DE102004029709A1

DE102004029709A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß

Info

Publication number: DE102004029709A1
Application number: DE200410029709
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Kahlert; Bernd-Ulrich Wilhelm
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2024-06-22
Also published as: DE102004029709B4

Abstract

Vorrichtung und Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß, mit einem über einen Magnetantrieb in Pendelbewegungen versetzbaren Pendel-Rührer, mit einem Membran-Korb, der einen Träger aufweist, der eine aus mindestens einer mikroporösen Hohlfaser gebildete Begasungsmembran zur Begasung eines in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturmediums trägt, und der innerhalb des Kulturgefäßes an einer Verschlussplatte mit Durchführungen zur Gaszufuhr und Gasabfuhr, die über flexible Schlauchverbindungen mit der Begasungsmembran verbunden sind, pendelnd aufgehängt ist, wobei der Träger des Membran-Korbes zusätzlich zu der Begasungsmembran mit einer mikroporösen membranartigen Ummantelung versehen ist, die mit einem lösbaren Bodenverschluss und mit einem Deckelelement einen Behälter zur Aufnahme von Zell-Trägermaterialien bildet, und wobei das Deckelement eine zentrale Durchführung aufweist, die mittels einer flexiblen Schlauchverbindung mit einer zentralen Durchführung an der Verschlussplatte verbunden ist, über die der mit dem Zell-Trägermaterial befüllte Membran-Korb direkt mit den zu kultivierenden Zellen beimpfbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß, mit einem über einen Magnetantrieb in Pendelbewegungen versetzbaren Pendel-Rührer, mit einem Membran-Korb, der einen Träger aufweist, der eine aus mindestens einer mikroporösen Hohlfaser gebildete Begasungsmembran zur Begasung eines in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturmediums trägt, und der innerhalb des Kulturgefäßes an einer Verschlussplatte mit Durchführungen zur Gaszufuhr und Gasabfuhr, die über flexible Schlauchverbindungen mit der Begasungsmembran verbunden sind, pendelnd aufgehängt ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß, mit einem über einen Magnetantrieb in Pendelbewegungen versetzbaren Pendel-Rührer, mit einem Membran-Korb, der einen Träger aufweist, der eine aus mindestens einer mikroporösen Hohlfaser gebildete Begasungsmembran zur Begasung eines in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturmediums trägt, und der innerhalb des Kulturgefäßes an einer Verschlussplatte mit Durchführungen zur Gaszufuhr und Gasabfuhr, die über flexible Schlauchverbindungen mit der Begasungsmembran verbunden sind, pendelnd aufgehängt ist.

Aus der DE 92 15 153 U1 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen bekannt. Die Vorrichtung besteht aus einem Kulturgefäß, mit einem Deckel, an dem ein Pendel-Rührer aufgehängt ist. Der Pendel-Rührer weist einen Membran-Korb mit einem hohlzylinderförmigen Träger auf, auf dem hydrophobe Membranhohlfäden schraubenartig aufgewickelt sind. Der Membran-Korb wird an seinem oberen Ende von elastischen Schläuchen gehalten, die mit Durchführungen in dem Deckel, zur Gaszufuhr und Gasabfuhr zur Versorgung der durch die Membranhohlfäden gebildeten Begasungsmembran, verbunden sind. Das Kulturgefäß ist in einen Inkubator aufgenommen, in dem die Begasungsmembran mittels einer Membranpumpe mit der Inkubatoratmosphäre speisbar ist. Im unteren Bereich des Membranträgers ist ein Magnetkern angeordnet, der von einer Magnetanordnung mit Drehantrieb außerhalb des Kulturgefäßes beaufschlagbar ist. Über die Drehung der Magnetanordnung in Wirkverbindung mit dem Magnetkern, ist der Pendel-Rührer zur Durchmischung des Kulturmediums in kreisende Pendelbewegungen versetzbar, um ein Sedimentieren der Zellen am Gefäßboden, was deren Absterben durch Sauerstoff- und Nährstoffmangel verursachen würde, zu verhindern. Der Pendel-Rührer hat gegenüber herkömmlichen Rührwerken, die innerhalb des Kulturgefäßes direkt in der Kulturflüssigkeit angeordnet sind den Vorteil, dass er eine für die zu kultivierenden Zellen schonendere Durchmischung gewährleistet. Über die Begasungsmembran wird eine bedarfsgerechte Sauerstoffversorgung der Zellen bei der Zellteilung sichergestellt, um möglichst gute Wachstumsbedingungen in dem Kulturgefäß zu ermöglichen. Die Begasungsmembran hat zudem den Vorteil, das sie eine blasenfreie und damit gegenüber den scherkraftempfindlichen Zellen scherkraftarme Einspeisung des Sauerstoffs ermöglicht.

Aus der EP 0172 478 B1 ist eine vergleichbare Vorrichtung bekannt, bei der das Kulturgefäß jedoch nicht in einen Inkubator aufgenommen ist, über den die Begasungsmembran mit einer Inkubatoratmosphäre versorgt wird.

Für die Kultivierung von Zellen, insbesondere zur Produktion von Antikörpern aus tierischen Zellen in kleineren Mengen zu Versuchzwecken oder zur Vorkulturherstellung für Bioreaktoren, haben sich die bekannten Vorrichtungen mit Pendel-Rührer und Begasungsmembran, die beispielsweise unter der Bezeichnung SuperSpinner der Sartorius BBI Systems GmbH im Handel sind, bewährt.

Nachteilig bei den bekannten Vorrichtungen mit Pendel-Rührer ist, dass sie nicht ohne weiteres zur Kultivierung von Zellen geeignet ist, die für ein effektives Wachstum eine feste Unterlage benötigen.

Weiterhin ist aus der DE 29 40 446 A1 eine Vorrichtung zur Zell-Kultivierung bekannt, bei der in einem Kulturgefäß ein feststehender zylinderförmiger doppelwandiger Hohlkörper aus Stahl, dessen Ober- und Unterseite mit Sieben begrenzt ist, als ein Wärmetauscher zur Temperierung des Kulturmediums ausgebildet ist. Der Hohlkörper ist mit einem permeablen Silikonschlauch umwickelt, der mit Druckluft gespeist wird, durch dessen Wände durch Diffusion das Kulturmedium mit Sauerstoff angereichert wird. Das Stahlrohr ist mit kleinen Kunststoffkugeln aufgefüllt, die als Zell-Träger, sogenannte Carrier, wirken, auf den die Zell-Kulturen wachsen. Zur Durchmischung des Kulturmediums ist in dem Kulturgefäß ein drehbarer Propeller angeordnet, der über einen äußeren Motor antreibbar ist.

Die bekannte Vorrichtung hat den Vorteil einer relativ scherkraftarmen Sauerstoffzufuhr durch die Silikon-Schlauchwicklung und ist zur Zell-Kultivierung mit Carriern prinzipiell geeignet, nachteilig bei der bekannten Vorrichtung ist jedoch, dass die Anlagerung der zu kultivierenden Zellen an die Carrier relativ uneffektiv ist, da die Zellen in dem Kulturmedium in dem gesamtem Kulturgefäß gleichmäßig verteilt und damit relativ niedrig konzentriert sind. Dadurch werden erst nach und nach die Carrier mit Zellen besetzt. Weiterhin wirkt sich die nicht sehr zellschonende Durchmischung mit dem Propeller aus. Auch die Begasung ist nicht sehr effektiv, da der durch die Schlauchwände des Silikonschlauches diffundierte Sauerstoff zunächst das Stahlrohr umströmen muss, um dann über die Siebe die Carrier-Füllung zu erreichen. Schließlich ist die Handhabung der Vorrichtung relativ umständlich, da zur Befüllung des Kulturgefäßes mit dem Kulturmedium und den Zellen, bzw. zum Austausch und zur Entnahme, der komplette Deckel des Kulturgefäßes abgenommen werden muss.

Schließlich ist aus der US 5 501 971 A eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Zell-Kultivierung bekannt, bei dem ein mit einem Zell-Trägermaterial befüllter Korb mit durchlässigen Seitenwänden und Sieben als obere und untere Begrenzung in einem Kulturgefäß angeordnet ist. Weiterhin ist ein Rührwerk vorgesehen, dessen Welle durch den Hohlzylinders hindurchführt. Zur Einspeisung der Kulturflüssigkeit führt ein erstes Zuführrohr an das obere Sieb und ein zweites Zuführrohr durch den Korb hindurch an die Unterseite des Korbes. Durch das Rührwerk wird der Korb mit der in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturflüssigkeit um- und durchströmt.

Nachteilig bei der bekannten Vorrichtung ist, das keine aktive Begasung des Korbes vorgesehen ist. Dadurch ist keine optimale Sauerstoffversorgung des Zell-Materials gewährleistet, wodurch insbesondere das Zellwachstum auf den Carriern eingeschränkt ist. Weiterhin ist durch den internen Rührer die Durchmischung weniger zellschonend. Weiterhin ist die Konstruktion mit zwei Zuführungsrohren und der durch den Korb führenden Propellerachse relativ aufwendig. Auch hier ist die Handhabung des Kulturgefäßes relativ umständlich, da zur Befüllung des Korbes mit den Carriern, bzw. zu deren Austausch, mindestens eine Abschirmung mit mindestens einer Rohr-Durchführung abgenommen werden muss.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die bekannten Vorrichtungen zur Zell-Kultivierung so weiterzuentwickeln, dass sie bei der zellschonenden und scherkraftarmen Arbeitsweise der Pendel-Rührer mit Begasungsmembran für die Verwendung mit Zell-Trägermaterialien geeignet sind, und dass sie eine einfache und effektive Handhabung zur Befüllung mit den Zell-Trägermaterialien sowie zur Zuführung/Entnahme der Kulturmedien und/oder der kultivierten Zellen und/oder der daraus erzeugten Wirkstoffe ermöglichen.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass der Träger des Membran-Korbes zusätzlich zu der Begasungsmembran mit einer mikroporösen membranartigen Ummantelung versehen ist, die mit einem lösbaren Bodenverschluss und mit einem Deckelelement einen Behälter zur Aufnahme von Zell-Trägermaterialien bildet, und dass das Deckelelement eine zentrale Durchführung aufweist, die mittels einer flexiblen Schlauchverbindung mit einer zentralen Durchführung an der Verschlussplatte verbunden ist, über die der mit dem Zell-Trägermaterial befüllte Membran-Korb direkt mit den zu kultivierenden Zellen beimpfbar ist.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen dargelegt.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird ein kompaktes System zur Zell-Kultivierung zur Verfügung gestellt, dass die Vorteile der zellschonenden und scherkraftarmen Durchmischung der Kulturflüssigkeit in einem Kulturgefäß mittels eines Pendel-Rührers sowie die blasenfreie effektive Begasung mittels einer Hohlfaser-Begasungsmembran mit der Möglichkeit zur Verwendung von Zell-Trägermaterialien (Carrier) zur Vermehrung von Zellkulturen, die eine feste Unterlage, bzw. Oberfläche, zum Wachstum benötigen, vereint. Der Membran-Korb des Pendel-Rührers wird in seiner Funktionsweise erweitert, indem er nicht mehr nur als ein Träger der Begasungsmembran dient, sondern nun auch Zell-Trägermaterialien als ein Behälter aufnehmen kann.

Die Vorrichtung ist insbesondere zum Einsatz mit sogenannten Micro-Carriern geeignet. Dies sind millimeterkleine Feststoffkörper mit definierter Geometrie (beispielsweise Kugeln, Scheiben, Würfel) aus Materialien (beispielsweise Polystyrol), die als adherentes Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, beispielsweise von tierischen Zellen, besonders effektiv sind. Durch die Micro-Carrier wird den Zellen eine sehr große Oberfläche zum Wachstum zur Verfügung gestellt.

Die Handhabung und Befüllung der Vorrichtung ist besonders einfach. Alle notwendigen Zuführungen sind in der Verschlussplatte angeordnet. Insbesondere ist es möglich, über die zentrale Zuführung die in dem Membran-Korb befindlichen Micro-Carrier direkt mit den Zellen zu beimpfen. Die Kultur- bzw. Nährflüssigkeit durchströmt bei der Durchmischung dann den Korb und gewährleistet, dass sich die zu kultivierenden Zellen optimal auf die vorhandenen Micro-Carrier verteilen und mit Nährstoff versorgt werden. Dadurch, dass bei der Beimpfung die Zellen direkt dem Korb zugeführt werden, stehen sie unmittelbar in konzentrierter Form zur Aufnahme auf den Micro-Carriern zur Verfügung. Dadurch wird der Kultivierungsprozess beschleunigt und die Carrier effektiver ausgenutzt.

Der Membran-Korb ist vorzugsweise als ein hohlzylinderförmiger Behälter ausgebildet. Grundsätzlich sind jedoch auch andere Behälterformen denkbar.

Für die Befüllung des Membran-Korbes mit den Micro-Carriern kann die Bodenplatte, bzw. der Bodenverschluss des Korbes gelöst und herausgenommen werden. Dies vereinfacht die Befüllung des Korbes gegenüber einer Befüllung von der Korb-Oberseite, bei der umständlich mit den Zuführungen hantiert werden muss. Insbesondere beim Einsatz der Vorrichtung für Versuchzwecke, kann der Anwender/Kunde leicht und schnell die Korb-Füllung austauschen, um verschiedene Carrier zum Einsatz zu bringen. Selbstverständlich ist natürlich auch eine Verwendung ohne eine Carrier-Füllung möglich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Ummantelung des Membran-Korbes mit einer Porengröße ausgebildet, die für das Kulturmedium und das Begasungsmedium durchlässig ist, und die für die Zellkulturen und/oder einen durch die Zell-Kultivierung erzeugten Wirkstoff undurchlässig sein kann.

Dadurch, dass die Ummantelung für das Kulturmedium und das Begasungsmedium durchlässig ist, aber für die vermehrten Zellen, bzw. Wirkstoffe undurchlässig sein kann, kann einerseits die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung der Kulturen auf den Micro-Carriern gewährleistet und andererseits eine Konzentrierung und ein Verbleib der bereits kultivierten Zellen / des erzeugten Wirkstoffes in dem Korb ermöglicht werden, so dass das kultivierte Medium in konzentrierter Form über die zentrale Zuführung entnommen werden kann. Ummantelungen mit verschiedenen Porengrößen können vorgesehen sein, bzw. vorgehalten werden, um verschiedene Membrankörbe entsprechend den Anforderungen herzustellen.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Verschlussplatte eine Durchführung auf, an der ein Steigrohr angeordnet ist, das bei auf das Kulturgefäß aufgesetzter Verschlussplatte außerhalb des Membran-Korbes in das eingefüllte Kulturmedium ragt.

Über das Steigrohr kann das Kulturmedium, bzw. das Zell-Material, alternativ zu der zentralen Verbindung mit dem Korb, aus dem Kulturgefäß entnommen werden, bzw. dem Kulturgefäß zugeführt werden. Dadurch, dass die Durchführung mit dem Steigrohr an der Verschlussplatte angeordnet ist, können dazu auch einfache kostengünstige Laborflaschen zum Einsatz kommen. Seitenstutzen mit zusätzlichen Anschlüssen in den Kulturflaschen können entfallen. Dadurch werden Kosten gespart und zudem die Handhabung weiter vereinfacht.

Die Verschlussplatte kann mit dem Öffnungshals einer Standard-Laborflasche kompatibel sein. Sie wird dann einfach auf die Öffnung aufgesetzt und beispielsweise mit einer, entsprechend des Verschlussplatten-Durchmessers durchbohrten Standard-Verschraubkappe, dicht verschlossen. Dadurch werden weitere Kosten eingespart, insbesondere, wenn in Versuchsreihen mehrere der Vorrichtungen gleichzeitig zum Einsatz kommen sollen. Grundsätzlich ist es auch möglich, dass dem Kunden Systeme mit Verschlussplatten verschiedenen Durchmessers zur Auswahl zur Verfügung gestellt werden. Es können auch weitere, vom Kunden frei verwendbare Durchführungen, bzw. Anschlüsse an der Verschlussplatte vorgesehen sein. Die wesentlichen Bauteile des Membran-Korbes, d.h. Träger, Deckel, Boden und Ummantelung, können kostengünstig und gewichtssparend aus Kunststoff hergestellt sein.

Die Begasungsmembran kann als ein Faserbündel aus einer Mehrzahl von Hohlfasern ausgebildet sein, um eine besonders effektive und gleichmäßige Begasung zu ermöglichen. Die Begasungsmembran kann wendelförmig an der Ummantelung des Membran-Korbes entlang geführt und an dieser fixiert sein. Die Hohlfaser lässt sich besonders einfach um die Außenseite der Ummantelung wickeln. Grundsätzlich ist jedoch auch möglich, dass die Hohlfaser auf der Innenseite der Ummantelung direkt auf dem Träger aufgewickelt ist. Die Ummantelung des Membran-Korbes kann aus einem für die Zellkulturen antihaftendem Material bestehen, damit eine Anlagerung von Zellen an der Ummantelung und ein Verstopfen des Ummantelung-Gewebes sicher verhindert wird.

Die bekannten Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß haben die oben beschrieben Nachteile.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die bekannten Verfahren so zu verbessern, dass sie effektiver arbeiten.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 10 dadurch gelöst, dass der zusätzlich mit einer mikroporösen membranartigen Ummantelung ausgebildete Membran-Korb über einen herausnehmbaren Bodenverschluss mit einem Zell-Trägermaterial befüllt wird, und dass der mit dem Zell-Trägermaterial befüllte Membran-Korb direkt durch eine zentrale Schlauchverbindung zwischen einem Deckelelement des Membran-Korbes und der Verschlussplatte mit den zu kultivierenden Zellen, beimpft wird.

Durch die Befüllung des Membran-Korbes mit Micro-Carriern über den herausnehmbaren Bodenverschluss und die direkte Beimpfung der Carrier mit dem Zellmaterial über den zentralen Anschluss wird eine schnelle, effektive und kostengünstige Arbeitsweise bei der Zell-Kultivierung mit Hilfe von Micro-Carriern ermöglicht. Die Entnahme der Kulturen, bzw. des angereicherten Kulturmediums nach der Kultivierung, d.h. nach Beendigung des sogenannten batch-Prozesses oder zur zwischenzeitlichen Probenahme, kann entweder direkt über die zentrale Schlauchverbindung, bzw. Zuführung oder ggf. über ein außerhalb des Korbes in die Kulturflüssigkeit hineinragendes Steigrohr erfolgen. Dadurch ist es möglich, die Kultur, bzw. den Wirkstoff, mittels einer entsprechenden Porengröße der Ummantelung nur oder überwiegend innerhalb des Korbes zu konzentrieren und dann in konzentrierter Form zu entnehmen oder in der herkömmlichen Weise die Kulturflasche zu entleeren.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.
In den Zeichnungen zeigen:
1a: Ein Pendel-Rührer mit einem erfindungsgemäßen Membran-Korb in einer perspektivischen Draufsicht,
1b: ein Abschnitt des Membran-Korbes mit einem Bodenverschluss in einer perspektivischen Ansicht von unten,
2a: den Membran-Korb in einer Seitenansicht im Schnitt,
2b: den Bodenverschluss des Membran-Korbes in einer Draufsicht und
2c: ein Deckelelement des Membran-Korbes in einer Draufsicht.
Eine Vorrichtung zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß besteht im Wesentlichen aus einem Pendel-Rührer 1 mit einem ummantelten Membran-Korb 2.
In 1a ist der Pendel-Rührer 1 mit einer Verschlussplatte 3 dargestellt. Der Membran-Korb 2 ist über flexible Schlauchverbindungen 4, 5, 6 mit der Verschlussplatte 3 verbunden, wodurch eine pendelnde Aufhängung gebildet wird. Dabei sind die äußeren Schläuche 4, bzw. 5 vorteilhaft wendelförmig über Kreuz angeordnet, mit ausreichend Spielraum, um dem Pendel-Rührer 1 eine freie Pendelbewegung zu ermöglichen. Die Verschlussplatte 3 kann auf den Öffnungshals eines nicht dargestellten Kulturgefäßes, vorteilhaft einer Standard-Laborflasche (beispielsweise mit 500 oder 1000 ml Volumen) aufgesetzt und mit einer nicht dargestellten durchbohrten Verschraubkappe dicht mit dem Flaschenhalsgewinde verschraubt werden. Die Schlauchverbindungen 4 und 5 enden verschlussplattenseitig an zwei Durchführungen 7, bzw. 8 der Verschlussplatte 3 und membrankorbseitig an den Oberseiten zweier Durchführungen 13, bzw. 14, die an einer als eine rechteckige Platte ausgebildeten Halterung 16 angeordnet sind. Weiterhin ist die zentrale Schlauchverbindung 6 angeordnet, die verschlussplattenseitig an eine zentrale Durchführung 9 in der Verschlussplatte 3 und membrankorbseitig an eine zentrale Durchführung 15 angeschlossen ist. Alle Durchführungen sind als Bohrungen ausgebildet, in die jeweils ein Rohr-Stutzen eingesetzt ist. Die Stutzen sind bei Bedarf mit entsprechenden Verschlusskappen verschließbar.
Zum Membran-Korb 2 hin sind die Schlauchverbindungen 4, bzw. 5 über die Stutzen 13, bzw. 14 mit einer Begasungsmembran 18 verbunden. Die Begasungsmembran 18 ist aus vier Hohlfaser-Membranen, beispielsweise aus vier „Oxyphan Plus"-Fasern, gebildet, deren Faserenden von unten in die Stutzen 13, bzw. 14 eingeführt sind. Die Halterung 16 ist auf dem oberen Ende eines Rohrstücks 17 befestigt. Das untere Ende des Rohstücks 17 ist mit einem Deckelelement 19 verbunden. Im Inneren des Rohrstücks 17 verläuft die Durchführung 15, die über eine Bohrung 31 in dem Deckelelement 19 mit dem Membrankorb 2 verbunden ist.
Die Schlauchverbindungen 4, bzw. 5 dienen zur Gaszufuhr, bzw. zur Gasabfuhr der Begasungs-Membran 18. Die zentrale Verbindung 6 dient zur Beimpfung/Entnahme von Zellen und/oder Kulturmedium direkt in, bzw. aus dem Membran-Korb 2. In der Verschlussplatte 3 sind weitere Durchführungen, bzw. Stutzen 10, 11, 12 vorgesehen, die als Anschlüsse, beispielsweise zur Anordnung eines (nicht dargestellten) Steigrohrs oder zur freien Verfügung des Anwenders stehen.
Der hohlzylinderförmige Membran-Korb 2 besteht aus einem Träger 20 (2a), der mit drei, jeweils im Winkel von 120° kreisförmig angeordneten Stegen 21, 22, 23, die auf der Oberseite mit dem Deckelelement 19 (2c) und auf der Unterseite mit einem Bodenverschluss 24 (1b und 2b) verbunden sind, ein Gerüst bildet. Das Gerüst 20 ist mit einem, für die zu kultivierenden Zellen antihaftendem, mikroporösen Filtergewebe 30, mit einer Porengröße von beispielsweise 100μm, ummantelt. Das Filtergewebe 30 liegt an den Rändern des Deckels 19 und des Bodens 24 an und ist mit diesen Rändern verbunden, vorteilhaft verklebt. Die Hohlfaser-Membran 18 ist mit dem einen Ende von der Gaszufuhr 7, bzw. 13 kommend, außen über die Ummantelung 30 geradlinig nach unten in Richtung Bodenverschluss 24 geführt und mit Klebepunkten entlang eines der Stege 21, 22, 23 fixiert, und ist dann von unten nach oben wendelförmig um die Ummantelung 30 gewickelt und zur Gasabfuhr 14, bzw. 8 zurückgeführt. Die Bauteile des Gerüsts 20, der Verschlussplatte 3 und der Halterung 16 sind vorteilhaft aus Polycarbonat hergestellt.
Der Bodenverschluss 24 besteht aus einem äußeren Ring 25 und einer inneren Bodenplatte 26. Die Bodenplatte 26 ist über einen Gewindestift 27 (M3) mit dem Ring 26 lösbar verbunden. In einem Stutzen 28 der Bodenplatte 26 ist ein Magnetkern 29 angeordnet, der die Platte nach innen und außen durchragt. Innen ist der Magnetkern 29 nach oben von einem Abschuss des Stutzens 28 abgedeckt Der Magnetkern 29 bildet mit einer nicht dargestellten drehbaren äußeren Magnetanordnung einen Magnetantrieb, über den der in dem Kulturgefäß aufgehängte Pendel-Rührer 1 in kreiselnde Pendelbewegungen versetzbar ist, um die Kulturflüssigkeit zu durchmischen.
Die gesamte Vorrichtung kann zur Sterilisation in einem Dampf-Autoklaven autoklaviert werden.
Ein Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß beruht im Wesentlichen auf einer direkten Beimpfung eines mit Micro-Carriern gefüllten, ummantelten Membran-Korbes 2, eines pendelnd in dem Kulturgefäß aufgehängten Pendel-Rührers 1.
Das Verfahren wird mit der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt.
Dazu wird zunächst der Bodenverschluss 24 gelöst und herausgenommen, der Membran-Korb 2 mit den gewünschten Micro-Carriern gefüllt und der Membran-Korb 2 wieder verschlossen. Anschließend wird der Pendel-Rührer 1 in das Kulturgefäß eingehängt, mit der Verschlussplatte 3 verschlossen und dicht verschraubt. Anschließend kann das Kulturgefäß autoklaviert werden und nach dem Autoklavieren mit Medium aufgefüllt werden. Über die zentrale Schlauchverbindung 6 wird anschließend der Membran-Korb 2 mit der zu kultivierenden Zelllinie, beispielsweise von Säugetierzellen zur Produktion von Antikörpern, direkt auf die Micro-Carrier beimpft. Die Zellen können sich nun unmittelbar an die Micro-Carrier anlegen und mit ihrer Wachstumsphase beginnen. Über die Begasungs-Membran 18 werden die Zellen ausreichend mit Sauerstoff versorgt, der durch die Hohlfaserwände und das Filtergewebe 30 in das Korbinnere diffundiert. Das Filtergewebe 30 ist ebenso für das Kulturmedium zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen durchlässig. Das Filtergewebe 30 kann so ausgelegt sein, dass die kultivierten Zellen (oder ein produzierter Wirkstoff) in dem Membran-Korb 2 zurückgehalten werden, und sich nicht oder nur verringert in der Kulturflüssigkeit außerhalb des Korbes 2 verteilen.
Durch das antihaftende Material des Filtergewebes 30 wird ein Anhaften der Zellen auf der Ummantelung 30 verhindert.
Die Durchführungen in der Verschlussplatte 3 werden mit den erforderlichen Anschlüssen (Gaszufuhr/Gasabfuhr) verbunden und der Magnetantrieb in Betrieb gesetzt. Zur Temperierung und Begasung (Sauerstoffversorgung) kann das gesamte System in einem Brutschrank angeordnet sein und der Kultivierungsprozess (batch Prozess), wie z.B. bei dem herkömmlichen SuperSpinner-System in der DE 92 15 153 U1 beschrieben, durchgeführt werden. Zur zwischenzeitlichen Kontrolle, oder zur Entnahme und Leerung nach der Beendigung des „batch"-Prozesses, ist es erfindungsgemäß möglich, die nun in hochkonzentrierter Form innerhalb des Membran-Korbes 2 vorliegenden Zellen über die zentrale Verbindung 6 zu entnehmen.

Claims

Vorrichtung zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß, mit einem über einen Magnetantrieb in Pendelbewegungen versetzbaren Pendel-Rührer, mit einem Membran-Korb, der einen Träger aufweist, der eine aus mindestens einer mikroporösen Hohlfaser gebildete Begasungsmembran zur Begasung eines in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturmediums trägt, und der innerhalb des Kulturgefäßes an einer Verschlussplatte mit Durchführungen zur Gaszufuhr und Gasabfuhr, die über flexible Schlauchverbindungen mit der Begasungsmembran verbunden sind, pendelnd aufgehängt ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (20) des Membran-Korbes (2) zusätzlich zu der Begasungsmembran (18) mit einer mikroporösen membranartigen Ummantelung (30) versehen ist, die mit einem lösbaren Bodenverschluss (24) und mit einem Deckelelement (19) einen Behälter zur Aufnahme von Zell-Trägermaterialien bildet, und dass das Deckelelement (19) eine zentrale Durchführung (15) aufweist, die mittels einer flexiblen Schlauchverbindung (6) mit einer zentralen Durchführung (9) an der Verschlussplatte (3) verbunden ist, über die der mit dem Zell-Trägermaterial befüllte Membran-Korb (2) direkt mit den zu kultivierenden Zellen beimpfbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zell-Trägermaterial als Micro-Carrier ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ummantelung (30) des Membran-Korbes (2) mit einer Porengröße ausgebildet ist, die für das Kulturmedium und das Begasungsmedium durchlässig ist, und die für die Zellkulturen und/oder einen durch die Zell-Kultivierung erzeugten Wirkstoff undurchlässig ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Verschlussplatte (3) eine Durchführung (10, 11, 12) aufweist, an der ein Steigrohr angeordnet ist, das bei auf das Kulturgefäß aufgesetzter Verschlussplatte (3) außerhalb des Membran-Korbes (2) in das eingefüllte Kulturmedium ragt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass die Begasungsmembran (18) als ein Faserbündel aus einer Mehrzahl von Hohlfasern ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Begasungsmembran (18) wendelförmig um die Außenseite der Ummantelung (30) des Membran-Korbes (2) gewickelt ist und an der Ummantelung (30) fixiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Verschlussplatte (3) mit dem daran aufgehängten Pendel-Rührer (1) mit dem Durchmesser des Öffnungshalses einer Standard-Laborflasche kompatibel ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Bauteile des Membran-Korbes (2) und der Verschlussplatte (3) aus Kunststoff hergestellt sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass die Ummantelung (30) des Membran-Korbes (2) aus einem für die Zellkulturen antihaftendem Material besteht.
Verfahren zur Zell-Kultivierung in einem Kulturgefäß, mit einem über einen Magnetantrieb in Pendelbewegungen versetzbaren Pendel-Rührer, mit einem Membran-Korb, der einen Träger aufweist, der eine aus mindestens einer mikroporösen Hohlfaser gebildete Begasungsmembran zur Begasung eines in dem Kulturgefäß befindlichen Kulturmediums trägt, und der innerhalb des Kulturgefäßes an einer Verschlussplatte mit Durchführungen zur Gaszufuhr und Gasabfuhr, die über flexible Schlauchverbindungen mit der Begasungsmembran verbunden sind, pendelnd aufgehängt ist, dadurch gekennzeichnet, dass der zusätzlich mit einer mikroporösen membranartigen Ummantelung (30) ausgebildete Membran-Korb (2) über einen herausnehmbaren Bodenverschluss (24) mit einem Zell-Trägermaterial befüllt wird, und dass der mit dem Zell-Trägermaterial befüllte Membran-Korb (2) direkt durch eine zentrale Schlauchverbindung (6) zwischen einem Deckelelement (19) des Membran-Korbes (2) und der Verschlussplatte (3) mit den zu kultivierenden Zellen, beimpft wird.
Verfahren nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass die vermehrten, in dem Kulturmedium innerhalb des Membran-Korbes (2) konzentrierten Zellen und/oder mit Hilfe der Zell-Kultivierung erzeugten Wirkstoffe, über die zentrale Schlauchverbindung (6) aus dem Kulturgefäß extrahiert werden.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 dadurch gekennzeichnet, dass die vermehrten Zellen und/oder mit Hilfe der Zell-Kultivierung erzeugten Wirkstoffe, über ein an der Verschlussplatte (3) angeordnetes Steigrohr, das außerhalb des Membran-Korbes (2) in die Kulturflüssigkeit ragt, extrahiert werden.