, die antioxidative Aktivität bzw. Kapazität einer Substanz über einen langen Zeitraum von bis zu 6 Stunden zu bestimmen. Damit wird lediglich eine allgemeine Aussage über die Reduktionskapazität von antioxidativen Substanzen gegenüber freien Radikalen getroffen, die keinerlei Aussagen über deren Effektivität macht.

Der Informationsgehalt der Verfahren TEAC I, TRAP und PCL ist höher, da er zusätzlich Informationen über die Reaktivität der antioxidativen Substanz enthält, dargestellt durch die Lag-Phase. Die Quantifizierung hinsichtlich der reduzierten Menge an freien Testradikalen ist jedoch weitaus schwieriger, da das Testradikal unmittelbar während des Messprozesses generiert und vom Antioxidanz sofort wieder reduziert wird. Der Prozess der Radikalgenerierung wird von vielen Parametern wie zum Beispiel dem Lösungsmittel, den Reaktionspartnern, dem pH-Wert und der Temperatur beeinflusst, die starke Schwankungen der Resultate bedingen. Eine exakte reproduzierbare Messung ist damit kaum möglich. Die genannten Verfahren gestatten zumeist nur Vergleichsmessungen zwischen gleichartigen Produkten.

Von den Verfahren TEAC II, TEAC III, DPPH und DMPD, die nur das Vermögen bzw. die Kapazität einer antioxidativen Substanz, eine bestimmte Menge von Testradikalen zu deaktivieren bzw. zu reduzieren, messen, ist das DPPH-Verfahren das Einfachste und Unkomplizierteste in der Anwendung. Es liefert die stabilsten Resultate und besitzt eine breite Anwendung. Nachteilig an dem Verfahren ist seine beschränkte Aussagekraft, die keine Informationen über die Aktivität der zeitlichen Reduktionskinetik der antioxidativen Substanz vermittelt.

Der Erfindung liegt daher das Problem zu Grunde, ein Messverfahren bereitzustellen, mit denen Parameter bestimmt werden, die Aussagen über die Reaktivität der zeitlichen Radikalreduktion sowie über das kapazitive Reduktionsvermögen der antioxidativen Substanz gestatten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Danach ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität von Stoffen oder Stoffgemischen, insbesondere von Rohstoffen und Fertigprodukten, mittels einer Messung der Reduktion von mindestens einem Testradikal mit mindestens einer antioxidativen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Messung einer zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I als ein Maß für die Anzahl der freien Testradikale N bei mindestens zwei unterschiedlichen Einwaagen w_n (n = 1, 2, ..) der zu testenden antioxidativen Substanz ausgeführt wird.

Aus den zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten t_m (m = 1, 2) gemessenen Signalintensitäten I für die jeweiligen Einwaagen w_n (n = 1, 2, ..) der zu testenden antioxidativen Substanz [I(t) = I_wn(t)] wird mindestens ein erster Datensatz zur Bestimmung eines ersten, dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeit t_r erzeugt.

Daran anschließend wird mindestens ein zweiter Datensatz aus dem funktionellen Zusammenhang der gemessenen Signalintensitäten I der jeweiligen Einwaagen w_n (n = 1, 2, ..) der zu testenden antioxidativen Substanz am Zeitpunkt t_r, [I_(t=tr) = f(w)] erzeugt, mit dem ein zweiter, statischer Parameter in Form der charakteristischen Einwaage w_c bestimmt wird.

Zur Bestimmung eines dritten, zweidimensionalen Parameters in Form der Antioxidative Power AP wird mindestens ein dritter Datensatz erzeugt. Der Parameter der Antioxidative Power AP ist als zeitabhängiges, quantitatives Maß zur Evaluierung der antioxidativen Aktivität einer antioxidativen Substanz als zweidimensionaler Quotient gemäß AP(t,w) ~ N/(tr·wc). beschrieben.

Mit dem Wert der Antioxidative Power AP wird ein Parameter definiert, der die Fähigkeit einer antiooxidativen Substanz angibt, in einem bestimmten Zeitintervall in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge an Antioxidatien eine bestimmte Zahl von Radikalen zu deaktivieren. In den Parameter AP sind somit zwei Eigenschaften der antioxidativen Substanz integriert: die antioxidative Kapazität als statischer Anteil und die Reaktivität als dynamischer Anteil. Die Differenzierung des AP in diese beiden Anteile ermöglicht eine genauere und umfassendere Beschreibung der antioxidativen Eigenschaften einer Substanz. Die Berücksichtigung des kinetischen Verhaltens des Reduktionsprozesses einer antioxidativen Substanz zusammen mit der Verwendung eines stabilen und etablierten Testverfahrens stellt eine neue Qualität im Vergleich zu bisher bekannten Methoden dar.

Die Reaktionszeit t_r als Parameter, der die Dynamik und Reaktivität der antioxidativen Substanz beschreibt, wird vorteilhafterweise mittels folgender, automatisch ablaufender Schritte bestimmt:

a) Auswertung mindestens zweier unterschiedlicher Einwaagen w_n (n = 1, 2, ...) der antioxidativen Substanz und Auswertung der Veränderung der Signalintensität des Testradikals I_wn(t) (w_n = w₁, w₂, ...) (Einheit Arbitrary Units) für die mindestens zwei Einwaagen zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten t_m (m = 1, 2 ....),
b) Normierung der jeweiligen gemessenen Signalintensitäten I_wn(t) = I(t) auf ihren jeweiligen Ausgangswert I_wn(t = 0) = I₀, Erzeugung eines Datensatzes mit n (n = 1, 2, ...) vergleichbaren normierten Reduktionskurven mittels Regression der durch die gemeinsame Einwaage w_n zusammengehörenden normierten Signalintensitäten mit einer monoexponentiellen Funktion i_wn(t) und Bestimmung des funktionellen Zusammenhangs i_wn(t)/I₀ = f(t) gemäß
wobei I_0n der Signalintensität entspricht die am Sättigungspunkt der Radikalreduktion für die jeweilige Einwaage w_n erreicht ist, und Bestimmung der jeweiligen Reaktionskonstante des Reduktionsprozesses k_wn (w_n = w₁, w₂, w₃, ...) mit der Maßeinheit min^–1 für die jeweilige Einwaage, und
c) Bestimmung der Reaktionszeit t_m (Einheit min) durch die auf I₀ normierten Gleichung trn = [-ln(1 – x)]/kwn (2)

Die Reaktionszeit t_rn wird vorteilhafterweise durch eine automatische Auswertung des funktionalen Zusammenhanges I_rn(t_rn) gemäß Irn(trn) = I0n + (1 – x)(I0 – I0n) = I0n + (I0 – I0n)exp – (kwn·trn) (3)mit (1 – x) = exp – (kwn·trn) (4)erzeugt.

Die Reaktionszeit t_rn bestimmt den Zeitraum, in dem die normierte Signalintensität i_wn(t = 0)/I₀ = I₀/I₀ = 1 des Testradikals um den Faktor x abgenommen hat, und wird zur Charakterisierung der Dynamik und Reaktivität der Radikalfängerkapazität der antioxidativen Substanz verwendet.

Der Faktor x ist bevorzugt eine beliebige, zwischen 0.....1 zu wählende Zahl, die für alle Einwaagen w_n konstant ist und den Zeitpunkt t_rn = t_r, wobei t_r eine Mittelung aller experimentell ermittelten t_rn-Werte ist, beschreibt an dem die Signalintensität I₀ um das x-fache der gesamten Signalabnahme I₀ – I_0n, des durch die Einwaage w_n bedingten gesamten Reduktionsvermögens, abgesunken ist.

Der Faktor x kann bevorzugt den Wert von x = 1/e = 0,368 einnehmen, so dass trn = 0,462/kwn. (5)ist.

Normalerweise sind die Reaktionszeiten gleich, so dass sich t_r = t_r1 = t_r2 = t_rn ergibt. Ungenauigkeiten bei der Regression erfordern jedoch eine Mittelung aller experimentell ermittelten t_rn-Werte gemäß tr = Σ trn/n (6).

Zur Charakterisierung der antioxidativen Kapazität als Parameter, der das Gesamtvermögen einer Substanz beschreibt, freie Radikale zu reduzieren ohne Beachtung von dessen Reaktionsdynamik, dient die Einwaagemasse w_c, die als charakteristische Einwaage bezeichnet wird. Der Wert der charakteristischen Einwaagemasse w_c wird bevorzugt mittels folgender, automatisch ablaufender Schritte bestimmt:

a) Anordnung der für den Zeitpunkt t_rn = t_r ermittelten Signalamplituden I_rn(t_rn)/I₀ als Funktion ihrer zugeordneten Einwaagen w = w_n (n = 1, 2, ..), Erzeugung des funktionellen Zusammenhanges I_rn(t_rn)/I₀ = f(w_n), und Regression der sich aus dem funktionellen Zusammenhang ergebenen Funktionskurve durch eine monoexponentielle Funktion gemäß
b) Bestimmung der Reaktionskonstante k_tr (Einheit mg^–1) aus der monoexponentiell angepassten Funktionskurve, und
c) Bestimmung der charakteristischen Einwaage w_c (Einheit mg/ml) als Menge, die notwendig ist, das maximale mögliche Reduktionsvermögen von x = (x·I₀)/I₀ um den Faktor x von I₀ auf I_c zu vermindern, gemäß

Vorteilhafterweise wird w_c durch die automatische Auswertung der Funktion I_c(w_c) gemäß Ic(wc) = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)(1 – x) = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)exp – (ktr·wc) (9)mit (1 – x) = exp – (ktr·wc) (10)bestimmt.

Bevorzugt nimmt x den Wert 1/e an, womit die charakteristische Masse gemäß

bestimmt wird.

Der Parameter der Antioxidative Power AP wird mittels der Gleichung AP = (RA·N)/(tr·wc) (12)bestimmt, wobei RA den charakteristischen Radikalabbau für das Testradikal darstellt.

Der Datensatz zur Bestimmung des Radikalabbaus RA ist gemäß der Gleichung RA = 1 – (1 – x2) = x2 (13)erzeugt, wobei RA durch eine automatische Auswertung des funktionellen Zusammenhanges I_c(RA) gemäß RA = I0/I0 – Ic/I0 (14)mit Ic = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)·(1 – x) = I0 – x2 I0 und Ic/I0 = 1 – x2 (15) bestimmt wird.

RA als Reduktionsfaktor wird somit über den Faktor x definiert, der jeden beliebigen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung sinnvollen Wert einnehmen kann. Bevorzugt weist RA einen Wert von RA = x² = (1/e)² = 0,135 auf.

N ist die Menge der reduzierten freien Radikale, charakterisiert durch ihren Elektronenspin. AP wird bevorzugt in den Einheiten [spins/min·mg] oder [mol/l·min·mg] angegeben.

Mit Vorteil wird die Antioxidative Power AP in der Standardeinheit Antioxidative Unit (AU) angegeben, wobei 1 AU der Antioxidative Power einer Lösung von Vitamin C mit einer Konzentration von 1 ppm entspricht.

Die Einführung der Standardeinheit AU ermöglicht einen direkten Vergleich der ermittelten antioxidativen Fähigkeiten von verschiedenen Substanzen und deren Bezug auf die Antioxidative Power AP von 1 ppm Vitamin C.

Die Messung der Signalintensität I des Testradikals wird vorteilhafterweise mittels ESR Spektroskopie durchgeführt. Als Testradikale werden bevorzugt 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH), 2,6-Di-tert-butyl-alpha-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy (Galvinoxyl), Fremysches Salz (festes Salz der Nitroso-disulfonsäure) und/oder Nitroxyde verwendet.

Die Signalintensität I des Testradikals kann aber auch colorimetrisch in einem UV/VIS Spektrometer unter Verwendung von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) als Testradikal vermessen werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird auch durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 20 gelöst.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
1: ein Diagramm, in dem die Abnahme der normierten Signalintensitäten i_w(t)/I₀ eines Testradikals als Funktion der Zeit und bedingt durch drei unterschiedliche Einwaagen w_n (n = 1, 2, 3) einer antioxidativ wirkenden Substanz aufgetragen ist;
2: ein zweites Diagramm, in dem die normierten Signalintensitäten I_rn(w_n)/I₀ des Testradikals, aufgenommen nach einer Reaktionszeit t_r, als gefittete monoexponentielle Funktion i(w)/I₀ = i_tr(w)/I₀ der eingewogenen Mengen w der antioxidativ wirkenden Substanz aufgetragen ist;
3a: ein drittes Diagramm, in dem die Antioxidative Power AP von verschiedenen getesteten Teesorten entsprechend ihren AU-Werten (Balkendiagramm) und in Abhängigkeit von den jeweiligen Reaktionszeiten t_r (Liniendiagramm) gezeigt ist; und
3b: ein viertes Diagramm, in dem die Antioxidative Power von verschiedenen getesteten Teesorten entsprechend ihren AU-Werten (Balkendiagramm) und in Abhängigkeit von den jeweiligen charakteristischen Einwaagen w_c (Liniendiagramm) gezeigt ist.
Ausführungsbeispiel 1: Bestimmung der Reaktionszeit t_r
Die Messung und Kalkulation der individuellen Parameter zur Bestimmung der Antioxidative Power AP wird am Beispiel von Grünem Tee als Radikalfänger gezeigt.
Hierzu werden zunächst drei unterschiedliche Mengen w_n an Grünem Tee (w₁ = 0,01 mg/ml, w₂ = 0,02 mg/ml, w₃ = 0,03 mg/ml) eingewogen. Zur Messung der Reaktionszeit t_r werden die Einwaagen in einer Wasser/Ethanol-Lösung (50/50) gelöst. 200 μl dieser Lösung wird mit 200 μl einer Testradikal-Lösung von 0,2 mM DPPH in reinem Ethanol vermischt, so dass sich eine DPPH Endkonzentration von 0,1 mM in einer Wasser/Ethanol-Lösung (25/75) ergibt. Sofort nach dem Mischen der Substanzlösung mit der DPPH-Lösung wird die ESR-Messung in einem ESR Gerät der Firma Magnettech (MS 200) gestartet. Zu fünf verschiedenen Zeitpunkten (t₁ = 1 min, t₂ = 4min, t₃ = 10min, t₄ = 20min und t₅ = 30min) wird die Abnahme der Signalintensität gemessen. Die sich aus den normierten Signalintensitäten I_wn(t)/I₀ für die jeweilige Einwaage ergebenden Daten werden mit monoexponentiellen Funktionen i_wn(t)/I₀ gefittet (siehe 1). Die sich daraus ergebenden Reaktionskonstanten k_wn beträgt für die drei Einwaagen jeweils k_w1 = 1,325 min^–1, k_w2 = 1,305 min^–1 und k_w3 = 1,346 min^–1. Die korrespondierenden Reaktionszeiten ergeben gemäß Gleichung (2) für die drei Einwaagen t_r1 = 0,349 min, t_r2 = 0,354 min und t_r3 = 0,343 min, woraus sich ein Mittelwert für t_r gemäß Gleichung (6) von 0,349 min ergibt. Der Mittelwert für t_r stellt den ersten Parameter der Antioxidative Power dar und bestimmt die Dynamik und Reaktivität des Radikalfänger-Prozesses verursacht durch die antioxidativen Inhaltsstoffe des Grünen Tees dar.
Ausführungsbeispiel 2: Bestimmung der Reaktionskapazität w_c
Für die Bestimmung des zweiten Parameters der charakteristischen Einwaage w_c, der die Reaktionskapazität charakterisiert, ist ein zweites Diagramm notwendig, in dem die normierten Signalintensitäten I_rn/I₀ zum Zeitpunkt t_r als Funktion der jeweiligen Einwaage w_n an Grünem Tee dargestellt werden (siehe 2). Ein monoexponentielles Fitten dieser Daten gemäß Gleichung (2) ergibt eine Reaktionskonstante k_tr von 45,87 mg^–1. Für die Reaktionskapazität w_c ergibt sich daraus gemäß Gleichung (3) von 0,01007 mg an Grünem Tee.
Ausführungsbeispiel 3: Bestimmung der Antioxidative Power AP
Daraus ergibt sich für Grünen Tee ein AP Wert gemäß Gleichung (12) aus
mit

RA: = 0.137;
N(DPPH-spins):: 0.1 mM ^ 6.022·10¹⁶ spins/ml;
t_r: = 0.349 min; und
w_c: = 0.01007 mg,

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Ausführungsbeispiel 4: Einführung der Standardeinheit Antioxidative Unit (AU)
Da die Definition der Antioxidative Power AP durch die Einheit [spins/mg·min] zu umständlich für eine einheitliche Betrachtungsweise und Vergleich der antioxidativen Aktivitäten der vermessenen Substanzen ist, wird die Einheit Antioxidative Unit (AU) eingeführt. Diese Einheit basiert auf der Antioxidative Power einer 1 ppm Vitamin C-Lösung. Die Antioxidative Power AP einer 1 ppm VitC Lösung beträgt 2.495·10¹³ spins/mg·min und ist als 1 Antioxidative Unit AU definiert. Darauf basierend ergibt sich für die berechnete Antioxidative Power AP des Grünen Tees von AP = 2.376·1018 [spins/mg·min] ein AU Wert von 0,95229·10⁶ AU.
Unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens wurden die Werte der Antioxidative Power AP für fünf verschiedene Teesorten ermittelt. In Tabelle 1 sind die kalkulierten AP Werte für die Teesorten Kamille, Grüner Tee, Schwarzer Tee, Kräuter Tee und Hagebutten-Hibiskus-Tee verglichen.
Tabelle 1
Grüner Tee weist neben einer herausragenden antioxidativen Kapazität auch eine sehr gute Reaktivität auf, woraus sich der hohe Wert für die Antioxidative Power AP ergibt. Der AP des Grünen Tees ist insgesamt 6-mal größer als der von Schwarzem Tee, ein Punkt der allgemein bekannt ist. Während Grüner Tee antioxidative Eigenschaften bedingt durch eine kurze Reaktionszeit von t_r = 0,349 min aufweist, besitzt der Hagebutten-Hibiscus-Tee eine 6,44-mal längere Reaktivitionszeit t_r von 2,249 min. Demzufolge muss, um eine Reduzierung der Signalintensität des DPPH-Radikals um RA = (1/2e)² zu erhalten, eine charakteristische Einwaage von w_c = 0,0842 mg an Hagebutten-Hibiskus-Tee eingesetzt werden, was insgesamt 8,42-mal mehr ist als die notwendige Menge an Grünem Tee. Die Reaktivität und Reaktionskapazität von Schwarzem Tee und Kräutertee unterscheiden sich nur geringfügig.
Mit Ausnahme von Kamillentee wird die Antioxidative Power der getesteten Teesorten durch die Reaktivität und die Reaktionskapazität gleichermaßen bestimmt. Im Unterschied dazu weist Kamillentee eine hohe Reaktivität von 0,634 min auf, jedoch ist die Reaktionskapazität von 0,178 mg/ml wesentlich höher als die der anderen Teesorten. Aus diesen Werten kann daher geschlossen werden, dass die Konzentration der antioxidativ wirksamen Komponente im Kamillentee um ein vielfaches geringer ist als in den anderen Teesorten. Der AP Wert gibt also Informationen über die Qualität in Form des zeitlichen Parameters der Reaktionszeit t_r und die Quantität in Form des stationären Parameters der Reaktionskapazität w_c.
1 zeigt die graphische Bestimmung der Reaktionszeit t_r, die sich aus dem funktionellen Zusammenhang der normierten Signalintensitäten I/I₀ = I_wn(t)/I₀ von jeweils drei Einwaagen w_n und den entsprechenden Reaktionszeiten t des Testradikals DPPH ergibt. Die experimentell ermittelten Werte werden entsprechend ihrer Zusammengehörigkeit (gleiche Einwaage w_n) mittels einer monoexponentiellen Funktion i_wn(t)/I₀ gefittet. Der Wert t_rn repräsentiert für die jeweilige Funktion i_wn(t)/I₀ die Zeit, nach der sich die Signalintensität des DPPH Radikals um einen Wert von 1/e, der durch die jeweilige Einwaage w_n vorgegebenen Radikalreduktion I₀ – I_0n, verringert hat. Die sich daraus ergebenden normierten Intensitätswerte für das Testradikal sind I_r1/I₀ = 0,849, I_r2/I₀ = 0,793 und I_r3/I₀ = 0,713 s. Die maximal mögliche Signalreduktion die durch den stationären Zustand (steady-state) charakterisiert ist, ist abhängig von der eingesetzten Menge w_n der antioxidativen Substanz und ist dabei gekennzeichnet durch die normierten Werte I₀₁/I₀ = 0,593 für w₁, I₀₂/I₀ = 0,441 für w₂ und I₀₃/I₀ = 0,225 für w₃.
2 zeigt die normierten Signalintensitäten I_rn/I₀ für eine 0,1 mM Ausgangslösung des DPPH-Radikals nach entsprechenden Reaktionszeiten t_rn die als monoexponentielle Funktion i_tr(w)/I₀ der jeweiligen Einwaagen w mit w = w_n (n = 3) des Grünen Tees dargestellt ist. Der gemäß Ausführungsbeispiel berechnete Wert der charakteristischen Einwaage (Reaktionskapazität) w_c des Grünen Tees beträgt 0,01007 mg/ml. Wie aus dem Diagramm entnehmbar ist, ist die bei diesem w_c Wert verbliebene Signalintensität I_c des DPPH Radikals I_c = 0,863·I₀. Für die monoexponentielle Kurve ergibt sich daraus ein Wert von I_c/I₀ = 0,863. Das bedeutet, dass 0,01007 mg/ml Grüner Tee das Signal des DPPH Radikals (0.1 mM) um 13,7 % reduzieren.
3a zeigt die Korrelation des Wertes der Antioxidative Power AP der getesteten Teesorten mit den dazu ermittelten Reaktionszeiten t_r, während 3b die Korrelation des AP Wertes mit den dazu ermittelten charakteristischen Einwaagen (Reaktionskapazitäten) w_c darstellt. Der Umstand, dass in beiden Figuren keine klare inverse Korrelation zwischen dem AP Wert und den Werten von t_r bzw. w_c deutlich wird, weist darauf hin, dass die verschiedenen Teesorten unterschiedliche Antioxidantien mit unterschiedlich ausgeprägten Radikalfängereigenschaften enthalten. Die verschiedenen Reaktionszeiten zeigen, dass neben den eingesetzten Mengen auch unterschiedliche Antioxidantien in den einzelnen Teesorten den AP Wert bestimmen. So weist die lange Reaktionszeit des Hagebutten-Hibiskus-Tees auf andere wirksame Antioxidantien in diesem Tee als im Grünen Tee hin.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität von Stoffen oder Stoffgemischen, insbesondere Rohstoffen oder Fertigprodukten, mittels Messung der Reduktion mindestens eines Testradikals mit mindestens einer antioxidativen Substanz, gekennzeichnet durch a) mindestens eine Messung einer zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I als ein Maß für die Anzahl der freien Testradikale N bei mindestens zwei unterschiedlichen Einwaagen w_n (n = 1, 2 ..) der zu testenden antioxidativen Substanz, b) Erzeugung mindestens eines ersten Datensatzes zur Bestimmung eines ersten, dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeit t_r aus den zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten t_m (m = 1, 2) gemessenen Signalintensitäten I für die jeweiligen Einwaagen w_n (n = 1, 2, ...) der zu testenden antioxidativen Substanz [I(t) = I_wn(t)], c) Erzeugung mindestens eines zweiten Datensatzes zur Bestimmung eines zweiten, statischen Parameters in Form der charakteristischen Einwaage w_c aus dem funktionellen Zusammenhang der gemessenen Signalintensitäten I der jeweiligen Einwaagen w_n (n = 1, 2, ..) der zu testenden antioxidativen Substanz am Zeitpunkt t_r, [I_(t=tr) = f(w)], und d) Erzeugung mindestens eines dritten Datensatzes zur Bestimmung eines dritten Parameters in Form der Antioxidative Power AP, der als zeitabhängiges, quantitatives Maß zur Evaluierung der antioxidativen Aktivität einer antioxidativen Substanz ein zweidimensionaler Quotient gemäß
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der dynamische Parameter der Reaktionszeit t_r mittels folgender, automatisch ablaufender Schritte bestimmt wird: a) Auswertung mindestens zweier unterschiedlicher Einwaagen w_n (n = 1, 2, ...) der antioxidativen Substanz und Auswertung der Veränderung einer Signalintensität des Testradikals I_wn (w_n = w₁, w₂, ...) (Einheit Arbitrary Units) für die mindestens zwei Einwaagen zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten t_m (m = 1 bis 2...), b) Normierung der jeweiligen gemessenen Signalintensitäten I_wn(t) = I(t) auf ihren jeweiligen Ausgangswert I_wn(t = 0) = I₀, Erzeugung eines Datensatzes mit n (n = 1, 2, ...) vergleichbaren normierten Reduktionskurven mittels Regression der durch die gemeinsame Einwaage w_n zusammengehörenden normierten Signalintensitäten mit einer monoexponentiellen Funktion i_wn(t) und Bestimmung des funktionellen Zusammenhangs i_wn(t)/I₀ = f(t) gemäß
wobei I_0n der Signalintensität entspricht die am Sättigungspunkt der Radikalreduktion für die jeweilige Einwaage w_n erreicht ist, und Bestimmung der jeweiligen Reaktionskonstante des Reduktionsprozesses k_wn (w_n = w₁, w₂, w₃, ...) mit der Maßeinheit min^–1 für die jeweilige Einwaage, und c) Bestimmung der Reaktionszeit t_rn (Einheit min) gemäß der auf I₀ normierten Gleichung
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass t_rn durch eine automatische Auswertung des folgenden funktionalen Zusammenhangs I_rn(t_rn) erzeugt wird: Irn(trn) = I0n + (1 – x)(I0 – I0n) = I0n + (I0 – I0n)exp – (kwn·trn) (3)mit (1 – x) = exp – (kwn·trn) (4).
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor x eine beliebige, zwischen 0.....1 zu wählende Zahl ist, die für alle Einwaagen w_n konstant ist und den Zeitpunkt t_rn = t_r, beschreibt an dem die Signalintensität I₀ um das x-fache der gesamten Signalabnahme I₀ – I_0n, des durch die Einwaage w_n bedingten gesamten Reduktionsvermögens, abgesunken ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass t_r eine Mittelung aller experimentell ermittelten t_rn-Werte gemäß
ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor x einen Wert von 1/e = 0,368 aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der statische Parameter der charakteristischen Einwaage w_c mittels folgender, automatisch ablaufender Schritte bestimmt wird: a) Anordnung der für den Zeitpunkt t_rn = t_r ermittelten Signalamplituden I_rn(t_rn)/I₀ als Funktion ihrer zugeordneten Einwaagen w = w_n (n = 1, 2, ...), Erzeugung des funktionellen Zusammenhanges I_rn(t_rn)/I₀ = f(w_n) und Regression der sich aus dem funktionellen Zusammenhang ergebenen Funktionskurve durch eine monoexponentielle Funktion gemäß
b) Bestimmung der Reaktionskonstante k_tr (Einheit mg^–1) aus der monoexponentiell angepassten Funktionskurve, und c) Bestimmung der charakteristischen Einwaage w_c (Einheit mg/ml) als Menge, die notwendig ist, das maximale mögliche Reduktionsvermögen von x = (x·I₀)/I₀ um den Faktor x von I₀ auf I_c zu vermindern, gemäß der Gleichung
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass w_c durch automatische Auswertung einer Funktion I_c(w_c) gemäß Ic(wc) = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)(1 – x) = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)exp – (ktr·wc) (9)mit (1 – x) = exp – (ktr·wc) (10)bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor x den Wert 1/e = 0,368 aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Parameter der Antioxidative Power AP (Einheit [spins/mg·min] oder [mol/l·min·mg] gemäß der Gleichung
bestimmt wird, wobei RA ein für ein Testradikal charakteristischer Radikalabbau ist und N der Menge der dabei der reduzierten freien Radikale entspricht, wobei N durch die Anzahl der Elektronenspins der freien Radikale oder durch die Konzentration des freien Testradikals bestimmt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass RA durch eine automatische Auswertung eines Datensatz zur Bestimmung des Radikalabbaus gemäß RA = 1 – (1 – x2) = x2 (13)erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass RA durch eine automatische Auswertung des funktionalen Zusammenhanges I_c (RA) gemäß RA = I0/I0 – Ic/I0 (14)mit Ic = (1 – x)I0 + (I0 – (1 – x)I0)·(1 – x) = I0 – x2 I0 und Ic/I0 = 1 – x2 (15)erzeugt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Radikalabbau RA einen Faktor von x² aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor x² einen Wert von (1/e)² = 0,135 aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Antioxidative Power AP eine Standardeinheit Antioxidative Unit (AU) definiert wird, wobei 1 AU der Antioxidative Power AP einer Lösung von Vitamin C mit einer Konzentration von 1 ppm entspricht.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Signalintensität I des Testradikals mittels ESR Spektroskopie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Testradikale 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH), 2,6-Di-tert-butyl-alpha-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxy (Galvinoxyl), Fremysches Salz (festes Salz der Nitrosodisulfonsäure) und/oder Nitroxyde verwendet werden.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Signalintensität I des Testradikals colourimetrisch in einem UV/VIS Spektrometer erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Testradikal 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) verwendet wird.
Vorrichtung zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität von Stoffen oder Stoffgemischen mittels Messung der Reduktion mindestens eines Testradikals mit mindestens einer antioxidativen Substanz mit einem Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.