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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein
Verfahren zur ortsaufgelösten
chemischen Stimulation und insbesondere zur ortsaufgelösten chemischen
Stimulation einer auf einem Träger
angeordneten Substanz durch ein Stimulansmedium.
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Bei
neurotechnologischen Anwendungen im Bereich der Grundlagenforschung
in der Neuroprothetik wird üblicherweise
eine elektrische Stimulation zur Erregung von Zellen und Gewebe
eingesetzt. Eine elektrische Stimulation ist jedoch unselektiv bezüglich der
Zielstrukturen (Zelltypen) und umfasst weitere Nachteile, weshalb
eine chemische Stimulation mittels Applikation von in Flüssigkeit
gelösten Neurotransmittern
unter Umständen
von Vorteil sein kann.
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Hinsichtlich
künstlicher
Synapsen ist ein elektronisches System, bei dem analoge Eingangssignale ähnlich der
Verknüpfung
in einem Neuron aufsummiert werden und ein entsprechendes Ausgangssignal
erzeugt wird, in der
EP
0490177 A2 beschrieben. Chips und Systeme zur elektrischen (Elektroden
bzw. Feldeffekttransistoren), bzw. chemischen (chemischer Sensor,
z.B. ISFET) Ableitung von Neuronen sind in der
US 2002050611 beschrieben. Die
US 5,172,204 betrifft einen
MOSFET, der anstelle von Elektronen oder Löchern wie bei konventionellen
Feldeffekttransistoren Ionen als Ladungsträger im Kanal verwendet.
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Die
WO 03/002710 offenbart ein System zum Erzeugen künstlicher Synapsen, bei dem
eine Nano-Öffnung
vorgesehen ist, über
die eine Zelle oder ein Zellprozess mit einem chemischen oder elektrischen
Mittel zur neuronalen Anregung verbunden werden kann. Diese Schrift
offenbart ein Mikrosystem und Verfahren zur Steuerung des Neuritenwachstums
in sol cher Weise, dass Nervenzellen über Nanoporen bzw. Nanoelektroden
anwachsen.
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Aus
der WO 04/073785 A2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem man bestimmte
Zelltypen in Membrankanäle
einwachsen lässt,
um sie durch in den Poren lokalisierte Elektroden spezifisch mit
hoher Ortsauflösung
und vergleichsweise geringer elektrischer Energie spezifisch zu
stimulieren.
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Bei
sog. "Drug-Delivery-Systemen" zur lokalen intrakorporalen
Freisetzung von Medikamenten sind verschiedene Verfahren zur Applikation
von Flüssigkeiten
zum Zwecke der Medikation bekannt. Gemäß diesem Verfahren wird jedoch
die gewünschte
Medikamentenmenge mit einer mehr oder weniger definierten Dosierrate
in einen relativ großen
unspezifischen Bereich freigesetzt.
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Aus
der US-6,123,861 und der WO 01/35928 sind Mikrochips aus Siliziumbasis
bekannt, die Mikroküvetten
enthalten, die mit einer Substanz befüllt und danach mit einer dünnen Goldfolie
verschlossen werden. Diese Deckel können einzeln elektrisch adressiert
und elektrochemisch aufgelöst
werden, wodurch die in der Küvette
befindliche Substanz freigesetzt wird. Auch Membranverschlüsse und
passiver Transport werden als Releasemechanismus genannt. Die Chips
sind für
den Einsatz in Durchflusssystemen beispielsweise bei der Medikamentendosierung
bei einer Transfusion vorgesehen.
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Die
DE 19853035 A1 ,
die US-5,651,986, die
EP
0290891 A1 , die
EP
0302693 A2 , die US-6,196,993, die WO 94/01093 und die US 2001/0038853
A1 betreffen Anwendungen, die polymere Materialien nutzen, um ein
optimiertes zeitliches Dosierverhalten von Medikamenten zu erreichen.
Dies schließt
die Verkapselung in semipermeablen Membranen oder die Verwendung
von bioabbaubaren oder quellbaren und auf diese Weise einen Druck
erzeugenden Materialien ein.
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Tragbare
Medikamentenspender zur zeitverzögerten
Verabreichung flüssiger
Medikamente sind beispielsweise in der
DE 19756775 A1 und der
DE 19853053 A1 beschrieben.
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Aus
der
EP 0302693 A2 ist
eine Vorrichtung zur Medikamentengabe bekannt, bei der Medikamentenspezies
durch eine in einer semipermeablen Wand vorgesehene Öffnung gelangen.
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Aus
Jaan Noolandi „Towards
a neutrotransmitter-based retinel Prosthesis using an ink jet print-head", Biomedical micro
devises 5:3, 195 bis 199, 2003, ist es bekannt, Neurotransmitter
unter Verwendung eines Tintenstrahldruckers auf Zellen auszustoßen.
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Aus
der EP-1314479 A2 ist eine Vorrichtung für den Transfer flüssiger Proben
aus Standardgefäßen in einen
mit einer Trägerflüssigkeit
gefüllten
miniaturisierten Störungskanal
im sub-μl-Bereich
bekannt. Um flüssige
Proben im sub-μl-Bereich totvolumenfrei
in einen Strömungskanal
zu applizieren, ist ein eingangsseitig verschließbarer miniaturisierter Strömungskanal
mit einem räumlich
begrenzten siebartig durchbrochenen Wandbereich vorgesehen. Auf
den siebartig durchbrochenen Wandbereich ist eine flüssige Probe
mittels einer Mikrodosiereinheit kontaktfrei applizierbar, so dass
die Probe nachfolgend durch eine am Ende dieses Strömungskanals befindlichen
Pumpe bei eingangsseitig verschlossenem Strömungskanal unter weitgehender
Verdrängung
der Trägerflüssigkeit
einsaugbar ist.
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Für die genannten
und ähnliche
Anwendungen wären
deshalb Verfahren wünschenswert,
mit welchen eine lokal aufgelöste,
das heißt,
auf einen sehr kleinen räumlichen
Bereich beschränkte,
typischerweise 100 μm × 100 μm × 100 μm, wiederholte und
gezielte Dosierung von Flüssigkeiten,
beispielsweise Neurotransmittern, im Volumenbereich von wenigen
Picolitern bis Femtolitern (10–9 – 10–12 l)
realisiert werden könnte.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung
und ein Verfahren zu schaffen, die effektiv und technologisch einfach
eine ortsaufgelöste
chemische Stimulation einer Substanz durch ein Stimulansmedium ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren
gemäß Anspruch
11 gelöst.
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Die
vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung zur chemischen Stimulation
einer Substanz durch ein Stimulansmedium, mit folgenden Merkmalen:
einem
für das
Stimulansmedium permeablen Träger mit
einer ersten Seite und einer der ersten Seite gegenüberliegenden
zweiten Seite;
einer Dosiervorrichtung mit zumindest einer
Abgabestelle, wobei die Abgabestelle von der ersten Seite des permeablen
Trägers
durch ein Trennmedium getrennt ist; und
einer auf der zweiten
Seite des Trägers
angeordneten zu stimulierenden Substanz,
wobei die Dosiervorrichtung
ausgelegt ist, um das Stimulansmedium als Tröpfchen oder Strahl von der Abgabestelle
durch das Trennmedium zu der ersten Seite des permeablen Trägers auszustoßen, so
dass das Stimulansmedium durch den permeablen Träger auf die zweite Seite des
permeablen Trägers
gelangt und dort die zu stimulierende Substanz ortsaufgelöst stimuliert.
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Die
vorliegende Erfindung schafft ferner ein Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen
Stimulation einer Substanz, bei der ein Stimulansmedium durch ein
Trennmedium auf eine erste Seite eines für das Stimulansmedium permeablen
Träges
ausgestoßen
wird, so dass das Stimulansmedium durch den permeablen Träger auf
eine der ersten Seite gegenüberlie gende
zweite Seite des permeablen Trägers gelangt
und dort eine auf der zweiten Seite angeordnete Substanz ortsaufgelöst chemisch
stimuliert.
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Erfindungsgemäß wird ein
Stimulansmedium, beispielsweise in Form von in Flüssigkeit
gelösten
Neurotransmittern, als Tropfen oder Strahl, das heißt im Freistrahl,
durch ein Trennmedium auf die Rückseite
eines permeablen Trägers
ausgestoßen. Somit
ist ein Reservoir des Stimulansmediums (Flüssigkeit und chemisch aktiver
Stoff) durch das Trennmedium von einem Ort, an dem eine Stimulation stattfindet
getrennt. Dadurch kann effektiv und technologisch einfach eine Diffusion
von einem Flüssigkeitsreservoir
zu dem Ort, an dem eine chemische Stimulation stattfinden soll,
unterbunden werden, und die Dynamik des Systems zur ortsaufgelösten chemischen
Stimulation deutlich verbessert werden. Die vorliegende Erfindung
ermöglicht
eine ortsaufgelöste Stimulation
von Zellen bzw. Gewebe mit in Flüssigkeit
gelösten
chemischen Substanzen, bei dem ein durch Diffusion getriebener Transport
der wirksamen chemischen Substanzen aus einem Flüssigkeitsreservoir nahezu vollständig unterdrückt wird,
so dass eine möglichst
hohe Dynamik erreicht werden kann. Unter Dynamik ist hierbei die
Konzentration des Stimulansmediums bei Dosierung im Vergleich zur
Konzentration im Ruhezustand zu verstehen.
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Erfindungsgemäß erfolgt
der Ausstoß des Stimulansmediums
auf die Rückseite
eines Trägers, auf
dessen Vorderseite die zu stimulierende Substanz, beispielsweise
Zellen und/oder Gewebe, angeordnet ist. Der Träger ist vorzugsweise membranförmig und
wird daher im Folgenden als Membran bzw. Folie bezeichnet, unabhängig davon,
ob derselbe aus einem flexiblen Material besteht. Die Membran bzw.
Folie ist für
das Stimulansmedium permeabel, wobei die Permeabilität beispielsweise
durch eine oder mehrere Mikroporen, in welche das Stimulansmedium
direkt dosiert wird, durch eine poröse Struktur oder durch Nanokanäle in der
Membran bewirkt werden kann. Die Membran kann ferner beispielsweise
vollstän dig
aus einem biologischen Gewebe bestehen. Mögliche biologische Gewebe,
aus denen die Membran bestehen kann, sind Lipid-Doppelschichten
(=Zellmembran) oder Darmgewebe. Darüber hinaus kann die Membran
semipermeabel sein, das heißt,
die Permeabilität
kann selektiv nur für bestimmte
Chemikalien vorliegen.
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Bei
bevorzugten Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung besitzt der permeable Träger eine
geringe Dicke von weniger als 50 μm,
vorzugsweise weniger als 20 μm
und noch vorzugsweiser 10 μm
und darunter. Der erfindungsgemäße Lösungsansatz
des Applizierens des Stimulansmediums auf die Rückseite eines solchen permeablen
Trägers
ermöglicht,
dass die zu dosierenden Substanzen sehr schnell, lokal begrenzt
und für
eine kurze Dauer appliziert werden können. Dabei gelangt das Stimulansmedium
durch Diffusion durch den permeablen Träger, wobei die Diffusion bei
Dicken der Membran in der angegebenen Größenordnung, und insbesondere
bei Dicken von 10 μm
und darunter, immer der dominierende Flüssigkeitstransportprozess ist.
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Es
hat sich als ungünstig
herausgestellt, Zellen, welche in vitro typischerweise von einem
Flüssigkeitsfilm,
der sog. Nährlösung, bedeckt
sind, durch diesen Film hindurch zu stimulieren. Die Dicke des Flüssigkeitsfilms
beträgt
in der Regel zwischen 0,5 und 1 mm. Die applizierte Substanz vermischt
sich dann an der Oberfläche
mit der Nährlösung, wird
verdünnt
und muss mittels Diffusion eine Strecke in Richtung der Zellen von
mehreren 100 μm
zurücklegen.
Dabei verdünnt
sich erstens die Flüssigkeit
exponentiell weiter, weshalb erheblich höhere Konzentrationen erforderlich
sind, und zweitens wird der stimulierte Raumbereich erheblich vergrößert. So
kann aus einem ursprünglichen
Stimulationspunkt von ca. 50 μm
Durchmesser an der Flüssigkeitsoberfläche am Ort
der Zellen ohne weiteres ein Stimulationsbereich mit einem Durchmesser
zwischen 0,5 und 1 mm werden. In einem solchen Fall kann kaum noch
von einer ortsaufgelösten
Stimulation gesprochen werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird ein Auseinanderlaufen des Tropfens verhindert, da die Menge
entweder in eine räumlich
begrenzte Mikrodüse
appliziert wird, oder auf die Rückseite
einer permeablen Membran dosiert wird, wo sie durch Adhäsion haften
bleibt. Vorzugsweise ist die permeable Membran an der Rückseite
nicht stark benetzend bezüglich
des Stimulansmediums (Kontaktwinkel um die 90°), um ein Auseinanderlaufen
des Tropfens zu verhindern. Eine solche Oberflächenbeschaffenheit stellt jedoch
keine Voraussetzung für
das erfindungsgemäße Verfahren
dar, da dieses auch bei Benetzung der Membran funktioniert, wobei
lediglich die Ortsauflösung
schlechter wird.
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Erfindungsgemäß kann dann
die an der Rückseite
der Membran haftende oder in der Mikroöffnung befindliche Substanz
durch Diffusion, ggf. unterstützt
durch Kapillarkräfte,
sehr schnell durch die Membran hindurchbewegt werden, beispielsweise
innerhalb von 0,01 Sekunden bei Membranen einer Dicke von etwa 10 μm. Unmittelbar
auf der anderen Seite der Membran befinden sich die Zellen, die somit
sehr schnell angeregt werden können.
Ferner klingt die Konzentration durch die Verdünnung, die unweigerlich in
der Nährlösung auf
der Vorderseite der Membran stattfindet, sehr schnell ab, wobei
diese Verdünnung
zu einem sehr begrenzten Stimulationsbereich von in der Regel weniger
als 50 μm
führen kann.
Somit herrscht in einiger Entfernung von der stimulierten Zelle
keine nennenswerte Konzentration der Substanz vor.
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Besteht
das Stimulansmedium beispielsweise aus in Wasser gelösten Neurotransmittern,
kann das Trennmedium beispielsweise aus einem Gas (z. B. Luft) oder
einer nicht-mischbaren
Flüssigkeit
(beispielsweise Öl)
bestehen.
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Somit
kann festgestellt werden, dass ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
darin besteht, dass eine geringe, konzentrierte Menge eines Stimulansmedi ums
bzw. einer Stimulanssubstanz nahe an die zu stimulierende Substanz (beispielsweise
eine Zelle) herangebracht werden kann, ehe die Diffusion zu einer
Verdünnung
und Ausbreitung des Stimulationsbereichs führt. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß die Diffusion
aktiv genutzt, um den geringen Abstand, der nach Auftreffen der
Substanz auf die Rückseite
des Trägers
noch zur Zelle hin zu überwinden
ist, zu überwinden.
Bei einer geringen Membrandicke kann dies zu einer sehr schnellen
Reaktionszeit, wie sie oben beschrieben wurde, führen.
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Bei
bevorzugten Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung befindet sich die Rückseite der Membran in unmittelbarer
Nähe zu
der Abgabestelle der Dosiervorrichtung, so dass im Freistrahl lediglich
eine geringe Distanz überbrückt werden muss.
Ferner sind Dosiervorrichtung und Membran derart ausgebildet und
zueinander angeordnet, dass das dosierte Stimulansmedium im Wesentlichen senkrecht
auf die Rückseite
der Membran trifft, um dadurch eine Vorzugsrichtung der Diffusion
von der Rückseite
der Membran zu der Vorderseite derselben zu unterstützen.
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Es
bedarf keiner gesonderten Erläuterung, dass
das Trennmedium bezüglich
des Stimulansmediums derart beschaffen ist, dass die Flüssigkeit
des Stimulansmediums mit dem Trennmedium nicht mischbar, bzw. der
chemisch aktive Stoff in dem Stimulansmedium in dem Trennmedium
nicht lösbar
ist, bzw. das eine Mischbarkeit bzw. Lösbarkeit vernachlässigbar
ist. Das Dosiersystem ist vorzugsweise ausgebildet, um Flüssigkeitstropfen
bzw. Flüssigkeitsstrahlen
mit Volumina von wenigen Picolitern bis Femtolitern dosieren zu
können.
Geeignet hierzu sind beispielsweise nach Art eines Tintenstrahldruckers
arbeitende Dosiersysteme, bei denen eine Tropfenerzeugung mittels
Bubble-Jet-Verfahren oder mittels Piezoverfahren stattfindet.
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Die
Dosiervorrichtung bzw. das Dosiersystem kann ferner eine Vielzahl
von Abgabestellen, welche unterschiedliche Che mikalien enthalten
können,
aufweisen. Diese Vielzahl von Abgabestellen kann vorzugsweise in
einem Raster angeordnet sein, um ein gleichzeitiges Ausstoßen gleicher
oder unterschiedlicher Chemikalien auf die Rückseite der Membran zu ermöglichen.
Somit können
an mehreren Positionen der Membran gleiche oder unterschiedliche auf
der Vorderseite befindliche Substanzen chemisch stimuliert werden.
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Durch
den erfindungsgemäßen Lösungsansatz
zur ort- und zeitaufgelösten
chemischen Stimulation, wird eine Diffusion zwischen Applikationsbereich,
beispielsweise Zellen und/oder Gewebe, und einem Reservoir für das Stimulansmedium
durch einen mit einem Trennmedium gefüllten Zwischenraum unterbunden.
Dieser Zwischenraum wird zur Applikation von Chemikalien, beispielsweise
Neurotransmittern, mit Hilfe eines Flüssigkeitsstrahls oder eines freifliegenden
Tropfens, der beispielsweise durch ein Ink-Jet-Verfahren erzeugt
werden kann, überwunden.
Der permeable Träger,
auf dem die Zellen oder das Gewebe aufgebracht sind, kann von der
Dosiervorrichtung mechanisch getrennt sein, so dass beide Teilsysteme
gegeneinander verschiebbar sind, oder kann fest mit der Dosiervorrichtung
gekoppelt sein.
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Bevorzugte
Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf
die beiliegenden Zeichnungen näher
erläutert.
Es zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur chemischen
Stimulation;
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2a, 2b, 3a und 3b schematische
Querschnittsansichten zur Veranschaulichung von Ausführungsbeispielen
der vorliegenden Erfindung;
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4a bis 4d schematische
Darstellungen einer numerischen Stimulation eines Flüssigkeitstransfers
von einer Mikrodüse
zu einer gegenüberliegenden
Mikroöffnung;
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5 eine
schematische Darstellung eines permeablen Trägers zur Erläuterung
des Diffusionseffekts;
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6a bis 6c Graphen,
die Konzentrationsverteilungen in unterschiedlichen Diffusionsrichtungen
darstellen;
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7 eine
schematische Darstellung der Konzentration zu einem bestimmten Zeitpunkt;
und
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8a und 8b Zeitkonstanten
für die Diffusion
in drei unterschiedlichen Richtungen.
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Ein
Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zur chemischen Stimulation, wie es in 1 gezeigt ist,
umfasst ein Dosiersystem 10, mit einer Mehrzahl von Abgabestellen 12,
die in einem Raster angeordnet sind. Die Abgabestellen 12 stellen
Ausstoßöffnungen
dar und können
beispielsweise nach Art eines Tintenstrahldruckers Flüssigkeit
ausstoßen. Diesbezüglich umfasst
das Dosiersystem 10 entsprechende Flüssigkeitsreservoire und Antriebsmechanismen
(in 1 nicht gezeigt).
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Ferner
ist, beabstandet von einer Seite bzw. Oberfläche 10a des Dosiersystems,
in der die Ausschussöffnungen 12,
vorgesehen sind, eine Folie bzw. Membran 14 angeordnet,
welche auf einer Seite bzw. Oberfläche 14a mit Zellen
oder Gewebe 16 besiedelt ist. Zwischen einer der Seite 14a gegenüberliegenden
Seite 14b der Membran 14 und der Oberfläche 10a des
Dosiersystems, in der die Ausschlussöffnung 12 gebildet
sind, ist ein Trennmedium 18 vorgesehen.
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An
dieser Stelle sei angemerkt, dass zu Darstellungszwecken der Abstand
zwischen der Membran 14 und dem Dosiersystem 10 in 1 vergrößert dargestellt
ist. Bei dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel
sind die Abgabestellen periodisch zu einem Gitter angeordnet, um
eine ortsaufgelöste Stimulation
zu ermöglichen,
wobei auf der von dem Dosiersystem 10 abgewandten Oberfläche 14a der Membran 14 die
Zellkulturen aufgebracht sind. Die zu dosierende Flüssigkeit,
das heißt,
das Stimulansmedium befindet sich innerhalb der Mikrodosiervorrichtung 10,
die es durch eine oder mehrere der Abgabestellen 12, die
Mikrodüsen
darstellen, verlassen kann. Die Membran 14 besitzt eine
hohe Permeabilität
für das
Stimulansmedium, das heißt
die Flüssigkeit
bzw. den zu dosierenden chemischen Stoff, sowie eine hohe Rückhaltefähigkeit
für die
zu stimulierende Substanz. Wird das Stimulansmedium somit aus den
Abgabestellen 12 auf die Rückseite 14b der Membran 14 abgeschossen,
so gelangt dasselbe durch die Membran 14, um die auf der
gegenüberliegenden
Seite 14a desselben angeordnete Substanz zu stimulieren.
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Implementierungen
von Ausführungsbeispielen
der Erfindung sind in den 2a bis 3b gezeigt.
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Gemäß 2a umfasst
das Dosiersystem 10 eine Düsenplatte 20, in der
Mikrodüsen 22,
die Abgabestellen definieren, gebildet sind. Das Dosiersystem 10 umfasst
ferner eine Aktorplatte 24, die Heizelemente 26 aufweist.
Die Heizelemente 26 liegen den Mikrodüsen 22 gegenüber, wobei
ein Flüssigkeitsreservoirbereich 28 zwischen
der Aktorplatte 24 und der Düsenplatte 20 vorgesehen
ist. Durch Erwärmen
der Heizelemente kann eine Dampfblase 30 in dem Flüssigkeitsreservoirbereich
erzeugt werden, was zur Folge hat, dass aus der Ausschlussöffnung der
Mikrodüse 22 ein
Tröpfen 32 ausgestoßen wird. Diesbezüglich kann
der Betrieb des Dosiersystems dem eines Bubble-Jet-Tintenstrahldruckers
entsprechen.
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Eine
Folie bzw. Membran 34 ist der oberen Oberfläche der
Düsenplatte 20 des
Dosiersystems 10 gegenüberliegend
vorgesehen, deren Permeabilität
für das
Stimulansmedium bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel durch Mikroöffnungen 36 gegeben ist.
Diese Mikroöffnungen 36 sind
gegenüberliegend zu
den Abgabestellen, das heißt,
den Mikrodüsen 22 vorgesehen.
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Auf
einer von dem Dosiersystem 10 abgewandten Seite 34a der
Membran 34 sind zu stimulierende Zellen 38 angeordnet,
die sich in einem Flüssigkeitsfilm 40,
der sog. Nährlösung, befinden.
Wie in 2a zu sehen ist, reichen die
Mikroöffnungen 36 von
der Seite 34a bis zu der der Dosiervorrichtung zugewandten
Seite 34b durch die Membran 34. Zwischen der Dosiervorrichtung 10 und
der Seite 34b der Membran 34 ist ein Spalt mit
einem Trennmedium 44 vorgesehen.
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Im
Betrieb wird der durch die Mikrodüsen 22 ausgestoßene Tropfen 32 mit
einer solchen kinetischen Energie beaufschlagt, dass er die zugewandte Seite
der Membran 34 erreicht, wie dies schematisch durch den
Strahl 42 in 2a angedeutet ist. Der Strahl
gelangt in die Mikroöffnung 36,
in der sich Flüssigkeit
des Flüssigkeitsfilms 40 befindet,
und von dort durch Diffusion zu der von dem Dosiersystem 10 abgewandten
Oberfläche
der Membran 34. Dort findet im Bereich der Mikroöffnung eine
ortsaufgelöste
lokale Stimulation der Zellen 38 statt.
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Bei
dem in 2a gezeigten Ausführungsbeispiel
sind die Membran 34, welche die Zellen bzw. das Gewebe
trägt,
und das Dosiersystem 10 nicht mechanisch miteinander verbunden,
so dass dieselben separat bewegt werden können. Somit können beispielsweise
mit Hilfe einer einzigen Abgabestelle verschiedene Positionen auf
der Membran stimuliert werden.
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Alternativ
kann die Membran, welche die Zellen bzw. das Gewebe trägt, mit
der Dosiervorrichtung fest verbunden sein und eine Einheit bilden.
Ein solches Ausführungsbeispiel
ist in 2b gezeigt, bei dem gleiche
Elemente mit gleichen Bezugszeichen wie in 2a versehen
sind.
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Gemäß 2b ist
eine Verbindungsschicht 50 vorgesehen, die die Oberseite
des Dosiersystems 10 mit der zugewandten Seite 34b der
Membran 34 verbindet. In der Verbindungsschicht 50 sind
Ausnehmungen 52 vorgesehen, die den zwischen jeweiliger
Abgabestelle und Mikroöffnung
vorgesehenen Spalt mit Trennmedium 44 definieren. Die Verbindungsschicht 50 kann
einstückig
mit der Düsenplatte 20 ausgebildet
oder separat von derselben vorgesehen sein. Bei dem in 2b gezeigten
Ausführungsbeispiel
ist der mit einem Trennmedium gefüllte Spalt in Form der Ausnehmung 52 zwischen
dem Dosiersystem 10 und der Membran 34 fest eingeschlossen. Dies
kann insbesondere im Hinblick auf integrierte, implantierbare Stimulationsvorrichtungen
von Vorteil sein.
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Bei
dem, Bezug nehmend auf die 2a und 2b beschriebenen
Ausführungsbeispielen wurde
eine Permeabilität
durch Mikroöffnungen 36 in der
Membran 34 erreicht. Alternativ kommen aber auch anderweitig
permeable Membrane in Betracht, die Flüssigkeit mit dem zu dosierenden
chemischen Stoff bzw. den zu dosierenden Stoffen, d.h. das Stimulansmedium,
passieren lassen.
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Eine
poröse
Membran 54 ist in den 3a und 3b gezeigt.
Die poröse
Membran ist permeabel für
das Stimulansmedium 28, das heißt nach einem Applizieren desselben
auf eine dem Dosiersystem zugewandte Seite 54b der Membran 54 diffundiert
das Stimulansmedium durch die Membran auf eine gegenüberliegende
Seite 54a, um dort befindliche Zellen ortsaufgelöst zu stimulieren.
Ein auf die Membran 54 appliziertes Stimulansmedium vor
dieser Diffusion ist schematisch in 3a bei 56 dargestellt.
Bei dem in 3a gezeigten Ausführungsbeispiel
sind wiederum die Membran 54 und das Dosiersystem nicht
mechanisch miteinander verbunden, während bei dem in 3b gezeigten
Ausführungsbeispiel
wiederum eine Verbindungsschicht 50 vorgesehen ist, die
die Membran 54 und das Dosiersystem 10 miteinander
verbindet.
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Bei
dem in den 2a und 2b gezeigten
Ausführungsbeispielen,
bei denen in der Membran 34 kleine Öffnungen 36 gegenüber der
Abgabestelle angebracht sind, vermischt sich der Strahl bzw. der
Tropfen in den Öffnungen 36 mit
der die Zellen umgebenden interstitiellen Flüssigkeit bzw. Nährlö sung und
gelangt durch Diffusion durch die Öffnung 36 an die Zellen
oder das Gewebe heran, welches sich in der unmittelbaren Umgebung
der Öffnung
befinden. Dieser Prozess findet in der unmittelbaren Umgebung der Öffnungen
in einem Umkreis von wenigen μm
sehr schnell statt, innerhalb weniger Millisekunden, und erlaubt
deshalb eine zeitaufgelöste
Stimulation der Zellen. In den 4a bis 4d ist
rein schematisch eine numerische Simulation eines Flüssigkeitstransfers
von einer Mikrodüse 60 zu
einer gegenüberliegenden
Mikroöffnung 62 dargestellt.
Die dargestellte Bildsequenz wurde dabei mit Hilfe einer numerischen
Strömungssimulation
für eine
Mikrodüse
mit einem Durchmesser von 30 μm
und einer der Mikrodüse 60 genau
gegenüberliegenden
Mikroöffnung 62 mit
einem vergleichbaren Durchmesser durchgeführt. Als Antriebsmechanismus
fungiert eine expandierende Gasblase, wie sie durch ein Heizelement 64,
das mit der Mikrodüse
in Fluidverbindung steht, erzeugt wird. Zwischen der Mikrodüse 60 und der
gegenüberliegenden
Mikroöffnung 62 ist
ein Trennmedium in der Form eines Luftspalts 66 vorgesehen.
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4a zeigt
das System im Ruhezustand. Gemäß 4b entsteht
nach dem Betätigen
des Heizelements 64 an der Mikrodüse, das heißt der Auslassöffnung derselben,
ein Strahl 68 des Stimulansmediums. Gemäß 4c überwindet
der Strahl 68 den Luftspalt 66 und trifft auf
die Mikroöffnung 62. Schließlich reißt der Strahl 68 an
der Mikrodüse 60 ab
und wird in die Mikroöffnung 62 aufgenommen, wie
in 4d zu sehen ist.
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An
dieser Stelle sei angemerkt, dass die Flüssigkeit, das heißt, das
Stimulansmedium, abhängig
von dem Abstand zwischen der Mikrodüse und Mikroöffnung und
abhängig
von dem dosierten Volumen entweder als Strahl, wie Bezug nehmend
auf die 4a bis 4d beschrieben
wurde, oder als freifliegendes Tröpfchen das Trennmedium 66 überwindet.
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Für den Fall,
dass die Membran, welche die Zellen oder das Gewebe trägt, als
permeable Membran, beispielsweise poröse Membran, ausgebildet wird,
wie oben Bezug nehmend auf die 3a und 3b erläutert wurde,
sind keine separaten Mikroöffnungen
in der Membran erforderlich. Vielmehr wird die von der Aufgabestelle
ausgestoßene
Flüssigkeit einfach
auf die zugewandte Seite der Membran dosiert. Die Membran sollte
dabei so ausgestaltet sein, dass der Tropfen auf der Oberfläche haften
bleibt und nicht zurück
reflektiert wird. Die Diffusion durch die dünne permeable Membran bewirkt
wiederum, dass die auf die gegenüberliegenden
Seite der Membran befindlichen Zellen in der unmittelbaren Umgebung stimuliert
werden. Ist die Membran ausreichend dünn, ist die Diffusion entsprechend
schnell. Geeignete Dicken für
die Membran liegen hier in einem Bereich von weniger als 50 μm, vorzugsweise
weniger als 20 μm
und noch vorzugsweise 10 μm
oder darunter.
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Die
Diffusion durch die Membran kann ferner durch Kapillarkräfte unterstützt werden.
Sind die Poren durch die Membran in vertikaler Richtung und parallel
angeordnet, so resultiert daraus der zusätzliche Vorteil, dass die Wirkstoffe
während
der diffusiven Membrandurchdringung keine räumliche Verbreiterung erfahren
und der auf der Oberseite der Membran stimulierte Bereich nicht
breiter ist als der Bereich der Membranunterseite, auf den der Tropfen
dosiert wurde. Eine solche Ausrichtung kann beispielsweise bei länglichen
Poren erreicht werden, deren längliche Erstreckung
senkrecht zu den Hauptoberflächen
der Membran ausgerichtet ist. Es sei jedoch an dieser Stelle angemerkt,
dass dies kein notwendiges Merkmal der vorliegenden Erfindung darstellt,
sondern eine weiter verbesserte Ortsauflösung unterstützt.
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Alternativ
zu Mikroöffnungen
mit einem Öffnungsdurchmesser
im Mikrometerbereich, beispielsweise in einem Bereich von 10 bis
100 μm,
kann die Membran auch Nanokanäle
aufweisen, die sich zwischen den Hauptoberflächen durch dieselbe erstrecken.
In einem solchen Fall kann eine Mehrzahl von Nanokanälen an den
jeweiligen Abgabestellen des Dosiersystem gegenüberliegend angeordnet sein,
so dass das Stimulansmedium durch diese Nanokanäle zu der gegenüberliegenden
Oberfläche
diffundieren kann.
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Erfindungsgemäß überwindet
das Stimulansmedium einen mit einem Trennmedium gefüllten Zwischenraum
als freifliegendes Tröpfchen
oder freifliegender Strahl. Um daher einzelne Punkte, Zellen bzw.
Gewebe, auf der Membran zu stimulieren, können die Flüssigkeitstropfen bzw. Flüssigkeitsstrahlen durch
geeignete Antriebe an den Abgabestellen erzeugt werden. Die Tropfen
bzw. Strahlen durchdringen aufgrund ihrer kinetischen Energie das
Trennmedium und erreichen die zugewandte Seite bzw. Oberfläche des
Trägers.
Wie Bezug nehmend auf die 2a bis 3b erläutert wurde,
kommt hier beispielsweise eine thermisch erzeugte Dampfblase als Antrieb
in Frage, wie sie thermischen Tintenstrahldruckern Verwendung findet.
Es können
aber auch beliebig andere Antriebe verwendet werden. Wichtig ist
lediglich, dass die Flüssigkeit
von der Abgabestelle durch das Trennmedium hindurch auf die zugewandte
Seite der Membran dosiert werden kann und dass das Trennmedium weder
mit der zu dosierenden Flüssigkeit
mischbar ist, noch die zur Stimulation verwendete chemische Substanz
im Trennmedium löslich
ist. Bei wässrigen
Dosiermedien kommen daher als Trennmedien beispielsweise Luft als
gasförmiges
Trennmedium oder Öl
als flüssiges
Trennmedium in Frage.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird zum einen eine Diffusion des Stimulansmediums, das heißt der chemischen
Substanz, aus den Abgabestellen in Richtung der Zellen durch das
Trennmedium unterbunden, sofern sich Trennmedium und Dosiermedium
nicht durchmischen und die Löslichkeit der
zu applizierenden Subtanzen im dem Trennmedium vernachlässigbar
ist. Die zu dosierende Substanz im Reservoirbereich hat keinen direkten
Kontakt mit den Zellen. Dieser Kontakt wird lediglich für kurze Zeit
mit Hilfe des erzeugten Strahls hergestellt, siehe beispielsweise 2a oder 4c.
Dieser Kontakt wird ganz gezielt auf ein kleines, definiertes Volumen beschränkt, welches
auch als kleiner Tropfen auf der Rückseite der Membran haften
bleiben kann, siehe Tropfen 56 in 3a. Damit
ergibt sich im Ruhezustand, wenn keine Tropfen bzw. Strahlen aus
den Abgabestellen dosiert werden, keine ungewollte Stimulation der
Zellen durch die chemische Substanz. Die Dynamik, das heißt, die
Konzentration des Stimulansmediums bei Dosierung im Vergleich zur
Konzentration im Ruhezustand, wird dadurch erheblich verbessert.
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Darüber hinaus
ermöglicht
die vorliegende Erfindung durch das Aufbringen des Stimulationsmediums
auf die Rückseite
der Trägermembran
eine Stimulation mit einer deutlich verbesserten Ortsauflösung, verglichen
mit einem Fall, in dem das Stimulansmedium direkt auf die Oberfläche appliziert
werden würde,
auf der sich die Zellen in der Nährlösung befinden.
Der Grund hierfür
liegt neben der Tatsache, dass sich die Zellen in der Nährlösung benachbart
zu der Oberfläche
des Trägers
ansiedeln, in dem Diffusionsverhalten des applizierten Stimulansmediums.
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5 zeigt
einen Ausschnitt der porösen Membran 54,
auf deren oberer Oberfläche
wiederum eine zu stimulierende Substanz 70 (Zellen in Nährlösung) angeordnet
ist. Auf der Unterseite wurde durch im Wesentlichen senkrechten
Beschuss ein Tröpfchen 56 des
Stimulansmediums appliziert. In 5 sind nunmehr
drei Diffusionsrichtungen r1D, r2D und r3D gezeigt.
Ferner ist die Diffusionsgleichung angegeben, wobei n eine dimensionsabhängige Variable darstellt,
die für
eindimensionale Diffusion in Richtung 1D eins, für zweidimensionale Diffusion
in Richtung 2D zwei und für
dreidimensionale Diffusion in Richtung 3D drei beträgt.
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In
den 6a bis 6c sind
die relativen Konzentrationen in den Richtungen 1D, 2D und 3D unter
Angabe der jeweiligen Diffusionsgleichungen gezeigt. Bei einer angenommenen
Dicke der Membran 54 von 10 μm, einer angenommenen unbegrenzten
Punktkonzentration und einer beispielhaften Diffusionskon stante
D = 400 μm2/s durchquert das applizierte Stimulansmedium
die Membran 54 bei vorherrschender eindimensionaler Diffusion
in der Richtung 1D innerhalb etwa 10 ms. Wie 6b zu
entnehmen ist, bewegt sich das Stimulansmedium auf der Oberseite
der Membran nur um eine Distanz r2D von
etwa 60 μm,
bevor die Konzentration auf unter 1% des anfänglichen Werts abgefallen ist.
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6c ist
zu entnehmen, dass sich das applizierte Stimulansmedium in der Richtung
3D nur um eine Distanz r3D von etwa 30 μm bewegt,
wenn eine transversale Diffusion in der Membran möglich ist, bevor
die Konzentration wiederum unter 1% des Anfangswerts abgefallen.
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Die
spezifischen Unterschiede beim Diffusionsverhalten in einer eindimensionalen
oder dreidimensionalen Geometrie können wie nachfolgend beschrieben
für die
anwendungsspezifische Optimierung des Systems verwendet werden.
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In
einer ersten, bevorzugten Ausführungsform
wird eine Membran verwendet, welche nur eine eindimensionale Ausbreitung
des Stimulansmediums entlang der Membrandicke zulässt. Die
Zellen werden auf der Membranoberfläche 34a kultiviert
und der Überstand
an Nährlösung ist
sehr groß im
Vergleich zur Membrandicke. Diese Geometrie führt zu einer eindimensionalen
diffusiven Ausbreitung des Stimulansmediums durch die Membran hindurch
in Richtung der Membranoberfläche 34a und
einer dreidimensionalen diffusiven Ausbreitung des Stimulansmediums
in der Nährlösung auf
der Membranoberfläche.
Aufgrund der eindimensionalen Diffusion durch die Membran hindurch
ist die bei den Zellen an der Membranoberfläche 34a ankommende
Maximalkonzentration an Stimulansmedium relativ hoch und relativ
lang anhaltend. Diese Konfiguration könnte beispielsweise eingesetzt
werden um ortsaufgelöst
einzelnen Zellen einer Zellpopulation möglichst effizient Nährstoffe
zuzuführen.
Die dreidimensionale Diffusion in der Nährlösung führt zu einer schnellen Verdünnung, d.h. einem
kurzen Stimulanssignal und einem räumlich stark lokalisierten
Stimulus.
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In
einer zweiten, bevorzugten Ausführungsform
wird eine Membran verwendet, welche eine dreidimensionale Ausbreitung
des Stimulansmediums innerhalb der Membran zulässt. Die zu stimulierenden
Zellen werden auf der Membranoberfläche 34a kultiviert
und der Überstand
an Nährlösung ist sehr
groß im
Vergleich zur Membrandicke. Aufgrund der durchweg dreidimensionalen
Diffusion der Stimulansmedien sowohl in der Membran als auch in
dem Nährmedium
ist die an der Membranoberfläche 34a ankommende
Maximalkonzentration an Stimulansmedium im Vergleich zum vorherigen
Beispiel sehr viel niedriger aber auch bezogen auf die zeitliche Dauer
sehr viel kürzer.
Diese Konfiguration könnte z.B.
verwendet werden um Nervenzellen mit möglichst kurzen Impulsen chemisch
zu stimulieren.
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7 zeigt,
dass der Anteil von Molekülen, die
zu einer bestimmten Zeit t in dem Bereich innerhalb eines Radius
r0 enthalten sind, durch Integration berechnet
werden kann.
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Die 8a und 8b zeigen
einen Vergleich der Zeitkonstanten für die Richtungen 1D, 2D und
3D anhand der relativen Konzentrationen C rel. In 8a ist
dabei ein Zeitraum bis zu 1 Sekunde dargestellt, während 8b einen
Zeitraum bis zu 10 ms zeigt.
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Wie
den 8a und 8b zu
entnehmen ist, fällt
für den
2D-Fall (Diffusion
auf der Membranoberfläche)
die Konzentration nach 10 ms auf 20% ab. Für den 3D-Fall (Diffusion transversal
durch die Membran) fällt
die Konzentration nach 1 ms auf 20% ab. Wie ausgeführt wurde,
erfolgt eine Diffusion durch eine Membran einer Dicke von 10 μm mit einer Verzögerungszeit
von nicht mehr als 10 ms, wobei die Verzögerungszeit bei Vorliegen eines
Kapillardrucks oder einer 3D-Difusion noch geringer sein kann. Zusammenfassend
heißt
dies, dass die Aufweitung bei dem betrachteten Beispiel im schlechtesten
Fall geringer als 50 μm
ist, wobei bei größeren Abständen die
Konzentration unterhalb von 1% liegt.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
somit eine exakte orts- und zeitaufgelöste Stimulation von auf einer
Trägermembran
befindlichen Substanzen. Durch Vorsehen einer Dosiervorrichtung,
die eine Vielzahl von Ausstoßöffnungen
aufweist, die vorzugsweise in einem Raster angeordnet sind, können gleichzeitig
gleiche oder unterschiedliche Stimulansmedien auf die zugewandte
Oberfläche
der Trägermembran
appliziert werden. Dadurch können
an mehreren Positionen gleiche oder unterschiedliche auf der zweiten
Seite befindliche Substanzen sowohl ortsausgelöst als auch zeitaufgelöst chemisch
stimuliert werden. Die Ausstoßöffnungen
der Dosiervorrichtungen können
dabei gemeinsam oder separat ansteuerbar sein, wobei sich bei einzelner
Ansteuerbarkeit ein weiterer Freiheitsgrad hinsichtlich der zeitaufgelösten Stimulierung
ergibt.
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Die
Erfindung kann beispielsweise eingesetzt werden um dieselben oder
verschiedene biologische Zellen innerhalb einer Zellkultur mit denselben oder
unterschiedlichen Nährlösungen zu
versorgen. Dies könnte
etwa verwendet werden um Stammzellen innerhalb einer Kultur mit
unterschiedlichen Neurotransmittern zu versorgen und sie so zu unterschiedlichen
Ausprägungen
heranzuziehen.
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Die
Erfindung kann beispielsweise in Form implantierbarer Dosiersysteme
verwendet werden. Damit könnten
etwa ortsaufgelöst
bestimmte Hirnregionen im Vorfeld eines epileptischen Anfalls mit Neurotransmittern
behandelt werden. Die fehlende Leckage des Systems führt zu einer
hohen Dynamik der Medikamentierung und die Diffusionsprozesse quer
durch die Membran führen
zu einer sehr schnellen Applikation auf der Substanzseite im Millisekundenbereich.
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Ebenso
könnte
die Erfindung vorteilhaft zur Tumorbehandlung eingesetzt werden.
So könnte etwa
ein Array aus Abgabestel len für
Chemotherapeutika einen räumlich
ausgedehnten Tumor sehr viel effizienter bekämpfen als eine Überdosis
von einem Chemotherapeutikum an einer definierten Tumorstelle, die
allerdings an weit entfernten Tumorstellen drastisch abfällt. Ebenfalls
könnte
es vorteilhaft sein verschiedene Düsen mit unterschiedliche Stimulationsmedien
zu versorgen um so entweder die Wirksamkeit von unterschiedlichen
Therapeutika zu testen oder den Tumor über den zeitlichen Verlauf hinweg
mit unterschiedlichen Therapeutika zu bekämpfen.