DE10136842A1

DE10136842A1 - GABA¶A¶-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA-antagonistischer Aktivität

Info

Publication number: DE10136842A1
Application number: DE10136842A
Authority: DE
Inventors: Christopher Brueckner; Roland Neuhaus; Rainer Dorow
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2001-07-23
Filing date: 2001-07-23
Publication date: 2003-02-13
Also published as: AU2002333262A1; WO2003011264A3; WO2003011264A2; JP2004537567A; EP1411939A2

Abstract

Es wird die Verwendung von GABA¶A¶-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA-antagonistischer Aktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Neuroprotektion und die Kombination und alpha-Liponsäure oder Dihydro-alpha-Liponsäure beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von GABA_A-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA-antagonistischer Aktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Neuroprotektion und die Kombination von GABA_A-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA-antagonistischer Wirkung und α-Liponsäure oder Dihydro-α-Liponsäure.
Glutamat ist ein unentbehrlicher erregender Transmitter im Körper des Menschen und Säugers. Erhöhte Glutamat-Spiegel führen zu schweren Schäden des Nervengewebes, in deren Folge Neurodegenerationen auftreten können. Innerhalb der Glutamat-Rezeptoren spielt der NMDA(N-methyl-D- aspartat)-Rezeptor pathologisch die wichtigste Rolle. Der NMDA-Rezeptor agiert gleichzeitig Spannungs- und Liganden-abhängig. Beim normalen Ruhepotenzial des Neurons von -60 mV ist der Ionenkanal des Rezeptors durch Mg²⁺-Ionen verschlossen (Mayer ML et al. Nature 1984; 309 (5965): 261-3), und ein Ligand kann den Rezeptor nicht aktivieren. Wird aber die Membran depolarisiert, verlässt Mg²⁺ den Ionenkanal, und der Rezeptor kann durch einen Liganden aktiviert werden, was zum Einstrom von Ca²⁺ und Na⁺ und Ausstrom von K⁺ führt. Die nicht-NMDA-Rezeptoren sind für Ca²⁺ fast nicht permeabel. Eine übermäßige Aktivierung des NMDA-Rezeptors bewirkt einen verstärkten Ca²⁺- Einstrom, der zelltoxisch wirkt. Durch diesen Ca²⁺-Einstrom werden in der Zelle Apoptose- (Riveros N et al. Neuroscience 1986; 17 (3): 541-6) und später Nekrose-Prozesse ausgelöst, die schließlich zum Zelltod führen.
Im fortgeschrittenen Stadium einer neurodegenerativen Erkrankung sterben bevorzugt die mit NMDA-Rezeptoren besetzten Zellen ab, was dazu führt, dass mit fortschreitender Neurodegeneration NMDA-Rezeptor-Antagonisten immer stärker an Wirksamkeit verlieren. Die Zellen hingegen, die GABA-Rezeptoren tragen, sind durch die inhibitorische Wirkung dieses Transmitters (GABA) geschützt und auch im Zustand einer fortgeschrittenen Neurodegeneration einer pharmakologischen Wirkung zugänglich.
Durch die oben geschilderte übermäßige Aktivierung von NMDA Rezeptoren können erhöhte intrazelluläre Ca²⁺-Spiegel hervorgerufen werden. Diese führen häufig zu einer verstärkten Bildung von freien Radikalen, z. B. durch Freisetzung von Arachidonsäure oder der Umwandlung von Xanthin-Dehydrogenase zu Xanthin-Oxidase. Werden erhöhte Mengen an Ca²⁺ in die Mitochondrien aufgenommen, so können diese Hydroxyle und organische Radikale bilden (Packer L et al. Free Radic Biol Med 1997; 22 (1-2): 359-78). Eine verstärkte Aktivierung des NMDA-Rezeptors kann zu erhöhten intrazellulären Stickoxid- Spiegeln führen, welche mit Superoxid zu Peroxynitriten umgebildet werden können und ebenfalls zelltoxisch sind. Ein gleichzeitiger Einsatz einer NMDA- Rezeptor-antagonistisch wirkenden Substanz mit einem Antioxidans ist geeignet, auf synergistische Weise neurodegenerative Schädigungen zu verhindern. In den Zellen von neurodegenerativ erkrankten Säugern konnten verminderte Glutathion-Spiegel nachgewiesen werden. Eine Supplementierung des Gluthations wäre wünschenswert, eine nennenswerte Resorption von Gluthation aus der Nahrung bzw. peroralen Zufuhr jedoch findet nicht statt. Eine perorale Zufuhr von α-Liponsäure hingegen führt zu einer deutlichen Erhöhung des zellulären Glutathion-Spiegels.
Als neuroprotektive Therapie werden diejenigen Formen der Behandlung bezeichnet, die zu einer Verminderung bzw. Verhinderung der Schädigung bzw. Abtötung neuronaler Zellen führt. Dies kann durch Verminderung der Auswirkungen eines erhöhten Glutamat-Spiegels erfolgen, z. B. durch Blockierung des Ca²⁺-Einstroms in die Zelle, wie auch durch Verminderung der Glutamat-Ausschüttung.
Die Verabreichung von NMDA-Rezeptor-Antagonisten wäre für neuroprotektive Zwecke ausgesprochen wünschenswert, ist aber in klinischen Versuchen fast immer von schweren Nebenwirkungen, z. B. der sogenannten Vakuolisierung von Zellen (Fritz Kl et al. Brain Res. 1999; 816 (2): 438-45) begleitet, die letztendlich eine klinische Einführung unmöglich gemacht haben. Darüber hinaus zeigen nahezu alle NMDA-Rezeptor-Antagonisten psychiatrische mittelschwere bis schwere Nebenwirkungen. Bei gleichzeitiger Anwendung von GABA-Rezeptor-potenzierenden und NMDA-Rezeptor-antagonisierenden Wirkstoffen ist eine Vakuolisierung nicht zu beobachten (Olney JW et al. Science 1991; 254 (5037): 1515-8).
GABA (gamma-Amino-Buttersäure) ist eine natürliche Verbindung, die innerhalb des Glutamat-Stoffwechsels entsteht und den wichtigsten inhibitorischen Transmitter des Säugers darstellt. Ein Mangel an GABA bzw. eine Unterdrückung des GABA-ergen Systems führt in den meisten Fällen zu Spasmen und epileptischen Krämpfen bis hin zum Zelltod.
1,4-Benzodiazepine zählen zu den am meisten verbreiteten GABA_A-Rezeptor- Modulatoren. Verbindungen aus dieser Substanzgruppe, wie z. B. Midazolam und Flunitrazepam, besitzen eine starke Affinität zu einer speziellen Bindungsstelle für Benzodiazepine, dem Benzodiazepin-Rezeptor. Dieser ist Teil des GABA_A-Rezeptors. Bindet GABA an den GABA_A-Rezeptor, so löst dies einen Chlorid-Einstrom aus. Binden gleichzeitig Benzodiazepine an den Benzodiazepin-Rezeptor, wird dieser Chlorid-Einstrom verstärkt. Daraus resultiert eine verstärkte Hyperpolarisierung der Zelle. Als Mechanismus hierfür wird eine erhöhte Öffnungswahrscheinlichkeit des Chlorid-Kanals vermutet. Bindung von Benzodiazepinen an den Benzodiazepin-Rezeptor verstärkt die Affinität des GABA_A-Rezeptors zu GABA und vice versa.
Benzodiazepine finden eine breite systemische Verwendung bei der Behandlung von Epilepsien, Angstzuständen, Spasmen und Schlafstörungen. Ihr toxisches Gefahrenpotenzial ist relativ gering, da ihre Wirksamkeit durch die Menge des vorhandenen GABA limitiert wird. Zudem existiert ein selektiver Benzodiazepin- Rezeptor-Antagonist, Flumazenil, mit dem eventuelle Überdosierungen sofort antagonisiert werden können. Ebenso potenzieren Barbitursäurederivate, wie z. B. Phenobarbital, die Öffnung des GABA-Chlorid-Ionen-Kanals.
Von β-Carbolinen ist bekannt, dass sie Affinität zu den Benzodiazepin- Rezeptoren besitzen und in Abhängigkeit von der Struktur der Verbindungen auf die von den Benzodiazepinen bekannten Eigenschaften antagonistische, invers agonistische und agonistische Wirkung ausüben. Manche Verbindungen aus dieser Substanzklasse zeigen ausschließlich starke Affinität an eine spezifische Bindungsstelle für Benzodiazepine, die Teil des GABA_A-Rezeptors ist, manche β-Carboline binden gleichzeitig an Rezeptoren für andere Neurotransmitter und manche β-Carboline binden nur an Rezeptoren für andere Neurotransmitter und zeigen keine Affinität zum Benzodiazepin-Rezeptor. So wird in WO 93/20820 beschrieben, dass bestimmte β-Carboline auf die Modulationsstelle des Quisqualat-Rezeptors einwirken und die pathologisch veränderte Form dieses Rezeptors korrigieren.
Elektrophysiologisch gesehen führt eine Verstärkung des GABA-ergen Systems zu einer Hyperpolarisierung der Zelle. Dies erschwert eine Depolarisierung bzw. die Ausbreitung eines Aktionspotenzials. Da der NMDA-Rezeptor nur dann für Ca²⁺ permeabel wird, wenn die Zellmembran depolarisiert ist, führt eine Applikation von GABA-verstärkenden Mitteln zu einer Inhibition des NMDA- Rezeptors. Durch die Hyperpolarisierung der Zellmembran wird aber zugleich verhindert, dass spannungsabhängige Ca²⁺-Kanäle aktiviert werden. Diese Kanäle werden durch reine NMDA-Rezeptor-Antagonisten nicht erfasst.
GABA_A-Rezeptor-Modulatoren verändern die Affinität bzw. die Effektivität von GABA am Rezeptor, in Abwesenheit von GABA sind sie unwirksam. Die Verabreichung von GABA_A-Rezeptor-Modulatoren ist somit deutlich weniger gefährlich als die von Agonisten, da Agonisten unabhängig von der Menge des vorhandenen Neurotransmitters mit zunehmender verabreichter Konzentration immer stärker wirken. Die Verabreichung von GABA_A-Rezeptor-Modulatoren besitzt deshalb, verglichen mit GABA-Agonisten, ein deutlich geringeres toxisches Risiko.
Es stellte sich daher die Aufgabe, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die von NMDA-Antagonisten und GABA-Agonisten bekannten Nebenwirkungen vermindern oder aufheben.
Erfindungsgemäß geeignet sind β-Carbolinderivate der Formel I und deren physiologisch verträgliches Salz

worin
R¹ Wasserstoff oder -O-R⁵,
R³ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl,
R⁴ Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder -CH₂-O-CH₃,
n 1 oder 2,
R⁵ Wasserstoff, Phenyl, Benzyl, mit Cl substituiertes Phenyl oder mit Cl substituiertes Phenyl ist.
R³ steht vorzugsweise für Isopropyl und der Substituent R¹ steht vorzugsweise einfach in 5- oder 6-Position oder zweifach in 6-, 7-Position. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist 6-Benzyloxy-4-methoxymethyl-β-carbolin-3- carbonsäureisopropylester (Abecarnil).
Die Herstellung der Verbindungen der Formel I erfolgt beispielsweise nach den in EP 54507A und EP 239667A beschriebenen Verfahren oder analog zu bekannten Methoden.
Erfindungsgemäß geeignete GABA_A-Rezeptor-Modulatoren, die zusätzlich zu ihrer GABA-Rezeptor-modulierenden Wirkung eine NMDA-Rezeptormodulierende Wirkung aufweisen, sind für die neuroprotektive Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, wie beispielsweise Schlaganfall, Alzheimer Erkrankung, Parkinson Erkrankung, Schädel-Hirn-Trauma, Morbus Huntington und Amyotrophische Lateralsklerose geeignet. Weiterhin eignen sich solche Verbindungen zur Therapie anderer Erkrankungen des Zentralen und peripheren Nervensystems wie z. B. Senile Demenz, Multiinfarkt Demenz; Restless leg syndrom, Epilepsie, Zellschäden durch Hypoglykämie, Hypoxie und Ischämie; neuronale Schäden, die durch unkontrollierte Bewegungen entstehen; Asphyxie sowie Psychosen, Schizophrenie, Angstzustände, Schmerzzustände, Migräne und Emesis; funktionelle Störungen wie Gedächtnisstörungen (Amnesie), Störungen des Lernprozesses, Vigilanzerscheinungen und Entzugserscheinungen nach chronischer Einnahme von Suchtmitteln wie Benzodiazepinen, Halluzinogenen, Alkohol, Kokain oder Opiaten; sowie Multiple Sklerose; AIDS-induzierte Encephalopathie und andere infektionsbedingte Encephalopathien, die durch Röteln-Viren, Herpes-Viren, Borrelien und durch unbekannte Erreger verursacht werden; Creutzfeld-Jakob-Erkrankung sowie neurodegenerative Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie Polyneuropathien und Polyneuritiden.
Erfindungsgemäß geeignete β-Carboline wie Abecarnil wirken über zwei Rezeptor-Systeme: Einerseits wirken sie positiv modulierend auf den Benzodiazepin-Rezeptor, verstärken also die inhibitorische Wirkung von GABA, gleichzeitig wirken sie aber auch NMDA-Rezeptor-antagonistisch, d. h. sie vermindern die schädlichen Auswirkungen von Glutamat. Beides zusammen bewirkt eine noch umfangreichere Neuroprotektion als bei Anwendung eines reinen GABA_A-Rezeptor-Modulators.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur symptomatischen und präventiven Behandlung der vorne genannten Erkrankungen des zentralen oder peripheren Nervensystems.
Die Erfindung umfasst auch die Kombination von GABA_A-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA-antagonistischer Wirkung und α-Liponsäure oder Dihydro-α- Liponsäure. α-Liponsäure (1,2-dithiolan-3-valerian-Säure) bildet zusammen mit seiner reduzierten Form, der Dihydroliponsäure (DHP), ein Redoxsystem.
Dieses Redoxsystem übt im Säuger-Organismus einen sehr starken antioxidativen Effekt aus. Darüber hinaus bindet α-Liponsäure freie Radikale, chelatiert Metalle und reaktiviert wichtige zelluläre Antioxidantien und Radikalfänger wie z. B. Gluthathion, Vitamin C und E.
Die Kombinationsbehandlung verstärkt den neuroprotektiven Effekt und reduziert die zelltoxischen Schäden eines verstärkten Ca²⁺-Einstromes.
Die pharmazeutischen Mittel bzw. Zusammensetzungen der Erfindung werden mit üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und üblichen pharmazeutischen und technischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in an sich bekannter Weise hergestellt. Bevorzugte Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zur oralen, enteralen oder parenteralen, beispielsweise i. p. (intraperitonealen), i. v. (intravenösen), i. m. (intramuskulären) oder perkutanen, Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Pillen, Kapseln, Pulver, Cremes, Salben, Lotionen, Flüssigkeiten, wie Sirupe, Gele, injizierbare Flüssigkeiten, beispielsweise zur i. p., i. v., i. m. oder perkutanen Injektion usw. Weiterhin sind auch Depotformen, wie implantierbare Zubereitungen, sowie Suppositorien geeignet. Dabei geben die einzelnen Zubereitungen die erfindungsgemäßen Benzimidazolderivate je nach deren Art allmählich oder die gesamte Menge in kurzer Zeit an den Körper ab.
Zur oralen Verabreichung können Kapseln, Pillen, Tabletten, Dragees und Flüssigkeiten oder andere bekannte orale Darreichungsformen als pharmazeutische Präparate eingesetzt werden. In diesem Falle können die Arzneimittel in der Weise formuliert sein, dass sie die Wirkstoffe entweder in kurzer Zeit freisetzen und an den Körper abgeben oder eine Depotwirkung aufweisen, so dass eine länger anhaltende, langsame Zufuhr von Wirkstoff zum Körper erreicht wird. Die Dosierungseinheiten können neben dem mindestens einen Benzimidazolderivat einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie des Arzneimittels, oberflächenaktive Stoffe, Lösungsvermittler, Mikrokapseln, Mikropartikel, Granulate, Verdünner, Bindemittel, wie Stärke, Zucker, Sorbit und Gelatine, ferner Füllstoffe, wie Kieselsäure und Talkum, Gleitmittel, Farbstoffe, Duftstoffe und andere Stoffe.
Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des Wirkstoffs mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln wie Dextrose, Zucker, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln wie Maisstärke oder Alginsäure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelatine, Gleitmitteln wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat, erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.
Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog zu den Tabletten hergestellten Kernen mit üblicherweise in Drageeüberzügen verwendeten Mitteln, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabikum, Talk, Titanoxid oder Zucker, hergestellt werden. Dabei kann auch die Drageehülle aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tabletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.
Wirkstoffe enthaltende Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man den Wirkstoff mit einem inerten Träger wie Milchzucker oder Sorbit mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.
Die Wirkstoffe können auch in Form einer Lösung formuliert werden, die für die orale Verabreichung bestimmt ist und die neben dem aktiven Benzimidazolderivat als Bestandteile ein pharmazeutisch verträgliches Öl und/oder eine pharmazeutisch verträgliche lipophile, oberflächenaktive Substanz und/oder eine pharmazeutisch verträgliche hydrophile, oberflächenaktive Substanz und/oder ein pharmazeutisch verträgliches wassermischbares Lösungsmittel enthält.
Um eine bessere Bioverfügbarkeit der erfindungsgemäßen Wirkstoffe zu erreichen, können die Verbindungen auch als Cyclodextrinchlatrate formuliert werden. Hierzu werden die Verbindungen mit α,β-, oder γ-Cyclodextrin oder deren Derivaten umgesetzt.
Falls Cremes, Salben, Lotionen und äußerlich anwendbare Flüssigkeiten eingesetzt werden sollen, müssen diese so beschaffen sein, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Körper in ausreichender Menge zugeführt werden. In diesen Darreichungsformen sind Hilfsstoffe enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie der Arzneimittel, oberflächenaktive Mittel, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Verdünner, Stoffe zur Erhöhung der Permeationsfähigkeit für die erfindungsgemäßen Benzimidazolderivate durch die Haut, Farbstoffe, Duftstoffe und Hautschutzmittel, wie Konditionierer und Feuchteregulatoren. Zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen können auch andere Wirkstoffe in dem Arzneimittel enthalten sein (Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Band 4 (1953), Seiten 1-39; J. Pharm. Sci., 52, 918 ff. (1963); H. v. Czetsch- Lindenwald, Hilfsstoffe für Pharmazie und angrenzende Gebiete; Pharm. Ind. 2, 72 ff. (1961); Dr. H. P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor AG, Aulendorf/Württ., 1971).
Die Wirkstoffe können auch in geeigneten Lösungen, wie beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung, als Infusions- oder Injektionslösung zur Anwendung kommen. Für die parenterale Applikation können die Wirkstoffe in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder suspendiert sein. Als Verdünnungsmittel sind insbesondere ölige Lösungen, wie zum Beispiel Lösungen in Sesamöl, Rizinusöl und Baumwollsamenöl, geeignet. Zur Erhöhung der Löslichkeit können Lösungsvermittler, wie zum Beispiel Benzylbenzoat oder Benzylalkohol, zugesetzt werden.
Zur Formulierung eines injizierbaren Präparats kann ein beliebiger flüssiger Träger verwendet werden, in dem die erfindungsgemäßen Verbindungen gelöst oder emulgiert sind. Diese Flüssigkeiten enthalten häufig auch Stoffe zur Regulation der Viskosität, oberflächenaktive Stoffe, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler, Verdünner und weitere Zusatzstoffe, mit denen die Lösung isotonisch eingestellt wird.
Es ist auch möglich, die Wirkstoffe in ein transdermales System einzuarbeiten und sie damit transdermal zu applizieren. Derartige Präparate können so formuliert sein, dass eine verzögerte Wirkstoff-Freigabe ermöglicht wird. Hierzu können bekannte Techniken eingesetzt werden, beispielsweise sich auflösende oder mit einer Membran arbeitende Depots. Implantate können als inerte Materialien beispielsweise biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, beispielsweise Silikonkautschuk, enthalten.
Die Dosierung der Wirkstoffe kann je nach Art der Anwendung, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die tägliche Dosis kann als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in zwei oder mehrere Tagesdosen gegeben werden. Die Verbindungen werden in einer Dosiseinheit von 0,05 bis 100 mg aktiver Substanz in einem physiologisch verträglichen Träger eingebracht. Im allgemeinen wird eine Dosis von 0,1 bis 500 mg/Tag, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg/Tag, angewendet.
In den erfindungsgemäßen Kombinationspräparaten können die Wirkstoffe in einer Formulierung oder auch in jeweils getrennten Formulierungen vorliegen, wobei die gesamte Dosis einmalig verabreicht oder in mehrere Dosen geteilt wird.
Die tägliche Dosis der Wirkstoffe in den Kombinationspräparaten beträgt für das β-Carbolin-Derivat 0,1 mg bis 500 mg und für die α-Liponsäure bzw. Dihydro-α- Liponsäure 10 mg bis 1000 mg, besonders geeignet sind Dosen von 600 mg.
Die Wirksamkeit der GABA_A-Rezeptor-Modulatoren, die zugleich auch NMDA- Rezeptor-antagonisierend wirken, wurde mittels der nachfolgend beschriebenen Untersuchungen bestimmt:
Die Messungen wurden an kultivierten Neuronen von Wistar-Embryonen am 18 Tragetag angefertigt. Nach der Präparation wurden die Neuronen auf kleinen Plättchen ausgesät. Hierzu wurden Deckgläschen für mikroskopische Präparate von 12 mm Durchmesser (Assistent) verwendet. Jeweils vier der Deckgläschen wurden in ein Kunststoffschälchen (Nunclon) überführt.
Als Präparationsmedien wurden folgende Lösungen verwendet: GBSS (Grey's buffered salt solution, Sigma) ergänzt mit 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid, Sigma), pH 7,3 eingestellt mit NaOH (Sigma). Als Kulturmedien wurden verwendet: DMEM (Sigma), glucosehaltig, Pferdeserum 10% (Sigma) und Glutamin. In der Regel wurden die Zellen so verteilt, daß zu Beginn der Kultur 50.000 Zellen pro Plättchen vorlagen. Das Medium wurde nach der Präparation nach 24 Stunden, und dann nach jeweils 3 Tagen ausgewechselt. Synaptische Spontanaktivität entwickelte sich in der Regel ab dem zehnten Tag in vitro.
Die extrazelluläre Meßlösung hatte folgende Zusammensetzung (in mM): NaCl 140; KCl 5,4; CaCl₂ 2; HEPES 10; MgCl 1; Glucose 25. Der pH wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt. IPSCs wurden durch Zusatz von 1,2,3,4-tetrahydro-6-nitro- 2,3-di-oxo-benzo-chinoxalin-7-sulfonamid (NBQX 10 µM) und DL-2-amino-5- phosphonovaleriansäure (±-APV 30 µM) isoliert. EPSCs wurden durch Zugabe von Bicucullin (10 µM) und Pikrotoxin (20 µM) isoliert. Bei der Untersuchung der EPSCs wurde eine Ringerlösung ohne MgCl₂ verwendet. Die Pipettenlösung hatte folgende Zusammensetzung (in mM): KCl 120; MgCl₂ 2; CaCl₂ 1; HEPES 10; EGTA 11; Glucose 20, der pH betrug 7,2.
Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Als Referenz wurde ein Silber- Silberchlorid-Pellet verwendet. Als Haltepotential wurde -60 mV gewählt. Aus dem Verstärker kommend wurden die Signale mit Hilfe von Zwischenverstärkern nachverstärkt und bei 1 kHz tiefpassgefiltert. Die so modulierten Signale wurden mittels eines Speicheroszilloskops dargestellt und mit einem Thermoschreiber aufgezeichnet. Gleichzeitig wurden die Signale über einen Digital/Analog- Wandler erfaßt und auf Videoband aufgezeichnet. Die gespeicherten Daten wurden später abgespielt, erneut digitalisiert und dann "offline" mit einem PC ausgewertet. Zur Auswertung wurde das TIDA-Programm (HEKA, Germany) und das Programm-Set von J. Dempster (University of Strathclyde, UK) verwendet.
Inhibitorische postsynaptische Ströme (IPSCs) wurden durch Zugabe der Glutamat-Rezeptor-Antagonisten NBQX (10 pM; für den AMPA-Rezeptor) und APV (30 µM; für den NMDA-Rezeptor) isoliert. Nach Zugabe der Glutamat- Rezeptor-Antagonisten brach die neuronale Spontanaktivität fast völlig zusammen. Durch Zugabe von 1 mM 4-Amino-pyridin (4-AP) konnte die Aktivität wieder angeregt werden. Jetzte zeigten sich synap-tische Ereignisse, die nach Zugabe von Bicucullin (20 µM) und Pikrotoxin (10 µM) vollständig verschwanden, also rein GABA_A-Rezeptor-vermittelt waren.
Zusätzlich wurden hier die pharmakologischen Effekte auf die Abklingkinetik der inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs) untersucht, da diese wesentlich für das Phänömen der Desensitivierung ist.
Die Amplituden der IPSCs fielen in einer biexponentiellen Kinetik ab, d. h. man fand eine Überlagerung zweier Komponenten, wobei die erste Zeitkonstante den schneller abfallenden Anteil des IPSCs darstellte und daher als τfast oder schnelle Zeitkonstante bezeichnet wird, während die zweite Zeitkonstante den langsamer auslaufenden Anteil des IPSCs beschreibt und deshalb als -uslow oder langsame Zeitkonstante bezeichnet wird. Die durchschnittliche Abklingzeit der schnellen Komponente τfast betrug 6.9 ± 4.8 ms, die der langsamen Komponente τslow 34.1 ± 12.5 ms. Diese Werte stellen einen Durchschnitt aus allen Kontrollmessungen dar.
Die Effekte von Abecarnil waren denen eines Benzodiazepins wie z. B. Midazolam sehr ähnlich (n = 10). So wurde die Frequenz auf 33.8 ± 24.7% des Ausgangswertes reduziert (P < 0.05), gleichzeitig wurde die Amplitude vergrößert (129.2 ± 26.9%; P < 0.05). Die schnelle Zeitkonstante der gemittelten IPSCs zeigte zwar eine Tendenz zu erhöhten Werten (143.9 ± 51.0%), doch erreichte dieser Effekt keine statistische Signifikanz. Die langsame Zeitkonstante hingegen wurde in signifikanter Weise vergrößert und zwar auf 289.7 ± 180.9% des Ausgangswertes (P < 0.05).
Exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) wurden durch Zugabe des GABA_A-Rezeptor-Antagonisten Bicucullin (20 µM) und des allosterisch wirkenden GABA_A-Rezeptor-Antagonisten Pikrotoxin (10 µM) isoliert. Auch hier führte die Zugabe von 4-AP zu einer Erhöhung der neuronalen Aktivität. Die nun erkennbaren reinen EPSCs waren durch Zugabe von 10 µM NBQX und 30 µM APV vollständig blockierbar, also rein glutamaterg.
Die Frequenz der EPSCs wurde durch Abecarnil auf 32.6 ± 19.8% des Ausgangswertes reduziert (P < 0.05), gleichzeitig wurde die Amplitude verkleinert, und zwar auf 81.2 ± 17.8% des Ausgangswertes (P < 0.05). In einigen Zellen war der Frequenz-Effekt nur schwach ausgeprägt, in einigen Zellen aber wurde die Aktivität vollständig blockiert.
Um diesen, zunächst sehr überraschenden, Effekt genauer zu untersuchen wurde folgender Versuch durchgeführt: Auf die isolierten EPSCs wurden zusätzlich 30 µM APV appliziert, um den NMDA-gesteuerten Anteil zu unterdrücken und die AMPA-erge Aktivität isoliert zu betrachten. Auf diese Aktivität hatte Abecarnil keinen Effekt (n = 3). Wurden im Gegenzug auf die isolierten EPSCs 10 µM NBQX appliziert, um den AMPA-ergen Anteil zu unterdrücken und den NMDA-Anteil herauszuheben, und dann 1 µM Abecarnil appliziert, so wurde diese Aktivität durch Abecarnil komplett geblockt (n = 7). Damit konnte gezeigt werden, daß Abecarnil deutliche NMDA-antagonistische Eigenschaften besitzt.

Claims

1. Verwendung von GABAA-Rezeptor-Modulatoren mit NMDA- antagonistischer Aktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur neuroprotektiven Behandlung neurodegenerativer und anderer, durch übermäßige Aktivierung des glutamatergen Systems hervorgerufener Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von neurodegenerativen und anderen, durch übermäßige Aktivierung des glutamatergen Systems hervorgerufenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung Multipler Sklerose, infektionsbedingter Encephalopathien oder Creutzfeld-Jakob-Erkrankung.

4. Verwendung von β-Carbolinderivaten der Formel I und deren physiologisch verträglichem Salz

worin
R¹ Wasserstoff oder -O-R⁵,
R³ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl,
R⁴ Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder -CH₂-O-CH₃,
n 1 oder 2,
R⁵ Wasserstoff, Phenyl, Benzyl, mit Cl substituiertes Phenyl oder mit Cl substituiertes Phenyl ist,
nach Anspruch 1 oder 2.

5. Verwendung von Abecarnil nach Anspruch 1 oder 2.

6. Mittel enthaltend (1) einen GABAA-Rezeptor-Modulator mit NMDA- antagonistischer Aktivität und (2) α-Liponsäure oder Dihydro-α-Liponsäure.

7. Verwendung eines Mittels nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur neuroprotektiven Behandlung von neurodegenerativen und anderen, durch übermäßige Aktivierung des glutamatergen Systems hervorgerufenen Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems.