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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des
Gehalts von mehrfach ungesättigten langkettigen
Fettsäuren
in einem Organismus, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht
werden, die für
Polypeptide bzw. Proteine mit einer Phospholipase-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
und/oder Dehydratase-Aktivität
kodieren. Vorteilhaft stammen diese Enzyme aus Ostreococcus oder
Thraustochytrium.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Nukleinsäuresequenzen, die Nukleinsäurekonstrukte
enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
die Vektoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen und/oder die Nukleinsäurekonstrukte,
sowie die transgenen Organismen enthaltend die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen,
Nukleinsäurekonstrukte
und/oder Vektoren.
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Vorteilhaft
können
diese vorgenannten Nukleinsäuresequenzen,
Nukleinsäurekonstrukte
und/oder Vektoren gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine der Biosynthese des Fettsäure- oder
Lipidstoffwechels kodieren, in dem Organismus exprimiert werden.
Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen
des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechels sind dabei solche, die für eine Δ-9-Elongase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-,
eine Δ-5-Desaturase-, Δ-4-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase- und/oder Δ-6-Elongase-Aktivität kodieren.
Vorteilhaft stammen diese Desaturasen und Elongasen aus Organismen
wie Thalassiosira, Euglena, Isochrysis, Physcomitrella, Thraustochytrium,
Borago, Phytophthora, Crypthecodinium, Oncorhynchus, Primula, Xenopus,
Ciona, Arabidopsis, Mortierella, Caenorhabditis, Phaeodactylum,
Ceratodon oder Ostreococcus.
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Ein
weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren, hergestellt
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren,
und deren Verwendung. Außerdem
betrifft die Erfindung ungesättigte
Fettsäuren sowie
Triglyceride mit einem erhöhten
Gehalt an ungesättigten
Fettsäuren
und deren Verwendung.
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Fettsäuren und
Triacylglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der
Tierernährung,
der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie
gesättigte
und ungesättigte
Fettsäuren
oder um Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten
oder ungesättigten Fettsäuren handelt,
sind sie für
die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie
Linol- und Linolensäure
sind für
Säugetiere
essentiell, da sie nicht von diesen selbst hergestellt werden können. Deshalb
stellen mehrfach ungesättigte ω-3-Fettsäuren und ω-6-Fettsäuren einen
wichtigen Bestandteil der tierischen und menschlichen Nahrung dar.
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Mehrfach
ungesättigte
langkettige ω-3-Fettsäuren wie
Eicosapentaensäure
(= EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17) oder
Docosahexaensäure
(= DHA, C22:6Δ4,7,10,13,16,19)
sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen
Rollen in der Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen
Gehirns, die Funktionalität
des Auges, die Synthese von Hormonen und anderen Signalstoffen,
sowie die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes
umfassen (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA und Yeo YK
Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Es besteht aus diesem Grund ein
Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren.
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Aufgrund
der heute üblichen
Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach
ungesättigten ω-3-Fettsäuren, die
bevorzugt in Fischölen
vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise
mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
wie Docosahexaensäure
(= DHA, C22:6Δ4,7,10,13,16,19)
oder Eisosapentaensäure
(= EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17)
Babynahrung zur Erhöhung
des Nährwertes
zugesetzt. Der ungesättigten
Fettsäure
DHA wird dabei ein positiver Effekt auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung
von Gehirnfunktionen zugeschrieben.
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Im
folgenden werden mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (poly unsaturated
fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren; long
chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach
ungesättigte
Fettsäuren).
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Hauptsächlich werden
die verschiedenen Fettsäuren
und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium
oder aus Öl-produzierenden
Pflanzen wie Soja, Raps oder Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum
und anderen gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride
(= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie
z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch
Verseifung hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie
DHA, EPA, Arachidonsäure
(= ARA, C20:4Δ5,8,11,14),
Dihomo-γ-linolensäure (C20:3Δ8,11,14)
oder Docosapentaensäure
(DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19)
werden in Ölfruchtpflanzen
wie Raps, Soja, Sonnenblume oder Färbersaflor nicht synthetisiert. Übliche natürliche Quellen
für diese
Fettsäuren
sind Algen oder Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal,
Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch.
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Je
nach Anwendungszweck werden Öle
mit gesättigten
oder ungesättigten
Fettsäuren
bevorzugt. So werden z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten
Fettsäuren,
speziell mehrfach ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt.
Den mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren wird
dabei ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und
damit auf die Möglichkeit
der Prävention
einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3-Fettsäuren zur
Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder
von Bluthochdruck deutlich verringert werden. Auch entzündliche,
speziell chronisch entzündliche
Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatroider
Arthritis lassen sich durch ω-3-Fettsäuren positiv
beeinflussen. Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätischen
Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ω-6-Fettsäuren wie
Arachidonsäure
haben bei diesen rheumatischen Erkrankungen aufgrund unserer üblichen
Nahrungsmittelzusammensetzung eher einen negativen Effekt auf diese
Krankheiten.
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ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind
Vorläufer
von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen,
die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der
Arachidonsäure
und der Eicosapentaensäure
ableiten, den Thromoxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und
der Eicosapentaensäure
ableiten. Eicosanoide (sog. PG2-Serie), die aus ω-6-Fettsäuren gebildet
werden, fördern
in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide
(sog. PG3-Serie) aus ω-3-Fettsäuren geringe oder keine entzündungsfördernde
Wirkung haben.
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Aufgrund
ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangenheit nicht
an Ansätzen
gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt
sind, für
die Herstellung von Ölen
in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten
Fettsäuren
verfügbar
zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase
beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase in WO 94/11516
wird eine Δ-12-Desaturase
beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337,
WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et
al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature
347, 1990: 200-203
oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. Die biochemische
Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher
nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine
nur sehr schwer zu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeon
et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al.,
Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). In der Regel erfolgt
die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Einbringung
in einen geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels
Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712,
US 5,614,393 ,
US 5614393 , WO 96/21022, WO00/21557
und WO 99/27111 beschrieben, und auch die Anwendung zur Produktion
in transgenen Organismen wird z.B. in WO98/46763 WO98/46764, WO9846765
beschrieben. Dabei wird auch die Expression verschiedener Desaturasen
wie in WO99/64616 oder WO98/46776 und Bildung polyungesättigter
Fettsäuren
beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivität der Expression
von Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung polyungesättigter
Fettsäuren
ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase
wie bisher beschrieben lediglich geringe Gehalte an ungesättigten
Fettsäuren/Lipiden wie
z.B. γ-Linolensäure und
Stearidonsäure
erreicht wurden. Weiterhin wurde in der Regel ein Gemisch aus ω-3- und ω-6-Fettsäuren erhalten.
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Besonders
geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroorganismen
wie Mikroalgen wie Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten,
Thraustochytrien-Arten,
Schizochytrien-Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia
oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor
und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon und Marchantia (R.
Vazhappilly & F.
Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987)
Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry
and Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl
von Mutantenstämmen
der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe
wünschenswerter
Verbindungen, einschließlich
PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen mit
verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls wie den mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Deshalb
werden, wann immer möglich,
wie oben beschrieben gentechnologische Verfahren bevorzugt. Mit
Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich jedoch nur begrenzte
Mengen der gewünschten mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren
wie DPA, EPA oder ARA herstellen, wobei diese in der Regel je nach
verwendetem Mikroorganismus als Fettsäuregemische aus beispielsweise
EPA, DPA und ARA anfallen.
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Für die Synthese
von Arachidonsäure,
Eicosapentaensäure
(EPA) und Docosahexaensäure
(DHA) werden verschiedene Synthesewege diskutiert (1).
So erfolgt die Produktion von EPA bzw. DHA in marinen Bakterien
wie Vibrio sp. oder Shewanella sp. nach dem Polyketid-Weg (Yu, R.
et al. Lipids 35:1061-1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology
143:2725-2731, 1997).
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Ein
alternative Strategie verläuft über die
wechselnde Aktivität
von Desaturasen und Elongasen (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268,
2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). Eine Modifikation des
beschriebenen Weges über Δ6-Desaturase, Δ6-Elongase, Δ5-Desaturase, Δ5-Elongase, Δ4-Desaturase ist
der Sprecher-Syntheseweg (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta
1486:219-231) in Säugetieren.
Anstelle der Δ4- Desaturierung erfolgt
hier ein weiterer Elongationsschritt auf C24,
eine weitere Δ6-Desaturierung und abschliessend
eine β-Oxidation
auf die C22-Kettenlänge. Für die Herstellung in Pflanzen
und Mikroorganismen ist der sogenannte Sprecher-Syntheseweg (siehe 1)
allerdings nicht geeignet, da die Regulationsmechanismen nicht bekannt
sind.
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Die
polyungesättigten
Fettsäuren
können
entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in zwei große Klassen,
in ω-6-
oder ω-3-Fettsäuren, eingeteilt
werden, die metabolisch und funktionell unterschiedliche Aktivitäten haben
(1).
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Als
Ausgangsprodukt für
den ω-6-Stoffwechselweg
fungiert die Fettsäure
Linolsäure
(18:2Δ9,12),
während
der ω-3-Weg über Linolensäure (18:3Δ9,12,15)
abläuft.
Linolensäure
wird dabei durch die Aktivität
einer ω-3-Desaturase
gebildet (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117; Domergue
et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113).
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Säugetiere
und damit auch der Mensch verfügen über keine
entsprechende Desaturase-Aktivität (Δ-12- und ω-3-Desaturase)
und müssen
diese Fettsäuren
(essentielle Fettsäuren) über die
Nahrung aufnehmen. Über
die Abfolge von Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann
aus diesen Vorstufen die physiologisch wichtigen polyungesättigten
Fettsäuren
Arachidonsäure
(= ARA, 20:4Δ5,8,11,14),
eine ω-6-Fettsäure, und
die beiden ω-3-Fettsäuren Eicosapentaen-
(= EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17)
und Docosahexaensäure
(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,17,19)
synthetisiert. Die Applikation von ω-3-Fettsäuren zeigt dabei die oben beschriebene
therapeutische Wirkung bei der Behandlung von Herz-Kreislaufkrankheiten
(Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), Entzündungen
(Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) und Arthritis (Cleland
und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307).
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Die
Verlängerung
von Fettsäuren
durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist für die Produktion von C20- bzw. C22-PUFAs
von entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess verläuft über 4 Stufen.
Der erste Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-CoA an das
Fettsäure-Acyl-CoA durch die
Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elongase bezeichnet).
Es folgt dann ein Reduktionschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein
Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschliessender Reduktionsschritt
(Enoyl-CoA-Reduktase). Es
wurde postuliert, dass die Aktivität der Elongase die Spezifität und Geschwindigkeit
des gesamten Prozesses beeinflusst (Millar and Kunst, 1997 Plant
Journal 12:121-131).
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In
der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongasegene
zu erhalten. Millar und Kunst (1997, Plant Journal 12:121-131) und
Millar et al. (1999, Plant Cell 11:825-838) beschreiben die Charakterisierung
von pflanzlichen Elongasen zur Synthese von einfach ungesättigten
langkettigen Fettsäuren (C22:1)
bzw. zur Synthese von sehr langkettigen Fettsäuren für die Wachsbildung in Pflanzen
(C28-C32). Beschreibungen
zur Synthese von Arachidonsäure
und EPA finden sich beispielsweise in WO0159128, WO0012720, WO02077213
und WO0208401. Die Synthese von mehrfach ungesättigten C24-Fettsäuren ist beispielsweise
in Tvrdik et al. (2000, JCB 149:707-717) oder WO0244320 beschrieben.
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Höhere Pflanzen
enthalten mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
wie Linolsäure
(C 18:2) und Linolensäure
(C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samenöl höherer Pflanzen gar nicht oder
nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales.
Technique & Documentation – Lavoisier,
1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es wäre
jedoch vorteilhaft, in höheren
Pflanzen, bevorzugt in Ölsaaten
wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soja, LCPUFAs herzustellen, da auf
diese Weise große
Mengen qualitativ hochwertiger LCPUFAs für die Lebensmittelindustrie,
die Tierernährung
und für
pharmazeutische Zwecke kostengünstig
gewonnen werden könnten.
Hierzu müssen
Gene, kodierend für
Enzyme der Biosynthese von LCPUFAs, vorteilhaft über gentechnische Methoden
in Ölsaaten
eingeführt
und exprimiert werden. Dies sind Gene, die beispielsweise für Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen oder Δ-4-Desaturasen
kodieren. Diese Gene können
vorteilhaft aus Mikroorganismen und niederen Pflanzen isoliert werden,
die LCPUFAs herstellen und in den Membranen oder Triacylglyceriden
einbauen. So konnten bereits Δ-6-Desaturase-Gene
aus dem Moos Physcomitrella patens und Δ-6-Elongase-Gene aus P. patens
und dem Nematoden C. elegans isoliert werden.
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Erste
transgene Pflanzen, die Gene kodierend für Enzyme der LCPUFA-Biosynthese
enthalten und exprimieren und LCPUFAs produzieren, wurden beispielsweise
in
DE 102 19 203 (Verfahren
zur Herstellung mehrfach ungesättigter
Fettsäuren
in Pflanzen) erstmals beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAs
in Mengen, die für
eine Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Öle noch
weiter optimiert werden müssen.
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Um
eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit diesen mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren
zu ermöglichen,
besteht daher ein großer
Bedarf an einem einfachen, kostengünstigen Verfahren zur Herstellung dieser
mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
speziell in eukaryontischen Systemen.
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Nach
wie vor bestehen eine Reihe von limitierenden Schritten in der Fettsäurebiosynthese,
die einer Erhöhung
des Gehalts an mehrfach ungesättigten
langkettigen Fettsäuren
im Wege stehen. So konnte beispielsweise in transgenen Pflanzen,
wie sie beispielsweise in
DE
10219203 beschrieben wurden, gezeigt werden, dass die Elongation,
d.h. die Kettenverlängerung,
von C18- auf C20-Fettsäuren
ein solcher limitierender Schritt ist (
2).
2 gibt
das Gas-Chromatogramm des Fettsäure-Extraktes
aus Leinsamen, transformiert mit dem Konstrukt pGPTV-USP_PSE1_d6Des(Pt)_d5Des(Pt),
gemäss
den Beschreibungen aus DE10219203 wieder. Die neu entstandenen Produkte
der Aktivitäten
der Gene sind mit Pfeilen markiert. Die Synthese der Endprodukte
Arachidonsäure
(ARA) und Eicosapentaensäure
(EPA) verläuft über γ-Linolensäure (g18:3)
bzw. Stearidonsäure
(18:4) (erster Schritt, siehe auch
1). Im
zweiten Schritt erfolgt dann die Elongation zu den Zwischenprodukten
20:3n-6 und 20:4n-3 (Elongationsschritt). Im letzten Schritt werden
dann die Zwischenprodukte zu ARA und EPA umgesetzt. Eine starke
Abnahme der Produktmengen vom ersten zum zweiten Schritt ist erkennbar.
2 zeigt,
dass nach dem ersten Schritt in der aeroben LCPUFA-Synthese, die
Desaturierung von Linol- bzw. Linolensäure (siehe
1),
die Produktmenge drastisch reduziert ist. Dies bedeutet möglicherweise,
dass der Umsatz der Elongation von Δ6-desaturierten Fettsäuren in
einem zu geringem Maße
erfolgt. Die Konversionsrate ist dabei deutlich geringer, als dies
in Hefeexperimenten, in denen die Δ6-desaturierten Fettsäuren gefüttert wurden,
gezeigt werden konnte (Zank et al. 2002, Plant Journal 31:255-268).
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Es
bestand daher die Aufgabe, weitere Gene bzw. Enzyme, die für die Synthese
von LCPUFAs geeignet sind, speziell Gene, die eine Phospholipase
A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
und/oder Dehydratase-Aktivität
aufweisen, für
die Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur
Verfügung
zu stellen und mit diesen die Fettsäurebiosynthese in Ölen und/oder
Lipiden weiter zu optimieren.
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Weiterhin
bestand die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von Ölen oder
Lipiden mit einem hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren, vorteilhaft
an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren,
in einem Organismus, vorteilhaft in einem eukaryontischen Organismus,
bevorzugt in einer Pflanze oder einem Mikroorganismus, zu entwickeln.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Ölen
oder Lipiden mit einem hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren in
transgenen Organismen gelöst.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte
umfasst:
- a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz
in den Organismus, welche für
eine Phospholipase A2-Aktivität
kodiert, oder
- b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus,
welche für
eine Ketoacyl-CoA-Reduktase-Aktivität kodiert, oder
- c) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus,
welche für
eine Dehydratase-Aktivität
kodiert, und
- d) Kultivierung und Ernte des transgenen Organismus.
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Vorteilhaft
werden die im Verfahren hergestellten Öle oder Lipide aus dem transgenen
Organismus isoliert, und gegegenenfalls werden die in den Ölen oder
Lipiden enthaltenen Fettsäuren,
vorteilhaft die ungesättigten
Fettsäuren,
aus diesen befreit.
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Vorteilhaft
enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
mindestens zwei, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen.
Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren vier, fünf oder
sechs Doppelbindungen. Im Verfahren hergestellte Fettsäuren haben
vorteilhaft 18, 20 oder 22 C-Atome in der Fettsäurekette, bevorzugt enthalten
die Fettsäuren
20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Diese hergestellten
Fettsäuren
können
als einziges Produkt im Verfahren hergestellt werden oder in einem
Fettsäuregemisch
vorliegen.
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Bei
den im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuresequenzen
handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder
Dehydratese-Aktivität
kodieren und vorteilhaft aus Organismen der Gattungen Ostreococcus oder
Thraustochytrium stammen.
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Bevorzugte
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratase-Aktivität
kodieren, sind ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO: 7 dargestellten Sequenz, oder
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den
in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten
Aminosäuresequenzen
ableiten lassen, oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide
bzw. Proteine mit mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 kodieren
und eine Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratasaktivität aufweisen.
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Diese
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratese-Aktivität
kodieren, können vorteilhaft
in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, ω-3-Desaturase- und/oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren,
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Diese im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen
und die durch sie kodierten Proteine fuhren zu einer Erhöhung des
Gehalts an ungesättigten
Fettsäuren,
bevorzugt zu einer Erhöhung
des Gehalts an LCPUFAs, in den transgenen Organismen. Unter dem
Begriff „mit
einem hohen Anteil" an
ungesättigten
Fettsäure
bzw. unter dem Begriff „Erhöhung" ist eine Zunahme
der ungestättigten
Fettsäuren in
den Ölen
oder Lipiden oder in Form der freien Fettsäuren in den Organismen von
mindestens 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 %, vorteilhaft von mindestens 15,
20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 %, bevorzugt von mindestens 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 %, besonders bevorzugt von mindestens
105, 110, 115 oder 120 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens
130, 135, 140, 145 oder 150 % gegenüber der Menge an ungestättigten Fettsäuren in
den Ölen
oder Lipiden oder in Form der freien Fettsäuren in den Organismen, die
die im erfindungsgemäßen Verfahren
mit den verwendeten Nukleinsäuresequenzen
und die durch diese kodierten Proteine gegenüber dem nicht transgenen Ausgangsorganismus,
beispielsweise einer Hefe, einer Alge, einem Pilz oder einer Pflanze
wie Arabidopsis oder Lein, beim Vergleich in der GC-Analyse (siehe
Beispiele) erreicht werden. Die vorgenannten Prozentangaben beziehen
sich auf die Steigerung der ungestättigten Fettsäuren in
den Ölen oder
Lipiden oder in Form der freien Fettsäuren in den Organismen bezogen
auf den Gesamtlipidgehalt in Gewichtsprozent. Im erfindungsgemäßen Verfahren
werden so die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens
3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens
8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-% und ganz
besonders bevorzugt von mindestens 15 Gew.-% bezogen auf die gesamten
Fettsäuren
in den transgenen Organismen, vorteilhaft in einer transgenen Pflanze,
hergestellt.
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Die
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Aktivität
der Phospholipase A2 [= PLA2(Ot)] ist beschrieben als Hydrolase-Reaktion
der Esterbindung der sn-2-Position von Triacylglyceriden (E.C. Nummer 3.1.1.4).
Eine Erhöhung
des LCPUFA-Gehalts kann aufgrund der Aktivität auf folgenden Reaktionsmechanismus
zurückgeführt werden:
Der Reaktionsmechanismus von LCPUFA setzt sich aus den Schritten Δ6-Desaturierung, Δ6-Elongation und Δ5-Desaturierung
zusammen (1). Diese Schritte erfolgen
in unterschiedlichen Kompartimenten (Domergue et al. 2003, JBC,
278:35115-35126). Dabei erfolgt der erste Desaturierungsschritt
an der sn-2-Position von Phospholipiden, hauptsächlich Phosphatidylcholin (Domergue
et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269:4105-4113). Für den folgenden Elongationsschritt
muss die Fettsäure
aus dem Phosphatidylcholin herausgelöst werden und dem Elongationskomplex
in Form eines Acyl-CoA-Esters zugänglich gemacht werden. Organismen
verfügen
dabei über
ein Set von Acyltransferasen, um diese Reaktion durchführen zu können.
-
In
transgenen Pflanzen scheint dieser Schritt limitierend zu sein,
d.h. das endogen vorhandene Set an Enzymen kann die Reaktion nicht
effizient katalysieren.
-
Aufgrund
der Aktivität
der PLA2(Ot) werden mehr Fettsäuren
für die
Elongation bereitgestellt, was zur Erhöhung des Gehalts an LCPUFA
führt.
Die PLA2(Ot) zeigt Homologien zu einer Phospholipase A2 aus Homo
sapiens (siehe 3).
-
Einen
weiteren Bestandteil der Erfindung stellen Enzyme des Elongationskomplexes
dar. Neben der oben erwähnten
Bereitstellung von Fettsäuren
für die
Elongation stellt die Aktivität
des Elongationskomplexes ein wichtiges Potential zur Erhöhung des
Gehalts an verlängerten
Fettsäuren
dar.
-
Aus
der Alge Ostreococcus tauri sowie dem Pilz Thraustochytrium ssp.
konnten Gene identifiziert werden, die für Proteine des Elongasekomplexes
kodieren, deren Kombination in Organsimen zur Erhöhung des Gehalts
an LCPUFA führt.
-
Der
Prozess der Verlängerung
von Fettsäuren
verläuft über 4 Stufen
(Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000, ed. Buchanan,
Gruissem, Jones, ASPP). Der erste Schritt stellt die Kondensation
von Malonyl-CoA an das Fettsäure-Acyl-CoA
durch die Ketoacyl-CoA-Synthase
(KCS, im weiteren Text als Elongase bezeichnet) dar. Es folgt dann
ein Reduktionschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein Dehydratationsschritt
(Dehydratase) und ein abschliessender Reduktionsschritt (Enoyl-CoA-Reduktase).
Es wurde postuliert, dass die Aktivität der Elongase die Spezifität und Geschwindigkeit
des gesamten Prozesses beeinflussen (Millar and Kunst, 1997 Plant
Journal 12:121-131). Es konnte gezeigt werden, dass die verstärkte Bereitstellung einer
der Komponenten des Elongasekomplexes zu einer Erhöhung der
Menge an Elongationsprodukt führt (Beaudoin
et al. 2001, JBC, 277:11481-11488).
-
Überraschenderweise
führt die
kombinierte Expression der Gene für die Ketoacyl-CoA-Reduktase [KR(Ot)]
und für
die Dehydratase [DH (Ot)] aus der Alge Ostreococcus in Pflanzen
zu einer Erhöhung
bzw. weiteren Steigerung der Menge an LCPUFAs. Anhand von Sequenzvergleichen
konnte gezeigt werden, dass die beiden identifizierten Gene Homologien
zu Enzymen mit Ketoacyl-CoA-Reduktase (Ketoacyl-CoA-Reduktase von
Saccharomyces cerevisiae GenBank Acc. NP009717; Ybr159w) bzw. Dehydratase-Aktivität (Dehydratase/
enoyl-Reduktase Aktivität
von Saccharomyces cerevisiae GenBank Acc. S61591; Ydr036c) besitzen (siehe 4, 5 und 6).
-
Vorteilhaft
werden, wie oben beschrieben, im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuresequenzen, die
für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- und/oder für die Dehydratase-Aktivität kodieren,
in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase- oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren,
verwendet. Die Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, ω-3-Desaturase-
oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren,
sind dabei vorteilhaft ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ
ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50,
SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ
ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:
68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76,
SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ
ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO:
94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102,
SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110,
SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118,
SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126,
SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134,
SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142 oder
SEQ ID NO: 144 dargestellten Sequenz, oder
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den
in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ
ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:
35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ
ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:
53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61,
SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ
ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:
79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ
ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID
NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID
NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID
NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID
NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID
NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 oder SEQ
ID NO: 145 dargestellten Aminosäuresequenzen
ableiten lassen, oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ
ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:
48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56,
SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID
NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:
74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ
ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO:
100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO:
108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:
116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:
124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:
132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO:
140, SEQ ID NO: 142 oder SEQ ID NO: 144 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25,
SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ
ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:
43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51,
SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ
ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO:
69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77,
SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ
ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:
95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103,
SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111,
SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119,
SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127,
SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135,
SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 oder SEQ
ID NO: 145 haben und eine Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
oder Δ-4-Desaturase-Aktivität aufweisen.
-
Die
im Verfahren hergestellten Öle
oder Lipide enthalten vorteilhaft einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren,
die vorteilhaft in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden
sind. Die mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
können
aber auch als freie Fettsäuren
oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen
vorkommen. Dabei können
sie als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in
Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher
Glyceride vorliegen. Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschieden
Fettsäuren
lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen,
mittelkettigen Fettsäuren
mit 8 bis 12 C-Atomen
oder langkettigen Fettsäuren
mit 14 bis 24 C-Atomen ableiten. Bevorzugt sind die langkettigen
Fettsäuren,
besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C18-,
C20- und/oder C22-Fettsäuren.
-
Im
erfindungsgemäßen Verfahren
werden vorteilhaft Öle
oder Lipide in Form ihrer Fettsäureester
mit mehrfach ungesättigten
C18-, C20- und/oder
C22-Fettsäuremolekülen mit mindestens zwei Doppelbindungen
im Fettsäureester,
vorteilhaft mit mindestens drei oder vier Doppelbindungen im Fettsäureester,
besonders vorteilhaft mit mindestens fünf oder sechs Doppelbindungen
im Fettsäureester
hergestellt. Dies führt
im Verfahren vorteilhaft zur Synthese von Linolsäure (=LA, C18:2Δ9,12), γ-Linolensäure (= GLA,
C18:3Δ6,9,12),
Stearidonsäure (=
SDA, C18:4Δ6,9,12,15),
Dihomo-γ-Linolensäure (= DGLA,
20:3Δ8,11,14), ω-3-Eicosatetraensäure (= ETA, C20:4Δ5,8,11,14),
Arachidonsäure
(ARA, C20:4Δ5,8,11,14),
Eicosapentaensäure
(EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17), ω-6-Docosapentaensäure (C22:5Δ4,7,10,13,16), ω-6-Docosatetraensäure C22:4Δ,7,10,13,16, ω-3-Docosapentaensäure (= DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19),
Docosahenaensäure
(= DHA, C22:6Δ4,7,10,13,16,19)
oder deren Mischungen, bevorzugt zu ARA, EPA und/oder DHA. Ganz
besonders bevorzugt werden ω-3-Fettsäuren wie
EPA und/oder DHA hergestellt.
-
Die
Fettsäureester
mit mehrfach ungesättigten
C18-, C20- und/oder
C22-Fettsäuremolekülen können aus den Organismen, die
für die
Herstellung der Fettsäureester
verwendet wurden, in Form eines Öls
oder Lipids, beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipiden,
Phosphoglyceriden, Lipiden, Glycolipiden wie Glycosphingolipiden,
Phospholipiden wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin,
Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder
Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceriden, Diacylglyceriden, Triacylglyceriden
oder sonstigen Fettsäureestern
wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
mit mindestens zwei, drei oder vier, bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen
enthalten, isoliert werden. Vorteilhaft werden sie in der Form ihrer
Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form des Phosphatidylcholin
isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride.
Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch
als freie Fettsäuren
oder gebunden in anderen Verbindungen in den Organismen, vorteilhaft
den Pflanzen, enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen
(Fettsäureester
und frei Fettsäuren)
in den Organismen in einer ungefähren
Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride,
5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2
bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen
Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.
-
Im
erfindungsgemäßen Verfahren
werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens
3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens
8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-% und ganz
besonders bevorzugt von mindestens 15 Gew.-% bezogen auf die gesamten
Fettsäuren
in den transgenen Organismen, vorteilhaft in einer transgenen Pflanze,
hergestellt. Dabei werden vorteilhaft C18-C20-
und/oder C22-Fettsäuren, die in den Wirtsorganismen
vorhanden sind, zu mindestens 10 %, vorteilhaft zu mindestens 20
%, besonders vorteilhaft zu mindestens 30 % und ganz besonders vorteilhaft
zu mindestens 40 % in die entsprechenden Produkte wie DPA oder DHA,
um nur zwei beispielhaft zu nennen, umgesetzt. Vorteilhaft werden
die Fettsäuren
in gebundener Form hergestellt. Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuren
lassen sich diese ungesättigten
Fettsäuren
an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten
Triglyceride bringen. Weiterhin werden vorteilhaft Vorprodukte dieser
Fettsäuren
im erfindungsgemäßen Verfahren
zur Verfügung
gestellt. Da im erfindungsgemäßen Verfahren
von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3)
mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Endprodukte
des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA), ω-6-Docosapentaensäure oder
DHA nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch geringe
Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in dem Ausgangsorganismus bzw.
in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als
auch Linolensäure
vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA, EPA oder DHA als Mischungen
vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%,
bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als
10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen
auf die Menge des jeweilige Endprodukts betragen. Vorteilhaft werden
in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ARA, EPA oder nur
DHA im erfindungsgemäßen Verfahren
gebunden oder als freie Säuren
hergestellt. Werden die Verbindungen ARA, EPA und DHA gleichzeitig hergestellt,
werden sie vorteilhaft in einem Verhältnis von mindesten 1:1:2 (EPA:ARA:DHA),
vorteilhaft von mindestens 1:1:3, bevorzugt von 1:1:4 und besonders
bevorzugt von 1:1:5 hergestellt.
-
Fettsäureester
bzw. Fettsäuregemische,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft 6 bis 15 % Palmitinsäure, 1 bis
6 % Stearinsäure;
7 bis 85 % Ölsäure; 0,5
bis 8 % Vaccensäure,
0,1 bis 1 % Arachinsäure,
7 bis 25 % gesättigte
Fettsäuren,
8 bis 85 % einfach ungesättigte
Fettsäuren
und 60 bis 85 % mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
jeweils bezogen auf 100 % und auf den Gesamtfettsäuregehalt
der Organismen. Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte Fettsäure sind
in den Fettsäureestern bzw.
Fettsäuregemischen
bevorzugt mindestens 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9
oder 1 % bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Arachidonsäure, EPA
und/oder DHA enthalten. Weiterhin enthalten die Fettsäureester
bzw. Fettsäuregemische,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene
octadec-9-enonsäure),
Malvalinsäure
(8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure),
Chaulmoogrinsäure
(Cyclopenten-dodecansäure),
Furan-Fettsäure
(9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic
acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder
Coriolinsäure
(13-Hydroxy-9c,11t- Octadecadienonsäure). Die
vorgenannten Fettsäuren
kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Fettsäureestern
bzw. Fettsäuregemischen
in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen
bezogen auf die Gesamtfettsäuren
zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %,
22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10
%, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % oder 5 % und ganz besonders bevorzugt zu weniger
als 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Fettsäureester
bzw. Fettsäuregemische
weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren oder keine Buttersäure, kein
Cholesterin, keine Clupanodonsäure (=
Docosapentaensäure,
C22:5Δ4,8,12,15,21)
sowie keine Nisinsäure
(Tetracosahexaensäure,
C23:6Δ3,8,12,15,18,21).
-
Auch
chemisch reine, mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
oder Fettsäurezusammensetzungen
sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden
die Fettsäuren
oder die Fettsäurezusammensetzungen
aus dem Organismus wie den Mikroorganismen oder den Pflanzen oder
dem Kulturmedium, in dem oder auf dem die Organismen angezogen wurden,
oder aus dem Organismus und dem Kulturmedium in bekannter Weise,
beispielsweise über
Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder
Kombinationen dieser Methoden, isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder
Fettsäurezusammensetzungen
sind für Anwendungen
im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und
besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft.
-
Als
Organismus für
die Herstellung im erfindungsgemäßen Verfahren
kommen prinzipiell alle Organismen wie Mikroorganismen, nicht-humane
Tiere oder Pflanzen in Frage.
-
Als
Pflanzen kommen prinzipiell alle Pflanzen in Frage, die in der Lage
sind, Fettsäuren
zu synthetisieren, wie alle dikotylen oder monokotylen Pflanzen,
Algen oder Moose. Vorteilhafte Pflanzen sind ausgewählt aus
der Gruppe der Pflanzenklassen bzw. -familien Adelotheciaceae, Anacardiaceae,
Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae,
Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae,
Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae,
Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae,
Euglenacease oder Prasinophyceae. Auch Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen
wie Tagetes kommen in Betracht.
-
Beispielhaft
seien die folgenden Pflanzen genannt, ausgewählt aus der Gruppe:
Adelotheciaceae
wie die Gattungen Physcomitrella z.B. die Gattung und Arten Physcomitrella
patens, Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium
z.B. die Gattung und Arten Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica
[Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae wie die
Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus,
Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana z.B. die Gattung und Arten
Calendula officinalis [Garten-Ringelblume], Carthamus tinctorius
[Färberdistel,
safflower], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Wegwarte],
Cynara scolymus [Artichoke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca
sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp.
sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L.
var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis,
Valeriana locusta [Salat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes
tenuifolia [Studentenblume], Apiaceae wie die Gattung Daucus z.B.
die Gattung und Art Daucus carota [Karotte], Betulaceae wie die
Gattung Corylus z.B. die Gattungen und Arten Corylus avellana oder
Corylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae wie die Gattung Borago
z.B. die Gattung und Art Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae
wie die Gattungen Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis
z.B. die Gattungen und Arten Brassica napus, Brassica rapa ssp.
[Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea,
Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa,
Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis
[Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana,
Bromeliaceae wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas) z.B. die
Gattungen und Arten Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa
[Ananas], Caricaceae wie die Gattung Carica wie die Gattung und
Art Carica papaya [Papaya], Cannabaceae wie die Gattung Cannabis
wie die Gattung und Art Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae wie
die Gattungen Ipomea, Convolvulus z.B. die Gattungen und Arten Ipomoea
batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus,
Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus
[Süßkartoffel,
Batate], Chenopodiaceae wie die Gattung Beta wie die Gattungen und
Arten Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris
var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta
vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae
wie die Gattung Crypthecodinium z.B. die Gattung und Art Cryptecodinium
cohnii, Cucurbitaceae wie die Gattung Cucubita z.B. die Gattungen
und Arten Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder
Cucurbita moschata [Kürbis],
Cymbellaceae wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum,
Reimeria z.B. die Gattung und Art Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae
wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella,
Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium,
Saelania, Trichodon, Skottsbergia z.B. die Gattungen und Arten Ceratodon
antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon
purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon
purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius,
Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis,
Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum,
Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule,
Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare,
Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum
pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum
var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum
tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium
inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium
whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium
alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium
ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon
borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var.
oblongus, Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus z.B. die Gattung
und Art Olea europaea [Olive], Ericaceae wie die Gattung Kalmia
z.B. die Gattungen und Arten Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia,
Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus
chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euglenaceae wie
die Gattungen Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena,
Euglenopsis, Hyalaphacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas,
Trachelomonas z.B. die Gattung und Art Euglena gracilis; Euphorbiaceae wie
die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus z.B. die Gattungen
und Arten Manihot utilissima, Janipha manihot., Jatropha manihot.,
Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis,
Manihot esculenta [Manihot] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae
wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium,
Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja z.B.
die Gattungen und Arten Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile
[Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck,
Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia
berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans,
Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium
berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia
nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa
speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla,
Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa
[Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia
[Alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida,
Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae
wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella,
Physcomitrium z.B. die Gattungen und Arten Aphanorrhegma serratum,
Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii,
Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii,
Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus,
Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana,
Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria
calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana,
Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria
hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta,
Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis,
Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria
muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris,
Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae,
Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica,
Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe,
Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium
coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii,
Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium
hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum,
Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium
pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium
rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum,
Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium,
Cocos, Oleum z.B. die Gattungen und Arten Cocos nucifera, Pelargonium
grossularioides oder Oleum cocois [Kokusnuss], Gramineae wie die
Gattung Saccharum z.B. die Gattung und Art Saccharum officinarum,
Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia z.B. die Gattungen
und Arten Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana,
Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica,
Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans
major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss],
Lauraceae Wie die Gattungen Persea, Laurus z.B. die Gattungen und
Arten Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima
oder Persea persea [Avocado], Leguminosae wie die Gattung Arachis
z.B. die Gattung und Art Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae wie
die Gattungen Linum, Adenolinum z.B. die Gattungen und Arten Linum
usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum
angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum,
Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum
perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum
[Lein], Lythrarieae wie die Gattung Punica z.B. die Gattung und
Art Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae wie die Gattung Gossypium
z.B. die Gattungen und Arten Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum,
Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi
[Baumwolle], Marchantiaceae wie die Gattung Marchantia z.B. die
Gattungen und Arten Marchantia berteroana, Marchantia foliacea,
Marchantia macropora, Musaceae wie die Gattung Musa z.B. die Gattungen
und Arten Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp.
[Banane], Onagraceae wie die Gattungen Camissonia, Oenothera z.B.
die Gattungen und Arten Oenothera biennis oder Camissonia brevipes
[Nachtkerze], Palmae wie die Gattung Elacis z.B. die Gattung und
Art Elaeis guineensis [Ölpalme],
Papaveraceae wie die Gattung Papaver z.B. die Gattungen und Arten Papaver
orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae wie
die Gattung Sesamum z.B. die Gattung und Art Sesamum indicum [Sesam],
Piperaceae wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia
z.B. die Gattungen und Arten Piper aduncum, Piper amalago, Piper
angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum,
Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata,
Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayennepfeffer],
Poaceae wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon,
Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum z.B. die Gattungen und
Arten Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum
secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon.,
Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum
secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena
fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer],
Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum
vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum,
Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum
cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum
guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum,
Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare,
Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse],
Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais] Triticum aestivum,
Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha,
Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae
wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium,
Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia z.B. die Gattung und Art Porphyridium
cruentum, Proteaceae wie die Gattung Macadamia z.B. die Gattung
und Art Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae wie
die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis,
Mantoniella, Ostreococcus z.B. die Gattungen und Arten Nephroselmis olivacea,
Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis
suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae wie
die Gattung Coffea z.B. die Gattungen und Arten Cofea spp., Coffea
arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae
wie die Gattung Verbascum z.B. die Gattungen und Arten Verbascum
blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus,
Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum
olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum
pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Solanaceae wie
die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon z.B. die
Gattungen und Arten Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum,
Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana
tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca,
Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis,
Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak],
Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] Lycopersicon
esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme,
Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae wie
die Gattung Theobroma z.B. die Gattung und Art Theobroma cacao [Kakao]
oder Theaceae wie die Gattung Camellia z.B. die Gattung und Art
Camellia sinensis [Tee].
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Vorteilhafte
Mikroorganismen sind beispielweise Pilze, ausgewählt aus der Gruppe der Familien
Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae,
Dematiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae,
Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sordariaceae
oder Tuberculariaceae.
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Beispielhaft
seien die folgenden Mikroorganismen genannt, ausgewählt aus
der Gruppe: Choanephoraceae wie den Gattungen Blakeslea, Choanephora
z.B. die Gattungen und Arten Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum,
Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae wie
der Gattung Mortierella z.B. die Gattungen und Arten Mortierella
isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella
vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae wie den Gattungen Phytium,
Phytophthora z.B. die Gattungen und Arten Pythium debaryanum, Pythium
intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum,
Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora
cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora
cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica,
Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae,
Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora,
Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae
wie den Gattungen Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes,
Yarrowia z.B. die Gattungen und Arten Hansenula anomala, Hansenula
californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula
ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii,
Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri,
Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa,
Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia
angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia
canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa,
Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica,
Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia
henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia
membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta,
Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri,
Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha,
Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia
stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana,
Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti,
Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus,
Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces
chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus,
Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces
ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus,
Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces
hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus,
Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis,
Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces
montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces
paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis,
Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum,
Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae
wie die Gattungen Schizosaccharomyces wie z.B. die Arten Schizosaccharomyces
japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis,
Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus,
Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces
pombe var. pombe, Thraustochytriaceae wie die Gattungen Althornia,
Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium
wie z.B. die Arten Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum,
Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium
octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum,
Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium
aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum,
Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium
kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale,
Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium
roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum oder
Thraustochytrium visurgense.
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Weitere
vorteilhafte Mikroorganismen sind beispielweise Bakterien, ausgewählt aus
der Gruppe der Familien Bacillaceae, Enterobacteriacae oder Rhizobiaceae.
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Beispielhaft
seien die folgenden Mikroorganismen genannt ausgewählt aus
der Gruppe: Bacillaceae wie die Gattung Bacillus z.B die Gattungen
und Arten Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis,
Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus
sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus
globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus Zentimorbus,
Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus
polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus,
Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis
oder Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae wie die Gattungen
Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella
oder Serratia z.B die Gattungen und Arten Citrobacter amalonaticus,
Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies,
Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter
murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella
ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia
ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida,
Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp.
atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora
subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi,
Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia
mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis,
Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina,
Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia
stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata,
Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae,
Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile,
Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp.,
Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii
subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca,
Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae
subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella
trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori,
Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis
subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella
choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae,
Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp.
salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae,
Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella
gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella
senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia
ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia
marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra,
Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica,
Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia
quinivorans oder Serratia rubidaea; Rhizobiaceae wie die Gattungen
Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium
z.B. die Gattungen und Arten Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium
ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei,
Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium
rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium
tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter
heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer
kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti,
Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium
ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium
gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii,
Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum,
Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium
lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense,
Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes,
Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium
trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis,
Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii,
Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium
medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium
saheli oder Sinorhizobium xinjiangense.
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Weitere
vorteilhafte Mikroorganismen für
das erfindungsgemäße Verfahren
sind beispielweise Protisten oder Diatomeen ausgewählt aus
der Gruppe der Familien Dinophyceae, Turaniellidae oder Oxytrichidae wie
die Gattungen und Arten: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum,
Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina,
Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum oder
Colpidium sp.
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Vorteilhaft
werden im erfindungsgemäßen Verfahren
transgene Organismen wie Pilze wie Mortierella oder Thraustochytrium,
Hefen wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, Moose wie Physcomitrella oder
Ceratodon, nicht-humane Tiere wie Caenorhabditis, Algen wie Nephroselmis,
Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella,
Ostreococcus, Crypthecodinium oder Phaeodactylum oder Pflanzen wie
zweikeimblättrige
oder einkeimblättrige
Pflanzen verwendet. Besonders vorteilhaft werden Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet, die zu den Öl-produzierenden
Organismen gehören,
das heißt
die für
die Herstellung von Ölen
verwendet werden, wie Pilze wie Mortierella oder Thraustochytrium,
Algen wie Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia,
Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum
oder Pflanzen, insbesondere Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen, die große Mengen
an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume,
Saflor (Carthamus tinctoria), Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive,
Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen,
Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein,
Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme,
Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen,
Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes,
Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten,
Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten sowie ausdauernde
Gräser und
Futterfeldfrüchte.
Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen
sind Ölfruchtpflanzen,
wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf,
Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja,
Borretsch, Bäume
(Ölpalme,
Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind C18:2- und/oder C18:3-Fettsäurereiche
Pflanzen wie Sonnenblume, Färberdistel,
Tabak, Königskerze,
Sesam, Baumwolle, Kürbis,
Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel.
Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn,
Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
-
Für das erfindungsgemäße beschriebene
Verfahren ist es vorteilhaft, in den Organismus zusätzlich zu den
unter Verfahrensschritt (a) bis (c) eingebrachten Nukleinsäuren weitere
Nukleinsäuren
einzubringen, die für
Enzyme des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechsels kodieren.
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Im
Prinzip können
alle Gene des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit der (den)
erfinderischen Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase und/oder
Dehydratase(n) [im Sinne dieser Anmeldung soll der Plural den Singular
und umgekehrt beinhalten] im Verfahren zur Herstellung mehrfach
ungesättigter
Fettsäuren
verwendet werden. Vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder
Lipidstoffwechsels ausgewählt
aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier
protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n),
Fettsäure-Acyl-Transferase(n),
Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n),
Fettsäure-Hydroxylase(n),
Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n),
Fettsäure-Acetylenase(n),
Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n)
oder Fettsäure-Elongase(n)
in Kombination mit der Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase
und/oder Dehydratase verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene
ausgewählt
aus der Gruppe der ω-3-Desaturasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Elongasen
oder Δ-9-Elongasen
in Kombination mit den vorgenannten Genen für die PhospholipaseA2, Ketoacyl-CoA-Reduktase
und/oder Dehydratase verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere
Gene in Kombination verwendet werden können.
-
Durch
die enzymatische Aktivität
der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuren, die
für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Aktivität kodieren,
vorteilhaft in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide
bzw. Proteine des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechsels wie weiteren Polypeptiden bzw. Proteinen
mit ω-3-, Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-, Δ-8-, Δ-12-Desaturase-
oder Δ-5-, Δ-6-oder Δ-9-Elongase-Aktivität kodieren,
können
unterschiedlichste mehrfach ungesättigte Fettsäuren im
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren
verwendeten Organismen wie den vorteilhaften Pflanze lassen sich
Mischungen der verschiedenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder
einzelne mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
wie EPA oder ARA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem
welche Fettsäurezusammensetzung
in der Ausgangspflanze vorherrscht (C18:2- oder C18:3-Fettsäuren) entstehen
so Fettsäuren,
die sich von C18:2-Fettsäuren
ableiten, wie GLA, DGLA oder ARA, oder die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten,
wie SDA, ETA oder EPA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten
Pflanze als ungesättigte
Fettsäure
nur Linolsäure (=
LA, C18:2Δ9,12)
vor, so können
als Produkte des Verfahrens nur GLA, DGLA und ARA entstehen, die
als freie Fettsäuren
oder gebunden vorliegen können.
Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur α-Linolensäure (=ALA,
C18:3Δ9,12,15)
beispielsweise wie in Lein, so können
als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA, EPA und/oder DHA entstehen,
die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen
können.
Durch Modifikation der Aktivität
der an der Synthese beteiligten Enzyme wie der Phospholipase A2-,
Ketoacyl-CoA-Reduktase- und/oder Dehydratase vorteilhaft in Kombination
mit der ω-3-, Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-, Δ-12-Desaturase
und/oder Δ-6-, Δ-5-Elongase, oder der Δ-4-, Δ-5-, Δ-8-, Δ-12-Desaturase, und/oder Δ-9-, Δ-5-Elongase
lassen sich gezielt in den vorgenannten Organismen, vorteilhaft
in den vorgenannten Pflanzen, nur einzelne Produkte herstellten.
Durch die Aktivität
der Δ-6-Desaturase
und Δ-6-Elongase entstehen
beispielsweise GLA und DGLA bzw. SDA und ETA, je nach Ausgangspflanze
und ungesättigter
Fettsäure.
Bevorzugt entstehen DGLA bzw. ETA oder deren Mischungen. Werden
die Δ-5-Desaturase,
die Δ-5-Elongase
und die Δ-4-Desaturase
zusätzlich
in die Organismen, vorteilhaft in die Pflanze, eingebracht, so entstehen
zusätzlich
ARA, EPA und/oder DHA. Dies gilt auch für Organismen, in die vorher
die Δ-8-Desaturase und Δ-9-Elongase
eingebracht wurde. Vorteilhaft werden nur ARA, EPA oder DHA oder
deren Mischungen synthetisiert, abhängig von der in im Organismus
bzw. in der Pflanze vorliegenden Fettsäure, die als Ausgangssubstanz
für die
Synthese dient. Da es sich um Biosyntheseketten handelt, liegen
die jeweiligen Endprodukte nicht als Reinsubstanzen in den Organismen
vor. Es sind immer auch geringe Mengen der Vorläuferverbindungen im Endprodukt
enthalten. Diese geringen Mengen betragen weniger als 20 Gew.-%,
vorteilhaft weniger als 15 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger
als 10 Gew.-%, ganz besonders vorteilhaft weniger als 5, 4, 3, 2
oder 1 Gew.-% bezogen auf das Endprodukt DGLA, ETA oder deren Mischungen,
bzw. ARA, EPA, DHA oder deren Mischungen, vorteilhaft EPA oder DHA
oder deren Mischungen.
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Neben
der Produktion der Ausgangsfettsäuren
für die
erfindungsgemäßen Phospholipasen
A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen oder Dehydratasen direkt im Organismus
können
die Fettsäuren
auch von außen
gefüttert
werden. Aus Kostengründen
ist die Produktion im Organismus bevorzugt. Bevorzugte Substrate
der Phospholipase A2 sind Phospholipide, spezifischer Phosphatidylcholine
und Phosphatidylethanolamine, am besten Phosphatidylcholine mit
den Fettsäuren γ-Linolensäure (C18:3Δ6,9,12 Stearidonsäure (C18:4Δ6,9,12,15)
und Eicosapentaensäure
(C20:5Δ5,8,11,14,17)
an der sn-2-Position. Bevorzugte Substrate der Ketoacyl-CoA-Reduktase
oder Dehydratase sind die CoA-Ester der γ-Linolensäure (C18:3Δ6,9,12)
Stearidonsäure
(C18:4Δ6,9,12,15),
Arachidonsäure
(C20:4Δ5,8,11,14)
und Eicosapentaensäure
(C20:5Δ5,8,11,14,17).
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Zur
Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung
von Ölen
und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
ist es vorteilhaft, die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese
zu steigern. Dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer
Nukleinsäure
in den Organismus, die für
ein Polypeptid bzw. Protein mit Δ-12-Desaturase
kodiert, erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden
Organismen wie der Familie der Brassicaceae wie der Gattung Brassica
z.B. Raps; der Familie der Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus
z.B. die Gattung und Art Olea europaea oder der Familie Fabaceae
wie der Gattung Glycine z.B. die Gattung und Art Glycine max, die
einen hohen Ölsäuregehalt
aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen
(Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society,
38, 1961, 678 – 681),
ist die Verwendung der genannten Δ-12-Desaturasen
zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure vorteilhaft.
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Vorteilhaft
werden im erfindungsgemäßen Verfahren
die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen
oder deren Derivate oder Homologe verwendet, die für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder
Dehydratase-Aktivität
kodieren, die noch die enzymatische Aktivität der durch die Nukleinsäuresequenzen
kodierten Proteine besitzen. Diese Sequenzen werden einzeln oder
in Kombination mit den für
die Δ-12-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-8-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase, Δ-9-Elongase
und/oder ω-3-Desaturase
kodierenden Nukleinsäuresquenzen
in Expressionskonstrukte cloniert und zum Einbringen und zur Expression
in Organismen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen
durch ihre Konstruktion eine vorteilhafte optimale Synthese der
im erfindungsgemäßen Verfahren
produzierten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle
oder eines ganzen Organismus, der die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen
enthält, wobei
die Zelle und/oder der Organismus mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz,
die für
die Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase und/oder Dehydratase kodiert,
einem Genkonstrukt oder einem Vektor wie nachfolgend beschrieben,
allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine
des Fettsäure-
oder Lipidsstoffwechsels kodieren, transformiert wird. Bei einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide
oder freien Fettsäuren
aus dem Organismus oder aus der Kultur.
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Bei
der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Fermentationskultur,
beispielsweise im Falle der Kultivierung von Mikroorganismen wie
z.B. Mortierella, Thalassiosira, Mantoniella, Ostreococcus, Saccharomyces
oder Thraustochytrium, oder um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer
Pflanze handeln. Die so hergestellte Zelle oder der so hergestellte
Organismus ist vorteilhaft eine Zelle eines Öl-produzierenden Organismus wie
einer Ölfruchtpflanze
wie beispielsweise Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Erdnuss, Soja,
Safflower, Hanf, Sonnenblumen oder Borretsch.
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Unter
Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen,
-geweben oder -organen auf oder in einem Nährmedium oder die Kultivierung
der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat, beispielsweise in
Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
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"Transgen" bzw. "Rekombinant" im Sinne der Erfindung
bedeutet bezüglich
beispielsweise einer Nukleinsäuresequenz,
einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend
die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
oder einem Organismus transformiert mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz,
der Expressionskassette oder dem Vektor alle solche durch gentechnische
Methoden zustandegekommenen Konstruktionen, in denen entweder
- a) die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder
- b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
funktionell verknüpfte
genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
- c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen,
genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden
modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution,
Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer
Nukleotidreste sein kann.
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„Natürliche genetische
Umgebung" meint
den natürlichen
genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus
oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer
genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung
der Nukleinsäuresequenz
bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert
die Nukleinsäuresequenz
zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt
mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp und ganz
besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – beispielsweise
die natürlich
vorkommende Kombination des natürlichen
Promotors der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
mit den entsprechenden Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratasegenen – wird
zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche,
synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise
eine Mutagenisierung geändert
wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in
US 5,565,350 oder WO 00/15815.
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Unter „transgenem
Organismus" bzw. „transgener
Pflanze" im Sinne
der Erfindung ist wie vorgenannt zu verstehen, dass die im Verfahren
verwendeten Nukleinsäuren
nicht an ihrer natürlichen
Stelle im Genom eines Organismus sind. Dabei können die Nukleinsäuren homolog
oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch wie
genannt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an
ihrem natürlichen
Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der
natürlichen
Sequenz verändert
wurde und/oder dass die Regulationssequenzen gegenüber den
natürlichen
Sequenzen verändert
wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an
nicht natürlicher
Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt
heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte
transgene Organismen sind Pilze wie Mortierella oder Phytophtora,
Moose wie Physcomitrella, Algen wie Mantoniella, Euglena oder Ostreococcus,
Diatomeen wie Thalassiosira oder Crypthecodinium oder Pflanzen wie
die Ölfruchtpflanzen.
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Als
Organismen bzw. Wirtsorganismen für die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuren,
Expressionskassetten oder Vektoren eignen sich prinzipiell vorteilhaft
alle Organismen, die in der Lage sind, Fettsäuren, speziell ungesättigte Fettsäuren, zu
synthetisieren, bzw. die für
die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien
Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen
wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs,
Raps, Kokosnuss, Ölpalme, FärberSaflor
(Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze
beispielsweise die Gattung Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia,
Phytophtora oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia oder
Shewanella, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien,
Ciliaten, Algen wie Mantoniella, Euglena oder Ostreococcus oder
Protozoen wie Dinoflagellaten wie Thalassiosira oder Crypthecodinium
genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen
synthetisieren können wie
Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum, Phytophtora infestans
oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, FärberSaflor, Flachs, Hanf, Rizinus,
Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume, oder Hefen wie
Saccharomyces cerevisiae. Besonders bevorzugt werden Soja, Flachs,
Raps, FärberSaflor, Sonnenblume,
Calendula, Mortierella oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell
sind als Wirtsorganismen neben den vorgenannten transgenen Organismen
auch transgene Tiere, vorteilhaft nicht-humane Tiere geeignet, beispielsweise
C. elegans, Ciona intestinalis oder Xenopus laevis.
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Nutzbare
Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1990).
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Verwendbare
Expressionsstämme
wie z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen, sind
beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)
119-128.
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Zu
den Pflanzenwirten gehören
vorteilhaft auch Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile
von Pflanzen in all ihren Erscheinungsformen, wie Antheren, Fasern,
Wurzelhaare, Stängel,
Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches
Gewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, dies von der eigentlichen
transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder dazu verwendet werden
können,
die transgene Pflanze hervorzubringen.
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Transgene
Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten
mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten,
können
vorteilhaft direkt vermarktet werden, ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder
Fettsäuren
isoliert werden müssen.
Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren
sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenorgane oder Pflanzenteile
wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare,
Stängel,
Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches
Gewebe, reproduktives Gewebe oder Zellkulturen gemeint, die sich
von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden
können,
die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle
Samenteile wie die Samenhüllen,
Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Verbindungen können
aber auch aus den Organismen, vorteilhaft Pflanzen, in Form ihrer Öle, Fette,
Lipide und/oder freien Fettsäuren
isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur,
in der sie wachsen, oder vom Feld gewinnen. Dies kann über Pressen
oder Extraktion der Pflanzenteile, bevorzugt der Pflanzensamen,
erfolgen. Dabei können
die Öle,
Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes Kaltschlagen
oder Kaltpressen ohne Zuführung
von Wärme
durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile, speziell
die Samen, leichter aufschließen
lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die
so vorbehandelten Samen können
anschließend
gepresst werden oder mit Lösungsmittel
wie warmem Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel
wieder entfernt. Im Falle von Mikroorganismen werden diese nach
der Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert
oder aber nach Aufschluss über
verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese
Weise können
mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert
werden. Anschließend
werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert.
Dabei werden zunächst
beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte
Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch
durch Zugabe von Säure
wie Phosphorsäure
erfolgen. Anschließend
werden die freien Fettsäuren durch
Behandlung mit einer Base, beispielsweise Natronlauge, entfernt.
Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen
Lauge mit Wasser gründlich
gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe
zu entfernen, werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise
Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt
beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.
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Vorzugsweise
sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs bzw. LCPUFAs
C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle, vorteilhaft
C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens
zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise
drei, vier, fünf
oder sechs Doppelbindungen. Diese C18-,
C20- oder C22-Fettsäuremoleküle lassen
sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien
Fettsäure
isolieren. Geeignete Organismen sind beispielsweise die vorstehend
erwähnten.
Bevorzugte Organismen sind transgene Pflanzen.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung sind deshalb Öle,
Lipide, Fettsäuren
oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren
hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öl, Lipid oder eine Fettsäurezusammensetzung,
die PUFAs umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren.
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Diese Öle, Lipide
oder Fettsäuren
enthalten wie oben beschrieben vorteilhaft 6 bis 15 % Palmitinsäure, 1 bis
6 % Stearinsäure;
7 bis 85 % Ölsäure; 0,5
bis 8 % Vaccensäure,
0,1 bis 1 % Arachinsäure,
7 bis 25 % gesättigte
Fettsäuren,
8 bis 85 % einfach ungesättigte Fettsäuren und
60 bis 85 % mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
jeweils bezogen auf 100 % und auf den Gesamtfettsäuregehalt
der Organismen. Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte Fettsäure sind
in den Fettsäureestern
bzw. Fettsäuregemischen
bevorzugt mindestens 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9
oder 1 % bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Arachidonsäure, EPA und/oder
DHA enthalten. Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene
octadec-9-enonsäure),
Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten-dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic
acid), 6,9-Octadecenynonsäure,
Pyrulinsäure
(t10-Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure),Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder
Coriolinsäure
(13-Hydroxy-9c,11t-Octadecadienonsäure). Die vorgenannten Fettsäuren kommen
in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Fettsäureestern bzw.
Fettsäuregemischen
in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen
bezogen auf die Gesamtfettsäuren
zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %,
22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10
%, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % oder 5 %, ganz besonders bevorzugt zu weniger
als 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Fettsäureester
bzw. Fettsäuregemische
weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren oder keine Butterbuttersäure, kein
Cholesterin, keine Clupanodonsäure
(= Docosapentaensäure, C22:5Δ4,8,12,15,21)
sowie keine Nisinsäure
(Tetracosahexaensäure,
C23:6Δ3,8,12,15,18,21).
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Vorteilhaft
enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Öle,
Lipide oder Fettsäuren mindestens
0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % oder 5 %, vorteilhaft mindestens 6 %,
7 %, 8 %, 9 % oder 10 %, besonders vorteilhaft mindestens 11 %,
12 %, 13 %, 14 % oder 15 % ARA oder mindestens 0,5 %, 1 %, 2 %,
3 %, 4 % oder 5 %, vorteilhaft mindestens 6 %, oder 7 %, besonders
vorteilhaft mindestens 8 %, 9 % oder 10 % EPA und/oder DHA bezogen
auf den Gesamtfettsäuregehalt
des Produktionsorganismus, vorteilhaft einer Pflanze, besonders
vorteilhaft einer Ölfruchtpflanze
wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme,
Färbersafflor,
Flachs, Hanf, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne, Sonnenblume
oder den oben genannten weiteren ein- oder zweikeimblättrigen Ölfruchtpflanzen.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
ist die Verwendung dieser Öle,
Lipide, Fettsäuren und/oder
Fettsäurezusammensetzungen
in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die
erfindungsgemäßen Öle, Lipide,
Fettsäuren
oder Fettsäuregemische
können
in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden,
Fettsäuren
oder Fettsäuregemischen
tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Auch
diese Öle,
Lipide, Fettsäuren
oder Fettsäuregemische, die
aus pflanzlichen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur
Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika
verwendet werden.
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Unter
dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch
verstanden, das ungesättigte,
gesättigte,
vorzugsweise veresterte Fettsäure(n)
enthält.
Bevorzugt ist, dass das Öl,
Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten
freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder
Docosahexaensäure
hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %,
mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist
ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 % oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B.
der Anteil an Fettsäure
nach Überführung der
Fettsäuren
in die Methylester durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt
werden. Das Öl,
Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B.
Calendulasäure,
Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc. enthalten. Insbesondere
kann je nach Ausgangsorganismus der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in
dem Öl
oder Fett schwanken.
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Bei
den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit
vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen handelt es sich wie
oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide,
Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin
oder sonstige Fettsäureester.
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Aus
den so im erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
mit vorteilhaft mindestens fünf
oder sechs Doppelbindungen lassen sich die enthaltenden mehrfach
ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine
Alkalibehandlung, beispielsweise wäßrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse,
vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol
oder über
eine enzymatische Abspaltung freisetzen und beispielsweise über Phasentrennung
und anschließender
Ansäuerung über z.B. H2SO4 isolieren. Die
Freisetzung der Fettsäuren
kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung
erfolgen.
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Die
im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in einem
Organismus, vorteilhaft einer Pflanzenzelle bzw. Pflanze, entweder
auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom
der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann
die Integration zufallsgemäß sein oder durch
derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die
eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten
Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung
eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit,
welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende
Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten
Gens gewährleistende
Sequenz enthält,
funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten
oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Organismen, vorteilhaft
zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genen in die
Pflanzen, gebracht.
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Als
Substrate der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Nukleinsäuren,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
und/oder Dehydratase-Aktivität
kodieren, und/oder den weiteren verwendeten Nukleinsäuren wie
den Nukleinsäuren,
die für
Polypeptide bzw. Proteine des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels
ausgewählt
aus der Gruppe Δ-12-Desaturase(n), Δ-9-Elongase(n), Δ-8-Desaturase(n), Δ-6-Desaturase(n), Δ-6-Elongase(n), Δ-5-Desaturase(n), Δ-5-Elongase(n), ω-3-Desaturase(n), Δ-4-Desaturas(n), Acyl-CoA-Dehydrogenase(n),
Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n),
Fettsäure-Acyl-Transferase(n),
Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n),
Fettsäure-Hydroxylase(n),
Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n),
Fettsäure-Acetylenase(n),
Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n)
oder Fettsäure-Elongase(n)
kodieren, eignen sich vorteilhaft C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren.
Bevorzugt werden die im Verfahren als Substrate umgesetzten Fettsäuren in Form
ihrer Acyl-CoA-Ester und/oder ihrer Phospholipid-Ester umgesetzt.
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Zur
Herstellung der erfindungsgemäßen langkettigen
PUFAs müssen
die mehrfach ungesättigten C18-Fettsäuren
zunächst
durch die enzymatische Aktivität
einer Desaturase desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens
zwei Kohlenstoffatome verlängert
werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C20-Fettsäuren, und
nach zwei Elongationsrunden zu C22-Fettsäuren. Die
Aktivität
der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu C18-, C20- und/oder
C22-Fettsäuren, vorteilhaft mit mindestens
zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise
mit drei, vier, fünf
oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu C20-
und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen
im Fettsäuremolekül, vorzugsweise
mit drei oder vier Doppelbindungen, ganz besonders bevorzugt mit
fünf oder
sechs Doppelbindungen im Molekül.
Nachdem eine erste Desaturierung und die Verlängerung stattgefunden hat,
können
weitere Desaturierungs- und Elongierungsschritte wie z.B. eine solche
Desaturierung in Δ-5-
und Δ-4-Position
erfolgen. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapetaensäure und/oder
Docosahesaensäure.
Die C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen
in der Fettsäure
können
durch enzymatische Aktivitäten
in Form der freien Fettsäure
oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide,
Phosphoglyceride, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oder Triacylglycerin, verlängert werden.
-
Der
bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen, Lipiden oder Fetten in
den vorteilhaft verwendeten Pflanzen ist beispielsweise im allgemeinen
der Samen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische
Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Es ist jedoch
naheliegend, dass die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf
das Samengewebe beschränkt
sein muss, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze – beispielsweise
in Epidermiszellen oder in den Knollen – gewebespezifisch erfolgen
kann.
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Werden
im erfindungsgemäßen Verfahren
als Organismen Mikroorganismen wie Hefen wie Saccharomyces oder
Schizosaccharomyces, Pilze wie Mortierella, Aspergillus, Phytophtora,
Entomophthora, Mucor oder Thraustochytrium oder Algen wie Isochrysis,
Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum oder Crypthecodinium
verwendet, so werden diese Organismen vorteilhaft fermentativ angezogen.
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Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
können
die hergestellten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren in
den im Verfahren verwendeten Organismen prinzipiell auf zwei Arten
erhöht
werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
und/oder der Anteil der über
das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
erhöht
werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten
mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
in den transgenen Organismen erhöht.
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Werden
im erfindungsgemäßen Verfahren
als Organismen Mikroorganismen verwendet, so werden sie je nach
Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden
in der Regel in einem flüssigen
Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle
meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt
oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-,
Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen
0°C und
100°C, bevorzugt
zwischen 10°C
und 60°C
unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit
auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert
werden, oder nicht. Die Anzucht kann batchweise, semi batchweise
oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe
können
zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder
kontinuierlich nachgefüttert
werden. Die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren können nach
dem Fachmann bekannten Verfahren wie oben beschrieben aus den Organismen
isoliert werden, beispielsweise über
Extraktion, Destillation, Kristallisation, ggf. Salzfällung und/oder
Chromatographie. Die Organismen können dazu vorher noch vorteilhaft
aufgeschlossen werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird, wenn es sich bei den Wirtsorganismen um Mikroorganismen handelt,
vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C und 95°, bevorzugt zwischen 10°C und 85°C, besonders
bevorzugt zwischen 15°C
und 75°C
und ganz besonders bevorzugt zwischen 15°C und 45°C durchgeführt.
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Der
pH-Wert wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen
pH 6 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 7 und 8 gehalten.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann batchweise, semi batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch
von Chmiel (Bioprozeßtechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
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Das
zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme zu
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods für
General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Medien umfassen wie oben beschrieben gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
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Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide.
Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose,
Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose,
Saccharose, Raffinose, Stärke
oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen wie
Melassen oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den
Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener
Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette
wie z.B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und/oder Kokosfett, Fettsäuren
wie z.B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und/oder Linolsäure,
Alkohole und/oder Polyalkohole wie z. B. Glycerin, Methanol und/oder
Ethanol und/oder organische Säuren
wie z.B. Essigsäure
und/oder Milchsäure.
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Stickstoffquellen
sind gewöhnlich
organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien,
die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen
umfassen Ammoniak in flüssiger
Form oder Gasform oder Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren
oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein,
Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln
oder als Mischung verwendet werden.
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Anorganische
Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen
die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium,
Natrium, Kobalt, Molybdän,
Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
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Als
Schwefelquelle für
die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere
von Methionin, können
anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate,
Sulfate, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide, aber auch
organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet
werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.
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Chelatbildner
können
zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu
halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole
wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren wie
Citronensäure.
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Die
erfindungsgemäß zur Kultivierung
von Mikroorganismen eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise
auch andere Wachstumsfaktoren wie Vitamine oder Wachstumsförderer,
zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat
und Pyridoxin gehören.
Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten
wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem
Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung
der Medienverbindungen hängt
stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell
entschieden. Information über
die Medienoptimierung ist erhältlich aus
dem Lehrbuch "Applied
Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL
Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen
sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck)
oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
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Sämtliche
Medienkomponenten werden entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar
und 121°C)
oder durch Sterilfiltration sterilisiert. Die Komponenten können entweder
zusammen oder nötigenfalls
getrennt sterilisiert werden. Sämtliche
Medienkomponenten können
zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich
oder chargenweise hinzugegeben werden.
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Die
Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C,
und kann während
des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des
Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen.
Der pH-Wert für
die Anzucht lässt
sich während
der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen
wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel
wie z. B. Fettsäurepolyglykolester,
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika,
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z.B. Umgebungsluft, in
die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C
bis 45°C
und vorzugsweise bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
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Die
so erhaltenen, insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthaltenden
Fermentationsbrühen
haben üblicherweise
eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
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Die
Fermentationsbrühe
kann anschließend
weiter verarbeitet werden. Je nach Anforderung kann die Biomasse
ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z. B. Zentrifugation,
Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus
der Fermentationsbrühe
entfernt oder vollständig
in ihr belassen werden. Vorteilhaft wird die Biomasse nach Abtrennung
aufgearbeitet.
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Die
Fermentationsbrühe
kann aber auch ohne Zellabtrennung mit bekannten Methoden wie z.
B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers,
durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration eingedickt beziehungsweise
aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann
schließlich
zur Gewinnung der darin enthaltenen Fettsäuren aufgearbeitet werden.
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Die
im Verfahren gewonnenen Fettsäuren
eignen sich auch als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von
weiteren Wertprodukten. Sie können
beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung
von Pharmaka, Nahrungsmitteln, Tierfutter oder Kosmetika verwendet
werden.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand
sind isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
und/oder Dehydratasaktivität
kodieren.
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Ein
Erfindungsgegenstand sind isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-Aktivität kodieren, ausgewählt aus
der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen,
oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 2 haben und eine Phospholipase A2-Aktivität aufweisen.
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Ein
weiterer Erfindungsgegenstand sind isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Ketoacyl-CoA-Reduktase-Aktivität kodieren,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen,
oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 4 haben und eine Ketoacyl-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen.
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Ein
weiterer Erfindungsgegenstand sind isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Dehydratase-Aktivität kodieren,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen
ableiten lassen, oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten
Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 haben und eine Dehydratase-Aktivität aufweisen.
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Ein
weiterer Erfindungsgegenstand sind Genkonstrukte, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 enthalten,
wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit
einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist. Zusätzlich können weitere
Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels
ausgewählt
aus der Gruppe Δ-4-Desaturase(n), Δ-5-Desaturase(n), Δ-6-Desaturase(n), Δ-8-Desatuase(n), Δ-12-Desaturase(n), Δ-6-Elongase(n), Δ-5-Elongase(n), Δ-9-Elongase(n), ω-3-Desaturase(n),
Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n),
Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n),
Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n),
Fettsäure-Synthase(n),
Fettsäure-Hydroxylase(n),
Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n),
Fettsäure-Acetylenase(n),
Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n)
oder Fettsäure-Elongase(n)
im Genkonstrukt enthalten sein. Vorteilhaft sind zusätzlich Biosynthesegene
des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechsels ausgewählt
aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-8-Desatuase, Δ-9-Desaturase, Δ-12-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Elongase, Δ-9-Elongase
oder ω-3-Desaturase
enthalten.
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Moose
und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche
Mengen an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
wie Arachidonsäure
(ARA) und/oder Eicosapentaensäure
(EPA) und/oder Docosahexaensäure
(DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden, während Algen,
algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen
an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen
sich Nukleinsäuremoleküle, die
aus solchen Stämmen
isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren,
besonders vorteilhaft für
das erfindungsgemäße Verfahren
und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems
in einem Wirt.
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Die
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Nukleinsäuren
stammen daher vorteilhaft aus Pflanzen wie Algen, beispielsweise
Algen der Klasse der Prasinophyceae, wie aus den Gattungen Heteromastix,
Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus,
Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia
oder Tetraselmis wie den Gattungen und Arten Heteromastix longifillis,
Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis
olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus
tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus,
Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata,
Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae,
Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis
carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis
desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis
impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis
maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis,
Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele,
Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens oder Tetraselmis
sp. oder aus Algen der Familie Pythiaceae oder der Familie Euglenaceae
wie aus den Gattungen Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis,
Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus,
Strombomonas oder Trachelomonas wie die Gattungen und Art Euglena
acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea,
Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas
cylindrica oder Trachelomonas volvocina. Vorteilhaft stammen die
verwendeten Nukleinsäuren aus
Algen der Gattungen Euglena, Mantonielle oder Ostreococcus.
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Weitere
vorteilhafte Pflanzen sind Algen wie Isochrysis oder Crypthecodinium,
Diatomeen wie Thalassiosira, Crypthecodinium oder Phaeodactylum,
Moose wie Physcomitrella oder Ceratodon sowie höhere Pflanzen wie Muscarioides,
Borago, Primulaceae wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum
spinescens oder Osteospermum hyoseroides. Außerdem vorteilhaft sind Mikroorganismen
wie Pilze wie Phycomycota wie Thraustochytrium, Aspergillus, Phytophtora,
Entomophthora, Mucor, Fusarium, Phytophthora oder Mortierella, Hefen
wie Saccharomyces sowie Bakterien wie Shewanella.
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Auch
vorteilhaft sind Einzeller, Ciliaten, Dinoflagellaten sowie nicht-humane
Tiere wie Nematoden wie Caenorhabditis, Ciona, Xenopus, Insekten,
Seegurken oder Fische, bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes
wie der Familie der Salmonidae wie der Gattung Salmo, beispielsweise
aus den Gattungen und Arten Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder
Salmo trutta fario.. Vorteilhaft stammen die erfindungsgemäßen isolierten
Nukleinsäuresequenzen
aus einem Tier aus der Ordnung der Vertebraten. Bevorzugt stammen
die Nukleinsäuresequenzen
aus der Klasse der Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii;
Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae
bzw. Oncorhynchus oder Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus
oder Evertebrata wie Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae
wie Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis,
Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis oder Styela
partita.
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Die
im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine
mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Aktivität kodieren,
werden vorteilhaft allein oder bevorzugt in Kombination miteinander
oder mit anderen Nukleinsäuresequenzen,
die für
Proteine mit ω-3-Desaturase-, Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-9-Elongase-Aktivität kodieren,
in einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), die die Expression
der Nukleinsäuren
in einem Organismus, vorteilhaft einer Pflanze oder einem Mikroorganismus
ermöglicht,
eingebracht. Es kann im Nukleinsäurekonstrukt
mehr als eine Nukleinsäuresequenz
einer enzymatischen Aktivität
wie z.B. einer Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase, Dehydratase, Δ-12-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase
und/oder ω-3-Desaturase enthalten
sein.
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Zum
Einbringen werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft
einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen.
Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu-DNA-Polymerase
oder eines Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches
vor. Die Primer werden in Anlehnung an die zu amplifizierende Sequenz
gewählt.
Zweckmäßigerweise
sollten die Primer so gewählt
werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start-
bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird
das Amplifikat zweckmäßigerweise
analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer
Auftrennung hinsichtlich Qualität
und Quantität
erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll
gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats
steht dann für
die nachfolgende Klonierung zur Verfügung. Geeignete Klonierungsvektoren
sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren,
die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren,
die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilzen gewährleisten,
und die die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen.
Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation
geeignete, binäre
und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in
der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakteriumvermittelte
Transformation benötigten vir-Gene
sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten.
Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen
wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen
entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei
cointegrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben
Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei
Vektoren, von denen einer vir- Gene,
aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch
sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und
sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen
binären
Vektoren gehören
Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks und pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt
verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren
und ihre Verwendung gibt Hellens et al., Trends in Plant Science
(2000) 5, 446-451. Für
die Vektorpräparation
können
die Vektoren zunächst mit
Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter
Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor
gereinigt und ein Aliquot für
die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch
geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten
Vektorfragmenten unter Einsatz einer Ligase kloniert. Dabei kann
ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt
bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene
Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte
in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu
den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche
Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren.
Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen,
insbesondere Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, unter
selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen
Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen.
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Unter
der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die
im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und
Nukleinsäurekonstrukte
in Organismen wie Mikroorganismen oder vorteilhaft Pflanzen eingebracht
werden und damit bei der Pflanzentransformation verwendet werden,
wie diejenigen, die veröffentlicht
sind und zitiert sind in: Plant Molecular Biology and Biotechnology
(CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993);
F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic
Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R.
Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for
Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization,
Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)).
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und
Nukleinsäurekonstrukte
und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung
eines breiten Spektrums an Organismen, vorteilhaft an Pflanzen,
verwenden, so dass diese bessere und/oder effizientere Produzenten
von PUFAs werden.
-
Es
gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Veränderung
des erfindungsgemäßen Phospholipase
A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Proteins sowie der
weiteren im Verfahren verwendeten Proteine wie die Δ-12-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
oder Δ-4-Desaturase-Proteine
möglich
ist, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion
der vorteilhaft mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
in einer Pflanze, bevorzugt in einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus,
aufgrund dieses veränderten
Proteins direkt beeinflusst werden kann. Die Anzahl oder Aktivität der Phospholipase
A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-,
Dehydratase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
und/oder Δ-4-Desaturase-Proteine
und/oder -Gene kann erhöht
werden, so dass größere Mengen
der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen
der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese
in einem Organismus, dem die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der
Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene
fehlte, ist möglich. Entsprechendes
gilt für
die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren
Enzymen aus dem Fettsäure-
und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter,
d.h. auf DNA-Sequenzebene
unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die
Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche
Genexpression z.B. abhängig
vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden
Gewebes ermöglicht.
-
Durch
das Einbringen eines Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-,
Dehydratase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
und/oder Δ-4-Desaturase-Gens
in einen Organismus allein oder in Kombination mit anderen Genen
in eine Zelle kann nicht nur den Biosynthesefluss zum Endprodukt
erhöht,
sondern auch die entsprechende Triacylglycerin-Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen
werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import
von Nährstoffen,
die zur Biosynthese einer oder mehrerer Fettsäuren, Öle, polaren und/oder neutralen
Lipiden nötig
sind, erhöht
sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen
innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist,
wodurch die Fähigkeit
der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden beschrieben, weiter
gesteigert wird. Durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder
mehrerer Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-, Dehydratase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
und/oder Δ-4-Desaturase-Gene,
die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder
durch Zerstören
der Aktivität
einer oder mehrerer Gene, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt
sind, kann es möglich
sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion
von Fettsäure-
und Lipidmolekülen
aus Organismen und vorteilhaft aus Pflanzen zu steigern.
-
Die
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten isolierten Nukleinsäuremoleküle kodieren
für Proteine
oder Teile von diesen, wobei die Proteine oder das einzelne Protein
oder Teile davon eine Aminosäuresequenz
enthalten, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz
ist, die in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, so dass die Proteine oder Teile
davon noch eine Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder
Dehydratase-Aktivität
aufweisen. Vorzugsweise haben die Proteine oder Teile davon, die
von dem Nukleinsäuremolekül / den
Nukleinsäuremolekülen kodiert werden,
noch ihre wesentliche enzymatische Aktivität und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von
zum Aufbau von Zellmembranen oder Lipidkörperchen in Organismen, vorteilhaft
in Pflanzen, notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen teilzunehmen. Vorteilhaft sind die von den Nukleinsäuremolekülen kodierten
Proteine zu mindestens etwa 30 %, 35 %, 40 %, 45 % oder 50 %, vorzugsweise
mindestens etwa 55 % oder 60 % und stärker bevorzugt mindestens etwa
70 %, 80 % oder 90 % und am stärksten bevorzugt
mindestens etwa 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr identisch zu
den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8
dargestellten Aminosäuresequenzen.
Im Sinne der Erfindung ist unter „Homologie" oder „homolog" Identität oder identisch zu verstehen.
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Die
Homologie wurde über
den gesamten Aminosäure-
bzw. Nukleinsäuresequenzbereich
berechnet. Für
das Vergleichen verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine
Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen,
zur Verfügung.
Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith
und Waterman besonders zuverlässige
Ergebnisse. Für
die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp (J. Mol. Evolution.,
25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder
die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol.
48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489
(1981)] verwendet, die im GCG Software-Packet [Genetics Computer
Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]
enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte
wurden mit dem Programm GAP über
den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt:
Gap Weight: 8, Length Weight: 2, Average Match: 2.778 und Average
Mismatch: -2.248. Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders
angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.
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Unter „wesentlicher
enzymatischer Aktivität" der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase
ist zu verstehen, dass sie gegenüber
den durch die Sequenz mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5 oder SEQ ID NO: 7 und deren Derivate kodierten Proteinen/Enzymen
im Vergleich noch eine enzymatische Aktivität von mindestens 10 %, bevorzugt
20 %, besonders bevorzugt 30 % und ganz besonders bevorzugt 40 %
aufweisen und damit am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren, Fettsäureestern
wie Diacylglyceriden und/oder Triacylglyceriden in einem Organismus,
vorteilhaft einer Pflanze oder Pflanzenzelle, notwendigen Verbindungen
oder am Transport von Molekülen über Membranen
teilnehmen können,
wobei C18-, C20-
oder C22- Kohlenstoffketten im Fettsäuremolekül mit Doppelbindungen
an mindestens zwei, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Stellen gemeint
sind.
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Alternativ
können
im erfindungsgemäßen Verfahren
Nukleotidsequenzen verwendet werden, die für eine Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase
oder Dehydratase kodieren und die an eine Nukleotidsequenz, wie
in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellt,
vorteilhaft unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
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Die
im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft
in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in
Organismen wie Mikroorganismen oder Pflanzen ermöglicht, eingebracht.
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Dabei
werden die Nukleinsäuresequenzen,
die für
die Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase kodieren,
mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur
Erhöhung der
Genexpression funktionell verknüpft.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene
und der Proteine ermöglichen.
Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass
das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass
es sofort exprimiert und/oder überexprimiert
wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen
Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden
und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu
diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen
kann die natürliche
Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch
vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass
die natürliche
Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.
Die Expressionskassette (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt)
kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen
Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate
inseriert, und der natürliche
Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen
wurde die natürliche
Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt
und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten
Promotoren können
in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen)
auch allein vor das natürliche
Gen zur Steigerung der Aktivität
gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise eine
oder mehrere sogenannte "enhancer
Sequenzen" funktionell
verknüpft
mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen.
Auch am 3'-Ende
der DNA-Sequenzen können
zusätzliche
vorteilhafte Sequenzen wie weitere regulatorische Elemente oder
Terminatoren inseriert werden. Die Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratase-Gene können
in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt)
enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene
in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte
können
zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt
oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert
sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert
sein. Es ist vorteilhaft für
die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden
Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen.
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Die
regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben
vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen
und dadurch erhöhen.
So kann eine Verstärkung der
regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene
erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine Verstärkung der
Translation möglich,
indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung sind ein oder mehrere Genkonstrukte, die eine oder
mehrere Sequenzen enthalten, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder deren Derivate definiert
sind und für
Polypeptide bzw. Proteine gemäß SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 kodieren. Die
genannten Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Proteine
führen
dabei vorteilhaft zu einer Spaltung der Esterbindung von Fettsäuren an
der sn-2 Position von Phospholipiden bzw. zur Reduktion und Dehydrierung
von Fettsäuren,
wobei das Substrat vorteilhaft ein, zwei, drei, vier, fünf oder
sechs Doppelbindungen aufweist und vorteilhaft 18, 20 oder 22 Kohlenstoffatome im
Fettsäuremolekül aufweist.
Gleiches gilt für
ihre Homologe, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem
oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur Steigerung
der Genexpression, verbunden sind.
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Vorteilhafte
Regulationssequenzen für
das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie
dem cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-,
T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor und werden vorteilhafterweise
in Gram-negativen Bakterien angewendet. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen
liegen beispielsweise in den Gram-positiven Promotoren amy und SPO2,
in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF,
rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al.,
Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22
(1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin-
oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft
sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186
(Benzylsulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992:39704 (Gatz et
al., Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäureinduzierbar)
oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen
Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor
von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel
(Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor
aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr.
U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene nodienspezifische
Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche
die Expression in Geweben ermöglichen,
die an der Fettsäurebiosynthese
beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische
Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor
aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3, Phaseolin- oder
Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische
Promotoren, die für
monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und
in
US 5,608,152 (Napin-Promotor
aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis),
US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor
aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica),
von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (LeB4-Promotor
aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren
für Dikotyledonen
eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen:
lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230),
Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete
Promotoren.
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Es
ist im Prinzip möglich,
alle natürlichen
Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten,
für das
neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder
alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie
eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben
in WO 99/16890.
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Um
einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen
zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch
in Ölsaaten
exprimiert werden. Hierzu können
Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren
die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samen-spezifische
Promotoren können
prinzipiell sowohl aus dikotolydonen als auch aus monokotolydonen
Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind vorteilhafte bevorzugte
Promotoren aufgeführt: USP
(= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et
al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], Napin (Raps) [
US 5,608,152 ], Acyl-Carrier Protein
(Raps) [
US 5,315,001 und
WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO
93/20216], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [
US 5,504,200 ], Bce4 [WO 91/13980],
Leguminosen B4 (LegB4-Promotor)
[Bäumlein
et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 und lpt1(Gerste) [WO 95/15389
u. WO95/23230], Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen
[WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [
US 5,677,474 ], Bce4 (Raps) [
US 5,530,149 ], Glycinin
(Soja) [
EP 571 741 ], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase
(Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitratlyase
(Raps) [
US 5,689,040 ]
oder α-Amylase
(Gerste) [
EP 781 849 ].
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Die
Pflanzengenexpression lässt
sich auch über
einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht
in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108).
Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird,
dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele
für solche
Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer
Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz
et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
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Um
eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere
Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten
Nukleinsäuren,
die für
die Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase und/oder Dehydratase
kodieren, vorteilhaft in Kombination mit den Nukleinsäuren, die
für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-9-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ-8-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase
und/oder Δ-4-Desaturase
kodieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen
Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive
zu Instabilität
der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Die Expressionskassette
ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete
Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt,
vorteilhaft in einem Polylinker, und anschließend gegebenenfalls ein Terminator
hinter dem Polylinker liegt.
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Diese
Abfolge wiederholt sich mehrfach, bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so
dass bis zu fünf
Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression
in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt
sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über die
geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den
Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz
ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator.
Derartige vorteilhafte Konstrukte werden beispielsweise in
DE 10102337 oder
DE 10102338 offenbart.
Es ist aber auch möglich,
mehrere Nukleinsäuresequenzen
hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren.
Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten
Nukleinsäuren
in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das
heißt
eine Nukleinsäuresequenz
kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein,
ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es
können
in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren
wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche
Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich, nur
einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch
zu unerwünschten
Rekombinationsereignissen führen.
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Wie
oben beschrieben, sollte die Transkription der eingebrachten Gene
vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene
(hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann
hier z.B. der OCS1 Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten
hier für
jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
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Das
Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen,
die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und
vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene wie Gene für Induktoren,
Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die
Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen,
einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen
oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt
bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder
Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf
einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft
werden als weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels
im Genkonstrukt ausgewählt
aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier
protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n),
Fettsäure-Acyl-Transferase(n),
Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n),
Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n),
Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n),
Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n),
Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxygenase(n),
Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n)
oder Fettsäure-Elongase(n)
oder deren Kombinationen verwendet. Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen
sind Biosynthesegene des Fettsäure-
oder Lipidstoffwechsels ausgewählt
aus der Gruppe der Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, ω-3-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-8-Desatuase, Δ-9-Desaturase, Δ-12-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase
und/oder Δ-9-Elongase.
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Dabei
können
die vorgenannten Nukleinsäuren
bzw. Gene in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in
Expressionskassetten wie den vorgenannten kloniert werden und zur
Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterium eingesetzt
werden.
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Die
regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben
vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen
und dadurch erhöhen.
So kann eine Verstärkung der
regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene
erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine Verstärkung der
Translation möglich,
indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die Expressions kassetten können
prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden
oder aber in einen Vektoren eingebracht werden.
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Diese
vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten
die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Phospholipasen A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen
und/oder Dehydratasen kodieren und die vorteilhaft mit Nukleinsäuren kombiniert
werden können,
die für
die Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen
oder Δ-4-Desaturasen kodieren,
oder ein Nukleinsäurekonstrukt,
das die verwendete Nukleinsäure
allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder
Lipidstoffwechsels wie den Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, ω-3-Desaturasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, ω3-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen
und/oder Δ-9-Elongasen
enthält.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren
kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", das für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife
steht, in die zusätzlichen
DNA-Segmente ligiert werden können.
Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche
DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte
Vektoren können
in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom
replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung).
Andere Vektoren werden beim Einbringen in die Wirtszelle vorteilhaft
in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit
dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die
Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern.
Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben
Expressionsvektoren, die für
DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden.
In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das
Plasmid die am häufigsten
verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch die anderen
Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche
Funktionen ausüben, umfassen.
Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann
bekannt sind, wie Phagen, Viren wie SV40, CMV oder TMV, Transposons,
IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA,
umfassen.
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Die
im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren
umfassen die oben beschriebenen Nukleinsäuren oder das oben beschriebene
Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten
Nukleinsäuren
in einer Wirtszelle eignen, was bedeutet, dass die rekombinanten
Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf
der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit
der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz
funktionsfähig
verbunden ist, umfassen. In einem rekombinanten Expressionsvektor
bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz
von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist,
dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander
gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz
zugeschriebene Funktion erfüllen
(z.B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder
in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht
wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren,
Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale)
umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel:
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA (1990), oder in: Gruber und Crosby, in: Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton,
Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der
Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche
die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen
steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz
nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern.
Der Fachmann weiß,
dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren wie der
Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression
des gewünschten
Proteins usw. abhängen
kann.
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Die
verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Phospholipasen A2,
Ketoacyl-CoA-Reduktasen, Dehydratasen, Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen
und/oder Δ-4-Desaturasen
in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Dies
ist vorteilhaft, da häufig
Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in
Mikroorganismen durchgeführt
werden. Beispielsweise können die
Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-, Dehydratase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
und/oder Δ-4-Desaturase-Gene
in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren),
Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression
in yeast: a review",
Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene
expression in filamentous fungi",
in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure,
Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel,
C.A.M.J.J., & Punt,
P.J. (1991) "Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi, in:
Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb.,
S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore
et al., 1999, Marine Biotechnology. 1,3:239-251), Ciliaten der Typen Holotrichia,
Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium,
Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes,
Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia
lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben
in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen
(siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586;
Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton,
Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering
and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993),
128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42
(1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden.
Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum
Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen
und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
-
Die
Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren,
die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche
die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren
sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., und Johnson,
K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly,
MA) und pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST),
Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein
fusioniert wird.
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Beispiele
für geeignete
induzierbare Nicht-Fusions-E.coli-Expressionsvektoren sind u.a.
pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier
et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression
vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von
einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus
dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor,
die von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt
wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21
(DE3) oder HMS 174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der
ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV5-Promotors
birgt.
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Andere
in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann
bekannt Diese Vektoren sind beispielsweise in E.coli pLG338, pACYC184,
die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19,
die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200,
pUR290, pIN-III113-B1, λgt11
oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361,
in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77
oder pAJ667.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren
zur Expression in der Hefe S.cerevisiae umfassen pYeDesaturasec
1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz
(1982) Cell 30:933-943),
pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von
Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen wie z.B. den
filamentösen
Pilzen eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind
in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt,
P.J. (1991) "Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi, in:
Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsgb.,
S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene
Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428:
Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise
pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
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Alternativ
können
die Phospholipasen A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen und/oder Dehydratasen
vorteilhaft in Kombination mit den Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen
und/oder Δ-4-Desaturasen in
Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren
exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von
Proteinen in gezüchteten
Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe
(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe
(Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
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Die
oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete
Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum
Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H.,
et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische
Zellen sind in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch,
E.F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens können
die Phospholipasen A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen und/oder Dehydratasen
vorteilhaft in Kombination mit den Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen
und/oder Δ-4-Desaturasen
in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al.,
1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben,
und Pflanzenzellen aus höheren
Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele
für Pflanzen-Expressionsvektoren
umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D.,
Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary
vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197;
und Bevan, M.W. (1984) "Binary
Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors
for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1,
Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press,
1993, S. 15-38.
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Eine
Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen,
welche die Genexpress on in Pflanzenzellen steuern können und
funktionsfähig
verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion wie Termination
der Transkription erfüllen
kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale
sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen,
wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasinids pTiACH5
(Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente
davon. Auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren
sind geeignet.
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Da
die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsebene
beschränkt
ist, enthält
eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden
Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz,
welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz
aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl.
Acids Research 15:8693-8711).
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Die
Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit
einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression
auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare
Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J.
8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen,
wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch
US 5352605 und WO 84/02913)
oder Pflanzenpromotoren wie der in
US
4,962,028 beschriebene Promotor der kleinen Untereinheit
der Rubisco.
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Andere
bevorzugte Sequenzen für
die Verwendung zur funktionsfähigen
Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen,
die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment
notwendig sind (siehe eine Übersicht
in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 und darin
zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern,
alle Arten von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten,
den extrazellulären
Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen
und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
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Die
Pflanzengenexpression lässt
sich auch wie oben beschrieben über
einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht
in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch
induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird,
dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele
für solche
Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer
Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz
et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer
Promotor.
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Auch
Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen
reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte
PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366),
der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor
aus Tomate (
US 5,187,267 ),
der kälteinduzierbare
Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch
Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP-A-0 375 091).
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Es
sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression
in Geweben und Organen herbeiführen,
in denen die Fettsäure-,
Lipid- und Ölbiosynthese
stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des
sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor
aus Raps (
US 5,608,152 ),
der USP-Promotor
aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67),
der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor
aus Phaseolus vulgaris (
US 5,504,200 ),
der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4;
Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9), sowie Promotoren,
welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen
wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete
beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1-Gen-Promotor
aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890
beschriebenen Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen,
dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen,
Weizen-Glutelin-Gen,
dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen,
dem Roggen-Secalin-Gen.
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Insbesondere
kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten
Phospholipasen A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen und/oder Dehydratasen
vorteilhaft in Kombination mit den Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen
und/oder Δ-4-Desaturasen
gewünscht
sein. Die Einführung
solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation
mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch
Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch
können
mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert
und auf die Wirtszelle übertragen
werden.
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Ebenfalls
besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische
Expression herbeiführen,
da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie
einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete
Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben
in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis,
beschrieben in WO 99/46394.
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Vektor-DNA
lässt sich
in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder
Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", Konjugation und Transduktion, wie
hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten
Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z.B.
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DNA)
in eine Wirtszelle, einschließlich
Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte
Transfektion, Lipofektion, natürliche
Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder
Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation
oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen
sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie
Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols,
Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
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Wirtszellen,
die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des
erfindungsgemäßen Genproduktes
oder des erfindungsgemäßen Vektors
geeignet sind, sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen.
Vorteilhaft verwendete Wirtsorganismen sind Mikroorganismen wie
Pilze oder Hefen oder Pflanzenzellen, vorzugsweise Pflanzen oder
Teile davon. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise verwendet,
besonders bevorzugt Pflanzen, ganz besonders bevorzugt Pflanzen
wie Ölfruchtpflanzen, die
große
Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Hanf,
Diestel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Saflor, Sonnenblume, Borretsch,
oder Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste,
Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie Kartoffel,
Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen
(Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuss) sowie ausdauernde
Gräser
und Futterfeldfrüchte.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen
wie Soja, Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume,
Saflor, Bäume
(Ölpalme,
Kokosnuss).
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand
sind wie oben beschrieben isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide
bzw. Proteine mit Phospholipase A2-Aktivität kodieren, wobei die durch
die Nukleinsäuresequenzen
kodierten Phospholipasen A2 vorteilhaft an der sn2-Position der
Phospholipide gebundene Fettsäuren
abhydrolisieren.
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Bevorzugte
Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Phospholipase A2-Aktivität kodieren, sind Sequenzen
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen,
oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Homologie
auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 2 haben und eine Phospholipase A2-Aktivität aufweisen.
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Weitere
Erfindungsgegenstände
sind die im folgenden aufgezählten
Nukleinsäuresequenzen,
die für Ketoacyl-CoA-Reduktasen
oder Dehydratasen kodieren.
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Weitere
vorteilhafte isolierte Nukleinsäuresequenzen
sind Sequenzen, die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Ketoacyl-CoA-Reduktase-Aktivität kodieren,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen,
oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Homologie
auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 4 haben und eine Ketoacyl-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen.
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Weitere
vorteilhafte isolierte Nukleinsäuresequenzen
sind Sequenzen, die für
Polypeptide bzw. Proteine mit Dehydratase-Aktivität kodieren,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen
ableiten lassen, oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten
Nukleinsäuresequenzen,
die für
Polypeptide bzw. Proteine kodieren, die mindestens 40 % Identität auf Aminosäureebene
mit SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 haben und eine Dehydratase-Aktivität aufweisen.
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Die
oben genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stammen
vorteilhaft von vorgenannten Organismen.
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Der
Begriff "Nukleinsäure(molekül)", wie hier verwendet,
umfasst in einer vorteilhaften Ausführungsform zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden
Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt
200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des
5'-Endes des kodierenden
Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20
Nukleotide der Sequenz stromabwärts
des 3'-Endes des
kodierenden Genbereichs. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von
anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt,
die in der natürlichen
Quelle der Nukleinsäure
vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat
vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der
genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt,
natürlicherweise
flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen
Ausführungsformen
kann das isolierte Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratasemolekül zum Beispiel
weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb
an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der
genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, flankieren.
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Die
im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder
SEQ ID NO: 7 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer
Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert
werden. Auch kann mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise
eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche
auf DNA oder Aminosäureebene
identifiziert werden. Diese können als
Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie
z.B. beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer
im Verfahren nützlicher
Nukleinsäuresequenzen
verwendet werden. Überdies
lässt sich
ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine vollständige
Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO: 7 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren,
wobei Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder
von Teilen davon verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
die vollständigen
Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der
Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel
lässt sich
mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren
von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) und cDNA mittels
Reverser Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von
Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America,
Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer
zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich
auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Sequenzen oder mit Hilfe der in SEQ
ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten
Aminosäuresequenzen
erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann
unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als
Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken
amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann
in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse
charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Desaturase-Nukleotidsequenz
entsprechen, können
durch Standard-Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen
DNA-Synthesegerät,
hergestellt werden.
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Homologe
der verwendeten Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder
Dehydratase-Nukleinsäuresequenzen
mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ
ID NO: 7 bedeuten beispielsweise allelische Varianten mit mindestens
etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 %, vorzugsweise mindestens etwa
60, 65 oder 70 %, stärker
bevorzugt mindestens etwa 70 oder 80 %, 90 % oder 95 % und noch stärker bevorzugt
mindestens etwa 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität bzw. Homologie
zu einer in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen oder ihren Homologen, Derivaten
oder Analoga oder Teilen davon. Weiterhin sind isolierte Nukleinsäuremoleküle einer
Nukleotidsequenz, die an eine der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen oder
einen Teil davon hybridisieren, z.B. unter stringenten Bedingungen
hybridisiert. Unter einem Teil gemäß der Erfindung ist dabei zu
verstehen, dass mindestens 25 Basenpaare (= bp), 50 bp, 75 bp, 100
bp, 125 bp oder 150 bp, bevorzugt mindestens 175 bp, 200 bp, 225
bp, 250 bp, 275 bp oder 300 bp, besonders bevorzugt 350 bp, 400
bp, 450 bp, 500 bp oder mehr Basenpaare für die Hybridisierung verwendet
werden. Es kann auch vorteilhaft die Gesamtsequenz verwendet werden.
Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten,
die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden
aus/in der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ
ID NO: 7 dargestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Absicht
ist, dass die Enzymaktivität
der davon herrührenden
synthetisierten Proteine für
die Insertion eines oder mehrerer Gene vorteilhafterweise beibehalten
wird. Proteine, die noch die enzymatische Aktivität der Phospholipase
A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase besitzen, das heißt deren
Aktivität
im wesentlichen nicht reduziert ist, bedeutet Proteine mit mindestens
10 %, vorzugsweise 20 %, besonders bevorzugt 30 %, ganz besonders bevorzugt
40 % der ursprünglichen
Enzymaktivität,
verglichen mit dem durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5 oder SEQ ID NO: 7 kodierten Protein. Die Homologie wurde über den
gesamten Aminosäure- bzw.
Nukleinsäuresequenzbereich
berechnet. Für
das Vergleichen verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine
Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen
zur Verfügung.
Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith
und Waterman besonders zuverlässige
Ergebnisse. Für
die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp (J. Mol. Evolution.,
25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder
die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48;
443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489
(1981)] verwendet, die im GCG Software-Packet [Genetics Computer
Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]
enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte
wurden mit dem Programm GAP über den
gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap
Weight: 8, Length Weight: 2, Average Match: 2.778 und Average Mismatch:
-2.248. Diese wurden, falls nicht anders angegeben, als Standardeinstellungen
immer für
Sequenzvergleiche verwendet.
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Die
Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuremoleküle, die
sich von einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder
SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon) aufgrund
des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit die
gleiche Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase
kodieren wie diejenige, die von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen kodiert
wird.
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Zusätzlich zu
den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO:
7 gezeigten Phospholipasen A2, Ketoacyl-CoA-Reduktasen oder Dehydratasen
erkennt der Fachmann, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen
in den Aminosäuresequenzen
der Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase führen, innerhalb
einer Population existieren können.
Diese genetischen Polymorphismen im Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratase-Gen können
zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund von natürlicher
Variation existieren. Diese natürlichen
Varianten bewirken üblicherweise
eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des Phospholipase
A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Gens. Alle diese Nukleotidvariationen
und die daraus resultierenden Aminosäurepolymorphismen in der Phospholipase
A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase, die das Ergebnis natürlicher
Variation sind und die funktionelle Aktivität der Enzyme nicht verändern, sollen
im Umfang der Erfindung enthalten sein.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren
vorteilhafte Nukleinsäuremoleküle können auf
der Grundlage ihrer Homologie zu den hier offenbarten Phospholipase
A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratase-Nukleinsäuren
unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde
gemäß Standard-Hybridisierungstechniken
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei
können beispielsweise
isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden, die mindestens 15 Nukleotide lang sind und unter stringenten
Bedingungen mit den Nukleinsäuremolekülen, die
eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5 oder SEQ ID NO: 7 umfassen, hybridisieren. Es können auch
Nukleinsäuren
mit mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden verwendet
werden. Der Begriff "hybridisiert
unter stringenten Bedingungen",
wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben,
unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander
sind, gewöhnlich
aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise
derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt
mindestens etwa 70 % und noch stärker
bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind,
gewöhnlich
aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind
dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons,
N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente
Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt
von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis
65°C. Dem
Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich
je nach dem Typ der Nukleinsäure
und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich
der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden.
Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ
der Nukleinsäure
zwischen 42°C
und 58°C
in wässrigem
Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches
Lösungsmittel
im oben genannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, ist
die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen
für DNA:DNA-Hybride
zum Beispiel 0,1 × SSC
und 20°C
bis 45°C,
vorzugsweise zwischen 30°C
und 45°C.
Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride
zum Beispiel 0,1 × SSC
und 30°C
bis 55°C,
vorzugsweise zwischen 45°C
und 55°C.
Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise
für eine
Nukleinsäure
mit etwa 100 bp Länge
und einem G+C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt.
Der Fachmann weiß,
wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern wie
dem vorstehend erwähnten
oder aus den folgenden Lehrbüchern:
Sambrook et al., "Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization:
A Practical Approach",
IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular
Biology: A Practical Approach",
IRL Press at Oxford University Press, Oxford bestimmt werden können.
-
Zur
Bestimmung der prozentualen Homologie von zwei Aminosäuresequenzen
(z.B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 6 oder SEQ ID NO: 8) oder von zwei Nukleinsäuresequenzen (z.B. SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7) werden die Sequenzen zum
Zweck des optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in
die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales
Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen).
Die Aminosäurereste
oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen
werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch
den gleichen Aminosäurerest
oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz
belegt wird, dann sind die Moleküle
an dieser Position homolog (d.h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie", wie hier verwendet,
entspricht Aminosäure-
oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie
zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen
Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d.h. % Homologie =
Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100).
Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen.
Die verwendeten Programme bzw. Algorithmen sind oben beschrieben.
-
Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für eine Phospholipase
A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase kodiert, ausgewählt aus
der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID
NO: 7, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 homolog ist, kann durch Einbringen
einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen
in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere
Aminosäuresubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht
werden. Mutationen können
in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
5 oder SEQ ID NO: 7 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische
Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise
werden konservative Aminosäuresubstitutionen
an einer oder mehreren der vorhergesagten nichtessentiellen Aminosäureresten
hergestellt. Bei einer "konservativen
Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest
gegen einen Aminosäurerest
mit einer ähnlichen
Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten
mit ähnlichen
Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit
basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten
(z.B. Asparaginsäure,
Glutaminsäure),
ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin,
Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z.B.
Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin,
Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin,
Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin,
Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest
in einer Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase oder Dehydratase wird
somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie
ausgetauscht. Alternativ können
bei einer anderen Ausführungsform
die Mutationen zufallsgemäß über die
gesamte oder einen Teil der Phospholipase A2, Ketoacyl-CoA-Reduktase
oder Dehydratase kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch
Sättigungsmutagenese,
und die resultierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen
Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Aktivität durchmustert
werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Phospholipase A2-,
Ketoacyl-CoA-Reduktase- oder Dehydratase-Aktivität beibehalten haben. Nach der
Mutagenese einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert
werden, und die Aktivität
des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests
bestimmt werden.
-
Homologe
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 bedeuten
beispielsweise auch bakterielle, Pilz- und Pflanzenhomologe, verkürzte Sequenzen,
einzelsträngige
DNA oder RNA der kodierenden und nicht-kodierenden DNA-Sequenz.
-
Homologe
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 bedeutet
auch Derivate, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren
stromaufwärts
der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere
Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert
werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren
gestört
wird. Es ist weiterhin möglich,
dass die Aktivität
der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder
dass sie vollständig
durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt
werden.
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Die
vorgenannten Nukleinsäuren
und Proteinmoleküle
mit Phospholipase A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktase-
oder Dehydratase-Aktivität
vorteilhaft in Kombination mit den Nukleinsäuren und Proteinmolekülen mit Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-
und/oder Δ-4-Desaturase-Aktivität, die am
Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen oder am Transport
lipophiler Verbindungen über
Membranen beteiligt sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren
zur Modulation der Produktion von PUFAs in transgenen Organismen,
vorteilhaft in Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale,
Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Linum-Arten wie Öl- oder
Faserlein, Brassica-Arten wie Raps, Canola und Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume,
Borretsch, Nachtkerze und Tagetes, Solanacaen-Pflanzen wie Kartoffel,
Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa,
Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme,
Kokosnuss) und ausdauernden Gräsern
und Futterfeldfrüchten,
entweder direkt (z.B. wenn die Überexpression
oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins
einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz
der Produktion der Fettsäure
aus modifizierten Organismen hat) verwendet und/oder können eine
indirekte Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der
Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der PUFAs
oder einer Abnahme unerwünschter
Verbindungen führt
(z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren
und Enzymen zu Veränderungen
der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder
der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen
innerhalb der Zellen führt,
was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Fettsäuren beeinflussen
kann).
-
Die
Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme
führt zur
Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was
eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Lipide
hat, da mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
(= PUFAs) nicht nur einfach in Triacylglycerin, sondern auch in
Membranlipide eingebaut werden.
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Besonders
zur Herstellung von PUFAs, beispielsweise Stearidonsäure, Eicosapentaensäure und
Docosahexaensäure,
eignen sich Brasicaceae, Boraginaceen, Primulaceen oder Linaceen.
Besonders vorteilhaft eignet sich Lein (Linum usitatissimum) zur
Herstellung von PUFAS mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
wie beschrieben, in Kombination mit weiteren Desaturasen und Elongasen.
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Die
Lipidsynthese lässt
sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und
ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation
einer polaren Kopfgruppe. Übliche
Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide,
Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der
Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase
oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion
bilden diese beiden Produktmoleküle
zusammen Acetoacetyl-ACP, das über
eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen
umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der
gewünschten
Kettenlänge
erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus
diesen Molekülen
wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder
aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der
Fettsäuresynthese
in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E.coli und
Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 und darin enthaltene
Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes.
Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie
Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 und
die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten, an Phospholipide
gebundenen Fettsäuren
müssen
anschließend
wieder für
die weitere Elongationen aus den Phospholipiden in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden.
Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen.
Weiterhin können
diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA-Estern
auf die Phospholipide übertragen.
Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen
werden.
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Vorläufer für die PUFA-Biosynthese
sind beispielsweise Ölsäure, Linol-
und Linolensäure.
Diese C18-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf
C20 und C22 verlängert werden,
damit Fettsäuren
vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mit Hilfe der
im Verfahren verwendeten Phospholipasen A2-, Ketoacyl-CoA-Reduktasen
oder Dehydratasen in Kombination mit weiteren Enzymen wie Desaturasen
wie der Δ-12-, ω3-, Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-und Δ-8-Desaturasen
und/oder Elongasen wie der Δ-5-, Δ-6-, Δ-9-Elongasen
können
Arachidonsäure,
Eicosapentaensäure,
Docosapentaensäure
oder Docosahexaensäure,
vorteilhaft Eicosapentaensäure
und/oder Docosahexaensäure,
hergestellt werden und anschließend
für verschiedene Zwecke
bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen
verwendet werden. Mit den genannten Enzymen können Öle oder Lipide mit einem hohen
Anteil an C18-, C20-
und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei, vorteilhaft
mindestens drei, vier, fünf
oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise C20-
oder C22-Fettsäuren mit vorteilhaft vier,
fünf oder
sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül hergestellt
werden. Vorteilhaft lassen sich im Verfahren Fettsäuren wie
Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder
Eicosapentaensäure,
Docosapentaensäure,
Docosatetraensäure,
Docosapentaensäure,
Docosahexaensäure
oder deren Mischungen herstellen. Substrate der verwendeten Enzyme
im erfindungsgemäßen Verfahren
sind C16-, C18-
oder C20-Fettsäuren wie zum Beispiel Linolsäure, γ-Linolensäure, α-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Eicosatetraensäure oder
Stearidonsäure.
Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure bzw.
Arachidonsäure,
Eicosatetraensäure
oder Eicosapentaensäure.
Die synthetisierten vorteilhaften C20- oder
C22-Fettsäuren mit mindestens zwei, drei,
vier, fünf
oder sechs Doppelbindungen in der Fettsäure fallen im erfindungsgemäßen Verfahren
in Form der freien Fettsäure
oder in Form ihrer Ester, beispielsweise in Form ihrer Glyceride
an.
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Unter
dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein,
zwei oder drei Carbonsäureresten
verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch
an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch
kann weitere Zusätze,
z.B. freie Fettsäuren,
Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere
Substanzen enthalten.
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Unter
einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu
zählen
neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide
und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide
wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin,
Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.
Diese Glyceride kommen letztlich in den Ölen oder Lipiden als eine Substanzgruppe
vor.
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Ferner
müssen
Fettsäuren
anschließend
an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid
eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese
ist der Transfer von Fettsäuren
auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase
(siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
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Veröffentlichungen über die
Pflanzen-Fettsäurebiosynthese,
die Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und den Membrantransport
von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation
und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung siehe
in den folgenden Artikeln einschließlich der Literaturstellen
darin: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166;
Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin und Cahoon,
1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996,
Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992,
Prog. Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995,
Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid
Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular
Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata
und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158,
Murphy & Ross
1998, Plant Journal. 13(1):1-16.
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Die
im Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe von Molekülen, die
höhere
Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen, oder
die höhere
Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen
müssen,
obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert
werden. Beispielsweise können
Katzen Arachidonsäure
nicht mehr synthetisieren.
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Unter
Phospholipiden im Sinne der Erfindung sind zu verstehen: Phosphatidylcholin,
Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin
und/oder Phosphatidylinositol, vorteilhafterweise Phosphatidylcholin.
Die Begriffe „Produktion" oder „Produktivität" sind im Fachgebiet
bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes,
das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Fermentationsvolumen
gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Es umfasst
auch die Produktivität
innerhalb einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze, das heißt den Gehalt
an den gewünschten
im Verfahren hergestellten Fettsäuren
bezogen auf den Gehalt an allen Fettsäuren in dieser Zelle oder Pflanze.
Der Begriff „Effizienz
der Produktion" umfasst
die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist
(z.B. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate
einer Feinchemikalie benötigt).
Der Begriff „Ausbeute" oder „Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet
bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle
in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als
kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion
der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder
der geeigneten gewonnenen Moleküle
dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen
festgelegten Zeitraum erhöht.
Die Begriffe „Biosynthese" oder „Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet
bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise
einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen,
beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess.
Die Begriffe „Abbau" oder „Abbauweg" sind im Fachgebiet
bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise
einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte
(allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) beispielsweise
in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff „Stoffwechsel" ist im Fachgebiet
bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen,
die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten
Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit
der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung
in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
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Weitere
Erfindungsgegenstände
sind transgene nicht-humane Organismen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 enthalten
oder ein Genkonstrukt oder einen Vektor enthalten, die diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
enthalten. Vorteilhaft handelt es sich bei dem nicht-humanen Organismus
um einen Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze,
besonders bevorzugt um eine Pflanze.
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Diese
Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht,
die nicht als beschränkend
aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung
zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten
Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
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Beispiele
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Beispiel 1: Allgemeine
Klonierungsverfahren
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Die
Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese,
Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf
Nitrozellulose- und Nylon-Membranen,
Verknüpfen
von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli-Zellen,
Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden
wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
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Beispiel 2: Sequenzanalyse
rekombinanter DNA
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Die
Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer
der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend
aus einer Polymerase-Kettenreaktion
wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden
Konstrukten sequenziert und überprüft.
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Beispiel 3: Klonierung
von Genen aus Ostreococcus tauri
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Durch
Suche von homologen Bereichen in Proteinsequenzen konnten Sequenzen
mit entsprechenden Motiven in einer Ostreococcus tauri Sequenzdatenbank
(genomische Sequenzen) identifiziert werden. Die Alignments zum
Auffinden von Homologien der einzelnen Gene wurden mit dem tBLASTn-Algorithmus
(Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403 – 410) durchgeführt. Es
handelt sich dabei um die folgenden Sequenzen:
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Die
Klonierung wird wie folgt durchgeführt:
40 ml einer Ostreococcus
tauri Kultur in der stationären
Phase werden abzentrifugiert, in 100 μl Aqua bidest resuspendiert
und bei -20°C
gelagert. Auf der Basis des PCR-Verfahrens werden die zugehörigen genomischen
DNAs amplifiziert. Die entsprechenden Primerpaare werden so ausgewählt, dass
sie die Hefe-Konsensus-Sequenz für
hocheffiziente Translation (Kozak, Cell 1986, 44:283-292) neben
dem Startcodon tragen. Die Amplifizierung der Ot-DNAs wird jeweils mit 1 μl aufgetauten
Zellen, 200 μM
dNTPs, 2,5 U Taq-Polymerase und 100 pmol eines jeden Primers in
einem Gesamtvolumen von 50 μl
durchgeführt.
Die Bedingungen für
die PCR sind wie folgt: erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten,
gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C
für 30
Sekunden, 55°C
für 1 Minute
und 72°C
für 2 Minuten
sowie ein letzter Verlängerungsschritt
bei 72°C
für 10
Minuten.
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Beispiel 4: Klonierung
eines Dehydratase-Genes aus Thraustochytrium ssp.
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Durch
Vergleiche der verschiedenen in dieser Anmeldung gefundenen Dehydratase-Proteinsequenzen
konnten konservierte Nukleinsäurebereiche
definiert werden (6: Phe-Cys-Ala-Gly-Gly-Asp, Phe-Phe-X-X-GIu-Phe-X-Leu-Asn,
Thr-X-Phe-Ala-Met-Pro-Glu, Pro-Asp-Valin-Gly-X-Thr/Ser-Phe/Trp).
Mit Hilfe dieser Sequenzen wurde eine EST-Datenbank von Thraustochytrium
ssp. nach Dehydratasen durchsucht.
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-
Gesamt-RNA
von Thraustochytrium ssp. wurde mit Hilfe des RNAeasy Kits der Firma
Qiagen (Valencia, CA, US) isoliert. Aus der Gesamt-RNA wurde mit
Hilfe des PolyA Tract Isolierungssystems (Promega) mRNA isoliert.
Die mRNA wurde mit dem Marathon cDNA Amplification-Kit (BD Biosciences)
revers transkribiert und entsprechend der Herstellerangaben Adaptoren
ligiert. Die cDNA-Bank wurde dann für die PCR zur Klonierung von
Expressionsplasmiden mittels 5'-
und 3'-RACE (rapid
amplification of cDNA ends) verwendet.
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Beispiel 5: Klonierung
von Expressionsplasmiden zur heterologen Expression in Hefen:
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Zur
Charakterisierung der Funktion der identifizierten Gene aus Ostreococcus
tauri und Thraustochytrium werden die offenen Leserahmen der jeweiligen
DNAs stromabwärts
des Galactose-induzierbaren GAL1-Promotors von pYES2.1/V5-His-TOPO
(Invitrogen) kloniert, wobei pYES2-PLA2(Ot), pYES2-KR(Ot),pYES2-DH(Ot)
und pYES2(DH(Tc) erhalten werden. Folgende Primersequenzen werden
eingesetzt:
-
Der
Saccharomyces cerevisiae-Stamm 334 wird durch Elektroporation (1500
V) mit den Vektoren pYES2-PLA2(Ot), pYES2-KR(Ot), pYES2-DH(Ot) und
pYES2-DH(Tc) transformiert. Als Kontrolle wird eine Hefe verwendet,
die mit dem leeren Vektor pYES2 transformiert wird. Die Selektion
der transformierten Hefen erfolgt auf Komplett-Minimalmedium (CMdum)-Agarplatten mit
2% Glucose, aber ohne Uracil. Nach der Selektion werden je drei
Transformanten zur weiteren funktionellen Expression ausgewählt.
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Für die Expresssion
der Ot-Gene sowie des DH(Tc) Gens werden zunächst Vorkulturen aus jeweils
5 ml CMdum-Flüssigmedium
mit 2% (w/v) Raffinose aber ohne Uracil mit den ausgewählten Transformanten angeimpft
und 2 Tage bei 30°C,
200 rpm inkubiert. 5 ml CMdum-Flüssigmedium
(ohne Uracil) mit 2% Raffinose und 300 μM verschiedener Fettsäuren werden
dann mit den Vorkulturen auf eine OD600 von
0,05 angeimpft. Die Expression wird durch die Zugabe von 2% (w/v)
Galactose induziert. Die Kulturen werden für weitere 96 h bei 20°C inkubiert.
Zur Charakterisierung der Gene kann nach folgenden beschriebenen
Verfahren vorgegangen werden:
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- PLA2(Ot): Lee et al., 2003, Mol. Cells, 16:361-367
- KR(Ot): Beaudoin et al. 2001, JBC, 277:11481-11488
- DH(Ot) und DH(Tc): Garcia et al. 2004, The Acyl-CoA elongase
in Arabidopsis thaliana characterization of a candidate gene presumably
encoding the 3-hydroxyacyl-CoA dehydratase. Posterpräsentation
16th Plant Lipid Symposium, Budapest.
-
Beispiel 6: Klonierung
von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in Pflanzen
-
Für die Transformation
von Pflanzen wird ein weiterer Transformationsvektor auf Basis des
binäre Plasmids
pSUN-USP erzeugt. Dazu werden mittels PCR NotI-Schnittstellen am
5' und 3'-Ende der kodierenden
Sequenzen eingefügt.
Die entsprechenden Primersequenzen werden von den 5'- und 3'-Bereichen von PLA2(Ot),
KR(Ot), DH(Ot) und DH(Tc) abgeleitet.
-
Zusammensetzung
des PCR-Ansatzes (50 μL):
5,00 μL Template
cDNA
5,00 μL
10 × Puffer
(Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCl2
5,00 μL 2mM dNTP
1,25 μL je Primer
(10 pmol/μL)
0,50 μL Advantage-Polymerase
(Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:
Anlagerung: 1
min 55°C
Denaturierung:
1 min 94°C
Elongation:
2 min 72°C
Anzahl
der Zyklen: 35
-
Die
PCR Produkte werden für
16 h bei 37°C
mit dem Restriktionsenzym NotI inkubiert. Der Pflanzen-Expressionsvektor
pSUN300-USP wird in gleicher Weise inkubiert. Anschließend werden
die PCR Produkte sowie der Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese
aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten.
Die Aufreinigung der DNA erfolgt mittels Qiagen Gel Purification
Kit gemäss
Herstellerangaben. Anschliessend werden Vektor und PCR-Produkte
ligiert. Dazu wird das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Die
entstandenen Plasmide pSUN-PLA2(Ot), pSUN-KR(Ot), pSUN-DH(Ot) und
pSUN-DH(Tc) werden durch Sequenzierung verifiziert.
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pSUN300
ist ein Derivat des Plasmides pPZP (Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga,
P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary
vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP
entstand aus pSUN300, indem in pSUN300 ein USP-Promotor als EcoRI-
Fragment inseriert wurde. Das Polyadenylierungssignal ist das des
Octopin-Synthase-Gens aus dem A. tumefaciens Ti-Plasmid (ocs-Terminator,
Genbank Accession V00088) (De Greve,H., Dhaese,P., Seurinck,J.,
Lemmers,M., Van Montagu,M. and Schell,J. Nucleotide sequence and
transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded
octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982).
Der USP-Promotor entspricht den Nukleotiden 1 bis 684 (Genbank Accession
X56240), wobei ein Teil der nichtcodierenden Region des USP-Gens
im Promotor enthalten ist. Das 684 Basenpaar große Promotorfragment wurde mittels
käuflichen T7-Standardprimer
(Stratagene) und mit Hilfe eines synthetisierten Primers über eine
PCR-Reaktion nach Standardmethoden amplifiziert. (Primersequenz:
5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC
GGATCTGCTGGCTATGAA-3',
SEQ ID NO: 17). Das PCR-Fragment wurde mit EcoRI/SalI nachgeschnitten
und in den Vektor pSUN300 mit OCS Terminator eingesetzt. Es entstand
das Plasmid mit der Bezeichnung pSUN-USP. Das Konstrukt wurde zur
Transformation von Arabidopsis thaliana, Raps, Tabak und Leinsamen
verwendet.
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Beispiel 7: Expression
von PLA2(Ot), KR(Ot), DH(Ot) und DH(Tc) in Hefen
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Hefen,
die wie unter Beispiel 5 mit den Plasmiden pYES2, pYES2-PLA2(Ot),
pYES2-KR(Ot) und pYES2-DH(Ot)
transformiert werden, werden folgendermaßen analysiert:
Die Hefezellen
aus den Hauptkulturen werden durch Zentrifugation (100 × g, 5 min,
20°C) geerntet
und mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0 gewaschen,
um restliches Medium und Fettsäuren
zu entfernen. Aus den Hefe-Zellsedimenten werden Fettsäuremethylester
(FAMEs) durch saure Methanolyse hergestellt. Hierzu werden die Zellsedimente
mit 2 ml 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2% (v/v) Dimethoxypropan
für 1 h
bei 80°C
inkubiert. Die Extraktion der FAMES erfolgt durch zweimalige Extraktion
mit Petrolether (PE). Zur Entfernung nicht derivatisierter Fettsäuren werden
die organischen Phasen je einmal mit 2 ml 100 mM NaHCO3,
pH 8,0 und 2 ml Aqua dest. gewaschen. Anschließend werden die PE-Phasen mit
Na2SO4 getrocknet,
unter Argon eingedampft und in 100 μl PE aufgenommen. Die Proben
werden auf einer DB-23-Kapillarsäule
(30 m, 0,25 mm, 0,25 μm,
Agilent) in einem Hewlett-Packard
6850-Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor getrennt.
Die Bedingungen für
die GLC-Analyse sind wie folgt: Die Ofentemperatur wird von 50°C bis 250°C mit einer
Rate von 5°C/min
und schließlich
10 min bei 250°C(halten)
programmiert.
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Die
Identifikation der Signale erfolgt durch Vergleiche der Retentionszeiten
mit entsprechenden Fettsäurestandards
(Sigma). Die Methodik ist beschrieben zum Beispiel in Napier and
Michaelson, 2001,Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal
of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001,
Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 und Michaelson et al., 1998,
FEBS Letters. 439(3):215-218.
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Beispiel 8: Erzeugung
von transgenen Pflanzen
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a) Erzeugung transgener
Rapspflanzen (verändert
nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)
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Zur
Erzeugung transgener Rapspflanzen werden die binären Vektoren in Agrobacterium
tumefaciens C58C1:pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere
et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation
von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth,
Deutschland) wird eine 1:50 Verdünnung
einer Übernachtkultur
einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog
Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3
% Saccharose (3MS-Medium) benutzt.
Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen
(zu je ca. 1 cm2) werden dazu in einer Petrischale
mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung
für 5-10 Minuten inkubiert.
Es folgt eine 3-tägige Koinkubation
in Dunkelheit bei 25°C
auf 3MS-Medium mit
0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung erfolgt dann 3 Tage mit 16 Stunden
Licht / 8 Stunden Dunkelheit. In wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium
mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20
mikroM Benzylaminopurin (BAP) wird dann mit 1,6 g/l Glukose weiterinkubiert.
Wachsende Sprosse werden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/l
Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bildeten
sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wird als Wachstumshormon
2-Indolbuttersäure
zum Bewurzeln zum Medium gegeben.
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Regenerierte
Sprossen werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten,
nach Bewurzelung in Erde überführt und
nach Kultivierung für
zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht,
reife Samen geerntet und auf Elongase-Expression wie Δ-5-Elongase-
oder Δ-6-Elongase-Aktivität mittels
Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an C20- und C22
mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
können
so identifiziert werden.
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b) Herstellung von transgenen
Leinpflanzen
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Die
Herstellung von transgenen Leinpflanzen kann zum Beispiel nach der
Methode von Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant.
35(6):456-465 mittels particle bombartment erfolgen. Agrobakterien-vermittelte
Transformationen können
zum Beispiel nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13:
282-285 hergestellt werden.
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Beispiel 9: Lipidextraktion
aus Hefen und Samen
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Die
Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen
oder Ciliaten auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer
Fettsäure)
kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder
die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend
beschriebenen) gezüchtet
werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion
des gewünschten
Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese
Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie,
Dünnschichtchromatographie,
Färbeverfahren
verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie
analytische Chromatographie wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe
beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd.
A2, S. 89-90 und S. 443-613,
VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC
in Biochemistry" in:
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd.
17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery
and purification",
S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations:
downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy,
J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological
Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D.
(1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,
Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989)
Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
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Neben
den oben erwähnten
Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et
al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, und Browse
et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145 beschrieben extrahiert.
Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse
ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology,
Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie,
William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide – Ayr, Scotland:
Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library;
1); "Progress in
Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) – 16 (1977)
u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
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Zusätzlich zur
Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere
Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion
der gewünschten
Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um
die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen.
Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z.B.
Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere
Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums,
Analyse der Produktion üblicher
Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der
Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied
Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F.
Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN:
0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
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Ein
Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester;
GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie;
TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
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Der
unzweideutige Nachweis für
das Vorliegen von Fettsäureprodukten
kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren
erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben
von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances
on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee,
119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren,
Lipide 33:343-353).
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Das
zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen
in der Glasmühle,
flüssigen Stickstoff
und Mahlen oder über
andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss
nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua
dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und
erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol
mit 2 % Dimethoxypropan für
1 Std. bei 90°C,
was zu hydrolysierten Öl-
und Lipidverbindungen führt,
die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether
extrahiert und schließlich
einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack,
WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten
zwischen 170°C
und 240°C
für 20
min und 5 min bei 240°C unterworfen.
Die Identität
der erhaltenen Fettsäuremethylester
muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen
erhältlich
sind (d.h. Sigma), definiert werden.
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Pflanzenmaterial
wird zunächst
mechanisch durch Mörsern
homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
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Dann
wird 10 min auf 100°C
erhitzt und nach dem Abkühlen
auf Eis erneut sedimentiert. Das Zellsediment wird mit 1 M methanolischer
Schwefelsäure
und 2 % Dimethoxypropan 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide
transmethyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden
in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie
mit einer Kapillarsäule
(Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und
einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert.
Die Identität
der Fettsäuremethylester
wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME-Standards (Sigma) bestätigt. Die
Identität
und die Position der Doppelbindung kann durch geeignete chemische
Derivatisierung der FAME-Gemische
z.B. zu 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998) mittels
GC-MS weiter analysiert werden.
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Äquivalente:
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Der
Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen
erfindungsgemäßen spezifischen
Ausführungsformen
feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen
von den Patentansprüchen
umfasst sein.
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Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.