WO2006069752A2 - Vorrichtung und verfahren zur ortsaufgelösten chemischen stimulation - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur ortsaufgelösten chemischen stimulation Download PDF

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WO2006069752A2
WO2006069752A2 PCT/EP2005/013967 EP2005013967W WO2006069752A2 WO 2006069752 A2 WO2006069752 A2 WO 2006069752A2 EP 2005013967 W EP2005013967 W EP 2005013967W WO 2006069752 A2 WO2006069752 A2 WO 2006069752A2
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stimulant
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permeable
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Peter Koltay
Roland Zengerle
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Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for spatially resolved chemical stimulation and in particular for spatially resolved chemical stimulation of a substance arranged on a carrier by a stimulant medium.
  • electrical stimulation is usually used to excite cells and tissues.
  • electrical stimulation is unselective with regard to the target structures (cell types) and includes further disadvantages, which is why chemical stimulation by application of neurotransmitters dissolved in fluid may under certain circumstances be advantageous.
  • WO 03/002710 discloses a system for creating artificial synapses, in which a nano-opening is provided, via which a cell or a cell process can be connected to a chemical or electrical means for neuronal excitation.
  • This document discloses a microsystem and method for controlling neurite outgrowth in such rather, that nerve cells grow over nanopores or nanoelectrodes.
  • WO 04/073785 A2 discloses a method in which certain cell types are grown into membrane channels in order to specifically stimulate them by means of electrodes located in the pores, specifically with high spatial resolution and comparatively low electrical energy.
  • drug delivery systems for the local intracorporeal release of drugs
  • various methods for the application of fluids for the purpose of medication are known.
  • the desired amount of drug is released at a more or less defined dosage rate into a relatively large nonspecific range.
  • microchips of silicon base which contain microcuvettes which are filled with a substance and then sealed with a thin gold foil. These lids can be individually addressed electrically and electrochemically dissolved, releasing the substance in the cuvette. Membrane seals and passive transport are also called release mechanisms.
  • the chips are intended for use in flow-through systems, for example, in the drug dosage in a transfusion.
  • DE 19853035 Al ÜS-5, 651, 986, EP 0290891 A1, EP 0302693 A2, US-6, 196, 993, WO 94/01093 and US 2001/0038853 A1 relate to applications which use polymeric materials to achieve an optimized time-based dosing behavior of drugs. This includes encapsulation in semipermeable membranes or the use of biodegradable or swellable and thus pressure generating materials.
  • Portable medicament dispensers for the time-delayed administration of liquid medicaments are described, for example, in DE 19756775 A1 and DE 19853053 A1.
  • a device for the transfer of liquid samples from standard vessels in a filled with a carrier liquid miniaturized perturbation channel in the sub-microliter range is known.
  • a miniaturized flow channel which can be closed on the input side is provided with a spatially limited wall area which is perforated in a sieve-like manner.
  • On the sieve-like perforated wall area a liquid sample by means of a microdosing is applied without contact, so that the sample is subsequently sucked by a pump located at the end of this flow channel at the inlet side closed flow channel with substantial displacement of the carrier liquid.
  • a locally dissolved, ie, limited to a very small spatial area typically 100 .mu.m.times.100 .mu.m.times.100 .mu.m, repeated and targeted metering of liquids, for example neurotransmitters, in the volume range from a few picoliters to femtoliters (10 ⁇ 9 - 10 ⁇ 12 1).
  • the object of the present invention is to provide a device and a method which enable a spatially resolved chemical stimulation of a substance by a stimulant medium in an effective and technologically simple manner.
  • the present invention provides a device for chemically stimulating a substance through a stimulant medium, having the following features:
  • a carrier permeable to the stimulant medium having a first surface and a second surface opposite the first surface
  • a metering device having at least one delivery location, wherein the delivery location is separated from the first surface of the permeable carrier by a separation medium;
  • the metering device is adapted to expel the stimulant medium as a droplet or jet from the delivery site through the separation medium to the first surface of the permeable support such that the stimulant medium passes through the permeable carrier reaches the second surface of the permeable carrier and there stimulates the substance to be stimulated in a spatially resolved manner.
  • the present invention further provides a method of spatially-resolved chemical stimulation of a substance in which a stimulant medium is expelled through a separation medium onto a first surface of a stimulant-permeable support such that the stimulant medium passes through the permeable support onto a second surface opposite the first surface reaches the permeable carrier and there chemically stimulated a spatially resolved substance disposed on the second surface.
  • a stimulant medium for example in the form of neurotransmitters dissolved in liquid, is ejected as a drop or jet, that is to say in the free jet, through a separating medium onto the rear side of a permeable carrier.
  • a reservoir of the stimulant medium fluid and chemically active agent
  • the separation medium is separated by the separation medium from a location where stimulation is taking place.
  • the present invention enables a spatially-resolved stimulation of cells or tissue with chemical substances dissolved in liquid, in which a diffusion-driven transport of the active chemical substances from a liquid reservoir is almost completely suppressed, so that the highest possible dynamics can be achieved.
  • Dynamics mean the concentration of the stimulant medium during dosing in comparison to the concentration at rest.
  • the expulsion of the stimulant takes place on the back of a carrier, on the front side of the substance to be stimulated, for example cells and / or tissue is arranged.
  • the support is preferably membrane-shaped and will therefore be referred to below as membrane or foil, irrespective of whether it consists of a flexible material.
  • the membrane or film is permeable to the stimulant medium, wherein the permeability can be effected for example by one or more micropores, in which the stimulant medium is metered directly, through a porous structure or through nanochannels in the membrane.
  • the membrane may be semipermeable, that is, the permeability may be selective to only certain chemicals.
  • the permeable support has a small thickness of less than 50 microns, preferably less than 20 microns, and more preferably 10 microns and less.
  • the inventive approach of applying the stimulant on the back of such a permeable carrier allows the substances to be dosed very quickly, locally limited and can be applied for a short duration.
  • the stimulant medium passes through the permeable carrier by diffusion, with the diffusion at thicknesses of the membrane of the stated order of magnitude, and in particular at thicknesses of 10 ⁇ m and below, always being the dominant liquid transport process.
  • a divergence of the drop is prevented, since the amount is either applied in a spatially limited micro nozzle, or dosed to the back of a permeable membrane, where it adheres by adhesion.
  • the permeable membrane at the backside is not highly wetting with respect to the stimulant medium (90 ° contact angle) to prevent the droplet from divergence.
  • such a surface finish is not a prerequisite for the method according to the invention, since this also works when wetting the membrane, whereby only the spatial resolution is worse.
  • the substance adhering to the rear side of the membrane or located in the micro-opening can then be moved through the membrane very quickly by diffusion, possibly assisted by capillary forces, for example within 0.01 seconds for membranes of a thickness of about 10 ⁇ m.
  • the cells Immediately on the other side of the membrane are the cells, which can thus be stimulated very quickly.
  • the concentration by the dilution which inevitably takes place in the nutrient solution on the front side of the membrane, decays very rapidly, whereby this dilution can lead to a very limited stimulation range of generally less than 50 ⁇ m.
  • no appreciable concentration of the substance at some distance from the stimu- lanced no appreciable concentration of the substance.
  • the separation medium may be, for example, a gas (eg, air) or a non-miscible liquid (eg, oil).
  • a decisive advantage of the method according to the invention is that a small, concentrated amount of a stimulant or stimulant substance can be brought close to the substance to be stimulated (for example a cell) before the diffusion to dilution and out - spreading of the stimulation area leads.
  • the diffusion is actively used to overcome the small distance which is still to be overcome after the substance has hit the back of the carrier towards the cell. With a low membrane thickness, this can lead to a very fast reaction time, as described above.
  • the back of the membrane is located in immediate proximity to the delivery point of the metering device, so that only a small distance has to be bridged in the free jet.
  • the metering device and the membrane are designed and arranged relative to one another in such a way that the metered stimulant medium strikes the backside of the membrane substantially perpendicularly, thereby assisting a preferential direction of the diffusion from the backside of the membrane to the front side thereof.
  • the separation medium with respect to the stimulant medium is such that the liquid of the stimulant medium is immiscible with the separation medium, or the chemically active substance in the stimulant medium is not soluble in the separation medium, or that a miscibility or solubility is negligible.
  • the dosing system is preferably designed to be able to dose liquid droplets or liquid jets with volumes of a few picoliters to femtoliters. Suitable for this purpose are, for example, dosing systems operating in the manner of an inkjet printer, in which droplet generation takes place by means of a bubble jet process or by means of a piezoelectric process.
  • the metering device or the metering system may further comprise a plurality of delivery points, which may contain different chemicals.
  • This plurality of delivery sites may preferably be arranged in a grid to allow simultaneous ejection of the same or different chemicals to the backside of the membrane.
  • the same or different substances located on the front side can be chemically stimulated.
  • the solution according to the invention for location-resolved and time-resolved chemical stimulation prevents diffusion between the application area, for example cells and / or tissue, and a reservoir for the stimulant medium through a gap filled with a separation medium.
  • This space is overcome for the application of chemicals, such as neurotransmitters, by means of a liquid jet or a free-flowing droplet, which can be generated, for example, by an ink-jet process.
  • the permeable support on which the cells or tissue are applied may be mechanically separated from the metering device so that both subsystems are mutually displaceable, or may be fixedly coupled to the metering device.
  • the permeable carrier arranged between the separation medium and the substance to be stimulated may also comprise a liquid or be formed by a liquid.
  • the liquid can be used as a carrier for the substance to be stimulated act when the substance to be stimulated is dissolved, for example, in the liquid or floating on the liquid.
  • the substance to be stimulated can additionally be carried by a holder, for example the wall of a liquid container or a holder projecting into the liquid.
  • the discharge point is separated from the liquid region by a separating medium, wherein the metering device is designed to eject the stimulant medium as droplets or jet from the delivery point through the separation medium to the liquid region, so that the stimulant medium passes through the liquid region and one on the liquid the substance to be stimulated is stimulated in a spatially resolved manner on the other side of the liquid region.
  • a permeable carrier in the form of a solid carrier or in the form of a liquid region can thus be provided between the separating medium and the substance to be stimulated.
  • the substance to be stimulated is located on the side of the solid carrier or the liquid region opposite the separating medium, even if the substance to be stimulated is physically applied to a wall element or a holder projecting into the liquid.
  • the stimulant medium is expelled through a separation medium to a region through which it diffuses to the substance to be stimulated in order to stimulate the substance to be stimulated in a spatially resolved manner.
  • the region can be implemented as a permeable solid carrier or as a liquid region.
  • a dosing tip can be used, in which the discharge point is formed and which has hydrophobic wall areas in the region of the discharge point, which define the separation medium area immersing
  • the metering tip remains in a liquid which then forms the liquid region through which the stimulant medium passes, the separation medium region remains filled with a gas or a medium immiscible with the liquid of the liquid region which was prior to immersion therein.
  • the immiscible medium may be, for example, a liquid immiscible with the liquid of the liquid region.
  • hydrophobic wall regions which define the separation medium region for example, a lipophilic, water-immiscible liquid could be held and act as separation medium, eg oils.
  • Figure 1 is a schematic representation of a device according to the invention for chemical stimulation.
  • Figs. 2a, 2b, 3a and 3b are schematic cross-sectional views illustrating embodiments of the present invention.
  • 4a to 4d are schematic representations of a numerical stimulation of a liquid transfer from a micro nozzle to an opposite micro-orifice
  • FIG. 5 shows a schematic representation of a permeable carrier for explaining the diffusion effect
  • FIGS. 6a to 6c are graphs illustrating concentration distributions in different directions of diffusion
  • Fig. 7 is a schematic representation of the concentration at a given time; 8a and 8b show time constants for the diffusion in three different directions;
  • FIG. 9 shows a schematic illustration of a further embodiment of a device according to the invention for chemical stimulation
  • FIG. 10 is a schematic representation of an embodiment of a dosing tip for a
  • FIG. 11 shows schematically a cross-sectional view of an embodiment of a dosing tip according to the invention.
  • An embodiment of a chemical stimulation device as shown in Fig. 1, comprises a dosing system 10 having a plurality of delivery sites 12 arranged in a grid.
  • the dispensers 12 are ejection ports and can eject fluid, for example, in the manner of an inkjet printer.
  • the dosing system 10 includes respective fluid reservoirs and drive mechanisms (not shown in FIG. 1).
  • a film or membrane 14 is arranged, which is populated on a side or surface 14a with cells or tissue 16.
  • a separation medium 18 is provided between a side 14b of the diaphragm 14 opposite the side 14a and the surface 10a of the metering system, in which the discharge opening 12 are formed.
  • the distance between the membrane 14 and the metering system 10 in Fig. 1 is shown enlarged.
  • the dispensing points are arranged periodically to form a grid in order to enable spatially resolved stimulation, cell cultures being applied on the surface 14a of the membrane 14 facing away from the dispensing system 10.
  • the liquid to be dosed that is, the stimulant medium
  • the membrane 14 has a high permeability for the stimulant medium, that is to say the liquid or the chemical substance to be metered, as well as a high retention capacity for the substance to be stimulated.
  • the stimulant medium is fired from the delivery sites 12 to the back 14b of the membrane 14, it passes through the membrane 14 to stimulate the substance located on the opposite side 14a thereof.
  • the dosing system 10 includes a nozzle plate 20 in which micro-nozzles 22 defining delivery sites are formed.
  • the dosing system 10 further comprises an actuator plate 24 which has heating elements 26.
  • the heating elements 26 are opposite to the micro-nozzles 22, wherein a liquid reservoir area, in which a stimulant medium 28 is arranged, is provided between the actuator plate 24 and the nozzle plate 20.
  • a vapor bubble 30 can be generated in the liquid reservoir area, resulting in that a droplet 32 is ejected from the ejection opening of the micro nozzle 22.
  • the operation of the dosing system may correspond to that of a bubble jet ink jet printer.
  • a film or diaphragm 34 is provided opposite the upper surface of the nozzle plate 20 of the dosing system 10, whose permeability for the stimulant medium in the shown embodiment is given by micro-openings 36. These micro-openings 36 are provided opposite to the delivery sites, that is, the micro-nozzles 22. On a side facing away from the metering system 10 side 34 a of the membrane 34 to be stimulated cells 38 are arranged, which are in a liquid film 40, the so-called. Nutrient solution. As can be seen in FIG. 2 a, the micro-openings 36 extend from the side 34 a to the side facing the metering device 34 b through the membrane 34. Between the metering device 10 and the side 34 b of the membrane 34 there is a gap with a separation medium 44 intended.
  • the droplet 32 ejected through the micro-nozzles 22 is subjected to such kinetic energy that it reaches the facing side of the membrane 34, as indicated schematically by the jet 42 in FIG. 2a.
  • the beam passes into the microopening 36, in which liquid of the liquid film 40 is located, and from there by diffusion to the surface of the membrane 34 facing away from the dosing system 10. There, in the area of the microopening, spatially resolved local stimulation of the cells takes place.
  • the membrane 34 which carries the cells or the tissue and the dosing system 10 are not mechanically connected to each other, so that they can be moved separately. Thus, for example, with the help of a single delivery point various positions on the membrane can be stimulated.
  • the membrane carrying the cells or the tissue may be firmly connected to the metering device and form a unit.
  • Fig. 2b Such an embodiment is shown in Fig. 2b, in which the same elements are provided with the same reference numerals as in Fig. 2a.
  • connection layer 50 is provided, which is the upper side of the dosing system 10 with the facing Side 34b of the membrane 34 connects.
  • recesses 52 are provided which define the gap provided between the respective delivery point and micro-opening with separation medium 44.
  • the bonding layer 50 may be integrally formed with the nozzle plate 20 or provided separately therefrom.
  • the gap filled with a separation medium in the form of the recess 52 between the dosing system 10 and the diaphragm 34 is firmly enclosed. This may be particularly advantageous in terms of integrated, implantable stimulation devices.
  • permeability through micro-apertures 36 in membrane 34 has been achieved.
  • the liquid with the metered chemical substance or the substances to be dosed i. let the stimulant medium pass.
  • a porous membrane 54 is shown in Figs. 3a and 3b.
  • the porous membrane is permeable for the stimulant medium 28, that is, for a applying thereof on a surface facing the dispensing side 54b of the diaphragm 54 diffuses the stimulant medium diert through the membrane to an opposite side 54a - 'spatially resolved at present there cells stimulate.
  • a stimulant medium applied to the membrane 54 prior to this diffusion is shown schematically at 56 in FIG. 3a.
  • the membrane 54 and the dosing system are not mechanically connected to one another, whereas in the exemplary embodiment shown in FIG. 3b a connecting layer 50 is again provided which interconnects the membrane 54 and the dosing system 10. binds.
  • FIGS. 2 a and 2 b in which small openings 36 are provided in the membrane 34. are mounted above the delivery site, the jet or the drop in the openings 36 mixes with the interstitial fluid or nutrient solution surrounding the cells and, by diffusion through the opening 36, approaches the cells or tissue located in the immediate vicinity the opening. This process takes place very rapidly in the immediate vicinity of the apertures within a few ⁇ m range, within a few milliseconds, and therefore permits a time-resolved stimulation of the cells.
  • a numerical simulation of a transfer of liquid from a micro nozzle 60 to an opposite microopening 62 is shown purely schematically in FIGS. 4a to 4d.
  • the illustrated image sequence was carried out with the aid of a numerical flow simulation for a micro nozzle with a diameter of 30 ⁇ m and a micro-orifice 62 of diametrically opposite micro-opening 62 with a comparable diameter.
  • the driving mechanism is an expanding gas bubble as produced by a heating element 64 in fluid communication with the micro-nozzle.
  • a separation medium in the form of an air gap 66 is provided between the micro-nozzle 60 and the opposite micro-opening 62.
  • Fig. 4a shows the system at rest.
  • a jet 68 of the stimulant medium is formed.
  • the jet 68 overcomes the air gap 66 and strikes the micro-aperture 62.
  • the jet 68 at the micro-nozzle 60 ruptures and is received in the micro-orifice 62, as shown in Figure 4d.
  • the fluid that is, the stimulant medium
  • the fluid that is, the stimulant medium
  • the distance between the micro-nozzle and the micro-orifice and depending on the metered volume either as a jet, as referred to has been described on the Fig. 4a to 4d, or as free-flying droplets overcomes the separation medium 66.
  • the membrane carrying the cells or tissue is formed as a permeable membrane, for example a porous membrane, as explained above with reference to Figures 3a and 3b, no separate micro-openings are required in the membrane. Rather, the liquid ejected from the feed point is simply metered onto the facing side of the membrane.
  • the membrane should be designed so that the drop adheres to the surface and is not reflected back. In turn, diffusion through the thin permeable membrane causes the cells on the opposite side of the membrane to be stimulated in the immediate vicinity. If the membrane is sufficiently thin, the diffusion is correspondingly fast.
  • Suitable thicknesses for the membrane are here in a range of less than 50 microns, preferably less than 20 microns and more preferably 10 microns or less.
  • Diffusion through the membrane may also be assisted by capillary forces.
  • the pores are arranged in the vertical direction and parallel through the membrane, the additional advantage results from the fact that the active substances do not undergo any spatial widening during the diffusive membrane penetration and the region stimulated on the upper side of the membrane is not wider than the region of the membrane underside on which the drop was dosed.
  • Such alignment can be achieved, for example, with elongated pores whose elongated extent is oriented perpendicular to the major surfaces of the membrane.
  • this is not a necessary feature of the present invention, but supports a further improved spatial resolution.
  • the membrane may also have nanochannels extending through it between the major surfaces.
  • a plurality of nanochannels may be arranged opposite each other at the respective dispensing points of the dispensing system so that the stimulant medium can diffuse through these nanochannels to the opposite surface.
  • the stimulant medium overcomes a space filled with a separation medium as a free-flowing droplet or free-flying beam.
  • the liquid drops or liquid jets can be generated by suitable drives at the delivery points. Due to their kinetic energy, the drops or jets penetrate the separation medium and reach the facing side or surface of the support.
  • a thermally generated vapor bubble for example, which can be used as a drive, as used in thermal inkjet printers, is used here. But it can also be used any other drives.
  • aqueous metering media for example air as a gaseous separating medium or oil as a liquid separating medium are suitable as separating media.
  • the separation medium prevents diffusion of the stimulant medium, that is to say the chemical substance, from the delivery sites in the direction of the cells.
  • separation medium does not intermix and the solubility of the substances to be applied in the separation medium is negligible.
  • the substance to be dosed in the reservoir area has no direct contact with the cells. This contact is made only for a short time with the help of the generated beam, see for example Fig. 2a or 4c. This contact is specifically limited to a small, defined volume, which may also stick as a small drop on the back of the membrane, see drop 56 in Fig. 3a.
  • the present invention enables stimulation with a significantly improved spatial resolution, compared to a case in which the stimulant medium would be applied directly to the surface on which the cells are in the nutrient solution - Find.
  • the reason for this is besides the fact that the cells settle in the nutrient solution adjacent to the surface of the carrier, in the diffusion behavior of the applied stimulant medium.
  • Fig. 5 shows a section of the porous membrane 54, on whose upper surface in turn a substance to be stimulated 70 (cells in nutrient solution) is arranged. On the underside, a droplet 56 of the stimulant medium was applied by essentially vertical bombardment.
  • r ⁇ O and r 3D are now, three diffusion directions rn> is shown. Furthermore, the diffusion equation is given, where n represents a dimension-dependent variable which is three for one-dimensional diffusion in the direction ID 1, for two-dimensional diffusion in the direction 2D 2 and for three-dimensional diffusion in the direction 3D.
  • the relative concentrations in the directions ID, 2D and 3D are indicated by the respective ones Diffusion equations shown.
  • the applied stimulant medium traverses the membrane 54 with prevailing one-dimensional diffusion in the direction ID within approximately 10 ms.
  • the stimulant medium moves on the upper side of the membrane only by a distance r 2 D of about 60 ⁇ m, before the concentration has fallen below 1% of the initial value.
  • the applied stimulant medium only moves in the direction 3D by a distance r 3D of approximately 30 ⁇ m, if transverse diffusion in the membrane is possible, before the concentration again falls below 1% of the initial value.
  • a membrane which only permits a one-dimensional spread of the stimulant medium along the membrane thickness.
  • the cells are cultured on the membrane surface 34a and the supernatant of nutrient solution is very large compared to the membrane thickness.
  • This geometry leads to a one-dimensional diffusive propagation of the stimulant medium through the membrane in the direction of the membrane surface 34a and a three-dimensional diffusive propagation of the stimulant medium in the nutrient solution on the membrane surface. Due to the one-dimensional diffusion through the membrane, the maximum concentration of stimulant medium arriving at the cells at the membrane surface 34a is relatively high and relatively long lasting.
  • This configuration could be used, for example, for spatially resolved individual cells of a cell population as efficiently as possible To supply nutrients.
  • the three-dimensional diffusion in the nutrient solution leads to a rapid dilution, ie a short stimulus signal and a spatially strongly localized stimulus.
  • a membrane which allows three-dimensional propagation of the stimulant medium within the membrane.
  • the cells to be stimulated are cultured on the membrane surface 34a and the supernatant of nutrient solution is very large compared to the membrane thickness. Due to the consistently three-dimensional diffusion of the stimulant media both in the membrane and in the nutrient medium, the maximum concentration of stimulant medium arriving at the membrane surface 34a is much lower compared to the previous example, but also much shorter in relation to the time duration.
  • This configuration could e.g. can be used to chemically stimulate nerve cells with the shortest possible pulses.
  • Fig. 7 shows that the proportion of molecules contained at a certain time t in the region within a radius r 0 can be calculated by integration.
  • FIGS. 8a and 8b show a comparison of the time constants for the directions ID, 2D and 3D on the basis of the relative concentrations C_rel.
  • a time period of up to 1 second is shown, while FIG. 8b shows a time period of up to 10 ms.
  • the concentration drops to 20% after 10 ms for the 2D film (diffusion on the membrane surface).
  • the concentration drops to 20% after 1 ms.
  • a diffusion through a membrane of a thickness of 10 microns with a delay time of not more than 10 ms, wherein the delay time in the presence of a capillary pressure or a 3D diffusion can be even lower.
  • a dosing tip 200 is dipped in a container 210 in which a liquid 212, such as a physiological medium, is disposed. At the bottom of the container 210 is a cell culture 214 to be stimulated.
  • the dosing tip comprises at its front end, in which a discharge opening or discharge point is formed, hydrophobic wall regions which comprise a separation medium region 216 which remains filled with a gas (air) when the dosing tip 200 is immersed in the liquid 212.
  • This separation media area is arranged around a discharge opening 218 of the metering tip, wherein the discharge opening 218 may be connected via a fluid line 220 to a reservoir.
  • the device according to the invention thus comprises a metering device in the form of the metering tip 200, in which an ejection opening 218 is provided. Adjacent to the ejection orifice 218, the separation media region 216 is provided with the separation media region adjacent to the ejection orifice opening adjacent a liquid region of the liquid 212 disposed between the separation media 216 and the cell culture.
  • the dispensing tip is adapted to a Sti ⁇ mulansmedium eject through the ejection orifice 218 as drops or jet through the separation media 216 to the liquid 212, so that the stimulant medium by the liquid portion 212 to be stimulated substance ie the cell culture 214, arrives and stimulates them spatially resolved.
  • the dosing tip 200 may be designed, for example, to be able to dose one or more (for example 2 to 4) different chemical substances having a smallest volume in the pico to femtoliter range at its tip on a localized area (of, for example, approximately 100 ⁇ m), to chemically stimulate individual cells in a cell structure.
  • any conventional positioning mechanisms (not shown in FIG. 9) can be used to enable a precise spatial positioning of the dosing tip.
  • FIG. 10 A possible embodiment for a dosing tip suitable for this purpose is shown in FIG.
  • the metering tip shown in Fig. 10 is suitable for ejecting four different stimulant media, with two overhead ejection chambers 230 and 232 being seen in Fig. 10. Similar ejection chambers are arranged on the underside of the dosing, but not visible in Fig. 10.
  • the ejection chambers 230 and 232 can be filled, for example, by means of microfluidic channels from fluid reservoirs, as indicated by arrows 234 in FIG. 10.
  • optional structures 236 are shown in FIG. 10.
  • each of the ejection chambers 230 and 232 there is provided a heater 238 which enables droplet generation at ejection outlets 240 according to the ink-jet printing principle.
  • Arrows 242 in FIG. 10 indicate drop trajectories of drops or jets ejected through the ejection openings 240.
  • the metering tip has wall portions 244 and 246 which define a separation media area 250 (together with respective lid layers, not shown in FIG. 10).
  • the wall portions defining this separation media area have hydrophobic properties such that no liquid will pass from the ejection chambers into the separation media area without actuation using the heaters 238.
  • the hydrophobic coating can achieve that when the dosing tip is immersed in a liquid as described above with reference to FIG. 9, no liquid penetrates into the separation medium region, so that the gas (air) that has entered the liquid prior to immersion Liquid was present in the separation media area 250, remains there.
  • the metering tip, and in particular the regions defining the separation media region 250 thereof have sufficiently small dimensions to achieve this effect, the distance of the wall regions 244 and 246 from each other being, for example, less than 100 ⁇ m.
  • FIG. 11 shows schematically an embodiment of a metering device which can be used according to the invention.
  • a liquid cage 260 for a stimulant medium and a separation medium region 262 are structured in a substrate, for example comparable to the substrate, as shown in FIG. 10.
  • the liquid chamber 260 and the separation media area 262 on the top and bottom are bounded by respective covers 264 and 266.
  • the liquid chamber 260 again structures 268 for adjusting the fluidic resistance and a heater 270 are formed.
  • a wall 272 formed in the substrate, in which an ejection opening 274 is formed.
  • a liquid meniscus 276 protrudes into the separation media area, but does not displace gas in it due to the hydrophobic properties of the walls of the separation media area.
  • the droplet generation in this exemplary embodiment is based on the ink-jet actuation principle, wherein liquid is locally evaporated by the heating device, as indicated by a vapor bubble 278 in FIG. 11.
  • the liquid in the liquid chamber 260 is displaced and discharged from the opening 274 into the separation medium 262.
  • a droplet is thereby generated, wherein the location of the drop generation through the separation medium region 262 is separated from the liquid 276 into which the dosing tip is immersed.
  • Dosing tips as described above with reference to Figures 10 and 11, allow the ejection of variable drop volumes from the pico to femtoliter region
  • the individually controllable dosing units allow the system not only sequential substance applications but also the administration of complex substance combinations in adjustable volume ratios.
  • the substances are administered through a nozzle to a stimulation site, wherein the dosage units may be connected by integrated microchannels with associated reservoirs.
  • the separation medium region described on the one hand allows the generation of a droplet or jet in free flight and also prevents leakage due to diffusion between liquids in the liquid chambers within the dosing tip and the liquid in which the dosing tip is immersed.
  • the chemical substances to be applied are dissolved in liquids and are preferably transported via microfluidic channels from reservoirs capillary into the ejection chambers and to the ejection opening.
  • actuation mechanisms with minimum sizes, for example, an inkjet actuator with a so-called side-shot arrangement may be used, as shown in Fig. 11.
  • a suitable positioning device may be used which allows positioning with such small tolerances.
  • a miniaturization of the delivery dose as only locally so a high drug concentration can be achieved directly on an individual cell, which spatially extremely strong by diffusion. decays, so that neighboring cells are not stimulated or irritated.
  • the present invention enables a robust time-resolved dosing of the chemical substances in a time window of 10 ⁇ s and below. Further, the invention enables a single addressable dosage of two or more different substances sequentially and in parallel to a stimulation site.
  • the present invention further enables the use of cell culture-compatible materials and technologies, taking into account the compatibility with the media to be dispensed.
  • the present In the present invention small sizes of the devices to be used and complete integration in microsystem technology.
  • the present invention thus enables accurate location- and time-resolved stimulation of substances located on a carrier membrane.
  • a metering device having a plurality of ejection openings, which are preferably arranged in a grid, the same or different stimulant media can be applied simultaneously to the facing surface of the support membrane.
  • identical or different substances located on the second side can be chemically stimulated at several positions both locally triggered and time-resolved.
  • the ejection openings of the metering devices can be controlled jointly or separately, with a single degree of freedom of control resulting in a further degree of freedom with respect to the time-resolved stimulation.
  • the invention can be used, for example, to supply the same or different biological cells within a cell culture with the same or different nutrient solutions. This could be used, for example, to supply stem cells within a culture with different neurotransmitters and thus to use them in different forms.
  • the invention can be used, for example, in the form of implantable metering systems. In this way, certain brain regions could be treated with neurotransmitters prior to an epileptic seizure. The lack of leakage of the system leads to a high dynamics of the medication and the diffusion processes across the membrane lead to a very rapid application on the substance side in the millisecond range. Likewise, the invention could be used advantageously for the treatment of tumors. For example, an array of chemotherapeutic drug delivery sites would be able to combat a spatially-expanded tumor much more efficiently than a sabber dose of a chemotherapeutic drug at a defined tumor site, but it drops drastically at distant tumor sites. It could also be advantageous to supply different nozzles with different stimulation media in order either to test the effectiveness of different therapeutic agents or to combat the tumor over the course of time with different therapeutics.

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Abstract

Eine Vorrichtung zur chemischen Stimulation einer Substanz (38) durch ein Stimulansmedium (28) umfasst einen für das Stimulansmedium (28) permeablen Träger (34) mit einer ersten Seite (34b) und einer der ersten Seite gegenüberliegenden zweiten Seite (34a). Eine Dosiervorrichtung (10) mit zumindest einer Abgabestelle (12) ist vorgesehen, wobei die Abgabestelle (12) von der ersten Seite des permeablen Trägers (34) durch ein Trennmedium (44) getrennt ist. Auf der zweiten Seite (34a) des Trägers (34) ist die zu stimulierende Substanz (38) angeordnet. Die Dosiervorrichtung (10) ist ausgelegt, um das Stimulansmedium (28) als Tröpfchen oder Strahl von der Abgabestelle (12) durch das Trennmedium (34) zu der ersten Seite des permeablen Trägers (34) auszustoßen, so dass das Stimulansmedium (28) durch den permeablen Träger auf die zweite Seite des permeablen Trägers (34) gelangt und dort die zu stimulierende Substanz (38) ortsausgelöst stimuliert.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen
Stimulation
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation und insbesondere zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation einer auf einem Träger angeordneten Substanz durch ein Stimulansmedium.
Bei neurotechnologischen Anwendungen im Bereich der Grundlagenforschung in der Neuroprothetik wird üblicherweise eine elektrische Stimulation zur Erregung von Zellen und Ge- webe eingesetzt. Eine elektrische Stimulation ist jedoch unselektiv bezüglich der Zielstrukturen (Zelltypen) und um- fasst weitere Nachteile, weshalb eine chemische Stimulation mittels Applikation von in Flüssigkeit gelösten Neurotransmittern unter Umständen von Vorteil sein kann.
Hinsichtlich künstlicher Synapsen ist ein elektronisches System, bei dem analoge Eingangssignale ähnlich der Verknüpfung in einem Neuron aufsummiert werden und ein entsprechendes Ausgangssignal erzeugt wird, in der EP 0490177 A2 beschrieben. Chips und Systeme zur elektrischen (Elektroden bzw. Feldeffekttransistoren) , bzw. chemischen (chemischer Sensor, z.B. ISFET) Ableitung von Neuronen sind in der US 2002050611 beschrieben. Die US 5,172,204 betrifft einen MOSFET, der anstelle von Elektronen oder Lö- ehern wie bei konventionellen Feldeffekttransistoren Ionen als Ladungsträger im Kanal verwendet.
Die WO 03/002710 offenbart ein System zum Erzeugen künstlicher Synapsen, bei dem eine Nano-Öffnung vorgesehen ist, über die eine Zelle oder ein Zellprozess mit einem chemischen oder elektrischen Mittel zur neuronalen Anregung verbunden werden kann. Diese Schrift offenbart ein Mikrosystem und Verfahren zur Steuerung des Neuritenwachstums in sol- eher Weise, dass Nervenzellen über Nanoporen bzw. Nanoe- lektroden anwachsen.
Aus der WO 04/073785 A2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem man bestimmte Zelltypen in Membrankanäle einwachsen lässt, um sie durch in den Poren lokalisierte Elektroden spezifisch mit hoher Ortsauflösung und vergleichsweise geringer elektrischer Energie spezifisch zu stimulieren.
Bei sog. "Drug-Delivery-Systemen" zur lokalen intra- korporalen Freisetzung von Medikamenten sind verschiedene Verfahren zur Applikation von Flüssigkeiten zum Zwecke der Medikation bekannt. Gemäß diesem Verfahren wird jedoch die gewünschte Medikamentenmenge mit einer mehr oder weniger definierten Dosierrate in einen relativ großen unspezifischen Bereich freigesetzt.
Aus der US-6,123,861 und der WO 01/35928 sind Mikrochips aus Siliziumbasis bekannt, die Mikroküvetten enthalten, die mit einer Substanz befüllt und danach mit einer dünnen Goldfolie verschlossen werden. Diese Deckel können einzeln elektrisch adressiert und elektrochemisch aufgelöst werden, wodurch die in der Küvette befindliche Substanz freigesetzt wird. Auch Membranverschlüsse und passiver Transport werden als Releasemechanismus genannt. Die Chips sind für den Einsatz in Durchflusssystemen beispielsweise bei der Medikamentendosierung bei einer Transfusion vorgesehen.
Die DE 19853035 Al, die ÜS-5, 651, 986, die- EP 0290891 Al, die EP 0302693 A2, die US-6, 196, 993, die WO 94/01093 und die US 2001/0038853 Al betreffen Anwendungen, die polymere Materialien nutzen, um ein optimiertes zeitliches Dosierverhalten von Medikamenten zu erreichen. Dies schließt die Verkapselung in semipermeablen Membranen oder die Verwen- düng von bioabbaubaren oder quellbaren und auf diese Weise einen Druck erzeugenden Materialien ein. Tragbare Medikamentenspender zur zeitverzögerten Verabreichung flüssiger Medikamente sind beispielsweise in der DE 19756775 Al und der DE 19853053 Al beschrieben.
Aus der EP 0302693 A2 ist eine Vorrichtung zur Medikamentengabe bekannt, bei der Medikamentenspezies durch eine in einer semipermeablen Wand vorgesehene Öffnung gelangen.
Aus Jaan Noolandi „Towards a neutrotransmitter-based reti- nel Prosthesis using an ink jet print-head", Biomedical micro devises 5:3, 195 bis 199, 2003, ist es bekannt, Neurotransmitter unter Verwendung eines Tintenstrahldruckers auf Zellen auszustoßen.
Aus der EP-1314479 A2 ist eine Vorrichtung für den Transfer flüssiger Proben aus Standardgefäßen in einen mit einer Trägerflüssigkeit gefüllten miniaturisierten Störungskanal im sub-μl-Bereich bekannt. Um flüssige Proben im sub-μl- Bereich totvolumenfrei in einen Strömungskanal zu applizie- ren, ist ein eingangsseitig verschließbarer miniaturisierter Strömungskanal mit einem räumlich begrenzten siebartig durchbrochenen Wandbereich vorgesehen. Auf den siebartig durchbrochenen Wandbereich ist eine flüssige Probe mittels einer Mikrodosiereinheit kontaktfrei applizierbar, so dass die Probe nachfolgend durch eine am Ende dieses Strömungskanals befindlichen Pumpe bei eingangsseitig verschlossenem Strömungskanal unter weitgehender Verdrängung der Trägerflüssigkeit einsaugbar ist.
Aus der DE 101 29 243 C2 sind Verfahren und Vorrichtungen zur Dosierung fluider Medien bekannt, bei denen zumindest ein Tropfen mit einem Tropfengenerator erzeugt und auf einer freien Flugbahn bewegt wird. Die freie Flugbahn ist auf ein Target gerichtet. Der Tropfen trifft auf eine Maskie- rungsschicht mit mindestens einem Strukturelement, das in die Flugbahn ragt, wobei von dem Tropfen mindestens ein Teiltropfen abgelöst wird, der auf das Target übertragen wird. Für die genannten und ähnliche Anwendungen wären deshalb Verfahren wünschenswert, mit welchen eine lokal aufgelöste, das heißt, auf einen sehr kleinen räumlichen Bereich be- schränkte, typischerweise 100 μm x 100 μm x 100 μm, wiederholte und gezielte Dosierung von Flüssigkeiten, beispielsweise Neurotransmittern, im Volumenbereich von wenigen Pi- colitern bis Femtolitern (10~9 - 10~12 1) realisiert werden könnte.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, die effektiv und technologisch einfach eine ortsaufgelöste chemische Stimulation einer Substanz durch ein Stimulansmedium ermögli- chen.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 12 und ein Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15 gelöst.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung zur chemischen Stimulation einer Substanz durch ein Stimulansmedium, mit folgenden Merkmalen:
einem für das Stimulansmedium permeablen Träger mit einer ersten Oberfläche und einer der ersten Oberfläche gegenüberliegenden zweiten Oberfläche;
einer Dosiervorrichtung mit zumindest einer Abgabestelle, wobei die Abgabestelle von der ersten Oberfläche des perme- ablen Trägers durch ein Trennmedium getrennt ist; und
einer auf der zweiten Oberfläche des Trägers angeordneten zu stimulierenden Substanz,
wobei die Dosiervorrichtung ausgelegt ist, um das Stimulansmedium als Tröpfchen oder Strahl von der Abgabestelle durch das Trennmedium zu der ersten Oberfläche des permeablen Trägers auszustoßen, so dass das Stimulansmedium durch den permeablen Träger auf die zweite Oberfläche des permeablen Trägers gelangt und dort die zu stimulierende Substanz ortsaufgelöst stimuliert.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner ein Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation einer Substanz, bei der ein Stimulansmedium durch ein Trennmedium auf eine erste Oberfläche eines für das Stimulansmedium permeablen Träges ausgestoßen wird, so dass das Stimulansmedium durch den permeablen Träger auf eine der ersten Oberfläche gegenüberliegende zweite Oberfläche des permeablen Trägers gelangt und dort eine auf der zweiten Oberfläche angeordnete Substanz ortsaufgelöst chemisch stimuliert.
Erfindungsgemäß wird ein Stimulansmedium, beispielsweise in Form von in Flüssigkeit gelösten Neurotransmittern, als Tropfen oder Strahl, das heißt im Freistrahl, durch ein Trennmedium auf die Rückseite eines permeablen Trägers ausgestoßen. Somit ist ein Reservoir des Stimulansmediums (Flüssigkeit und chemisch aktiver Stoff) durch das Trennmedium von einem Ort, an dem eine Stimulation stattfindet getrennt. Dadurch kann effektiv und technologisch einfach eine Diffusion von einem Flüssigkeitsreservoir zu dem Ort, an dem eine chemische Stimulation stattfinden soll, unterbun- den werden, und die Dynamik des Systems zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation deutlich verbessert werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine ortsaufgelöste Stimulation von Zellen bzw. Gewebe mit in Flüssigkeit gelösten chemischen Substanzen, bei dem ein durch Diffusion getrie- bener Transport der wirksamen chemischen Substanzen aus einem Flüssigkeitsreservoir nahezu vollständig unterdrückt wird, so dass eine möglichst hohe Dynamik erreicht werden kann. Unter Dynamik ist hierbei die Konzentration des Stimulansmediums bei Dosierung im Vergleich zur Konzentration im Ruhezustand zu verstehen.
Erfindungsgemäß erfolgt der Ausstoß des Stimulansmediums auf die Rückseite eines Trägers, auf dessen Vorderseite die zu stimulierende Substanz, beispielsweise Zellen und/oder Gewebe, angeordnet ist. Der Träger ist vorzugsweise memb- ranförmig und wird daher im Folgenden als Membran bzw. Folie bezeichnet, unabhängig davon, ob derselbe aus einem flexiblen Material besteht. Die Membran bzw. Folie ist für das Stimulansmedium permeabel, wobei die Permeabilität beispielsweise durch eine oder mehrere Mikroporen, in welche das Stimulansmedium direkt dosiert wird, durch eine poröse Struktur oder durch Nanokanäle in der Membran bewirkt wer- den kann. Die Membran kann ferner beispielsweise vollständig aus einem biologischen Gewebe bestehen. Mögliche biologische Gewebe, aus denen die Membran bestehen kann, sind Lipid-Doppelschichten (=Zellmembran) oder Darmgewebe. Darüber hinaus kann die Membran semipermeabel sein, das heißt, die Permeabilität kann selektiv nur für bestimmte Chemikalien vorliegen.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung besitzt der permeable Träger eine geringe Dicke von weniger als 50 μm, vorzugsweise weniger als 20 μm und noch vorzugsweiser 10 μm und darunter. Der erfindungsgemäße Lösungsansatz des Applizierens des Stimulansmediums auf die Rückseite eines solchen permeablen Trägers ermöglicht, dass die zu dosierenden Substanzen sehr schnell, lokal begrenzt und für eine kurze Dauer appliziert werden können. Dabei gelangt das Stimulansmedium durch Diffusion durch den permeablen Träger, wobei die Diffusion bei Dicken der Membran in der angegebenen Größenordnung, und insbesondere bei Dicken von 10 μm und darunter, immer der dominierende Flüs- sigkeitstransportprozess ist.
Es hat sich als ungünstig herausgestellt, Zellen, welche in vitro typischerweise von einem Flüssigkeitsfilm, der sog. Nährlösung, bedeckt sind, durch diesen Film hindurch zu stimulieren. Die Dicke des Flüssigkeitsfilms beträgt in der Regel zwischen 0,5 und 1 mm. Die applizierte Substanz ver¬ mischt sich dann an der Oberfläche mit der Nährlösung, wird verdünnt und muss mittels Diffusion eine Strecke in Rieh- tung der Zellen von mehreren 100 μm zurücklegen. Dabei verdünnt sich erstens die Flüssigkeit exponentiell weiter, weshalb erheblich höhere Konzentrationen erforderlich sind, und zweitens wird der stimulierte Raumbereich erheblich vergrößert. So kann aus einem ursprünglichen Stimulationspunkt von ca. 50 μm Durchmesser an der Flüssigkeitsoberfläche am Ort der Zellen ohne weiteres ein Stimulationsbereich mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 1 mm werden. In einem solchen Fall kann kaum noch von einer ortsaufgelösten Stimulation gesprochen werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Auseinanderlaufen des Tropfens verhindert, da die Menge entweder in eine räumlich begrenzte Mikrodüse appliziert wird, oder auf die Rückseite einer permeablen Membran dosiert wird, wo sie durch Adhäsion haften bleibt. Vorzugsweise ist die permeable Membran an der Rückseite nicht stark benetzend bezüglich des Stimulansmediums (Kontaktwinkel um die 90°), um ein Auseinanderlaufen des Tropfens zu verhindern. Eine solche Oberflächenbeschaffenheit stellt jedoch keine Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren dar, da dieses auch bei Benetzung der Membran funktioniert, wobei lediglich die Ortsauflösung schlechter wird.
Erfindungsgemäß kann dann die an der Rückseite der Membran haftende oder in der MikroÖffnung befindliche Substanz durch Diffusion, ggf. unterstützt durch Kapillarkräfte, sehr schnell durch die Membran hindurchbewegt werden, beispielsweise innerhalb von 0,01 Sekunden bei Membranen einer Dicke von etwa 10 μm. Unmittelbar auf der anderen Seite der Membran befinden sich die Zellen, die somit sehr schnell angeregt werden können. Ferner klingt die Konzentration durch die Verdünnung, die unweigerlich in der Nährlösung auf der Vorderseite der Membran stattfindet, sehr schnell ab, wobei diese Verdünnung zu einem sehr begrenzten Stimulationsbereich von in der Regel weniger als 50 μm führen kann. Somit herrscht in einiger Entfernung von der stimu- lierten Zelle keine nennenswerte Konzentration der Substanz vor.
Besteht das Stimulansmedium beispielsweise aus in Wasser gelösten Neurotransmittern, kann das Trennmedium beispielsweise aus einem Gas (z. B. Luft) oder einer nichtmischbaren Flüssigkeit (beispielsweise Öl) bestehen.
Somit kann festgestellt werden, dass ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin besteht, dass eine geringe, konzentrierte Menge eines Stimulansmediums bzw. einer Stimulanssubstanz nahe an die zu stimulierende Substanz (beispielsweise eine Zelle) herangebracht werden kann, ehe die Diffusion zu einer Verdünnung und Aus- breitung des Stimulationsbereichs führt. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß die Diffusion aktiv genutzt, um den geringen Abstand, der nach Auftreffen der Substanz auf die Rückseite des Trägers noch zur Zelle hin zu überwinden ist, zu überwinden. Bei einer geringen Membrandicke kann dies zu einer sehr schnellen Reaktionszeit, wie sie oben beschrieben wurde, führen.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung befindet sich die Rückseite der Membran in unmit- telbarer Nähe zu der Abgabestelle der Dosiervorrichtung, so dass im Freistrahl lediglich eine geringe Distanz überbrückt werden muss. Ferner sind Dosiervorrichtung und Membran derart ausgebildet und zueinander angeordnet, dass das dosierte Stimulansmedium im Wesentlichen senkrecht auf die Rückseite der Membran trifft, um dadurch eine Vorzugsrichtung der Diffusion von der Rückseite der Membran zu der Vorderseite derselben zu unterstützen.
Es bedarf keiner gesonderten Erläuterung, dass das Trennme- dium bezüglich des Stimulansmediums derart beschaffen ist, dass die Flüssigkeit des Stimulansmediums mit dem Trennmedium nicht mischbar, bzw. der chemisch aktive Stoff in dem Stimulansmedium in dem Trennmedium nicht lösbar ist, bzw. das eine Mischbarkeit bzw. Lösbarkeit vernachlässigbar ist. Das Dosiersystem ist vorzugsweise ausgebildet, um Flüssigkeitstropfen bzw. Flüssigkeitsstrahlen mit Volumina von wenigen Picolitern bis Femtolitern dosieren zu können. Geeig- net hierzu sind beispielsweise nach Art eines Tintenstrahldruckers arbeitende Dosiersysteme, bei denen eine Tropfenerzeugung mittels Bubble-Jet-Verfahren oder mittels Piezo- verfahren stattfindet.
Die Dosiervorrichtung bzw. das Dosiersystem kann ferner eine Vielzahl von Abgabestellen, welche unterschiedliche Chemikalien enthalten können, aufweisen. Diese Vielzahl von Abgabestellen kann vorzugsweise in einem Raster angeordnet sein, um ein gleichzeitiges Ausstoßen gleicher oder unter- schiedlicher Chemikalien auf die Rückseite der Membran zu ermöglichen. Somit können an mehreren Positionen der Membran gleiche oder unterschiedliche auf der Vorderseite befindliche Substanzen chemisch stimuliert werden.
Durch den erfindungsgemäßen Lösungsansatz zur ort- und zeitaufgelösten chemischen Stimulation, wird eine Diffusion zwischen Applikationsbereich, beispielsweise Zellen und/oder Gewebe, und einem Reservoir für das Stimulansmedi- um durch einen mit einem Trennmedium gefüllten Zwischenraum unterbunden. Dieser Zwischenraum wird zur Applikation von Chemikalien, beispielsweise Neurotransmittern, mit Hilfe eines Flüssigkeitsstrahls oder eines freifliegenden Tropfens, der beispielsweise durch ein Tintenstrahl-Verfahren erzeugt werden kann, überwunden. Der permeable Träger, auf dem die Zellen oder das Gewebe aufgebracht sind, kann von der Dosiervorrichtung mechanisch getrennt sein, so dass beide Teilsysteme gegeneinander verschiebbar sind, oder kann fest mit der Dosiervorrichtung gekoppelt sein.
Erfindungsgemäß kann der zwischen Trennmedium und zu stimulierender Substanz angeordnete permeable Träger auch eine Flüssigkeit aufweisen, bzw. durch eine Flüssigkeit gebildet sein. Diesbezüglich kann die Flüssigkeit als ein Träger für die zu stimulierende Substanz wirken, wenn die zu stimulierende Substanz beispielsweise in der Flüssigkeit gelöst ist bzw. auf der Flüssigkeit schwimmt. Alternativ kann die zu stimulierende Substanz zusätzlich durch einen Halter- getra- gen werden, beispielsweise die Wand eines Flüssigkeitsbehälters bzw. eine in die Flüssigkeit hineinragende Halte- rung. Dabei ist die Abgabestelle von dem Flüssigkeitsbereich durch ein Trennmedium getrennt, wobei die Dosiervorrichtung ausgelegt ist, um das Stimulansmedium als Tropf- chen oder Strahl von der Abgabestelle durch das Trennmedium zu dem Flüssigkeitsbereich auszustoßen, so dass das Stimulansmedium durch den Flüssigkeitsbereich gelangt und eine auf der anderen Seite des Flüssigkeitsbereichs angeordnete zu stimulierende Substanz ortsaufgelöst stimuliert.
Erfindungsgemäß kann somit zwischen Trennmedium und zu stimulierender Substanz ein permeabler Träger in Form eines Festkörperträgers oder in Form eines Flüssigkeitsbereichs vorgesehen sein. In jedem Fall befindet sich die zu stimu- lierende Substanz auf der dem Trennmedium gegenüberliegenden Seite des Festkörperträgers bzw. des Flüssigkeitsbereichs, auch wenn die zu stimulierende Substanz physikalisch auf einem Wandelement oder einer in die Flüssigkeit hineinragenden Halterung aufgebracht ist.
In jedem Fall wird erfindungsgemäß das Stimulansmedium durch ein Trennmedium zu einem Bereich ausgestoßen, durch den dasselbe zu der zu stimulierenden Substanz diffundiert, um diese zu stimulierende Substanz ortsaufgelöst zu stimu- lieren. Der Bereich kann dabei als permeabler Festkörperträger oder als Flüssigkeitsbereich implementiert sein.
Wird das Stimulansmedium durch das Trennmedium und einen Flüssigkeitsbereich zu der zu stimulierenden Substanz aus- gestoßen, so kann vorzugsweise eine Dosierspitze verwendet werden, in der die Abgabestelle gebildet ist und die im Bereich der Abgabestelle hydrophobe Wandbereiche aufweist, die den Trennmedienbereich festlegen, so dass beim Eintau- chen der Dosierspitze in eine Flüssigkeit, die dann den Flüssigkeitsbereich, durch den das Stimulansmedium gelangt, bildet, der Trennmedienbereich mit einem Gas oder einem mit der Flüssigkeit des Flüssigkeitsbereichs nicht mischbaren Medium, das sich vor dem Eintauchen in demselben befand, gefüllt bleibt. Das nicht mischbare Medium kann beispielsweise eine mit der Flüssigkeit des Flüssigkeitsbereichs nicht mischbare Flüssigkeit sein. In hydrophoben Wandbereichen, die den Trennmedienbereich definieren, könnte bei- spielsweise eine lipophile, nicht mit Wasser mischbare Flüssigkeit gehalten werden und als Trennmedium fungieren, z.B. Öle.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur chemischen Stimulation;
Fig. 2a, 2b, 3a und 3b schematische Querschnittsansichten zur Veranschaulichung von Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung;
Fig. 4a bis 4d schematische Darstellungen einer numerischen Stimulation eines Flüssigkeitstransfers von einer Mikrodüse zu einer gegenüberliegenden Mik- roöffnung;
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines permeablen Trägers zur Erläuterung des Diffusionseffekts;
Fig. 6a bisβc Graphen, die Konzentrationsverteilungen in unterschiedlichen Diffusionsrichtungen darstel- len;
Fig. 7 eine schematische Darstellung der Konzentration zu einem bestimmten Zeitpunkt; Fig. 8a und 8b Zeitkonstanten für die Diffusion in drei unterschiedlichen Richtungen;
Fig. 9 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur chemischen Stimulation;
Fig. 10 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Dosierspitze für eine
Vorrichtung gemäß Fig. 9; und
Fig. 11 zeigt schematisch eine Querschnittansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Do- sierspitze.
Ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur chemischen Stimulation, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, umfasst ein Dosiersystem 10, mit einer Mehrzahl von Abgabestellen 12, die in einem Raster angeordnet sind. Die Abgabestellen 12 stellen Ausstoßöffnungen dar und können beispielsweise nach Art eines Tintenstrahldruckers Flüssigkeit ausstoßen. Diesbezüglich umfasst das Dosiersystem 10 entsprechende Flüssigkeitsreservoire und Antriebsmechanismen (in Fig. 1 nicht gezeigt) .
Ferner ist, beabstandet von einer Seite bzw. Oberfläche 10a des Dosiersystems, in der die Ausstoßöffnungen 12, vorgesehen sind, eine Folie bzw. Membran 14 angeordnet, welche auf einer Seite bzw. Oberfläche 14a mit Zellen oder Gewebe 16 besiedelt ist. Zwischen einer der Seite 14a gegenüberliegenden Seite 14b der Membran 14 und der Oberfläche 10a des Dosiersystems, in der die Ausstoßöffnung 12 gebildet sind, ist ein Trennmedium 18 vorgesehen.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass zu Darstellungszwecken der Abstand zwischen der Membran 14 und dem Dosiersystem 10 in Fig. 1 vergrößert dargestellt ist. Bei dem in Fig. 1 ge- zeigten Ausführungsbeispiel sind die Abgabestellen periodisch zu einem Gitter angeordnet, um eine ortsaufgelöste Stimulation zu ermöglichen, wobei auf der von dem Dosiersystem 10 abgewandten Oberfläche 14a der Membran 14 die Zellkulturen aufgebracht sind. Die zu dosierende Flüssigkeit, das heißt, das Stimulansmedium befindet sich innerhalb der Mikrodosiervorrichtung 10, die es durch eine oder mehrere der Abgabestellen 12, die Mikrodüsen darstellen, verlassen kann. Die Membran 14 besitzt eine hohe Permeabi- lität für das Stimulansmedium, das heißt die Flüssigkeit bzw. den zu dosierenden chemischen Stoff, sowie eine hohe Rückhaltefähigkeit für die zu stimulierende Substanz. Wird das Stimulansmedium somit aus den Abgabestellen 12 auf die Rückseite 14b der Membran 14 abgeschossen, so gelangt das- selbe durch die Membran 14, um die auf der gegenüberliegenden Seite 14a desselben angeordnete Substanz zu stimulieren.
Implementierungen von Ausführungsbeispielen der Erfindung sind in den Fig. 2a bis 3b gezeigt.
Gemäß Fig. 2a umfasst das Dosiersystem 10 eine Düsenplatte 20, in der Mikrodüsen 22, die Abgabestellen definieren, gebildet sind. Das Dosiersystem 10 umfasst ferner eine Ak- torplatte 24, die Heizelemente 26 aufweist. Die Heizelemente 26 liegen den Mikrodüsen 22 gegenüber, wobei ein Flüssigkeitsreservoirbereich, in dem ein Stimulansmedium 28 angeordnet ist, zwischen der Aktorplatte 24 und der Düsenplatte 20 vorgesehen ist. Durch Erwärmen der Heizelemente kann eine Dampfblase 30 in dem Flüssigkeitsreservoirbereich erzeugt werden, was zur Folge hat, dass aus der Ausstoßöffnung der Mikrodüse 22 ein Tröpfen 32 ausgestoßen wird. Diesbezüglich kann der Betrieb des Dosiersystems dem eines Bubble-Jet-Tintenstrahldruckers entsprechen.
Eine Folie bzw. Membran 34 ist der oberen Oberfläche der Düsenplatte 20 des Dosiersystems 10 gegenüberliegend vorgesehen, deren Permeabilität für das Stimulansmedium bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel durch MikroÖffnungen 36 gegeben ist. Diese MikroÖffnungen 36 sind gegenüberliegend zu den Abgabestellen, das heißt, den Mikrodüsen 22 vorgesehen. Auf einer von dem Dosiersystem 10 abgewandten Seite 34a der Membran 34 sind zu stimulierende Zellen 38 angeordnet, die sich in einem Flüssigkeitsfilm 40, der sog. Nährlösung, befinden. Wie in Fig. 2a zu sehen ist, reichen die Mikroöff- nungen 36 von der Seite 34a bis zu der der Dosiervorrichtung zugewandten Seite 34b durch die Membran 34. Zwischen der Dosiervorrichtung 10 und der Seite 34b der Membran 34 ist ein Spalt mit einem Trennmedium 44 vorgesehen.
Im Betrieb wird der durch die Mikrodüsen 22 ausgestoßene Tropfen 32 mit einer solchen kinetischen Energie beauf- schlagt, dass er die zugewandte Seite der Membran 34 erreicht, wie dies schematisch durch den Strahl 42 in Fig. 2a angedeutet ist. Der Strahl gelangt in die MikroÖffnung 36, in der sich Flüssigkeit des Flüssigkeitsfilms 40 befindet, und von dort durch Diffusion zu der von dem Dosiersystem 10 abgewandten Oberfläche der Membran 34. Dort findet im Bereich der MikroÖffnung eine ortsaufgelöste lokale Stimulation der Zellen 38 statt.
Bei dem in Fig. 2a gezeigten Ausführungsbeispiel sind die Membran 34, welche die Zellen bzw. das Gewebe trägt, und das Dosiersystem 10 nicht mechanisch miteinander verbunden, so dass dieselben separat bewegt werden können. Somit können beispielsweise mit Hilfe einer einzigen Abgabestelle verschiedene Positionen auf der Membran stimuliert werden.
Alternativ kann die Membran, welche die Zellen bzw. das Gewebe trägt, mit der Dosiervorrichtung fest verbunden sein und eine Einheit bilden. Ein solches Ausführungsbeispiel ist in Fig. 2b gezeigt, bei dem gleiche Elemente mit glei- chen Bezugszeichen wie in Fig. 2a versehen sind.
Gemäß Fig. 2b ist eine Verbindungsschicht 50 vorgesehen, die die Oberseite des Dosiersystems 10 mit der zugewandten Seite 34b der Membran 34 verbindet. In der Verbindungsschicht 50 sind Ausnehmungen 52 vorgesehen, die den zwischen jeweiliger Abgabestelle und MikroÖffnung vorgesehenen Spalt mit Trennmedium 44 definieren. Die Verbindungsschicht 50 kann einstückig mit der Düsenplatte 20 ausgebildet oder separat von derselben vorgesehen sein. Bei dem in Fig. 2b gezeigten Ausführungsbeispiel ist der mit einem Trennmedium gefüllte Spalt in Form der Ausnehmung 52 zwischen dem Dosiersystem 10 und der Membran 34 fest eingeschlossen. Dies kann insbesondere im Hinblick auf integrierte, implantierbare Stimulationsvorrichtungen von Vorteil sein.
Bei dem, Bezug nehmend auf die Fig. 2a und 2b beschriebenen Ausführungsbeispielen wurde eine Permeabilität durch Mikro- Öffnungen 36 in der Membran 34 erreicht. Alternativ kommen aber auch anderweitig permeable Membrane in Betracht, die Flüssigkeit mit dem zu dosierenden chemischen Stoff bzw. den zu dosierenden Stoffen, d.h. das Stimulansmedium, passieren lassen.
Eine poröse Membran 54 ist in den Fig. 3a und 3b gezeigt. Die poröse Membran ist permeabel für das Stimulansmedium 28, das heißt nach einem Applizieren desselben auf eine dem Dosiersystem zugewandte Seite 54b der Membran 54 diffun- diert das Stimulansmedium durch die Membran auf eine gegenüberliegende Seite 54a, -'um dort befindliche Zellen ortsaufgelöst zu stimulieren. Ein auf die Membran 54 appliziertes Stimulansmedium vor dieser Diffusion ist schematisch in Fig. 3a bei 56 dargestellt. Bei dem in Fig. 3a ge- zeigten Ausführungsbeispiel sind wiederum die Membran 54 und das Dosiersystem nicht mechanisch miteinander verbunden, während bei dem in Fig. 3b gezeigten Ausführungsbeispiel wiederum eine Verbindungsschicht 50 vorgesehen ist, die die Membran 54 und das Dosiersystem 10 miteinander ver- bindet.
Bei dem in den Fig. 2a und 2b gezeigten Ausführungsbeispielen, bei denen in der Membran 34 kleine Öffnungen 36 gegen- über der Abgabestelle angebracht sind, vermischt sich der Strahl bzw. der Tropfen in den Öffnungen 36 mit der die Zellen umgebenden interstitiellen Flüssigkeit bzw. Nährlösung und gelangt durch Diffusion durch die Öffnung 36 an die Zellen oder das Gewebe heran, welches sich in der unmittelbaren Umgebung der Öffnung befinden. Dieser Prozess findet in der unmittelbaren Umgebung der Öffnungen in einem Umkreis von wenigen μm sehr schnell statt, innerhalb weniger Millisekunden, und erlaubt deshalb eine zeitaufgelöste Stimulation der Zellen. In den Fig. 4a bis 4d ist rein schematisch eine numerische Simulation eines Flüssigkeitstransfers von einer Mikrodüse 60 zu einer gegenüberliegenden MikroÖffnung 62 dargestellt. Die dargestellte Bildsequenz wurde dabei mit Hilfe einer numerischen Strömungssi- mulation für eine Mikrodüse mit einem Durchmesser von 30 μm und einer der Mikrodüse 60 genau gegenüberliegenden MikroÖffnung 62 mit einem vergleichbaren Durchmesser durchgeführt. Als Antriebsmechanismus fungiert eine expandierende Gasblase, wie sie durch ein Heizelement 64, das mit der Mikrodüse in Fluidverbindung steht, erzeugt wird. Zwischen der Mikrodüse 60 und der gegenüberliegenden MikroÖffnung 62 ist ein Trennmedium in der Form eines Luftspalts 66 vorgesehen.
Fig. 4a zeigt das System im Ruhezustand. Gemäß Fig. 4b entsteht nach dem Betätigen des Heizelements 64 an der Mikrodüse, das heißt der Auslassöffnung derselben, ein Strahl 68 des Stimulansmediums. Gemäß Fig. 4c überwindet der Strahl 68 den Luftspalt 66 und trifft auf die MikroÖffnung 62. Schließlich reißt der Strahl 68 an der Mikrodüse 60 ab und wird in die MikroÖffnung 62 aufgenommen, wie in Fig. 4d zu sehen ist.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Flüssigkeit, das heißt, das Stimulansmedium, abhängig von dem Abstand zwischen der Mikrodüse und MikroÖffnung und abhängig von dem dosierten Volumen entweder als Strahl, wie Bezug nehmend auf die Fig. 4a bis 4d beschrieben wurde, oder als freifliegendes Tröpfchen das Trennmedium 66 überwindet.
Für den Fall, dass die Membran, welche die Zellen oder das Gewebe trägt, als permeable Membran, beispielsweise poröse Membran, ausgebildet wird, wie oben Bezug nehmend auf die Fig. 3a und 3b erläutert wurde, sind keine separaten MikroÖffnungen in der Membran erforderlich. Vielmehr wird die von der Aufgabestelle ausgestoßene Flüssigkeit einfach auf die zugewandte Seite der Membran dosiert. Die Membran sollte dabei so ausgestaltet sein, dass der Tropfen auf der O- berfläche haften bleibt und nicht zurück reflektiert wird. Die Diffusion durch die dünne permeable Membran bewirkt wiederum, dass die auf die gegenüberliegenden Seite der Membran befindlichen Zellen in der unmittelbaren Umgebung stimuliert werden. Ist die Membran ausreichend dünn, ist die Diffusion entsprechend schnell. Geeignete Dicken für die Membran liegen hier in einem Bereich von weniger als 50 μm, vorzugsweise weniger als 20 μm und noch vorzugsweise 10 μm oder darunter.
Die Diffusion durch die Membran kann ferner durch Kapillarkräfte unterstützt werden. Sind die Poren durch die Membran in vertikaler Richtung und parallel angeordnet, so resul- tiert daraus der zusätzliche Vorteil, dass die Wirkstoffe während der diffusiven Membrandurchdringung keine räumliche Verbreiterung erfahren und der auf der Oberseite der Membran stimulierte Bereich nicht breiter ist als der Bereich der Membranunterseite, auf den der Tropfen dosiert wurde. Eine solche Ausrichtung kann beispielsweise bei länglichen Poren erreicht werden, deren längliche Erstreckung senkrecht zu den Hauptoberflächen der Membran ausgerichtet ist. Es sei jedoch an dieser Stelle angemerkt, dass dies kein notwendiges Merkmal der vorliegenden Erfindung darstellt, sondern eine weiter verbesserte Ortsauflösung unterstützt.
Alternativ zu MikroÖffnungen mit einem Öffnungsdurchmesser im Mikrometerbereich, beispielsweise in einem Bereich von 10 bis 100 μm, kann die Membran auch Nanokanäle aufweisen, die sich zwischen den Hauptoberflächen durch dieselbe erstrecken. In einem solchen Fall kann eine Mehrzahl von Nanokanälen an den jeweiligen Abgabestellen des Dosiersys- tem gegenüberliegend angeordnet sein, so dass das Stimulansmedium durch diese Nanokanäle zu der gegenüberliegenden Oberfläche diffundieren kann.
Erfindungsgemäß überwindet das Stimulansmedium einen mit einem Trennmedium gefüllten Zwischenraum als freifliegendes Tröpfchen oder freifliegender Strahl. Um daher einzelne Punkte, Zellen bzw. Gewebe, auf der Membran zu stimulieren, können die Flüssigkeitstropfen bzw. Flüssigkeitsstrahlen durch geeignete Antriebe an den Abgabestellen erzeugt wer- den. Die Tropfen bzw. Strahlen durchdringen aufgrund ihrer kinetischen Energie das Trennmedium und erreichen die zugewandte Seite bzw. Oberfläche des Trägers. Wie Bezug nehmend auf die Figuren 2a bis 3b erläutert wurde, kommt hier beispielsweise eine thermisch erzeugte Dampfblase als Antrieb in Frage, wie sie thermischen Tintenstrahldruckern Verwendung findet. Es können aber auch beliebig andere Antriebe verwendet werden. Wichtig ist lediglich, dass die Flüssigkeit von der Abgabestelle durch das Trennmedium hindurch auf die zugewandte Seite der Membran dosiert werden kann und dass das Trennmedium weder mit der zu dosierenden Flüssigkeit mischbar ist, noch die zur Stimulation verwendete chemische Substanz im Trennmedium löslich ist. Bei wässri- gen Dosiermedien kommen daher als Trennmedien beispielsweise Luft als gasförmiges Trennmedium oder Öl als flüssiges Trennmedium in Frage.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zum einen eine Diffusion des Stimulansmediums, das heißt der chemischen Substanz, aus den Abgabestellen in Richtung der Zellen durch das Trennmedium unterbunden, sofern sich Trennmedium und Dosiermedium nicht durchmischen und die Löslichkeit der zu applizierenden Subtanzen im dem Trennmedium vernachlässigbar ist. Die zu dosierende Substanz im Reservoirbereich hat keinen direkten Kontakt mit den Zellen. Dieser Kontakt wird lediglich für kurze Zeit mit Hilfe des erzeugten Strahls hergestellt, siehe beispielsweise Fig. 2a oder 4c. Dieser Kontakt wird ganz gezielt auf ein kleines, definiertes Vo- lumen beschränkt, welches auch als kleiner Tropfen auf der Rückseite der Membran haften bleiben kann, siehe Tropfen 56 in Fig. 3a. Damit ergibt sich im Ruhezustand, wenn keine Tropfen bzw. Strahlen aus den Abgabestellen dosiert werden, keine ungewollte Stimulation der Zellen durch die chemische Substanz. Die Dynamik, das heißt, die Konzentration des Stimulansmediums bei Dosierung im Vergleich zur Konzentration im Ruhezustand, wird dadurch erheblich verbessert.
Darüber hinaus ermöglicht die vorliegende Erfindung durch das Aufbringen des Stimulationsmediums auf die Rückseite der Trägermembran eine Stimulation mit einer deutlich verbesserten Ortsauflösung, verglichen mit einem Fall, in dem das Stimulansmedium direkt auf die Oberfläche appliziert werden würde, auf der sich die Zellen in der Nährlösung be- finden. Der Grund hierfür liegt neben der Tatsache, dass sich die Zellen in der Nährlösung benachbart zu der Oberfläche des Trägers ansiedeln, in dem Diffusionsverhalten des applizierten Stimulansmediums.
Fig. 5 zeigt einen Ausschnitt der porösen Membran 54, auf deren oberer Oberfläche wiederum eine zu stimulierende Substanz 70 (Zellen in Nährlösung) angeordnet ist. Auf der Unterseite wurde durch im Wesentlichen senkrechten Beschuss ein Tröpfchen 56 des Stimulansmediums appliziert. In Fig. 5 sind nunmehr, drei Diffusionsrichtungen rn>, r∑O und r3D gezeigt. Ferner ist die Diffusionsgleichung angegeben, wobei n eine dimensionsabhängige Variable darstellt, die für eindimensionale Diffusion in Richtung ID eins, für zweidimensionale Diffusion in Richtung 2D zwei und für dreidimensio- nale Diffusion in Richtung 3D drei beträgt.
In den Fig. 6a bis 6c sind die relativen Konzentrationen in den Richtungen ID, 2D und 3D unter Angabe der jeweiligen Diffusionsgleichungen gezeigt. Bei einer angenommenen Dicke der Membran 54 von 10 μm, einer angenommenen unbegrenzten Punktkonzentration und einer beispielhaften Diffusionskonstante D = 400 μm2/s durchquert das applizierte Stimulans- medium die Membran 54 bei vorherrschender eindimensionaler Diffusion in der Richtung ID innerhalb etwa 10 ms. Wie Fig. 6b zu entnehmen ist, bewegt sich das Stimulansmedium auf der Oberseite der Membran nur um eine Distanz r2D von etwa 60 μm, bevor die Konzentration auf unter 1% des anfängli- chen Werts abgefallen ist.
Fig. 6c ist zu entnehmen, dass sich das applizierte Stimulansmedium in der Richtung 3D nur um eine Distanz r3D von etwa 30 μm bewegt, wenn eine transversale Diffusion in der Membran möglich ist, bevor die Konzentration wiederum unter 1% des Anfangswerts abgefallen.
Die spezifischen Unterschiede beim Diffusionsverhalten in einer eindimensionalen oder dreidimensionalen Geometrie können wie nachfolgend beschrieben für die anwendungsspezifische Optimierung des Systems verwendet werden.
In einer ersten, bevorzugten Ausführungsform wird eine Membran verwendet, welche nur eine eindimensionale Ausbrei- tung des Stimulansmediums entlang der Membrandicke zulässt. Die Zellen werden auf der Membranoberfläche 34a kultiviert und der überstand an Nährlösung ist sehr groß im Vergleich zur Membrandicke. Diese Geometrie führt zu einer eindimensionalen diffusiven Ausbreitung des Stimulansmediums durch die Membran hindurch in Richtung der Membranoberfläche 34a und einer dreidimensionalen diffusiven Ausbreitung des Sti- mulansmediums in der Nährlösung auf der Membranoberfläche. Aufgrund der eindimensionalen Diffusion durch die Membran hindurch ist die bei den Zellen an der Membranoberfläche 34a ankommende Maximalkonzentration an Stimulansmedium relativ hoch und relativ lang anhaltend. Diese Konfiguration könnte beispielsweise eingesetzt werden um ortsaufgelöst einzelnen Zellen einer Zellpopulation möglichst effizient Nährstoffe zuzuführen. Die dreidimensionale Diffusion in der Nährlösung führt zu einer schnellen Verdünnung, d.h. einem kurzen Stimulanssignal und einem räumlich stark lokalisierten Stimulus.
In einer zweiten, bevorzugten Ausführungsform wird eine Membran verwendet, welche eine dreidimensionale Ausbreitung des Stimulansmediums innerhalb der Membran zulässt. Die zu stimulierenden Zellen werden auf der Membranoberfläche 34a kultiviert und der überstand an Nährlösung ist sehr groß im Vergleich zur Membrandicke. Aufgrund der durchweg dreidimensionalen Diffusion der Stimulansmedien sowohl in der Membran als auch in dem Nährmedium ist die an der Membranoberfläche 34a ankommende Maximalkonzentration an Stimu- lansmedium im Vergleich zum vorherigen Beispiel sehr viel niedriger aber auch bezogen auf die zeitliche Dauer sehr viel kürzer. Diese Konfiguration könnte z.B. verwendet werden um Nervenzellen mit möglichst kurzen Impulsen chemisch zu stimulieren.
Fig. 7 zeigt, dass der Anteil von Molekülen, die zu einer bestimmten Zeit t in dem Bereich innerhalb eines Radius r0 enthalten sind, durch Integration berechnet werden kann.
Die Fig. 8a und 8b zeigen einen Vergleich der Zeitkonstanten für die Richtungen ID, 2D und 3D anhand der relativen Konzentrationen C_rel. In Fig. 8a ist dabei ein Zeitraum bis zu 1 Sekunde dargestellt, während Fig. 8b einen Zeitraum bis zu 10 ms zeigt.
Wie den Fig. 8a und 8b zu entnehmen ist, fällt für den 2D- FaIl (Diffusion auf der Membranoberfläche) die Konzentration nach 10 ms auf 20 % ab. Für den 3D-FaIl (Diffusion transversal durch die Membran) fällt die Konzentration nach 1 ms auf 20 % ab. Wie ausgeführt wurde, erfolgt eine Diffusion durch eine Membran einer Dicke von 10 μm mit einer Verzögerungszeit von nicht mehr als 10 ms, wobei die Verzögerungszeit bei Vorliegen eines Kapillardrucks oder einer 3D-Difusion noch geringer sein kann. Zusammenfassend heißt dies, dass die Aufweitung bei dem betrachteten Beispiel im schlechtesten Fall geringer als 50 μm ist, wobei bei größeren Abständen die Konzentration unterhalb von 1 % liegt.
Alternative Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer Vorrichtungen zur chemischen Stimulation werden nachfolgend Bezug nehmend auf die Fig. 9 bis 11 näher erläutert.
Bei diesen Ausführungsbeispielen wird eine Dosierspitze 200 in einen Behälter 210, in dem eine Flüssigkeit 212, beispielsweise ein physiologisches Medium, angeordnet ist, getaucht. Am Boden des Behälters 210 befindet sich eine zu stimulierende Zellkultur 214. Wie nachfolgend Bezug nehmend auf Fig. 10 näher erläutert wird, umfasst die Dosierspitze an ihrem vorderen Ende, in dem eine Ausstoßöffnung bzw. Abgabestelle gebildet ist, hydrophobe Wandbereiche, die einen Trennmedienbereich 216 definieren, der mit einem Gas (Luft) gefüllt bleibt, wenn die Dosierspitze 200 in die Flüssig- keit 212 eingetaucht wird. Dieser Trennmedienbereich ist um eine Ausstoßöffnung 218 der Dosierspitze herum angeordnet, wobei die Ausstoßöffnung 218 über eine Fluidleitung 220 mit einem Reservoir verbunden sein kann.
Bei dem in Fig. 9 gezeigten Ausführungsbeispiel umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung somit eine Dosiervorrichtung in Form der Dosierspitze 200, in der eine Ausstoßöffnung 218 vorgesehen ist. Angrenzend an die Ausstoßöffnung 218 ist der Trennmedienbereich 216 vorgesehen, wobei der Trenn- medienbereich auf der der Ausstoßöffnung gegenüberliegenden Seite an einen Flüssigkeitsbereich der Flüssigkeit 212, der zwischen dem Trennmedium 216 und der Zellkultur angeordnet ist, angrenzt. Die Dosierspitze ist ausgelegt, um ein Sti¬ mulansmedium durch die Ausstoßöffnung 218 als Tropfen oder Strahl durch den Trennmedienbereich 216 zu der Flüssigkeit 212 auszustoßen, so dass das Stimulansmedium durch den Flüssigkeitsbereich 212 zu der zu stimulierenden Substanz, d.h. der Zellkultur 214, gelangt und diese ortsaufgelöst stimuliert.
Die Dosierspitze 200 kann beispielsweise ausgebildet sein, um an deren Spitze auf einem örtlich begrenzten Bereich (von z.B. ca. 100 μm) ein oder mehrere (beispielsweise 2 bis 4) verschiedene chemische Substanzen mit einem kleinsten Volumen im Pico- bis Femtoliterbereich dosieren zu können, um damit einzelne Zellen in einem Zellverband chemisch zu stimulieren. Um eine präzise räumliche Positionierung der Dosierspitze zu ermöglichen, können dabei beliebige herkömmliche Positionierungsmechanismen (in Fig. 9 nicht gezeigt) verwendet werden.
Eine mögliche Ausführungsform für eine Dosierspitze, die hierzu geeignet ist, ist in Fig. 10 gezeigt. Die in Fig. 10 gezeigte Dosierspitze ist zum Ausstoßen von vier unterschiedlichen Stimulansmedien geeignet, wobei zwei oben liegende Ausstoßkammern 230 und 232 in Fig. 10 zu erkennen sind. Gleichartige Ausstoßkammern sind auf der Unterseite des Dosierkopfs angeordnet, in Fig. 10 jedoch nicht zu erkennen. Die Ausstoßkammern 230 und 232 können beispielsweise mittels mikrofluidischer Kanäle aus Fluidreservoiren befüllt werden, wie durch Pfeile 234 in Fig. 10 angedeutet ist. Um den fluidischen Widerstand in den Ausstoßkammern 230 und 232 einzustellen, sind in Fig. 10 optionale Strukturen 236 dargestellt. Ferner ist in jeder der Ausstoßkammern 230 und 232 eine Heizeinrichtung 238 vorgesehen, die eine Tropfengenerierung an Ausstoßöffnungen 240 nach dem Tintenstrahldruckprinzip ermöglicht. Pfeile 242 in Fig. 10 deuten Tropfenflugbahnen von durch die Ausstoßöffnungen 240 ausgestoßenen Tropfen bzw. Strahlen an. An dieser Stelle sei angemerkt, dass durch die Ausgestaltung der Wände der Ausstoßkammern 230, 232 sowie die Ausgestaltung der Aus- stoßöffnung 240 eine Tropfenflugbahn festgelegt werden kann, wobei die Vorrichtung so konfiguriert sein kann, dass die durch mehrere Öffnungen generierten Tropfen auf einen gemeinsamen Stimulationsort oder auf unterschiedliche Stimulationsorte gerichtet sind.
Wie in Fig. 10 gezeigt ist, weist die Dosierspitze Wandbe- reiche 244 und 246 auf, die (zusammen mit in Fig. 10 nicht gezeigten jeweiligen Deckelschichten) einen Trennmedienbereich 250 definieren. Die Wandabschnitte, die diesen Trennmedienbereich definieren, besitzen hydrophobe Eigenschaften, so dass ohne ein Betätigen unter Verwendung der Heiz- einrichtungen 238 keine Flüssigkeit aus den Ausstoßkammern in den Trennmedienbereich gelangt. Ferner kann durch die hydrophobe Beschichtung erreicht werden, dass beim Eintauchen der Dosierspitze in eine Flüssigkeit, wie oben Bezug nehmend auf Fig. 9 beschrieben wurde, keine Flüssigkeit in den Trennmedienbereich eindringt, so dass das Gas (Luft) , das vor dem Eintauchen in die Flüssigkeit in dem Trennmedienbereich 250 vorhanden war, dort verbleibt. Die Dosierspitze, und insbesondere die Bereiche, die den Trennmedienbereich 250 derselben definieren, weisen ausreichend gerin- ge Abmessungen auf, um diesen Effekt zu erreichen, wobei der Abstand der Wandbereiche 244 und 246 voneinander beispielsweise kleiner lOOμm ist.
Fig. 11 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel einer er- findungsgemäß verwendbaren Dosiervorrichtung. Bei der in Fig. 11 gezeigten Dosiervorrichtung sind in einem Substrat eine Flüssigkeitskaitimer 260 für ein Stimulansmedium und ein Trennmedienbereich 262 strukturiert, beispielsweise vergleichbar zu dem Substrat, wie es in Fig. 10 gezeigt ist. Wie in Fig. 11 zu sehen ist, sind die Flüssigkeitskammer 260 und der Trennmedienbereich 262 auf der Oberseite und der Unterseite durch jeweilige Abdeckungen 264 und 266 begrenzt. In der Flüssigkeitskammer 260 sind wiederum Strukturen 268 zur Einstellung des fluidischen Widerstands und eine Heizvorrichtung 270 gebildet. Zwischen der Flüssigkeitskammer 260 und dem Trennmedienbereich 262 ist eine in dem Substrat gebildete Wand 272 vorgesehen, in der eine Ausstoßöffnung 274 gebildet ist. Wie am rechten Rand der Fig.. 11 angedeutet ist, ragt nach dem Eintauchen dieser Dosierspitze in einer Flüssigkeit ein Flüssigkeitsmeniskus 276 in den Trennmedienbereich, ver- drängt jedoch aufgrund der hydrophoben Eigenschaften der Wände des Trennmedienbereichs einen Gaseinschluss in demselben nicht.
Wie in Fig. 11 angedeutet ist, basiert die Tropfengenerie- rung bei diesem Ausführungsbeispiel auf dem Tintenstrahl- Aktuationsprinzip, wobei durch die Heizeinrichtung lokal Flüssigkeit verdampft wird, wie durch eine Dampfblase 278 in Fig. 11 angedeutet ist. Durch diese Verdampfung wird die Flüssigkeit in der Flüssigkeitskammer 260 verdrängt und aus der Öffnung 274 in das Trennmedium 262 ausgestoßen. Mittels einer exakten Einstellung des Flusswiderstandes unter Verwendung der Strukturen 268 wird dabei ein Tropfen generiert, wobei der Ort der Tropfengenerierung durch den Trennmedienbereich 262 von der Flüssigkeit 276, in die die Dosierspitze eingetaucht ist, getrennt ist.
Dosierspitzen, wie sie oben Bezug nehmend auf die Figuren 10 und 11 beschrieben wurden, ermöglichen das Ausstoßen variabler Tropfenvolumina vom Pico- bis Femtoliterbereich
Das oben Bezug nehmend auf die Fig. 9 bis 11 beschriebene System besitzt die Möglichkeit, chemische Substanzen sequentiell oder als Ensemble individuell adressierbar sowie auch parallel zu dosieren. Diese Funktionalität ermöglicht beispielsweise die Applikation eines positiv stimulierenden
Neurotransmitters (Agonist) mit nachfolgender Abschaltung des Signals durch Dosierung des inhibierenden Gegenspielers
(Antagonist) . Die individuell ansteuerbaren Dosiereinheiten erlauben dem System neben sequentiellen Substanz- Applikationen auch die Gabe komplexer Substanz- Kombinationen in einstellbaren Volumenrelationen. Wie dargelegt wurde, werden die Substanzen durch eine Düse an einen Stimulationsort appliziert, wobei die Dosiereinheiten durch integrierte Mikrokanäle mit dazugehörigen Reservoiren verbunden sein können. Der beschriebene Trennmedienbereich ermöglicht zum einen die Generierung eines Tropfens bzw. Strahls im Freiflug und verhindert ferner eine Leckage durch Diffusion zwischen Flüssigkeiten in den Flüssigkeitskammern innerhalb der Dosierspitze sowie der Flüssigkeit, in die die Dosierspitze getaucht wird. Die chemischen, zu applizierenden Substanzen sind dabei in Flüssigkeiten gelöst und werden vorzugsweise über mikrofluidische Kanäle von Reservoiren kapillar in die Ausstoßkammern und zu der Ausstoßöffnung transportiert.
Um geometrische Beschränkungen der Düsenspitze einzuhalten, können vorzugsweise Aktuationsmechanismen mit minimalen Größen, beispielsweise eine Tintenstrahl-Aktorik mit einer sogenannten Side-Shot-Anordnung verwendet werden, wie sie in Fig. 11 gezeigt ist. Um eine optimale Ankopplung an den Wirkort mit einem Flüssigkeitsbereich einer Dicke von 50 μm bis 100 μm zwischen zu stimulierender Substanz und Trennme- dienbereich zu gewährleisten, kann vorzugsweise eine geeignete Positionierungseinrichtung verwendet werden, die eine Positionierung mit derart kleinen Toleranzen ermöglicht. Von erheblicher Bedeutung ist eine Miniaturisierung der Abgabedosis, da nur so lokal eine hohe Wirkstoffkonzentration direkt an einer individuellen Zelle erreicht werden kann, welche durch Diffusion räumlich extrem stark . abklingt, so dass benachbarte Zellen nicht stimuliert bzw. gereizt werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine robuste zeitaufgelöste Dosierung der chemischen Substanzen in einem Zeitfenster von 10 μs und darunter. Ferner ermöglicht die Erfindung eine einzeln adressierbare Dosierung von zwei oder mehr verschiedenen Substanzen sequentiell und parallel an einen Stimulationsort. Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung zellkulturkompatibler Materialien und Technologien unter Berücksichtigung der Kompatibilität zu den zu dosierenden Medien. Daneben ermöglicht die vorlie- gende Erfindung geringe Baugrößen der zu verwendenden Vorrichtungen und ein vollständige Integration in Mikrosyste- itie.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit eine exakte orts- und zeitaufgelöste Stimulation von auf einer Trägermembran befindlichen Substanzen. Durch Vorsehen einer Dosiervorrichtung, die eine Vielzahl von Ausstoßöffnungen aufweist, die vorzugsweise in einem Raster angeordnet sind, können gleichzeitig gleiche oder unterschiedliche Stimulansmedien auf die zugewandte Oberfläche der Trägermembran appliziert werden. Dadurch können an mehreren Positionen gleiche oder unterschiedliche auf der zweiten Seite befindliche Substanzen sowohl ortsausgelöst als auch zeitaufge- löst chemisch stimuliert werden. Die Ausstoßöffnungen der Dosiervorrichtungen können dabei gemeinsam oder separat ansteuerbar sein, wobei sich bei einzelner Ansteuerbarkeit ein weiterer Freiheitsgrad hinsichtlich der zeitaufgelösten Stimulierung ergibt.
Die Erfindung kann beispielsweise eingesetzt werden um dieselben oder verschiedene biologische Zellen innerhalb einer Zellkultur mit denselben oder unterschiedlichen Nährlösungen zu versorgen. Dies könnte etwa verwendet werden um Stammzellen innerhalb einer Kultur mit unterschiedlichen Neurotransmittern zu versorgen und sie so zu unterschiedlichen Ausprägungen heranzuziehen.
Die Erfindung kann beispielsweise in Form implantierbarer Dosiersysteme verwendet werden. Damit könnten etwa ortsaufgelöst bestimmte Hirnregionen im Vorfeld eines epileptischen Anfalls mit Neurotransmittern behandelt werden. Die fehlende Leckage des Systems führt zu einer hohen Dynamik der Medikamentierung und die Diffusionsprozesse quer durch die Membran führen zu einer sehr schnellen Applikation auf der Substanzseite im Millisekundenbereich. Ebenso könnte die Erfindung vorteilhaft zur Tumorbehandlung eingesetzt werden. So könnte etwa ein Array aus Abgabestellen für Chemotherapeutika einen räumlich ausgedehnten Tumor sehr viel effizienter bekämpfen als eine Sberdosis von ei- nem Chemotherapeutikum an einer definierten Tumorstelle, die allerdings an weit entfernten Tumorstellen drastisch abfällt. Ebenfalls könnte es vorteilhaft sein verschiedene Düsen mit unterschiedliche Stimulationsmedien zu versorgen um so entweder die Wirksamkeit von unterschiedlichen Thera- peutika zu testen oder den Tumor über den zeitlichen Verlauf hinweg mit unterschiedlichen Therapeutika zu bekämpfen.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur chemischen Stimulation einer Substanz (38), durch ein Stimulansmedium (28), mit folgenden
Merkmalen:
einem für das Stimulansmedium (28) permeablen Träger (14; 34; 54) mit einer ersten Seite (14b, 34b, 54b) und einer der ersten Oberfläche gegenüberliegenden zweiten Oberfläche (14a, 34a, 54a) ;
einer Dosiervorrichtung (10) mit zumindest einer Abgabestelle (12), wobei die Abgabestelle (12) von der ersten Oberfläche (14b, 34b, 54b) des permeablen Trägers (14; 34; 54) durch ein Trennmedium (18; 44) getrennt ist; und
einer auf der zweiten Oberfläche (14a, 34a, 54a) des Trägers (14;34;54) angeordneten zu stimulierenden Substanz (38) ,
wobei die Dosiervorrichtung (10) ausgelegt ist, um das Stimulansmedium (28) als Tröpfchen (32) oder Strahl (42) von der Abgabestelle (12) durch das Trennmedium
(18; 44) zu der ersten Oberfläche (14b, 34b, 54b) des permeablen Trägers (14; 34; 54) auszustoßen, so dass das Stimulansmedium durch den permeablen Träger auf die zweite Oberfläche (14a; 34a; 54a) des permeablen Trägers gelangt und dort die zu stimulierende Substanz (38) ortsaufgelöst stimuliert.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der permeable Träger (34) einen oder mehrere Kanäle (36) von der ersten zu der zweiten Oberfläche aufweist, der oder die der Abgabestelle (12) gegenüberliegen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der permeable Träger (54) eine poröse Membran ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der Poren in der po- rösen Membran (54) eine längliche Form aufweisen, wobei die längliche Abmessung der Poren in einer Richtung von der ersten Oberfläche (14b; 34b; 54b) zu der zweiten Oberfläche (14a; 34a; 54a) des permeablen Trägers (54) ausgerichtet ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der Träger zwischen der ersten und der zweiten Oberfläche eine Dicke von weniger als 50 μm aufweist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger aus einem biologischen Gewebe besteht.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die eine Halterung (50) aufweist, durch die der permeable Trä- ger (34;54) an der Dosiervorrichtung (10) angebracht ist, wobei die Halterung (50) Ausnehmungen (52) aufweist, in denen das Trennmedium (44) angeordnet ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der das Trennmedium gasförmig oder flüssig ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der die Dosiervorrichtung (10) eine Mehrzahl von Abgabestellen (12) aufweist und ausgebildet ist, um durch die Abgabestellen (12) gleiche oder verschiedene Stimulansmedien zu der ersten Oberfläche des permeablen Trägers (14;34;54) auszustoßen.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der die Dosiervorrichtung (10) eine thermische oder piezoelektrische Tropfenerzeugungseinrichtung (26; 64) aufweist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der permeable Träger durch eine zwischen dem Trennmedium und der zu stimulierenden Substanz angeordneten Flüssigkeitsbereich gebildet ist.
12. Vorrichtung zur chemischen Stimulation einer Substanz
(214) durch ein Stimulansmedium, mit folgenden Merkmalen:
einer Dosiervorrichtung (200) mit zumindest einer Abgabestelle (218),
einem an die Abgabestelle (218) angrenzenden Trennmedienbereich (216) ;
einem an den Tennmedienbereich (216) angrenzenden Flüssigkeitsbereich (212) , in dem eine Flüssigkeit angeordnet ist, wobei der Trennmedienbereich (216) zwischen der Abgabestelle (218) und dem Flüssigkeitsbe- reich (212) angeordnet ist;
einer auf der von dem Trennmedienbereich (216) abgewandten Seite des Flüssigkeitsbereichs angeordneten zu stimulierenden Substanz (214),
wobei die Dosiervorrichtung (200) ausgelegt ist, um das Stimulansmedium als Tröpfchen oder Strahl von der Abgabestelle (218) durch das Trennmedium zu dem Flüssigkeitsbereich (212) auszustoßen, so dass das Stimu- lansmedium durch den Flüssigkeitsbereich zu der zu stimulierenden Substanz (214) gelangt und diese ortsaufgelöst stimuliert.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der die Dosiervor- richtung eine Dosierspitze (200) aufweist, in der die
Abgabestelle gebildet ist, wobei die Dosierspitze hydrophobe Wandbereiche im Bereich der Abgabestelle (218) aufweist, die den Trennmedienbereich (216) festlegen, derart, dass beim Eintauchen der Dosierspitze in eine Flüssigkeit der Trennmedienbereich mit einem Gas oder einem mit der Flüssigkeit des Flüssigkeitsbereichs nicht mischbaren Medium gefüllt bleibt.
14. Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation einer Substanz (38) mit folgendem Schritt:
Ausstoßen eines Stimulansmediums (28) durch ein Trenn- medium (18;44) auf eine erste Oberfläche (14b; 34b;
54b) eines für das Stimulansmedium permeablen Trägers
(14;34;54), so dass das Stimulansmedium (28) durch den permeablen Träger auf eine der ersten Oberfläche (14b;
34b; 54b) gegenüberliegende zweite Oberfläche (14a; 34a; 54a) des permeablen Trägers gelangt und dort eine auf der zweiten Oberfläche angeordnete Substanz (38) ortsaufgelöst chemisch stimuliert.
15. Verfahren zur ortsaufgelösten chemischen Stimulation einer Substanz mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Dosiervorrichtung (200) mit zumindest einer Abgabestelle (218),
Anordnen eines Trennmediums an der Abgabestelle (218);
Anordnen einer Flüssigkeit, derart, dass das Trennmedium zwischen der Flüssigkeit und der Abgabestelle (218) angeordnet ist;
Anordnen einer zu stimulierenden Substanz (214) auf einer von dem Trennmedium abgewandten Seite der Flüssigkeit; und
Ausstossen eines Stimulansmediums als Tröpfchen oder Strahl aus der Abgabestelle durch das Trennmedium zu der Flüssigkeit, so dass das Stimulansmedium durch die Flüssigkeit zu der zu stimulierenden Substanz (214) gelangt und diese ortsaufgelöst stimuliert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Schritte des Anordnens ein Eintauchen einer die Abgabestelle (218) aufweisenden Dosierspitze (200) der Dosiervorrichtung in eine Flüssigkeit aufweist, wobei die Dosierspitze hydrophobe Wandbereiche im Bereich der Abgabestelle (218) aufweist, die einen Trennmedienbereich (216) festlegen, wobei der Schritt des Eintauchens derart durchgeführt wird, dass beim Eintauchen der Dosierspitze (200) in die Flüssigkeit der Trennmedienbereich (216) mit einem Gas oder einem mit der Flüssigkeit des Flüssigkeitsbereichs nicht mischbaren Medium gefüllt bleibt, das vor dem Eintauchen in demselben angeordnet war.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, das ferner einen Schritt des Ausstoßens mehrerer gleicher o- der unterschiedlicher Stimulansmedien auf die erste Oberfläche des permeablen Trägers (14;34;54) aufweist, so dass an mehreren Positionen die gleiche oder unterschiedliche auf der zweiten Oberfläche befindliche Substanzen chemisch stimuliert werden.
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