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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung beschreibt eine Testvorrichtung zur effizienten Erzeugung
und Testung von Mischungen zweier unterschiedlicher Substanzen in Hinblick
auf ihre biologische Aktivität.
Die Testvorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzmischungen
durch Diffusion erzeugt werden. Auf diese Weise ist die Anzahl der
Arbeitsschritte zur Vorbereitung des biologischen Tests unabhängig von
der Zahl der Substanzmischungen, die auf ihre biologische Aktivität getestet
werden sollen. Darüber
hinaus ist die Testvorrichtung in handelsüblichen Trägern zur Durchführung biologischer
Tests von Substanzen einsetzbar. Protokolle zum Nachweis der biologischen
Aktivität
von Substanzen insbesondere in zellbiologischen Tests können an
die Erfordernisse der Testvorrichtung angepasst werden.
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Die
gezielte Steuerung komplexer zellulärer Antworten ist eines der
vordringlichsten Ziele in der Wirkstoffentwicklung. Dabei ist zu
berücksichtigen, dass
eine spezifische zelluläre
Antwort meist nicht über
die Stimulation eines Rezeptors alleine, sondern erst durch die
kombinierte Stimulation mehrerer unterschiedlicher Rezeptoren hervorgerufen
wird. Insbesondere für
therapeutisch hochrelevante Organe wie das Immunsystem ist der Mangel
wirksamer und spezifischer Therapien auf die mangelnde Spezifität von Wirkstoffen
zurückzuführen, die
monokausal immunkompetente Zellen beeinflussen. In ähnlicher
Weise ist durch die Kombination von Wirkstoffen, die in der Zelle
wirken, eine spezifischere Steuerung zellulärer Vorgänge möglich. Die Herstellung und
Testung von Mischungen von Substanzen, die zelluläre Antworten
beeinflussen (typischerweise Wirkstoffkandidaten), und insbesondere
die systematische Herstellung und Testung einer großen Zahl von
Mischungen zweier Wirkstoffkandidaten, die sich jeweils in der relativen
und/oder absoluten Konzentration der Wirkstoffkandidaten unterscheiden,
für eine
große
Zahl von Kombinationen von Wirkstoffkandidaten ist jedoch mit den
gegenwärtigen
Technologien sehr zeit- und materialaufwändig. Zur Verfügung stehen
automatisierte Pipettierer, die die Mischungen einzeln durch Pipettieren
unterschiedlicher Volumina von Stammlösungen der Testsubstanzen in einzelne
Probenkammern von Testplatten herstellen.
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Zur
systematischen Testung aller Kombinationen von z. B. 5 Substanzen,
wobei für
jede Kombination z. B. 100 verschiedene Mischungsverhältnisse zu
untersuchen sind, sind 5 × 4 × 3 × 2 × 198 Pipettierschritte
zur Herstellung aller Mischungen mindestens erforderlich (für jedes
Array von 10 × 10
Mischungen 2 × 99,
da in je einer Probe eine Substanz in reiner Form vorliegt. D. h.
es sind 23760 Pipettierschritte erforderlich und 12000 Probenkammern
(es ist zu berücksichtigen,
dass im Hinblick auf die Entwicklung von Wirkstoffkombinationen
die Testung von nur 5 Substanzen an der unteren Grenze der in der
Praxis durchzuführenden
Tests liegt). Zur Durchführung
einer derart großen
Zahl von biologischen Tests wird unweigerlich eine Miniaturisierung
einzelner Probenkammern angestrebt werden. So stehen für die biologische
Testung von Substanzen z. B. Microtiterplatten mit 1536 Probenkammern
zur Verfügung.
Aufgrund der kleinen Volumina, die in diese Probenkammern pipettiert
werden und aufgrund des ungünstigen
Oberfläche
zu Volumenverhältnisses,
ist insbesondere die Durchführung
von zellbiologischen Tests in diesen Microtiterplatten nur eingeschränkt möglich.
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Die
hier beschriebene Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von
Substanzmischungen und Testung dieser Mischungen in zellulären Tests löst daher
sowohl das Problem der enormen Zunahme erforderlicher Pipettierschritte
bei Zunahme der zu testenden Substanzen und ihrer Mischungen als auch
das Problem des ungünstigen
Oberfläche
zu Volumenverhältnisses,
das bei der bislang üblichen Miniaturisierung
biologischer Tests entsteht.
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Inhalt der Erfindung
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Die
Erfindung löst
die oben genannten Probleme, indem die Substanzmischungen durch
Diffusion hergestellt werden. Auf diese Weise reduziert sich die
Anzahl der erforderlichen Pipettierschritte auf die Zahl der zu
testenden Substanzkombinationen. Es sind keine Pipettierschritte
zur Herstellung von Mischungen, in denen die Substanzen einer Kombination
in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, erforderlich. Für das oben
genannte Beispiel bedeutet dies, dass anstelle von 23760 Pipettierschritten nur
120 Pipettierschritte erforderlich sind.
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Durch
Diffusion liegen die Substanzen in Konzentrationsgradienten vor,
die bei einer Diffusionsstrecke von 1 cm bis zu 3 Größenordnungen
an Konzentrationen abdecken. Die Testvorrichtung stellt in ihren
wesentlichen Merkmalen Reservoire für die Aufnahme von Testsubstanzen
und eine Testkammer zur Verfügung.
Die Reservoire liegen bevorzugt in an zwei benachbarten Seiten der
Testkammer. Die Form der Diffusiongradienten ist von der offenen
Kontaktfläche
der Reservoire mit der Diffusionsmatrix und der Anordnung relativ
zur Testkammer abhängig.
In der Testkammer werden geeignete Nachweise zur Untersuchung der
biologischen Aktivität
der Substanzmischungen durchgeführt.
Die Durchführung des
Tests für
alle Mischungsverhältnisse
einer Substanzkombination in einer Testkammer löst das oben genannte Problem
des ungünstigen
Oberfläche
zu Volumen Verhältnisses
bei der Miniaturisierung von biologischen Tests nach dem Stand der
Technik. Wie in Ausführungsbeispiel
3 dargelegt wird, lassen sich etablierte biologische Nachweisverfahren
an die Anforderungen der hier beschriebenen Testvorrichtung anpassen.
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Die
Testvorrichtung wird wie in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen
beschrieben, typischerweise auf eine Diffusionsmatrix aufgesetzt.
Wesentliche Aufgabe der Diffusionsmatrix ist Vermeidung von Konvektion
zur Gewährleistung
der Entstehung von Konzentrationsgradienten durch Diffusion. Ein
geeignetes Material zur Herstellung der Diffusionsmatrix für den Einsatz
in biologischen Tests ist z. B. Agarose der Konzentration von 1–4%. Alternativ zu
Gelen und Polymeren können
aber auch feine Netz verwendet werden, sofern durch Temperatur- und
Feuchtigkeitskonstanz während
der Herstellung des Diffusionsgradienten Konvektion ausreichend vermieden
werden kann. Netz anstelle von Gelen und Polymeren sind z. B. für die Diffusion
von großen Molekülen wie
z. B. Antikörpern
vorteilhaft oder wenn in die Diffusionsmatrix Partikel, z. B. Nano-
und Mikropartikel eingelagert werden, die nach einer Immobilisierung
der Substanzen auf diesen Partikeln für eine weitere Testung z. B.
mit einem Kapillarnetz der Diffusionsmatrix entnommen werden sollen.
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Die
Konzentrationen der Testsubstanzen an den einzelnen Orten der Diffusionsmatrix
werden bevorzugt über
Simulationen oder Zusatz fluoreszent markierter Referenzsubstanzen
mit sehr ähnlichen Diffusionseigenschaften
ermittelt.
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Biologische
Tests werden, wie z. B. in Ausführungsbeispiel
3 beschrieben, bevorzugt in der Testkammer durchgeführt. Auf
diese Weise kann das Ergebnis des Tests an einem Ort direkt einer
Substanzmischung zugeordnet werden. Die Anzahl der individuellen
Testergebnisse ist allein durch die räumliche Auflösung des
Instrumentes, mit dem das Testergebnis ausgelesen wird, gegeben.
Besteht das Detektionsprinzip in der Bildung eines fluoreszenten Niederschlags,
so kann der Test z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop mit digitaler
CCD Kamera ausgelesen werden. In diesem Fall können aus einem Test tausende
von Datenpunkten generiert werden.
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1.
Aufbau der Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von Substanzmischungen
gemäß Ausführungsbeispiel
1
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2.
Aufbau der Testvorrichtung zur Herstellung und Testung von Substanzmischungen
gemäß Ausführungsbeispiel
2.
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3.
Darstellung der zusammengesetzten Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel
2 mit eingelegtem Netz
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4.
Schematische Darstellung der Durchführung eines Sandwich-ELISA-artigen
Nachweises in der Testvorrichtung
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Ausführungsbeispiel 1: Testvorrichtung
zur Erzeugung und Testung von Substanzmischungen.
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Dieses
Ausführungsbeispiel
beschreibt die Testvorrichtung zur Erzeugung und Testung von Substanzmischungen
in einer einfachen. Form. Die äußeren Dimensionen
und die Bauhöhe
der Testvorrichtung (1) sind bevorzugt kompatibel mit dem
Einsatz der Testvorrichtung in handelsüblichen Testplatten (6)
mit 12 Probenkammern (12-well ELISA-Platten).
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Probenreservoire
(2) dienen der Aufnahme von Lösungen der Testsubstanzen,
die durch Diffusion die Konzentrationsgradienten bilden. Um die
manuelle oder automatisierte Befüllung
zu erleichtern können
die Reservoire über
Ausbuchtungen (8) verfügen.
In der Testkammer (3) werden die Lösungen eingefüllt, die
dem Nachweis der Aktivität
der Testsubstanzen dienen. Dies kann z. B. eine Zellsuspension sein.
Kerben (5) erleichtern das Herausheben der Testvorrichtung
aus den Probenkammern z. B. mit einer Uhrmacherpinzette. Die Zähne (4)
verhindern zum einen ein Unterfließen der Testlösung unter den
Rändern
der Reservoire bei nicht befüllter
Testkammer durch hydrostatischen Druck und stellen sicher, dass
Testsubstanz aus den Reservoiren nur durch Diffusion in die Diffusionsmatrix
(7) gelangt. Zum anderen verankern sie die Halterung in
der Diffusionsmatrix.
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Ausführungsbeispiel 2: Testvorrichtung
zur Erzeugung von Substanzmischungen und Durchführung von biologischen Tests
mit, auf einem Netz immobilisierten, Probenmolekülen
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Bei
diesem Ausführungsbeispiel
besteht die Testvorrichtung aus einem äußerem Rahmen (9) und einem
Einsatz (10). Beide können
durch Einsetzen von Schrauben in die Schraublöcher (12) über die Gewinde
(11) verschraubt werden. Zwischen äußeren Rahmen und Einsatz kann
ein Netz (14) eingelegt werden. Vorstehende Kanten (15)
spannen das Netz in dem Rahmen auf. Eine Verschraubung ist bei einer Fertigung
der Bauteile aus Metall eine bevorzugte Realisierung. Bei einer
Fertigung aus einem geeigneten Kunststoff ist auch ein festes Eindrücken des
Einsatzes in den Rahmen denkbar. Das Netz ist so beschaffen, dass
Proteine, bevorzugt Antikörper,
absorbieren können.
Z. B. erfüllen
Netze aus Gewebsstahl, die für
den Siebdruck und als Filter eingesetzt werden, diese Anforderung.
Diese Netze verfügen
in einer bevorzugten Realisierung über eine Drahtdicke von 50 μm und einer
Maschenweite von 100 μm.
Vor dem Einsatz in der Testvorrichtung werden diese Netze gereinigt.
Dies kann z. B. durch Waschen mit Aceton und Ethanol oder durch
ein Sauerstoffplasma geschehen.
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Ausführungsbeispiel 3: Testung von
Substanzmischungen in Hinblick auf die Beeinflussung der Zytokinexpression
in T-Lymphozyten
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Ein
Einsatz der Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel
2 in einer bevorzugten Realisierung zur Durchführung eines zellulären Assays
wird nachfolgend beschrieben. In diesem zellulären Assay wird die Wirkung
von Substanzmischungen auf die Zytokinexpression von Zellen, z.
B. T-Lymphozyten erfasst. Eine Anpassung anderer Assays (z. B. Expression von
Reportergenen in Zellen) an das Format der Testvorrichtung ist möglich. Auch
für solche
zellulären
Assays ist der Einsatz eines Netzes sinnvoll, da das Netz die Bewegung
von Zellen durch Flüssigkeitsströmungen verhindert.
Auf diese Weise kann eine zelluläre
Antwort eindeutig einer Position des Konzentrationsgradienten zugeordnet
werden. Kann diese Bewegung vermieden, werden so ist die Durchführung eines
solchen Reporterassays auch mit einer Testvorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel
1 möglich.
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In
einer Realisierung wird in eine Probenkammer einer handelsüblichen
Polystyrol 12-Loch Testplatte (6) eine Agaroselösung als
Diffusionsmatrix (7) eingegossen und durch Abkühlen geliert.
Für die
Dimensionen einer Testvorrichtung, die in einer 12-Loch Testplatte
verwendet werden kann, ist das Volumen des Gels bevorzugt 3 ml.
Die Konzentration der Agarose ist bevorzugt 1–4% (w/v). Je größer das Molekulargewicht
der Testsubstanzen ist, umso geringer wird die bevorzugte Konzentration
der eingesetzten Agarose sein. Neben Agarose können weitere gelierende und
vernetzte Polymere bildende Materialien eingesetzt werden. Auch
der Einsatz feinmaschiger Gitter ist denkbar. Wichtig ist, dass
die Störung
der Bildung der Gradienten durch Diffusion infolge von Konvektion
verhindert wird.
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Die
Testvorrichtung wird in die Probenkammer eingesetzt und leicht angedrückt. Anschließend werden
die Testsubstanzen in die Reservoire für Testsubstanz (2)
eingefüllt
(5 bis 50 μl).
Durch den leichten Druck schneiden die Zähne (4) in die Agarose.
Vor dem Einsatz der Testvorrichtung in die Probenkammer wird das
Netz mit einer Lösung
inkubiert, die einen Antikörper
(16) enthält.
Dieser Antikörper ist
gegen Substanzen gerichtet, die von Zellen im Zusammenhang mit dem
durch den Assay zu untersuchenden Signaltransduktionsweg abgegeben
werden. In dem hier beschriebenen Fall ist diese Substanz ein Zytokin
(18). Der Antikörper
dient der Bindung der Zytokine für
einen nachfolgenden Zytokinnachweis im Rahmen eines sogenannten
Sandwich-ELISA. Durch die Fixierung der Antikörper auf dem Netz spiegelt
die Menge des gebundenen Zytokins die zelluläre Antwort in Nachbarschaft.
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Durch
Diffusion entstehen in der Diffusionsmatrix Konzentrationsgradienten
der Testsubstanzen und durch Überlagerung
der Gradienten der beiden Testsubstanzen unterschiedliche Mischungen
der Testsubstanzen in der Diffusionsmatrix. Die von links nach rechts
weisenden spitzen Dreiecke deuten den Konzentrationsgradienten der
Testsubstanz an. Die Dauer, die zur Einstellung der Gradienten gewartet wird,
hängt (i)
von der Konzentration der Agaroselösung, (ii) der Größe der Testmoleküle, (iii)
der Temperatur und (iv) dem zu testenden Konzentrationsgradienten
ab. Bei einer Konzentration des Agarosegels von 4%, einer Inkubationstemperatur
von 20°C
und Testmolekülen
von einem Molekulargewicht von 500 Da beträgt die Inkubationsdauer typischer
weise 16–40
h. Die Zeit zur Durchführung
des Testes muss nach Möglichkeit
kurz gegenüber
der Zeit sein, die zur Einstellung des Konzentrationsgradienten
verstrichen ist. Dies ist z. B. bei einer Zeit für die Einstellung des Konzentrationsgradienten
von 12 h und der Zeit für
die Durchführung
des Tests von 1 h gegeben. In einzelnen Fällen wird es erforderlich sein,
die Zellen für
längere
Zeit in der Testkammer zu belassen, z. B. um zur Expression von
ausreichend Zytokinen Zeit zu geben. In diesem Fall ist davon auszugehen,
dass sich die Konzentration an Testsubstanz während der Testdurchführung ändert. Da
für eine
zelluläre
Antwort häufig
die Konzentration eines Inhibitors zu Beginn einer Zellantwort von
Bedeutung ist, ist eine Interpretation der Ergebnisse also dennoch
möglich.
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Nach
Einstellung der Konzentrationsgradienten wird die Testkammer (3)
mit einer Zellsuspension befüllt.
Typischerweise wird die Füllhöhe um einige 100 μm über der
Oberkante der Netze liegen. Die Zellen sinken ab und setzen sich
in den Maschen des Netz auf der Agarose ab. Die Testsubstanzen treten aus
der Agaroseschicht in die darüber
befindliche Zellsuspension aus. Die Zellen werden nach einer geeigneten
Wartezeit, die dem Eintreten der Testsubstanzen in die Zellen dient
stimuliert (23). Diese Stimulation erfolgt z. B. durch
Aufsprühen
einer Lösung, die
einen geeigneten Stimulus enthält,
in Form eines Aerosols. Infolge der Stimulation exprimieren die
Zellen das Zytokin. Das Ausmaß der
Zytokinexpression wird durch die Testsubstanzen beeinflusst. Die
Zytokine, die von den Zellen abgegeben werden, werden lokal durch
die am Netz befindlichen Antikörper
gebunden.
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Nach
einer geeigneten Inkubationszeit wird die Testvorrichtung der Probenkammer
entnommen, gewaschen und die an die Antikörper gebundenen Zytokine nachgewiesen.
Dies erfolgt gemäß der gängigen Praxis
bei der Durchführung
eines Sandwich-ELISA durch Inkubation mit einem zweiten, gegen das
Zytokin gerichteten Antikörper
(19). Der Antikörper
kann entweder direkt mit einem Enzym konjugiert sein (20),
das eine mit einer geeigneten Auslesemethode detektierbare Umsetzung
eines Präzipitat
(22)-bildendes Substrates (21) katalysiert, oder der
Antikörper
kann biotinyliert sein und das Enzym wird in Streptavidin-gekoppelter Form
zugegeben oder es wird ein Enzym-gekoppelter Zweitantikörper eingesetzt.
Ein geeignetes Beispiel ist ein Sekundärantikörper, der mit dem Enzym alkalischer
Phosphatase konjugiert ist. Für
dieses Enzym steht ein Substrat ELF97 (Molecular Probes, Invitrogen
Technologies, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether Straße 10, 76131
Karlsruhe) zur Verfügung,
das durch die enzymatische Umsetzung durch Phosphatase ein unlösliches,
fluoreszentes Präzipitat
bildet, das auf dem Netz abgeschieden wird. Dieses Präzipitat
kann z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop ortsaufgelöst detektiert
werden. Die Intensität
der Fluoreszenz auf einer Position des Netzes korreliert positiv
mit der Menge des dort von den Zellen abgeschiedenen Zytokins. Auf
diese Weise kann über
die Fluoreszenzmikroskopie des Netzes auf den Effekt der Testsubstanzen
auf die Zytokinexpression rückgeschlossen
werden.