DE10151071A1

DE10151071A1 - Gegen Abbau stabilisierte Nukleinsäure

Info

Publication number: DE10151071A1
Application number: DE10151071A
Authority: DE
Inventors: Helmut Merk; Volker Erdmann; Wolfgang Stiege
Original assignee: RINA-NETZWERK fur RNA TECHNOLOGIEN GmbH; RINA NETZWERK fur RNA TECHNOL
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2002-10-02

Abstract

Die Erfindung betrifft eine gegen Abbau durch Exonukleasen stabilisierte Nukleinsäure mit folgenden Komponenten: a) einer für ein definiertes Protein codierenden Codesequenz, b) einer die Expression der Codesequenz kontrollierenden Promotorsequenz und c) zumindest einem an einem Ende der linearen Sequenz enthaltend die Komponenten a und b angefügten Molekül A, welches mit einem nicht-immobilisierten volumigen Molekül B verbunden ist.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine stabilisierte Nukleinsäu re, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung. Nukleinsäuren können DNA oder RNA, aber auch PNA sein, einzelsträngig oder doppelsträngig.

Hintergrund der Erfindung

Proteine werden für biotechnologische und medizinische Anwendungen in hoher Reinheit, insbesondere aber auch in hoher Menge, i. e. im mg- und g-Maßstab benötigt. Im Falle von größeren Proteinen ist eine klassische Synthese kaum möglich und jedenfalls unwirtschaftlich.

Eine Möglichkeit der Herstellung von Proteinen in grö ßerem Maßstab ist die gentechnische Herstellung. Hier zu wird klonierte DNA, welche für das gewünschte Pro tein codiert, als Fremd DNA in Form von Vektoren bzw. Plasmiden in Zellen, insbesondere prokaryontische Zel len eingeschleust. Diese Zellen werden dann kulti viert, wobei die durch die Fremd DNA codierten Protei ne exprimiert und gewonnen werden. Zwar lassen sich auf diesem Wege bereits beachtliche Mengen an Protein gewinnen, die insofern bekannten Maßnahmen, insbeson dere die Klonierung, sind jedoch aufwendig. Zudem sind die Zellen meist nur transient transfiziert und zudem nur in Ausnahmefällen stabil immortalisiert. Eine kon tinuierliche Produktion von Protein erfordert daher einen stetigen Nachschub an frischen Zellen, welche wiederum mittels der vorstehend beschriebenen aufwen digen Maßnahmen hergestellt werden müssen.

Ein weiterer Ansatz ist die sogenannte zellfreie in vitro Proteinbiosynthese. Hierbei werden biologisch aktive Zellextrakte eingesetzt, welche von natürli cherweise vorliegenden zellulären Nukleinsäuren weit gehend befreit sind und welche mit Aminosäuren, ener gieliefernden Substanzen und zumindest einer Nuklein säure versetzt werden. Die zugesetzte Nukleinsäure codiert dabei für das herzustellende Protein. Wenn als Nukleinsäure DNA eingesetzt wird, ist die Anwesenheit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase erforderlich. Es kann natürlich auch direkt RNA, mRNA, eingesetzt wer den. Auf diesem Wege lassen sich nicht nur solche Pro teine in kurzer Zeit und mit vergleichsweise moderatem Aufwand herstellen, die auch gentechnisch herstellbar sind, vielmehr können sogar Proteine hergestellt wer den, die beispielsweise zelltoxisch sind und folglich mtt den üblichen gentechnischen Zellsystemen überhaupt nicht nennenswert exprimierbar sind. Allerdings ist es notwendig, die zugesetzte Nukleinsäure selbst herzu stellen, was mittels gentechnischer Methoden wiederum aufwendig ist. Hinzu kommt, daß es oft wünschenswert ist, nicht natürlicherweise mit einer Proteinsequenz verknüpfte regulatorische Sequenzen sowie sonstige Sequenzen, wie Spacer, einzuführen, um die Effizienz der Proteinsynthese zu verbessern.

Eine Alternative zur gentechnischen Herstellung von vollständigen, in der zellfreien Proteinbiosynthese einsetzbaren Nukleinsäuren ist die sogenannte Expressions-PCR. In diesen Zusammenhängen spielt die effiziente Einführung regulatorischer Sequenzen (sowie anderer, die Translationseffizienz fördernder Sequen zen) in eine herzustellende Nukleinsäure im Rahmen der Amplifikation eine besondere Rolle. Für die Einführung solcher weiterer Sequenzen in eine Ziel-Nukleinsäure sind sehr lange PCR Primer notwendig. Lange Primer sind einerseits in der Herstellung wiederum aufwendig und erhöhen andererseits die Wahrscheinlichkeit der Generierung inhomogener PCR-Produkte.

Unabhängig von der Herstellungsweise der Nukleinsäuren für die zellfreie Proteinbiosynthese stellt sich die folgende grundsätzliche Problematik. Im Rahmen dieser Synthesemethode für Proteine werden sogenannte Zellly sate verwendet, i. e. Extrakte aus Zellen, welche die für die Proteinsynthese wesentlichen Komponenten und Zellbausteine enthalten. Der Einsatz solcher Zelllysate bedingt aber auch, daß in den Ursprungszellen natürli cherweise vorhandene (Exo-)Nukleasen in das Lysat gleichsam verschleppt werden. Diese Nukleasen bewirken einen Abbau der für die Proteinsynthese hergestellten und eingesetzten Nukleinsäuren und reduzieren folglich deren Halbwertszeit und letztendlich somit die Pro teinausbeute. Dies stört aus offensichtlichen Gründen. Die gleiche Problematik stell sich natürlich auch im Falle der zellulären Systeme.

Stand der Technik

Aus der Praxis ist es bekannt, im Rahmen der zellfrei en Proteinbiosynthese Zelllysate zu verwenden, die natürlicherweise eine geringe Menge an (Exo-)Nuklea sen enthalten. Ein Beispiel hierfür ist das Escheri chia coli S-30 Lysat. Zwar kann dadurch eine gegenüber anderen Lvsaten verbesserte Halbwertszeit der intakten Nukleinsäure in dem Synthesesystem und folglich eine Erhöhung der Proteinausbeute bei Einsatz gleicher Men ge an Nukleinsäure erreicht werden, jedoch findet den noch ein Abbau durch Nuklease in störendem Ausmaß statt.

Ebenfalls aus der Praxis ist es bekannt, zum Zwecke der Reinigung ein Ende einer Nukleinsäure mit einem Affinitätsmolekül, beispielsweise Biotin, auszustat ten. Biotin ist dann in der Lage an immobilisiertes Streptavidin zu binden, wodurch die Nukleinsäure immo bilisiert, von der Lösung und deren sonstigen Kompo nenten getrennt und danach - gereinigt - wieder von der festen Phase abgelöst wird.

Technisches Problem der Erfindung

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, Nukleinsäuren anzugeben, die beispielsweise bei Ein satz in einem zellfreien Proteinbiosynthesesystem eine verbesserte Halbwertzeit und folglich eine verbesserte Proteinausbeute erreichen.

Grundzüge der Erfindung

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er findung eine gegen Abbau durch Exonukleasen stabilisierte Nukleinsäure mit folgenden Komponenten: a) einer für ein definiertes Protein codierenden Code sequenz, b) einer die Expression der Codesequenz kon trollierenden Promotorsequenz, und c) zumindest einem an einem Ende der linearen Sequenz enthaltend die Kom ponenten a und b angefügten Molekül A, welches mit einem nicht-immobilisierten volumigen Molekül B ver bunden ist. Als volumige Moleküle B sind solche mit einem Molekulargewicht von mehr als 500, vorzugsweise mehr als 1000, vorzugsweise mehr als 10000, bezeich net. Zweckmäßigerweise handelt es sich bei den volumi nösen Molekülen B um Proteine. Bei den Molekülen A handelt es sich um vergleichsweise kleine Moleküle, welche zumindest eine freie Bindungsstelle für ein zum Moleküle A gepaartes Molekül B aufweisen. Ein Molekül B kann eine, aber auch mehrere Bindungsstellen für ein zum Molekül B gepaartes Molekül A aufweisen. Die Bin dung zwischen einem Molekül A und einem Molekül B kann sowohl nicht-kovalent als auch kovalent sein. Die Bin dung des Moleküls A an ein endständiges Nukleotid der linearen Sequenz ist zweckmäßigerweise kovalent. Wenn an sowohl am 3' als auch am 5' Ende der linearen Se quenz jeweils ein Molekül A angebracht ist, erfolgt eine Stablisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gegenüber sowohl 3'- als auch 5'-Exonukleasen.

D1e Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß sich mit modifizierten Primern, nämlich solchen, die ein Mole kül A tragen, auf einfachem Wege mittels PCR und in hoher Menge Nukleinsäuren herstellen lassen, die an zumindest einem Ende ein Molekül A tragen. Eine volu minöse Schutzgruppe zur Verhinderung eines Angriffes von Exonukleasen läßt sich dann in Form des Moleküls B einfach anhängen. Moleküle B können unschwer in der benötigten hohen Menge eingesetzt werden, da hierfür beispielsweise handelsübliche und preiswerte Proteine eingesetzt werden können.

In dem Fall, daß ein Molekül B mehrere Bindungsstellen n für ein zum Molekül B gepaartes Molekül A aufweist, kann es zweckmäßig sein, einen Teil der Bindungstel len, insbesondere n-1 Bindungstellen so abzusättigen, so daß nur noch wenige Moleküle A, insbesonder nur ein Molekül A an einem Molekül B binden. Zum Absättigen der Bindungstellen des Moleküles B können sowohl nicht an Primer gebundene Moleküle A, als auch andere Mole küle verwendet werden, die an die Bindungsstelle für die Moleküle A des Moleküles B binden. Es versteht sich, daß in der Lösung Moleküle B in der benötigten hohen Menge eingesetzt werden, daß trotz der Absätti gung jedes Molekül A eine Molekül B binden kann. Durch die Absättigung der Bindungsstellen des Moleküles B, die für die Bindungen des Moleküles B notwendig sind, kann verhindert werden, daß ein Molekül B mehrere Mo leküle A bindet, und es somit zu ein Aggregation der an Moleküle A gebundenen Primer an einem Molekül B kommt, was die Amplifikation der Nukleinsäurebasisse quenzen stören kann. Auch kann es zu einer Zusammen lagerung mehrerer amplifizierten Nukleinsäurebasissequenzen über die durch die Primer angefügten Moleküle A an einem Molekül B kommen, was die Transkription und/oder Translation der Nukleinsäurebasissequenz ersohweren und somit die translatierte Menge des durch die Nukleinsäurebasissequenz codierten Proteins verringern kann.

Um einer Zusammenlagerung mehrerer amplifizierten Nukleinsäurebasissequenzen über die durch die Primer angefügten Moleküle A an einem Molekül B zu vermin dern, insbesondere zu verhindern, kann es von Vorteil sein, die Transkription/Translation in zeitlich direk tem Anschluß an die Amplifikation durchzuführen.

Mit der Erfindung wird erreicht, daß Exonukleasen nicht mehr oder in nur sehr reduziertem Maße die zur Proteinsynthese hergestellten und eingesetzten Nu kleinsäuren angreifen und abbauen können. Dadurch wird die Halbwertszeit der in der Herstellung aufwendigen und folglich teuren Nukleinsäuren in einem Expressi onssystem beachtlich erhöht mit der Folge einer ebenso beachtlich erhöhten Ausbeute an Protein bei mengenmä ßig gleichem oder sogar reduzierten Einsatz der Nu kleinsäuren.

Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Her stellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, mit den folgenden Verfahrensstufen: 1) es wird eine lineare Sequenz enthaltend die Komponenten a) und b) herge stellt, 2) die lineare Sequenz aus Stufe 1) wird mit tels PCR amplifiziert, wobei zumindest ein Primer oder ein Primerpaar eingesetzt wird, welches das Molekül A trägt, 3) das Produkt aus Stufe 2) wird mit einer Lö sung enthaltend Moleküle B inkubiert.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform eines sol chen Verfahrens ist ein Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR, mit den folgenden Hybridisierungsschritten: a) eine Nu kleinsäurenbasissequenz wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Adapterprimer hybridisiert, b) das Pro dukt aus Stufe a) wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Verlängerungsprimer, welcher eine Verlängerungs sequenz enthält, hybridisiert, wobei aus der Nuklein säurebasissequenz eine an dem 3' und dem 5' Ende der Nukleinsäurebasissequenz um die Verlängerungssequenzen verlängerte und amplifizierte Nukleinsäuresequenz ge bildet wird und wobei vorzugsweise die in einer letz ten Amplifikationsstufe eingesetzten Primer ein Mole kül A tragen.

Als Nukleinsäurebasissequenz ist eine Sequenz bezeich net, die für ein Protein codiert. Dabei kann es sich insbesondere um ein Gen handeln, aber auch um Sequen zen aus intronlosen Genomen. Bei den Verlängerungsse quenzen kann es sich insbesondere um Sequenzen han deln, die eine regulatorische Sequenz umfassen und/o der um Sequenzen, welche eine ribosomale Bindungsse quenz enthalten. Die Adapterprimer sind vergleichswei se kurz. Eine Teil einer Adaptersequenz ist spezifisch für die Nukleinsäurebasissequenz, ein weiterer Teil ist konstant und hybridisiert jeweils einer Verlängerungssequenz.

Hieraus folgt, daß für unterschiedliche Nukleinsäure basissequenzen nicht jeweils "passende" lange Verlän gerungssequenzen eingesetzt werden müssen. Vielmehr müssen lediglich die vergleichsweise kurzen Adapter primer auf eine definierte Nukleinbasissequenz abge stimmt werden, während die Verlängerungssequenzen gleichsam universell sein können, i. e. für verschiedene Nukleinsäurebasissequenzen sind stets die gleichen bzw. einige wenige ausgewählte Verlänge rungsequenzen einsetzbar. Somit können die relativ aufwendig herzustellenden Verlängerungsequenzen einer breiten Nutzung zugeführt werden und für eine spezifi sche Nukleinsäurebasissequenz müssen lediglich die Adaptersequenzen hergestellt werden. Dies ist jedoch wenig aufwendig, da die Adaptersequenzen vergleichs weise kurz sein können.

Dies erlaubt es beispielsweise, sowohl eine regulato rische Sequenz als auch eine ribosomale Bindungsse quenz, jeweils über einen der Verlängerungsprimer, an eine Nukleinsäurebasissequenz anzufügen, und zwar so gar in einem PCR-Schritt. So kann eine Nukleinsäure erhalten werden, die eine besonders hohe Transskripti ons- und/oder Translationseffizienz in einem pro karyontischen System der zellfreien Proteinbiosynthese ergibt.

Ein besonderer Vorteil dieser Ausführungsform der Er findung ist, daß es sich um ein allgemein anwendbares Verfahren für beliebige codierende Sequenzen handelt.

Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem Verfahren zur Einstellung eines durch die Codesequenz codierten Pro teins in einem zellfreien Proteinbiosynthesesystem oder in einem zellulären Proteinbiosynthesesystem. Bezüglich der Verfahrensstufen der zellfreien Protein biosynthese wird auf die Ausführungsbeispiele verwie sen, aus welchen der Fachmann ohne weiteres die grund legenden Merkmale verallgemeinern kann.

Ausführungsformen der Erfindung

Hinsichtlich der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es bevorzugt, wenn beide Enden der linearen Sequenz mit je einem Molekül A verbunden sind, da dann vollständi ge Stabilisierung beider Enden der Sequenz gegenüber Exonukleasen gewährleistet ist.

Um die Expression nicht durch die voluminösen Moleküle B zu behindern kann es sich empfehlen, wenn zwischen den Komponenten a und/oder b und dem Molekül A oder den Molekülen A eine Spacersequenz eingerichtet ist.

Im Einzelnen kann jedes Molekül A mit je einem Molekül B verbunden sein oder es können beide Moleküle A mit einem einzigen, zumindest zwei Bindungstellen für ein Molekül A aufweisenden Molekül B verbunden sein. In ersterem Falle wird ein lineares Produkt erhalten. In letzterem Fall wird ein cirkularisiertes Produkt er halten, welches hinsichtlich der Stabilität noch wei ter verbessert sein kann.

Das Molekül A kann Biotin oder Digoxygenin und das Molekül B kann Avidin, Streptavidin oder Anti-Digoxy genin-Antikörper sein. Dies sind in großen Mengen und preiswert erhältliche Handelsprodukte.

In dem Fall, daß das Molekül Avidin Streptavi din ist, kann es zweckmäßig sein, einen Teil der Bin dungstellen n, insbesondere n-1 Bindungstellen so abzusättigen, so daß nur noch wenige Moleküle Biotin, insbesondere nur ein Molekül Biotin an einem Molekül Avidin oder Streptavidin binden. Zum Absättigen der Bindungstellen des Avidins oder Streptavidins können sowohl nicht an einen Primer gebundenes Biotin, als auch andere Moleküle verwendet werden, die an die Bindungsstelle für das Biotin am Avidin oder Strepta vidin binden. Es versteht sich, daß in der Lösung die Moleküle Avidin und/oder Streptavidin in der benötig ten hohen Menge eingesetzt werden, daß trotz der Ab sättigung jedes Molekül Biotin eine Molekül Avidin oder Streptavidin binden kann. Durch die Absättigung der Bindungen von Avidin oder Streptavidin für die Bindungen des Biotins kann verhindert werden, daß ein Molekül Avidin oder Streptavidin mehrere Moleküle Biotin bindet, und somit es zu ein Aggregation der an Biotin gebundenen Primer an einem Molekül Avidin oder Streptavidin kommt, da dadurch die Amplifikation, Transkription oder Translation der Nukleinsäureba sissequenzen gestört werden kann.

Im Rahmen des Verfahrens zur Herstellung einer erfin dungsgemäßen Nukleinsäure ist von selbstständiger Be deutung eine Weiterbildung, wobei das Produkt aus der Stufe b) in einer Stufe c) am 3' Ende und am 5' Ende mit jeweils einem Amplifikationsprimer hybridisiert werden kann, wobei eine amplifizierte Nukleinsäureend sequenz gebildet wird. Es versteht sich, daß dann die Primer der Stufe c) mit dem Molekül A ausgestattet sind. Auch die Amplifikationsprimer sind einerseits vergleichsweise kurz und universell einsetzbar und folglich leicht verfügbar. Mittels der Amplifikati onsprimer können zudem weitere (kürzere) Sequenzen an den Enden angefügt werden, welche die Translationsef fizienz weiter erhöhen. Auch sind mittels der kurzen Amplifikationsprimer auch andere Variationen und Modi fikationen an den Enden der Nukleinsäuren mit wenig Aufwand einführbar. Dies ist insbesondere deshalb von Vorteil, da damit für Variationen und Modifikationen keine unterschiedlichen Verlängerungsprimer herge stellt zu werden brauchen, was wiederum in störendem Maße aufwendig wäre.

Insbesondere kann erfindungsgemäß ein Biotinrest am 5'-Ende des Amplifikationsprimers gekoppelt sein. Hierdurch wird nach Inkubation der Nukleinsäureendse quenz mit Biotin-bindendem Streptavidin eine gegen Exonuklease-Abbau stabilisierte Nukleinsäureendsequenz erhalten, welche eine Erhöhung der Halbwertszeit in einem in vitro Proteinbiosynthesesystem gegenüber ei ner nicht stabilisierten Nukleinsäureendsequenz um ein Vielfaches, typischerweise mehr als 5-fach, beispiels weise von ca. 15 min. auf ca. 2 h, aufweist. Es werden Stabilitäten von linearen Konstrukten erreicht, welche mit jenen von klassischen zirkulären Plasmiden ver gleichbar sind und diese insofern praktisch gleichwer tig ersetzen können.

Es mag angemerkt werden, daß ein Molekül A auch eine Doppel- oder Mehrfachfunktion aufweisen, beispielswei se gleichzeitig als Ankergruppe funktionieren kann.

Die Adapterprimer enthalten typischerweise < 70, ins besondere 20-60, Nucleotide. Die Verlängerungsprimer enthalten typischerweise ≧ 70, auch 90 und mehr, Nucleotide. Die Amplifikationsprimer wiederum enthal ten typischerweise < 70, meist < 30, Nukleotide, typi scherweise < 9 Nukleotide. Lediglich die Adapterprimer müssen an eine definierte Nukleinsäurebasissequenz spezifisch angepaßt werden, was im Lichte der relativ kurzen Sequenzen mit wenig Aufwand verbunden ist.

Vorteilhafterweise werden die Schritte a), b) und op tional der Schritt c) in einer PCR Lösung enthaltend die Nukleinsäurebasissequenz, die Adapterprimer, die Verlängerungsprimer und optional die Amplifikati onsprimer durchgeführt. Es handelt sich dann um eine Einstufen PCR mit insgesamt 6 Primern, zwei Adap tersquenzen, zwei Verlängerungssequenzen und zwei Amplifikationssequenzen. Dabei reicht es, die Adapter primer und Verlängerungsprimer in geringen Konzentra tionen einzusetzen und insofern auch nur eine geringe Menge an Zwischenprodukt zu erzeugen. Das Zwischenpro dukt braucht zudem nicht homogen vorliegen, wodurch aufwendige Optimierungen entfallen können. Aufgrund der Kürze der Amplifikationsprimer sind auch bei der Amplifikation auf die hohe Menge an Nukleinsäureendse quenz keine Optimierungen erforderlich.

Alternativ zu der vorstehenden Ausführungsform ist von selbstständiger Bedeutung eine Variante, die mit zwei PCR Stufen arbeitet. Dabei werden die Schritte a) und b) in einer Verfahrenstufe A) in einer Vor-PCR Lösung enthaltend die Nukleinsäurebasissequenz, die Adapter primer und die Verlängerungsprimer für eine definierte erste Zyklenzahl durchgeführt und wird der Schritt C) in einer Verfahrenstufe B) in einer Haupt-PCR-Lösung enthaltend das PCR-Produkt aus der Stufe A) und die Amplifikationsprimer für eine definierte zweite Zy klenzahl durchgeführt. Dabei kann die Stufe A) in ei nem Reaktionsvolumen durchgeführt werden, welches 1/2 bis 1/10 des Reaktionsvolumens der Stufe B) beträgt. In der Stufe A) entsteht dann, bedingt durch das ge ringere Volumen eine höhere Konzentration an Zwischen produkt bzw. es kann deutlich weniger Nukleinsäureba sissequenz eingesetzt werden. Mit der Verdünnung mit tels PCR-Ansatzvolumen beim Übergang von der Stufe A) zur Stufe B) werden wiederum die Adapterprimer sowie die Verlängerungsprimer stark verdünnt mit der Folge einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit des Einbaus von Variationen und/oder Modifikationen in die Nukleinsäu reendsequenzen über die Amplifikationsprimer.

Im Einzelnen kann in der ersten vorstehenden Alterna tive so verfahren werden, daß die PCR in einem Reakti onsvolumen von 10 bis 100 µl, vorzugsweise 20 bis 40 µl, mit 0,01 bis 100 pg, vorzugsweise 1 bis 50 pg, Nukleinsäurebasissequenz, 0,05 bis 10 µM, vorzugsweise 0,1 bis 5 µM, Adapterprimer und 0,005 bis 0,5 µM, vor zugsweise 0,001 bis 0,1 µM, Verlängerungsprimer durch geführt wird, wobei nach einer definierten Anfangszy klenzahl 0, 01 bis 10 µM, vorzugsweise 0,1 bis 10 µM, Amplifikationsprimer zugegeben werden, und wobei mit tels einer definierte Anzahl anschließender Zyklen die amplifizierte Nukleinsäureendsequenz hergestellt wird. In der zweiten vorstehenden Alternative empfehlen sich die folgenden Reaktionsbedingungen: Stufe A): Reakti onsvolumen < 10 µl; 0,001 bis 50 pg, vorzugsweise 0,01 bis 5 pg, Nukleinsäurebasissequenz; 0,05 bis 10 µM, vorzugsweise 0,1 bis 5 µM, Adapterprimer und 0,05 bis 10 µM, vorzugsweise 0,1 bis 5 µM, Verlängerungsprimer; erste Zyklenzahl 10 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, Stufe B): Reaktionsvolumen 10 bis 100 µl, vorzugsweise 15 bis 50 µl, erhalten durch Ergänzung der Lösung aus Stufe A) mit PCR-Ansatzlösung; 0,01 bis 10 µM, vor zugsweise 0,1 bis 5 µM, Amplifikationsprimer; zweite Zyklenzahl 15 bis 50, vorzugsweise 20 bis 40.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind beispielsweise einsetzbar für die zellfreie in vitro Proteinbiosyn these, insbesondere in prokaryontischen Systemen, vor zugsweise in einem Translationsystem aus Escheria coli D10.

Die erfindungsgemäße Verwendung ist vorteilhafterweise einsetzbar zur selektiven Amplifikation einer defi nierten Nukleinsäurebasissequenz aus einer Nukleinsäu rebibliothek. Dies ermöglicht eine Charakterisierung von Gensequenzen, wobei die Gensequenz als Nukleinsäu renbasissequenz eingesetzt wird und wobei das erhalte ne Protein hinsichtlich Struktur und/oder Funktion analysiert wird. Der Hintergrund dieses Aspekts ist, daß für viele Gene zwar die Sequenzen bekannt sind, nicht jedoch die Struktur und Funktion des dadurch codierten Proteins. Somit können Elemente einer Genbi bliothek, zu welchen lediglich die Sequenz als solche bekannt ist, auf ihre Funktion in einem Organismus untersucht werden. Die Untersuchung der Struktur und Funktion des erhaltenen Proteins folgt dabei üblichen Arbeitsmethoden der Biochemie.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Nukleinsäuren gewinnen, welche eine für ein Protein codierenden Nukleinsäurebasissequenz und eine riboso male Bindungssequenz sowie eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus "Promotorsequenz, Trans skriptionsterminatorsequenz, Expressionsenhancersequenz, Stabilisierungssequenz und Affinitytagsequenz" enthalten. Eine Affinitytagsequenz codiert für eine Struktur, welche eine hohe Affinität für (meist immobilisierte) Bindungsstellen in Trennsy stemen zur Aufreinigung aufweist. Dadurch ist eine leichte und hochaffine Abtrennung von Proteinen, wel che das Affinitytag nicht enthalten, möglich. Ein Bei spiel hierfür ist Strep-tag II, eine Peptidstruktur aus 8 Aminosäureresten mit Affinität zu StrepTactin. Eine Stabilisierungssequenz codiert für eine Struktur, welche entweder selbst, oder nach Bindung mit einem ür die Struktur spezifischen Bindungsmolekül, eine Stabilisierung gegen Degradation, insbesondere durch Nukleasen, bewirkt. Eine solche Stabilisierungssequenz kann an einem nicht mit einem Molekül A ausgestatteten Ende angebracht sein. Eine Expressionsenhancersequenz steigert die Translationseffizienz gegenüber einer Nukleinsäure ohne Expressionsenhancersequenz. Dabei kann es sich beispielsweise um (nicht translatierte) Spacer handeln. Eine Transkriptionsterminatorsequenz terminiert die RNA-Synthese. Ein Beispiel hierfür ist der T7 Phage Gen 10 Transskriptionsterminator. Trans skriptionsterminatorsequenzen können auch gegen Degra dation durch 3' Exonukleasen stabilisieren. Vorteil hafte relative Anordnungen der vorstehenden Sequenze lemente zueinander lassen sich aus den folgenden Aus führungsbeispielen verallgemeinern.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert.

Methoden PCR

Die PCR wurde in einem in den Beispielen quantifizier ten Reaktionsvolumen mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,85 bei 20°C), 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgAO₄, 0,25 mM jeder dNTP, 3 U Pwo DNA Polymerase (Roche) sowie der in den Beispielen angegebenen Menge Nukleinsäureba sissequenz durchgeführt. Die Zyklen wurden für 0,5 min. bei 94°C, 1 min. bei 55°C und 1 min. bei 72°C durchgeführt.

In vitro Expression

In vitro Experimente wurden gemäß der Literaturstelle Zubay, G.; Annu. Rev. Genet. 7: 267-287 (1973) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Das Escherichia coli S-30 Lysat wurde mit 750 U/ml T7 Phagen RNA Poly merase (Stratagene) und 300 µM [¹⁴C]Leu (15 dpm/pmol, Amersham) supplementiert. PCR Produkte und Kontroll plasmide wurden in Konzentrationen von 1 nM bis 15 nM eingesetzt. Die Reaktionen wurden bei 37°C durchge führt, wobei der Verlauf dadurch verfolgt wurde, daß zu subsequenten Zeitpunkten 5 µl Aliquoten der Reakti onsmischung entnommen und der Einbau von [¹⁴C]Leu mit tels TCA Präzipitation abgeschätzt wurde. Weitere 10 µl Aliquoten wurden zwecks Analyse des synthetisierten Proteins mittels SDS-PAGE, gefolgt von einer Autora diographie in einem Phosphoimager-System (Molecular Dynamics) entnommen.

Plasmid Konstruktion

Ein high copy Derivat des Plasmids pET BH-FABP (Specht, B. et al.; J. Biotechnol. 33: 259-269 (1994)), welches für bovine heart fatty acid bindung protein codiert wurde konstruiert, pHMFA genannt. Ein Fragment von pET BH-FABP wurde durch Verdau mit den Endonuklea sen SphI und EcoRI erzeugt und in den Vektor pUC18 insertiert. Bezüglich der Sequenzen, welche für die Synthese vcn H-FABP relevant sind, ist das Plasmid pHMFA identisch mit dem Originalplasmid. Es sei ange merkt, daß das linearisierte Plasmid sich nicht besser als das circuläre Plasmid verhält.

Konstruktion von Nukleinsäuren mit verschiedenen Se quenzbereichen stromaufwärts des Promotors:

Das Plasmid pHMFA diente als Matrize für die Konstruk tion von Nukleinsäuren mit verschiedenen Sequenzberei chen upstream des Promotors. Die Konstrukte (siehe Beispiele) FA1, FA2 und FA4 mit 0, 5 und 249 Basenpaa ren stromaufwärts des Promotors wurden mit den Primern P1, C1 und P2 sowie mit dem downstream Primer P3 gene riert. Das Konstrukt FA3 mit einem Sequenzbereich von 15 Basenpaaren stromaufwärts des Promotors wurde durch Verdau von FA4 mit der Endonuklease Bgl II erhalten. Das Kontrollplasmid pHMFA(EcoRV) mit einem Sequenzbe reich von 3040 Basenpaaren wurde duch Verdau des Plasmids mit EcoRV erhalten. Alle Produkte wurden ge reinigt durch Agarose Gel Elektrophorese, gefolgt von Gel Extraktion mittels des "High Pure PCR Product Pu rification Kit".

Affinitätsreinigung

Die Reinigung des fatty acid binding protein enthal tend Strep-tag II (Voss, S. et al.; Protein Eng. 10: 975-982 (1997)) wurde mittels Affinitätschromato graphie gemäß Herstellervorschrift (IBA Göttingen, Deutschland) durchgeführt mit der Abweichung eines reduzierten Volumens der Affinitätssäule (200 µl). Die Reaktionsmischung der gekoppelten Transkription/Trans lation wurde kurz zentrifugiert und dann auf der Säule aufgetragen. Isolierte Fraktionen wurden durch TCA Präzipitation und Autoradiographie nach SDS-PAGE (s. o.) analysiert.

H-FABP Aktivitätsassay

Die vollständige Reaktionsmischung mit in vitro syn thetisiertem H-FABP wurde auf die Aktivität der Bin dung von Oleinsäure untersucht. Verschiedene Volumina (0-30 µl) wurden mit Reaktionsmischung ohne H-FABP auf 30 µl aufgefüllt und mit Translationpuffer (50 mM HEPES pH 7,6, 70 mM KOAc, 30 mM NH₄Cl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 0,002% NaN₃) auf ein Endvolumen von 120 µl verdünnt. Nach Zugabe von 2 µl 5 mM [9,10(n)-³H] Oleinsäure (Amersham) mit einer spezifischen Aktivität von 1000 dpm/pmol wurden die Proben für eine Stunde bei 37°C inkubiert. 50 µl der Proben wurden zur Ent fernung ungebundener Oleinsäure mittels Gelfiltration (Micro Bio Spin Chromatographie Columns; Bio-Rad) ein gesetzt. Die ³H Radioaktivität der eluierten Fraktio nen wurde mittels eines Scintillationszählers gemessen.

Analyse der Stabilität der Nukleinsäuren

Radioaktiv markierte Nukleinsäuren wurden gemäß den vorstehenden Bedingungen synthetisiert, jedoch in Ge genwart von 0,167 µCi/µl [a-³⁵S] dCTP. Die markierten Nukleinsäuren wurden in einer gekoppelten Transskrip tion/Translation, Reaktionsvolumen 400 µl, eingesetzt. 30 µl Aliquoten wurden an aufeinanderfolgenden Zeit punkten entnommen. Nach der Zugabe von 15 µg Ribonuklease A (DNAse-frei, Roche) wurden diese für 15 min. bei 37°C inkubiert. Eine weitere Inkubation für 30 min. bei 37°C wurde nach Zugabe von 0,5% SDS, 20 mM EDTA und 500 µg/ml Proteinase K (Gibco BRL) in ei nem Gesamtreaktionsvolumen von 60 µl durchgeführt. Verbleibende PCR Produkte wurden weiter gereinigt mit tels Ethanolfällung und wurden danach einer denaturie renden Elektrophorese (5,3% Polyacrylamid, 7 M Harn stoff, 0,1% SDS, TBE) unterzogen. Das getrocknete Gel wurde zur Quantifizierung der Radioaktivität durch ein Phosphoimager System (Molecular Dynamics) laufen gelassen.

Sequenzen

Eingesetzte Primersequenzen sind in der Fig. 1 darge stellt.

Beispiel 1: PCR mit vier Primern

In der Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Einstufen-POP mit vier Primern dar gestellt. Mittig erkennt man zunächst die für ein Pro tein codierende Nukleinsäurebasissequenz, welche die vollständige Codierungssequenz für H-FABP (homogeneous and functionally active fatty acid binding protein from bovine heart), erhalten als ein 548 bp Restrikti onsfragment aus pHMFA durch Verdau mittels der Endonu kleasen Ncol und BamHI, umfaßt (sowie eine 150 bp Se quenz am 3'-Ende, welche weder translatiert wird, noch zu einem Adapterprimer oder Verlängerungsprimer com plementär ist). Hieran werden die beiden Adapterprimer A und B hybridisiert, welche mit den Enden der Nukleinsäurebasissequenz homologe Enden umfassen. Der Adapterprimer A enthält weiterhin eine ribosomale Bin dungssequenz. An die außenliegenden Enden der Adapter primer A und B werden die Verlängerungsprimer C und D hybridisiert. Der Verlängerungprimer C umfaßt die T7 Gen 10 Leadersequenz einschließlich des T7 Transskrip tionspromotors sowie optional upstream eine Sequenz von beispielsweise 5 Nukleotiden. Der Verlänge rungsprimer D umfaßt die T7 Gen 10 Terminatorsequenz.

Beispiel 2: Effizienz der H-FABP Synthese in Abhängig keit des Sequenzbereiches upstream des Promotors.

Vier PCR Produkte (FA1 bis FA4) mit verschiedenen Se quenzbereichen upstream des Promotors (0, 5, 15, 250 Basenpaare) und das linearisierte Kontrollplasmid pHMFA(EcoRV mit 3040 bp upstream des Promotors wurden in verschiedenen Konzentrationen (1, 5, 10 und 15 mM) auf in vitro Transskription/Translation untersucht. Die Fig. 3 zeigt, daß alle Sequenzbereiche, außer 0 (untere Kurve), eine Erhöhung der Proteinsynthese be wirken. Bereits 5 Basenpaare reichen aus.

Beispiel 3: Verbesserung der H-FABP Synthese durch Phage T7 Gen 10 Transscriptionsterminator/5' leader Secuenz Phage T7 Gen 10.

In der Fig. 4 erkennt man, daß durch den Phage T7 Gen 10 Transskriptionsterminator die Synthese um zumindest einen Faktor 2,8 verbessert werden kann. Die Dreiecke stehen für FAΔt und die Quadrate für FAt (siehe auch Fig. 2).

Weiterhin erkennt man in der Fig. 4, daß eine Deleti cn von 34 bp zwischen dem Transskriptionsanfang und der epsilon-Sequenz (Olins, P. O. et al.; Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 16973-16976 (1989) zu einer Unterdrückung einer Produktbildung führt. Die Kreise stehen für diese Variante FAΔ34 (siehe auch Fig. 2).

Beispiel 4: Einfluß der Lage der Transskriptionster minatorsequenz.

Zur Untersuchung des Einflusses der Lage der Termina torsequenz wurden die Produkte FAst und FAast (siehe Fig. 2) erzeugt. Beide sind identisch mit FAt und FAat, außer daß eine 22 bp Spacersequenz zwischen dem Stopcodon und dem Terminator mittels unterschiedlicher Primer eingeführt wurde. In der Fig. 5 erkennt man, daß die Spacersequenz eine etwa 2-fache Erhöhung der Expression bewirkt.

In der Fig. 5 ist aber auch aus einem Vergleich von FAt und FAat; weiterhin zu erkennen, daß ein Affini tytag kaum Einfluß auf die Expression hat.

Beispiel 5: PCR aus einer komplexen DNA Mischung

Die Effektivität und Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde in Gegenwart einer hohen Menge an kompetitiver DNA untersucht. Eine PCR für FAst wurde entsprechend der vorstehenden Beschreibungen ausge führt mit den folgenden Ausnahmen: die Nukleinsäureba sissequenz wurde in Konzentrationen von 0,16 bis 20 pg/50 µl Reaktorvolumen durchgeführt und die Reaktio nen wurden mit 0,83 µg chromosomaler DNA aus Escheri chia coli, ultraschallbehandelt für 5 min., supplemen tiert. Es wurde gefunden, daß weder die Qualität noch die Quantität des PCR Produkts durch die Anwesenheit eines 5-millionenfachen Überschusses an kompetitiver DNA beeinflußt wurde.

Beispiel 6: Affinitätsreinigung mit Strep-tag II

Eine Reaktionsmischung mit 10 µg des radioaktiv mar kierten FAast wurde der Affinitätsreinigung unterwor fen. Etwa 81% des aufgetragenen Materials wurde von der Säule erhalten und 67% konnten als reines Produkt in den Elutionsfraktionen gewonnen werden (berechnet aus TCA Präzitipation der Fraktionen der Affinitätssäule).

Beispiel 7: Aktivität des PCR Produkts

Proben von H-FABP, synthetisiert entweder mittels des Plasmids oder als PCR Produkt FAast, wurden miteinan der hinsichtlich der Bindungsaktivität für Oleinsäure untersucht. Nach der Transskription/Translation wurden verschiedene Volumina mit 0 bis 330 µmol nicht-mar kierten H-FABP in einem Bindungsassay gemäß der vor stehenden Beschreibung zu Methoden untersucht. Die Aktivitäten wurden als identisch gefunden, unabhängig von dem Herstellungsweg.

Beispiel 8: Stabilität des PCR Produkts

Zur Untersuchung, ob die Stabilität des PCR Produkts möglicherweise die Effektivität der Expression begren zen könnte, wurde die Abnahme des PCR Produktes FAast gemessen. Es wurde hierfür das radioaktiv markierte Produkt eingesetzt. In bestimmten Zeitabständen wurden Aliquoten des Reaktionsgemisches entnommen und mittels denaturierender Polyacrylamid Gelelektrophorese unter sucht. Die Menge am verbleibendem PCR Produkt wurde durch Scannen der Radioaktivität des Gels quantifi ziert und mit dem Zeitverlauf der Proteinsynthese, gemessen durch Scannen der Radioaktivität von H-FABP im Gel nach Auftrennung der Reaktionsmischungen mit tels SDS-PAGE, verglichen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 6 dargestellt. Man erkennt, daß die Halbwertzeit des PCR Produkts ca. 100 min. beträgt, was dem Einlauf der H-FABP Synthese in ein Plateau entspricht.

Beispiel 9: Optimierte Bedingungen für eine PCR mit vier Primern.

In der Tabelle I sind optimierte Bedingungen für eine PCR mit vier Primern in einem Reaktionsvolumen von 25 µl zusammengefaßt.

Tabelle I

a) Reaktionskomponenten

b) Temperaturprogramm

Beispiel 10: PCR mit sechs Primern.

Mit den Materialien aus Beispiel 9, jedoch mit zusätzlich zwei Amplifikationsprimern e (26 Nucleotide) und f (33 Nucleotide) sowie einer erhöhten Adapterprimer- Konzentration von 0,2 µM wurden variierende Verlängerungsprimer Konzentrationen eingestellt. Bezüglich der Amplifikationsprimer wird auf die Fig. 1 verwiesen, dort BIOR und BIOF. BIOF ist ein biotinmarkierter Forwardprimer und BIOR ein biotinmarkierter Reverseprimer. Die Struktur ist in der Fig. 7 dargestellt.

Ein minimaler Bedarf an teurem Verlängerungsprimer ergab sich, wenn zunächst 25 Zyklen ohne Amplifikationsprimer und anschließend weitere 25 Zyklen mit Amplifikationsprimer gefahren wurden. Die Konzentration an Verlängerungssprimer konnte durch den Einsatz der Amplifikationsprimer bis auf 0,025 µM gesenkt werden, ein Faktor von ca. 1/20, bei dennoch verbesserter Ho mogenität und Ausbeute an PCR-Produkt.

Diese Vorteile beruhen darauf, daß die Wahrscheinlich keit der Bildung von Zwischenprodukten in hohen Kon zentrationen mit dem Einsatz der sechs Primer stark reduziert ist, da die Primer, die zur Entstehung der Zwischenprodukte erforderlich sind, in geringen Kon zentrationen eingesetzt werden. Zwischenprodukte kön nen folglich nicht mit den Amplifikationsprimern expo nentiell angereichert werden.

Beispiel 11: PCR mit sechs Primern in zwei Stufen

Grundsätzlich wird mit den Materialien, wie vorstehend angegeben, gearbeitet. Zunächst wird eine Vor-PCR in einem Reaktionsvolumen von 5 µl mit 0,1 pg Nukleinsäu rebasisseauenz durchgeführt, und zwar mit 0,3 µM Adap terprimer und 0,5 µM Verlängerungsprimer über 20 Zy klen. Dann wird die so erhaltene Reaktionslösung mit PCR Ansatzvolumen auf 25 µl verdünnt. Dann wird Ampli fikationsprimer auf eine Endkonzentration von 0,5 µM zugegeben. Schließlich wird für weitere 30 Zyklen amplifiziert.

Beispiel 12: Stabilisierung einer Nukleinsäure mit Biotin

Es wurde unter Einsatz der Primer BIOF und BIOR im Wege der PCR mit 6 Primern, wie vorstehend beschrie ben, eine Nukleinsäure hergestellt und deren Abbau als Funktion der Zeit sowie die Verbesserung der Protein synthese untersucht. Dies ist in den Fig. 7 und 8 dargestellt. Man erkennt, daß sich mit Biotin, insbe sondere nach Umsatz mit Streptavidin eine erheblich verbesserte Stabilität ergibt. Dies führt auch zu ei ner bis zu 20% höheren Proteinsynthese, und dies in einem System mit geringen Anteilen von Exonukleasen. Das Beispiel belegt somit, daß sogar in solchen Syste men eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung er reicht wird. In Systemen mit Lysaten, welche höhere Mengen an Exonukleasen ausweisen, sind Verbesserungen der Syntheseleistung um einen Faktor von bis zu 5 und mehr zu erwarten.

Unabhängig von den vorstehenden Beispielen ist anzu merken, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch sehr leicht Variationen der Sequenzen durch Mutationen möglich sind, beispielsweise durch Einsetzen von Taq- Polymerase und/oder veränderten Reaktionsbedingungen. Wenn dies nicht gewünscht ist, so kann vorzugsweise mit Pwo oder Pfu gearbeitet werden, welche genauer funktionieren und proofreading Aktivität haben.

Claims

1. Gegen Abbau durch Exonukleasen stabilisierte Nu kleinsäure mit folgenden Komponenten:

a) einer für ein definiertes Protein codierenden Codesequenz,
b) einer die Expression der Codesequenz kontrollie renden Promotorsequenz, und
c) zumindest einem an einem Ende der linearen Se quenz enthaltend die Komponenten a und b ange fügten Molekül A, welches mit einem nicht-immo bilisierten volumigen Molekül B verbunden ist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei beide Enden der linearen Sequenz mit je einem Molekül A verbunden sind.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei zwischen den Komponenten a und/oder b und dem Molekül A oder den Molekülen A eine Spacersequenz eingerichtet ist.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei entweder jedes Molekül A mit je einem Molekül B verbunden ist oder wobei beide Moleküle A mit einem einzigen, zumindest zwei Bindungstellen für ein Molekül A aufweisenden Molekül B verbunden sind.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wo bei das Molekül A Biotin oder Digoxygenin und das Molekül B Avidin, Streptavidin oder Anti-Digoxygen in-Antikörper ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mit den folgenden Verfahrensstufen:

1. es wird eine lineare Sequenz enthaltend die Kom ponenten a) und b) hergestellt,
2. die lineare Seauenz aus Stufe 1) wird mittels PCR amplifiziert, wobei zumindest ein Primer oder ein Primerpaar eingesetzt wird, welches das Molekül A trägt,
3. das Produkt aus Stufe 2) wird mit einer Lösung enthaltend Moleküle B inkubiert.

7. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der An sprüche 1 bis 5 in einem Verfahren zur Herstellung eines durch die Codesequenz codierten Proteins in einem zellfreien Proteinbiosynthesesystem oder in einem zellulären Proteinbiosynthesesystem.