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Die Erfindung betrifft die Verwendung
von Derivaten des 1,5,6,7-Tetrahydrochinolins zur Behandlung von
Tropenkrankheiten, insbesondere von Leishmaniosen, der Trypanosomiasis
oder der Chagas-Krankheit.
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Es ist bekannt, dass Deferiprone
(1,2-Dimethyl-3-hydroxy-4-(1H)-pyridon), ein synthetischer oraler Chelator,
zur Therapie der Thalassämie
und bei Schwermetallvergiftungen eingesetzt wird (Olivieri et al.,
N. Engl. J. Med. 339 (1998), 41–423).
Weiterhin ist bekannt, dass das Deferiprone Aktivität gegen
Trypanosoma cruzi zeigt (Jones et al., Arzneim. Forsch. 46 (1996),
1158–1162;
Singh et al., Arnzeim. Forsch. 47 (I) (1997), 311–315).
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Ferner sind Derivate des 1,5,6,7-Tetrahydrochinolins
pflanzlichen Ursprungs bekannt (Tinto et al., J. Nat. Prot. 54 (1991),
1309–1313;
Alves et al., Tetrahedron Lett. 40 (1999), 205–208). Bei einer der Verbindungen
handelt es sich um 3-Methoxy-2-methyl-5-n-octyl-1,5,6,7-tetrahydro-chinolin-4,8-dion
(Antidesmon) (Bringmann et al., Tetrahedron 56 (2000), 3691–3695).
Die Substanzen werden in Pflanzen der Gattung Hyeronima und in Antidesma-Arten
gefunden.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, ein Arzneimittel zur Behandlung von Tropenkrankheiten zur Verfügung zu
stellen.
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Die Aufgabe wird gelöst durch
ein Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formeln (I)
oder (II)
worin R
1,
R
2, R
3, R
5, R
6, R
7,
und R
8 ausgewählt wird aus Wasserstoff, substituiertem
oder unsubstituiertem C
1–4 Alkyl, C
2_
4 Alkenyl, C
1_
4 Alkoxy,
R
4 ausgewählt wird
aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem C
1_
5 Alkyl, C
2_
5 Alkenyl,
R
9 ausgewählt wird
aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem C
1–4 Alkyl,
C
2_
4 Alkenyl, Hydroxyl oder
Sauerstoff, der über
eine Doppelbindung gebunden ist,
R
10 ausgewählt wird
aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem C
1_
4 Alkyl, C
2_
4 Alkenyl, C
1_
4 Acyl,
X N,O oder S ist;
oder
pharmazeutisch verträgliche
Säureadditionssalze
der Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder (II).
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In einer bevorzugten Ausführungsform
ist R, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl.
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Weiterhin ist R2 bevorzugt
Methyl oder Ethyl.
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Ferner kann R3 vorzugsweise
Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sein.
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R4 ist vorzugsweise
substituiertes oder unsubstituiertes C6–10-Alkyl
oder C6–10-Alkenyl,
insbesondere C8-Alkyl oder C8-Alkenyl.
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Weiterhin können R5 und
R6 vorzugsweise Wasserstoff sein.
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R7 und R8 können
unabhängig
voneinander vorzugsweise Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sein.
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R10 ist vorzugsweise
Methyl oder Acetyl.
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In weiteren bevorzugten Ausführungsformen
kann C1_4-Alkyl
Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder tert-Butyl sein.
Ferner kann C2_4-Alkenyl
vorzugsweise Ethenyl, Propenyl oder Butenyl sein.
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In weiteren bevorzugten Ausführungsformen
ist die Verbindung der allgemeinen Formel (I) ausgewählt aus:
worin
glc Glucopyranosyl bedeutet.
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Ferner ist die Verbindung der allgemeinen
Formel (II) bevorzugt ausgewählt
aus:
Die Verbindung der allgemeinen
Formel (I) oder (II) kann zur Behandlung von Tropenkrankheiten,
vorzugsweise von parasitären
Tropenkrankheiten, insbesondere der Schlafkrankheit, der Malaria,
der Bilharziose, der Amöben-Ruhr,
der Chagas-Krankheit, der Onchocercose, der Kala Azar u. a. Leishmaniosen,
Gelbfieber und Lepra verwendet werden.
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Es können vorzugsweise pharmazeutisch
verträgliche
Additionssalze, wie Hydrochloride oder Tatrate, verwendet werden.
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Im folgenden wird das Arzneimittel,
enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder (II) genauer
beschrieben.
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Die erfindungsgemäßen Arzneimittelzubereitungen
werden vor allem intravenös,
aber auch intramuskulär,
intraperitoneal, subkutan oder peroral verabreicht. Auch eine äußerliche
Applikation ist möglich.
Bevorzugt ist die Verabreichung durch intravenöse Injektion oder intravenöse Infusion.
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Die Arzneimittelzubereitungen werden
nach an sich bekannten Verfahren hergestellt, wobei die erfindungsgemäß verwendete
Verbindung als solche oder gegebenenfalls in Kombination mit geeigneten
pharmazeutischen Trägerstoffen
eingesetzt wird. Enthalten die neuen pharmazeutischen Zubereitungen
neben dem Wirkstoff pharmazeutische Trägerstoffe, beträgt der Wirkstoffgehalt
dieser Mischungen 0,1 bis 99,5, vorzugsweise 0,5 bis 95 Gew.-% der
Gesamtmischung.
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In Übereinstimmung mit der Erfindung
wird der Wirkstoff in jeder geeigneten Formulierung angewandt unter
der Voraussetzung, dass die Ausbildung bzw. Aufrechterhaltung von
ausreichenden Wirkstoffpegeln gewährleistet ist. Das kann beispielsweise
durch orale oder parenterale Gabe in geeigneten Dosen erreicht werden.
Vorteilhafterweise liegt die pharmazeutische Zubereitung des Wirkstoffs
in Form von Einheitsdosen vor, die auf die gewünschte Verabreichung abgestimmt
sind. Eine Einheitsdosis kann zum Beispiel eine Tablette, ein Dragee,
eine Kapsel, ein Suppositorium oder eine gemessene Volumenmenge
eines Pulvers, eines Granulates, einer Lösung, einer Emulsion oder einer
Suspension sein.
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Unter "Einheitsdosis" im Sinne der vorliegenden Erfindung
wird eine physikalisch bestimmte Einheit verstanden, die eine individuelle
Menge des aktiven Bestandteils in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägerstoff
enthält
und deren Wirkstoffgehalt einem Bruchteil oder Vielfachen einer
therapeutischen Einzeldosis entspricht. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise
die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird
und die gewöhnlich
einer ganzen, einer halben, einer drittel oder einer viertel Tagesdosis
entspricht. Wenn für
eine einzelne therapeutische Verabreichung nur ein Bruchteil, wie
die Hälfte
oder ein Viertel der Einheitsdosis benötigt wird, ist die Einheitsosis
vorteilhafterweise teilbar, z.B. in Form einer Tablette mit Bruchkerbe.
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Die pharmazeutischen Zubereitungen
gemäß der Erfindung
können,
wenn sie in Einheitsdosen vorliegen und für Applikationen z.B. am Menschen
bestimmt sind, etwa 0,1 bis 500 mg, bevorzugt 10 bis 200 mg und
insbesondere 50 bis 150 mg Wirkstoff enthalten.
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Im allgemeinen werden in der Humanmedizin
der oder die Wirkstoffe in einer Tagesdosis von 0,1 bis 5, vorzugsweise
1 bis 3 mg/kg Körpergewicht,
gegebenenfalls in Form mehrerer, vorzugsweise 1 bis 3 Einzelgaben
zur Erzielung der gewünschten
Ergebnisse verabreicht. Eine Einzelgabe enthält den oder die Wirkstoffe in
Mengen von 0,1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 mg/kg Körpergewicht.
Bei einer oralen Behandlung können ähnliche
Dosierungen zur Anwendung kommen.
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Die therapeutische Verabreichung
der pharmazeutischen Zubereitung kann 1 bis 4 mal am Tage zu festgelegten
oder variierenden Zeitpunkten erfolgen, z.B. jeweils vor den Mahlzeiten
und/oder am Abend. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten
Dosierungen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art, dem Körpergewicht
und dem Alter der zu behandelnden Individuen, der Art und Schwere
der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation der
Arzneimittelzubereitungen sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb
welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend
sein, mit weniger als der oben genannten Menge Wirkstoff auszukommen,
während
in anderen Fällen
die oben angeführte Wirkstoffmenge überschritten
werden muss. Es kann sich auch als zweckmäßig erweisen, die Arzneimittelzubereitungen
nur einmalig oder im Abstand von mehreren Tagen zu verabreichen.
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Die Festlegung der erforderlichen
optimalen Dosierung und Applikationsart der Wirkstoffe kann durch jeden
Fachmann aufgrund seines Fachwissens erfolgen.
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Die pharmazeutischen Zubereitungen
bestehen in der Regel aus den erfindungsgemäßen Wirkstoffen und nichttoxischen,
pharmazeutisch verträglichen
Arzneimittelträgern,
die als Zumischung oder Verdünnungsmittel,
beispielsweise in fester, halbfester oder flüssiger Form oder als Umhüllungsmittel,
beispielsweise in Form einer Kapsel, eines Tablettenüberzugs,
eines Beutels oder eines anderen Behältnisses für den therapeutisch aktiven
Bestandteil in Anwendung kommen. Ein Trägerstoff kann z.B. als Vermittler
für die
Arzneimittelaufnahme durch den Körper,
als Formulierungshilfsmittel, als Süßungsmittel, als Geschmackskorrigens,
als Farbstoff oder als Konservierungsmittel dienen.
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Zur oralen Anwendung können z.B.
Tabletten Dragees, harte und weiche Kapseln, z.B. aus Gelatine, dispergierbare
Pulver, Granulate, wässrige
und ölige
Suspensionen, Emulsionen, Lösungen
oder Sirupe kommen.
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Tabletten können inerte Verdünnungsmittel,
z.B. Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Natriumphophat oder Lactose;
Granulierungs- und Verteilungsmittel, z.B. Maisstärke oder
Alginate; Bindemitte, z.B. Stärke,
Gelatine oder Akaziengummi; und Gleitmittel, z.B. Aluminium- oder
Magnesiumstearat, Talkum oder Silikonöl, enthalten. Sie können zusätzlich mit
einem Überzug
versehen sein, der auch so beschaffen sein kann, dass er eine verzögerte Auflösung und
Resorption der Arzneimittelzubereitung im Gastrointestinaltrakt
bewirkt, so dass z.B. eine bessere Verträglichkeit, Protahierung oder
Retardie rung erreicht wird. Gelatinekapseln können den Arzneistoff vermischt
mit einem festen, z.B. Calciumcarbonat oder Kaolin, oder einem öligen, z.B.
Oliven-, Erdnuss-, oder Paraffinöl,
Verdünnungsmittel
enthalten.
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Wässrige
Suspensionen können
Suspendiermittel, z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose,
Hydroxypropylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Traganthgummi
oder Akaziengummi; Dispergier- und Benetzungsmittel, z.B. Polyoxyethylenstearat,
Heptadecaethylenoxycatanol, Polyoxyethylensorbitolmonooleat oder
Lecithin; Konservierungsmittel, z.B. Methyl- oder Propylhydroxybenzoate;
Geschmacksmittel; Süßungsmittel,
z.B. Saccharose, Lactose, Natriumcyclamat, Dextrose, Invertzuckersirup,
enthalten.
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Ölige
Suspensionen können
z.B. Erdnuss-, Oliven-, Sesam-, Kokos- oder Paraffinöl und Verdickungsmittel,
wie z.B. Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol, enthalten;
ferner Süßungsmittel
, Geschmacksmittel und Antioxidantien.
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In Wasser dispergierbare Pulver und
Granulate können
die erfindungsgemäß verwendete
Verbindung in Mischung mit Dispergier-, Benetzungs- und Suspendiermitteln,
z.B. den oben genannten, sowie mit Süßungsmitteln, Geschmacksmitteln
und Farbstoffen enthalten.
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Emulsionen können z.B. Oliven-, Erdnuss-,
oder Paraffinöl
neben Emulgiermitteln, wie z.B. Akaziengummi, Traganthgummi, Phosphatiden,
Sorbitanmonooleat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat, und Süßungs- und
Geschmacksmittel enthalten.
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Wässrige
Lösungen
können
Konservierungsmittel, z.B. Methyl- oder Propylhydroxybenzoate; Verdickungsmittel;
Geschmacksmittel; Süßungsmittel,
z.B. Saccharose, Lactose, Natriumcyclamat, Dextrose, Invertzuckersirup,
sowie Geschmacksmittel und Farbstoffe enthalten.
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Zur parenteralen Anwendung der Arzneistoffe
dienen steril injizierbare, wässrige
Lösungen,
isotonische Salzlösungen
oder sonstige Lösungen.
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Figurenbeschreibung
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1:
Vergleich der trypanoziden Wirkung von Antidesmon und Benznidazol,
ermittelt im Trypanosma-cruzi-in-vitro-Assay (Versuch 2). Die Höchstkonzentration
von Antidesmon war 0,37, von Benznidazol 30 μg/ml; die Wirkung wird als prozentuales
Wachstum im Vergleich zur Positivkontrolle angegeben.
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2:
Vergleich der antitrypanosomalen Wirkung der Derivate der Gruppe
I mit Antidesmon (Daten für
die Derivate aus Versuch 5, für
Antidesmon aus Versuch 2).
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3:
Vergleich der antitrypansomalen Aktivität der Gruppe II-Derivate mit
Antidesmon (Daten für
die Derivate aus Versuch 5, für
Antidesmon aus Versuch 1).
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4:
Vergleich der antitrypanosomalen Wirkung der Derivate aus Gruppe
III mit Antidesmon (Daten für
die Derivate aus Versuch 5, für
Antidesmon aus Versuch 2).
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5:
Vergleich der antitrypansomalen Aktivität der Gruppe IV-Derivate mit
Antidesmon (Daten für die
Derivate aus Versuch 5, für
Antidesmon aus Versuch 1).
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6:
Vergleich der antitrypansomalen Aktivität der Strukturanaloga mit Antidesmon
(Daten für
Deferiprone und Melochinin aus Versuch 5, für Antidesmon aus Versuch 1).
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7:
Vergleich der Substanzen, die Aktivität gegen T. cruzi zeigten (Daten
aus Versuch 7).
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8:
Selektivitätsindices
für die
untersuchten Substanzen. Die Werte sind die Quotienten aus dem mittleren
IC50-Wert für
L6-Zellen und dem mittleren IC-50-Wert für Trypanosoma cruzi; je höher der
Wert, desto wahrscheinlicher ist eine selektive Wirkung auf die
Trypanosomen.
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9:
Vergleich der IC50-Werte für
Antidesmon im Test gegen drei verschiedene Trypanosomenspezies.
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10:
IC50-Werte in der In-vitro-Testreihe gegen den P.-falciparum-Stamm
K1.
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11:
IC50-Werte in der In-Vitro-Testreihe gegen den P.-falciparum-Stamm
NF54.
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12:
Zytotoxische Wirkung von Antidesmon auf humane und murine Zellinien.
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13:
Zytotoxische Wirkung von Mefloquin auf humane und murine Zellinien.
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14:
Zytotoxische Wirkung von Benznidazol auf humane und murine Zellinien
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15:
Schema der Mikrotiterplatten-Aufteilung im T.-cruzi-Assay (AK =
Anfangskonzentration)
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16:
Schema der Objektträger-Aufteilung
im L.-donovani-Assay
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17:
Schema der Mikrotiterplatten-Aufteilung im P.-falciparum-Assay
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18:
Schema der Mikrotiterplatten-Aufteilung im Zytotoxizitäts-Assay
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand
von Beispielen erläutert.
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1. Beispiel
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1.1. Tests auf Aktivität gegen
Trypanosomen
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1.1.1. Trypanosoma cruzi
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Das Ziel der Versuche war es, Antidesmon,
seine Derivate und strukturähnlichen
Substanzen auf Aktivität
gegen Trypanosoma cruzi in vitro zu testen und die Wirkung mit der
einer Referenzsubstanz, Benznidazol, zu vergleichen.
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Hierbei wurde jede Substanz im Parallelansatz
in sechs Konzentrationen getestet, die sich durch Reihenverdünnung der
Anfangskonzentration ergaben. Das Wachstum der Parasiten bei einer
gegebenen Substanzkonzentration wird als Prozentsatz des Parasitenwachstums
ohne Wirksubstanz (Kontrollansatz) angegeben. In den Tabellen sind
die Ergebnisse der Parallelansätze
getrennt aufgeführt,
für die
Diagramme wurden die Resultate eines Versuches Bemittelt.
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Als Endergebnis jedes Versuchs wurde
der IC50-Wert mit Hilfe von Formel (I) ermittelt. Dieser Wert gibt
die Substanzkonzentration an, die eine fünfzigprozentige Wachstumshemmung
der Parasiten im Vergleich zur Positivkontrolle bewirkt. Konnte
der Wert nur näherungsweise
ermittelt werden (s. Testmethoden Kap. 4.5.), wird er im Text durch
ein * gekennzeichnet.
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Formel
1: IC50-Berechnung in der Auswertung der Parasiten- und Zytotoxizitäts-in-vitro-Assays
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Die Aktivität der Substanzen wurde anhand
der ermittelten IC50-Werte beurteilt (Tab. 1). Die nach der in Tabelle
1 vorgenommenen Unterteilung bezieht sich im folgenden lediglich
auf den speziellen getesteten Assay und ist nicht als allgemeine
Beurteilung der jeweiligen Verbindung zu verstehen.
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Tab.
1: Bewertung der Testsubstanzen im T.-cruzi-Assay
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Als Referenzsubstanz wurde Benznidazol
ausgewählt,
das eines der Mittel der ersten Wahl zur Therapie der durch T. cruzi
verursachten Chagas-Krankheit und auch in vitro gut wirksam ist.
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Wirkung von
Antidesmon
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Der erste Versuch wurde mit einer
Höchstkonzentration
von 90 μg/ml
für Antidesmon
und 30 μg/ml
für Benznidazol
in sechs Reihenverdünnungen
von 1:3 und je zwei Parallelansätzen
durchgeführt
(Tab 1). Es ergab sich ein IC50-Wert von 0,49 μg/ml als Mittelwert der beiden
Parallelansätze
für Benznidazol.
Für Antidesmon
konnte kein IC50-Wert
ermittelt werden, da selbst in der kleinsten Konzentration von 0,37 μg/ml das
Parasitenwachstum weit unter 50 Prozent der Positivkontrolle lag.
Dieses Ergebnis wies auf eine stark hemmende Wirkung des Anitdesmons
auf das Parasitenwachstum hin. Der IC50-Wert mußte gemäß diesen Resultaten kleiner
als 0,37 μg/ml
sein.
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Folglich wurde die Anfangskonzentration
von Antidesmon im nächsten
Versuch verringert und mit 3μg/ml
begonnen, um einen genauen IC50-Wert zu erhalten. Im übrigen wurde
verfahren wie in Versuch 1. Trotz der um ein Dreißigstel
verringerten Anfangskonzentration konnte erneut kein IC50-Wert für Antidesmon ermittelt
werden (Tab. 1). Noch in der kleinsten Antidesmon-Konzentration
(0,01 μg/ml)
war das Parasitenwachstum auf 34 bzw. 48% der Positivkontrolle reduziert.
Es mußte
angenommen werden, daß die
IC50 kleiner als 0,01 μg/ml
ist. Für
Benznidazol ergab sich als Mittelwert der beiden Ansätze ein
IC50-Wert von 0,46 μg/ml.
Im nächsten
Test wurde die Höchstkonzentration
von Antidesmon nochmals verringert. Der Test wurde mit einer Anfangskonzentration
von 0,37 μg/ml
für Antidesmon
und 30 μg/ml
für Benznidazol
im Parallelversuch und sechs Reihenverdünnungen von 1:3 durchgeführt (Tab.
2).
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Es ergab sich für Antidesmon ein IC50-Wert
von 0,054 μg/ml
als Mittelwert der beiden Parallelansätze und analog für Benznidazol
ein Wert von 0,69 μg/ml.
Antidesmon hemmt also in deutlich niedrigeren Konzentrationen als
Benznidazol das Wachstum der Trypanosomen (1).
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Tabelle
1: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay: Antidesmon und Benznidazol
wurden im Parallelansatz in sechs Konzentrationen getestet, die
sich durch 1:3 Reihenverdünnung
der Anfangskonzentration ergaben. Die Spalten 1a und 1b geben die
Werte der zwei Parallelansätze
wieder. Die Hemmwirkung auf die Parasiten wird als prozentuales
Wachstum in Bezug zur Postivkontrolle angegeben, und durch Formel
(I) der IC50-Wert
ermittelt.
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Tabelle
2: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay
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Wirkung der Derivate und
Strukturanaloga von Antidesmon
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Weiterhin wurden für Derivate
des Antidesmons und die Strukturanaloga Deferiprone und Melochinin IC50-Werte
ermittelt. Dazu wurde jede Substanz zweimal in unabhängigen Testreihen
(Test 4 und 5), jeweils in zwei Parallelansätzen, untersucht.
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Für
die Referenzsubstanz Benznidazol wurden in beiden Testreihen je
zwei IC50-Werte ermittelt, die in Tabelle 3 angegeben sind. Sie
sind die Referenzwerte für
die gesamte jeweilige Testreihe. Die Anfangskonzentration von Benznidazol
war in beiden Versuchsdurchläufen
30 μg/ml.
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Gruppe I: AdOMeb, AdOMec,
AdOL
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Bei diesen Derivaten wurden funktionelle
Gruppen am Bicyclus verändert.
In Versuch 4 war die Anfangskonzentration aller Derivate 90 μg/ml. Es
wurden sechs Reihenverdünnungen
von 1:3 und je zwei Parallelversuche pro Test durchgeführt (Tab.
3).
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Für
die Versuchsreihe 4 ergab sich eine IC50 von 0,41 bzw. 0,58 μg/ml für Benznidazol.
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Die IC50 für das Derivat AdOMec betrug
1,56 bzw. 1,21 μg/ml.
Die Derivate AdOMeb und AdOL zeigten eine stärkere Wirkung auf T. cruzi.
Sie vermochten das Wachstum der Parasiten noch in der kleinsten
Konzentration auf weniger als zehn Prozent des Kontrollansatzes
zu reduzieren. Ein IC50-Wert konnte deshalb für diese beiden Substanzen nicht
ermittelt werden.
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Daher wurde in Versuchsreihe 5 die
Anfangskonzentration von AdOMeb und AdOL um ein Dreißigstel auf
3 μg/ml
reduziert. AdOMec und Benznidazol wurden wie in Versuch 4 dosiert.
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Der Versuch ergab IC50-Werte von
0,45 bzw. 0,48 μg/ml
für Benznidazol
und von 3,63 bzw. 3,94 μg/ml für AdOMec.
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Durch die niedrigere Anfangskonzentration
konnten nach diesem Versuch auch IC50-Werte für AdOL berechnet werden, die
mit 0,075 und 0,071 μg/ml ähnlich niedrig
lagen wie die des Antidesmons.
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Das Derivat AdOMeb zeigt die größte antitrypanosomale
Aktivität
der Substanzen dieser Gruppe. In der niedrigsten Konzentration von
0,01 μg/ml
reduzierte es das Trypanosomenwachstum auf unter drei Prozent der
Positivkontrolle. Der IC50-Wert des Derivats muß demnach kleiner als 0,01 μg/ml sein.
Der Vergleich der Dosis-Wirkungs-Beziehungen
(2) der Derivategruppe
I mit Antidesmon zeigt, daß AdOMeb
eine größere antitrypanosomale
Aktivität
als Antidesmon besitzt.
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Tabelle
3: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die Derivate der Gruppe 1.
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Gruppe II: AdNMeb, AdNMea
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Diese Derivate unterscheiden sich
vom Antidesmon durch ihre sterischen Ansprüche. In beiden Versuchsreihen
war die Anfangskonzentration der Derivate aus Gruppe II 90 μg/ml. Es
wurden sechs Reihenverdünnungen
von 1:3 und je zwei Parallelversuche pro Test durchgeführt (Tab.
4).
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AdNMea und AdNMeb erwiesen sich in
ihrer Wirkstärke
als sehr ähnlich.
In beiden Versuchen konnten IC50-Werte festgestellt werden. Es ergab
sich als mittlere IC50 ein Wert von 1,93 μg/ml für AdNMea und 2,12 μg/ml für AdNMeb.
Beide Derivate wirken schwächer
als Antidesmon (3).
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Tabelle
4: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die Derivate der Gruppe II.
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Gruppe III: AdAc, AdAml
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Die beiden Derivate der Gruppe III,
AdAc und AdAml, weisen ein gegenüber
dem Antidesmon verändertes
Oberflächenpotential
auf. Sie wurden in Test 4 zunächst
mit einer Anfangskonzentration von 90 μg/ml getestet. Es wurden sechs
Reihenverdünnungen
von 1:3 und je zwei Parallelversuche pro Test durchgeführt (Tab.
5).
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Versuch 4 ergab eine IC50 von 9,57
und 7,33 μg/ml
für AdAml.
Das Derivat AdAc reduzierte das Trypanosomenwachstum noch in der
kleinsten Konzentration auf Werte unter 10 Prozent der Postivkontrolle.
Es konnte daher kein IC50-Wert ermittelt werden.
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In Test 5 wurde die Anfangskonzentration
von AdAc auf 3 μg/ml
verringert. Der IC50-Wert
betrug in beiden Parallelansätzen
0,02 μg/ml.
Für AdAml
ergaben sich IC50-Werte von 7,39 und 5,06 μg/ml.
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In dieser Gruppe ist ein deutlicher
Wirkungsunterschied zwischen den beiden Substanzen zu erkennen.
Im Vergleich der Dosis-Wirkung-Beziehungen der Derivate mit Antidesmon
(4) zeigt AdAc eine
etwas schwächere
Wirkung als die Muttersubstanz.
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Tabelle
5: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die Derivate der Gruppe III.
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Gruppe IV: Ad-glc, Deoxo-Ad
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Im Unterschied zu Antidesmon besitzen
diese natürlichen
Derivate eine Glucopyranosylgruppe in der Seitenkette; bei Deoxo-Ad
fehlt zudem die Ketogruppe an C8. Die Substanzen wurden in beiden
Versuchsreihen mit einer Anfangskonzentration von 90 μg/ml getestet.
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Als Endergebnis von Versuch 4 und
5 (Tab. 6) fand sich eine mittlere IC50 von 7,28 μg/ml für Ad-glc und
15,27 μg/ml
für Deoxo-Ad.
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Deoxo-Ad hat den höchsten IC50-Wert
der bisher untersuchten Substanzen und ebenso wie Ad-glc eine im
Vergleich zu Antidesmon deutlich schwächere Wirkung (5).
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Tabelle
6: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die Derivate der Gruppe IV
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Strukturanaloga: Melochinin
und Deferiprone
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Mit derselben Methode wie die Antidesmon-Derivate
wurden die beiden Strukturanaloga getestet. Melochinin ist ein als
giftig bekannter Naturstoff, Deferiprone ein synthetischer Schwermetall-Chelatbildner.
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Die Anfangskonzentration beider Substanzen
in Versuchsreihen 4 und 5 war 90 μg/ml
(Tab. 7). Dabei ergab sich als mittlere IC50 für Deferiprone 9,62 μg/ml und
für Melochinin
16,89 μg/ml.
Damit ist Melochinin die am wenigsten wirksame aller untersuchten
Substanzen. Auch Deferiprone zeigt im Vergleich zu Antidesmon nur
geringe antitrypanosomale Aktivität (6).
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Tabelle
7: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die Strukturanaloga des Antidesmons.
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Vergleich der
aktiven Substanzen
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Als aktiv wurden analog einer Klassifizierung
des Tropeninstituts Basel Substanzen mit einer IC50 unter 1 μg/ml bezeichnet
(Tab. 1). Das trifft auf Antidesmon, Benznidazol, AdAc, AdOL und
AdOMeb zu. Diese Substanzen wurden in zwei weiteren Versuchsreihen
untersucht (Versuche 6 und 7). Das Ziel war es, die gefundenen IC50-Werte
zu überprüfen und
zudem einen IC50-Wert für
AdOMeb zu bestimmen. Durch gleiche Anfangskonzentration und gemeinsame
Testung aller aktiven Substanzen wurde ein direkter Vergleich der Wirksamkeit
ermöglicht.
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In den Versuchen 6 und 7 war die
Anfangskonzentration aller Substanzen 1 μg/ml (zuvor 3 μg/ml für die wirksamen
Derivate und 0,37 μg/ml
für die
Muttersubstanz). Es wurden sechs Reihenverdünnungen von 1:4 durchgeführt (zuvor
Verdünnungen
von 1:3). Beide Versuche bestanden aus je zwei Parallelansätzen pro Substanz.
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Als Mittel der vier gefundenen IC50-Werte
ergab sich für
AdOMeb 0,007 μg/ml,
für Antidesmon
0,027 μg/ml
sowie für
AdAc 0,093 μg/ml.
Die entsprechenden Werte für
AdOL und Benznidazol waren 0,0129 und 0,691 μg/ml (Tab 8).
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Die Resultate bestätigen, daß sowohl
Antidesmon als auch die drei getesteten Derivate in deutlich niedrigerer
Dosis als Benznidazol das Parasitenwachstum hemmen (7).
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Aufgrund des kleinsten IC50-Wertes
läßt sich
AdOMeb als die wirksamste der untersuchten Substanzen bezeichnen.
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Tabelle
8: Ergebnisse im T. cruzi-in-vitro-Assay für die in bisherigen Versuchen
am stärksten
wirksamen Substanzen.
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In der Zusammenschau aller ermittelten
IC50-Werte erweist sich AdOMeb als die Substanz, die das Trypanosomenwachstum
am stärksten
hemmt (Tab. 9). Es wirkt in signifikant geringerer Konzentration
(p < 0,01) als
alte anderen getesteten Substanzen, einschließlich der Referenzsubstanz
Benznidazol.
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Tabelle
9: Wirkung, mittlere IC-50-Werte und Standardabweichung σ aller getesteten
Substanzen im In-Vitro-Assay gegen Trypanosoma cruzi in μg/ml in n
Versuchsansätzen
-
1.1.2. Zytotoxizität auf L-6-Zellen
-
In dem zur Untersuchung der Substanzen
verwandten Trypanosoma-cruzi-Assay vermehrten sich die Parasiten
in einer Lage von L-6-Myofibroblasten. Eine Wirkung auf das Trypanosomenwachstum
könnte
daher auch auf einer Schädigung
der Wirtszellen beruhen. Um dies zu überprüfen, wurde die Toxizität der Substanzen
auf die Wirtszellen untersucht.
-
Zu diesem Zweck wurde die Wachstumshemmung
von L-6-Zellen durch Antidesmon, die drei wirksamsten seiner Derivate
sowie die Referenzsubstanz Benznidazol geprüft und IC50-Werte in gleicher
Weise wie im Trypanosoma-cruzi-Assay ermittelt. Die toxische Wirkung
der drei schwach aktiven sowie der inaktiven Substanzen Deferiprone,
Melochinin und Deoxo-Ad wurde ebenfalls untersucht. Die Anfangskonzentration war
100 μg/ml,
mit Ausnahme von Benznidazol (1000 μg/ml) und den inaktiven Substanzen
Deoxo-Ad und Melochinin (200 μg/ml).
Es wurde ein Versuch im Doppelansatz und je sechs Reihenverdünnungen
von 1:2 durchgeführt.
-
Am stärksten toxisch wirkte das Derivat
AdOMec (IC50 19,1 μg/ml)
auf die Wirtszellen (Tab. 10). Diese Substanz hatte eine schwache
Aktivität
gegen T. cruzi gezeigt. Die beiden ebenfalls schwach aktiven Substanzen
der Gruppe II hemmten das Zellwachstum dagegen in den Höchstkonzentrationen
von 100 μg/ml
kaum. Die IC50 dieser Substanzen ist größer als 100 μg/ml.
-
Die IC50-Werte der gegen T.cruzi
aktiven Substanzen AdOMeb, Antidesmon, AdOL und AdAc lagen um 60 μg/ml (Tab.
10).
-
Die inaktiven Substanzen Deferiprone,
Melochinin und Deoxo-Ad zeigten in den Höchstkonzentrationen von 100
(Deferiprone) bzw. 200 μg/ml
keine toxische Wirkung. Benznidazol verringerte das Zellwachstum in
einer Konzentration von 1000 μg/ml
nicht auf Werte unter 50 Prozent der Kontrolle (Tab. 10).
-
Tabelle
10: Wirkung der Testsubstanzen auf die Wirtszellen von Trypanosoma
cruzi (L6-Myofibroblasetn)
-
Um der Frage nachzugehen, inwieweit
die Substanzen hemmend auf das Wachstum von Trypanosoma cruzi wirken,
ohne die Wirtszellen zytotoxisch zu beeinflussen, wurde aus den
ermittelten Werten der Selektivitätsindex berechnet (Tab. 11).
Dieser ist der Quotient aus dem mittleren IC50-Wert für die Säugerzellen und
dem mittleren IC-50-Wert
für die
Parasiten. Die Berechnung war nur für die Substanzen möglich, bei
denen ein IC50-Wert für
die toxische Wirkung auf die Wirtszellen ermittelt werden konnte.
-
Je höher der Selektivitätsindex
, desto wahrscheinlicher eine hohe Wirksamkeit gegen die Trypanosomen
bei geringer Zytotoxizität.
Hierbei ergibt sich für
das Derivat AdoMeb der größte Selektivitätsindex.
Für das
Derivat AdOMec, das bei schwacher Wirksamkeit eine hohe Toxizität aufwies,
errechnete sich der niedrigste Selektivitätsindex der betrachteten Substanzen
(8). Ein Selektivitätsindex
für Benznidazol
muss erheblich größer als
1660 sein (Tab. 11).
-
Tabelle
11: Vergleich der IC50-Werte für
die Parasiten und deren Wirtszellen und Berechnung des Selektivitätsindex.
-
1.1.3. Trypanosoma brucei
rhodesiense und Trypanosoma evansi
-
In den vorangegangenen Versuchen
wurde eine Aktivität
von Antidesmon und einigen seiner Derivate gegen Trypanosoma cruzi
ermittelt.
-
Es stellte sich nun die Frage, ob
Antidesmon spezifisch auf T. cruzi wirkt oder auch Aktivität gegen
andere Trypanosomenspezies besitzt. Um dies zu prüfen, wurde
die Wirkung von Antidesmon gegen T. b. rhodesiense und T. evansi
in vitro untersucht. Als Referenzsubstanz für die Versuche wurde Melarsoprol
verwandt. Von dieser Substanz ist eine gute Aktivität in vitro
und in vivo gegen die beiden Trypanosomenspezies bekannt. Die Aktivität von Antidesmon
wurde nach dem ermittelten IC50-Wert beurteilt (Tab.12). Die nach
der in Tabelle 12 vorgenommenen Unterteilung bezieht sich im folgenden
lediglich auf den speziellen getesteten Essay und ist nicht als
allgemeine Beurteilung derjeweiligen Verbindung zu verstehen.
-
Tabelle
12: Bewertung der Testsubstanzen im T.-b.-rhodesiense- und T.-evansi-Assay
-
Die Wirkung von Antidesmon gegen
T. b. rhodesiense wurde in zwei Versuchen in sechs Konzentrationen
geprüft,
die sich im aus einer 1:3-(Versuch Tr1) bzw. 1:2-(Versuch Tr2) Reihenverdünnung ergaben.
Die Anfangskonzentration war im ersten Versuch 75 μg/ml, im
zweiten 100 μg/ml.
In jeden Versuch wurde die Referenzsubstanz in den gleichen Verdünnungsschritten
und in beiden Fällen
mit einer Anfangskonzentration von 75 ng/ml mitgeführt. In
Versuch 2 wurde das Trypanosomenwachstum auch bei der kleinsten
Melarsoprol-Konzentration Werte auf 14,4 bzw. 13,2% der Kontrolle
reduziert. Der IC50-Wert wurde daher näherungsweise durch lineare
Regressionsanalyse ermittelt.
-
Im T.-b.-rhodesiense-Assay ergab
sich für
Antidesmon ein mittlerer IC50-Wert von 4,57 μg/ml, für Melarsoprol betrug er 0,0013 μg/ml (Tab.
13). Antidesmon bewirkt erst in signifikant höheren Konzentrationen als Melarsoprol
(p < 0,05) eine
Wachstumsreduktion der Parasiten. Der Naturstoff ist nicht aktiv
gegen T. b. rhodesiense.
-
Tabelle
13: Wirkung von Antidesmon auf T. b. rhodesiense im Vergleich zu
Melarsoprol
-
Die Wirkung von Antidesmon und Melarsoprol
auf T. evansi wurde analog dem Versuch Tr1 untersucht (Tab 14).
Da das Wachstum der Parasiten bei den kleinsten Substanzkonzentrationen
50 Prozent nicht überschritt,
wurden die IC50-Werte näherungsweise
bestimmt und sind daher mit * gekennzeichnet.
-
Auch hier lag der IC50-Wert von Antidesmon
mit 1,95 μg/ml
deutlich höher
als der von Melarsoprol. Nach Tab.12 kann Antidesmon dennoch als
schwach wirksam gegen T. evansi bezeichnet werden.
-
-
Tabelle 14: Wirkung von Antidesmon
auf T. evansi im Vergleich zu Melarsoprol
-
Vergleicht man die IC50-Werte für die drei
Trypansomenspezies miteinander (9),
so ist zu erkennen, dass der IC50-Wert des Antidesmons für T. cruzi
erheblich niedriger ist als die Werte für T. b. rhodesiense und T.
evansi. Zudem wirkte Antidesmon im T.cruzi-Assay in niedrigerer
Konzentration als die Referenzsubstanz, was bei den anderen beiden
Trypanosomenspezies nicht der Fall war.
-
1.2. Test auf Aktivität gegen
Leishmanien
-
1.2.1. Leishmania donovani
-
Die Wirkung von Antidesmon, seinen
Derivaten und Strukturanaloga auf Leishmania donovani wurde in zwei
Versuchsreihen betrachtet. Als Referenzsubstanz diente das Chemotherapeutikum
Natrium-Stibogluconat.
-
Das Maß für die Wirkung der Substanzen
war der Anteil nichtinfizierter Makrophagen im Vergleich zu einem
Kontrollansatz. Gemäß Formel
(I) wurde der IC50-Wert durch lineare Regressionsanalyse als Endresultat
jedes Versuchs berechnet. Falls bei allen Substanzkonzentrationen
in einem Versuch der Anteil nichtinfizierter Zellen größer bzw. kleiner
als 50 Prozent der Kontrolle war, wurde der IC50-Wert näherungsweise
bestimmt und mit einem * gekennzeichnet. War der Anteil nichtinfizierter
Zellen bei der größten Konzentration einer
Substanz 10 Prozent oder weniger, unterblieb eine IC50-Bestimmung und die
Substanz wurde als inaktiv bezeichnet.
-
Bei der mikroskopischen Auswertung
wurden auch toxische Effekte der Testsubstanz auf die Makrophagen
beurteilt.
-
In der ersten Versuchsreihe L1 wurden
alle Substanzen in den Konzentrationen 15 und 5 μg/ml im Duplikat getestet. Die
Referenzsubstanz Natrium-Stibogluconat wurde in Dosen von 150 und
50 μg/ml
getestet. Aus bereits durchgeführten
Versuchen zur Erstellung des Referenzbereiches war bekannt, dass
das Chemotherapeutikum in vitro erst in hohen Dosen wirkt. Hieraus
erklärt
sich der Konzentrationsunterschied zu den anderen Testsubstanzen.
-
Die Aktivität einer Substanz wurde anhand
der IC50-Werte beurteilt (Tab. 14)
Tabelle
14: Bewertung der Aktivität
der Testsubstanzen gegen L. donovani Antidesmon
-
In zwei Versuchsreihen mit unterschiedlichen
Konzentrationen (Tab. 15) ergab sich ein mittlerer IC50-Wert von
4,6* μg/ml
für Antidesmon
und 59,3* μg/ml
für Natrium-Stibogluconat. Antidesmon
wurde aufgrund des Resultats als schwach wirksam gegen L. donovani
eingestuft.
-
Tabelle
15: Wirkung von Antidesmon auf Leishmania donovani im Vergleich
zu Natrium-Stibogluconat
(%NIZ = Anteil nichtinfizierter Zellen, * = näherungsweise ermittelt).
-
Die mikroskopische Auswertung der
Versuche ergab Hinweise auf eine geringe toxische Wirkung des Antidesmons
auf die Wirtszellen. In der Höchstkonzentration
der Versuchsreihe L2 von 10 μg/ml
waren morphologische Schäden
der Makrophagen zu beobachten, der Anteil der nichtinfizierten Zellen
betrug 97%. Die Zellschäden
könnten
mitverursachend für
den geringen Anteil infizierter Zellen sein. In der mittleren Konzentration
von 3,3 μg/ml
zeigten die Makrophagen größtenteils
normale Morphologie Hier waren 23% der Zellen nicht infiziert. Die
niedrigste Antidesmon-Konzentration (1,1 μg/ml) hatte keine sichtbaren
Zellschäden
zur Folge. Nahezu alle Makrophagen waren mit Leishmanien befallen.
-
Die Referenzsubstanz Pentostam verursachte
keine mikroskopisch erkennbaren Zellveränderungen in Konzentrationen
von 40 und 13,3 μg/ml.
Der Anteil nichtinfizierter Zellen war mit 43 und 6% im Vergleich zum
Ansatz mit Antidesmon relativ gering.
-
Gruppe I: AdOMec, AdOMeb,
AdOL
-
Für
AdOMec und AdOL wurden mittlere IC50-Werte von 18* bzw. 15* μg/ml gefunden
(Tab. 16). Beide Substanzen gelten damit als inaktiv. Bei der mikroskopischen
Auswertung fiel eine starke Toxizität von AdOMec auf die untersuchten
Zellen auf. In der Probe mit der höchsten Testkonzentration dieser
Substanz (30 μg/ml)
waren nur noch Zelltrümmer
und stark verformte Zellen zu finden.
-
Der mittlere IC50-Wert von AdOMeb
wurde mit 1,3* μg/ml
bestimmt (Tab. 16). Die Substanz ist damit die wirksamste unter
den bisher untersuchten. Merkmale einer toxischen Wirkung waren
mikroskopisch nicht festzustellen.
-
Tabelle
16: Wirkung der Derivategruppe I auf Leishmania donovani (%NIZ =
Anteil nichtinfizierter Zellen, * = näherungsweise ermittelt).
-
Gruppe II: AdNMeb, AdNMea
-
In beiden Versuchen konnte kein IC50-Wert
für die
Derivate ermittelt werden, da ihre Wirkung auf die Parasiten zu
gering war. Die höchste
Konzentration von AdNMea und AdNMeb (60μg) verringerte die Zahl der infizierten
Zellen lediglich um 5 bzw. 9 Prozent.
-
Tabelle
17: Wirkung der Derivategruppe II auf Leishmania donovani (%NIZ
= Anteil nichtinfizierter Zellen).
-
Gruppe III: AdAc, AdAml
-
Der mittlere IC50-Wert von AdAc wurde
mit 5,6 μg/ml
festgestellt. Die mikroskopischen Auswertung zeigte einen geringfügigen toxischen
Effekt in der Konzentration 15μg/ml
(Tab. 18).
-
Für
AdAml konnte wegen seiner geringen Wirkung auf die Leishmanien kein
IC50-Wert ermittelt werden (Tab. 18).
-
Tabelle
18: Wirkung der Derivategruppe III auf Leishmania donovani (%NIZ
= Anteil nichtinfizierter Zellen).
-
Gruppe IV: Ad-glc, Deoxo-Ad
-
Diese Substanzen bewirkten lediglich
eine sehr geringe Reduktion des Anteils an infizierten Zellen. IC50-Werte
konnten daher nicht festgestellt werden.
-
Tabelle
19: Wirkung der Derivategruppe IV auf Leishmania donovani (%NIZ
= Anteil nichtinfizierter Zellen).
-
Strukturanaloga: Melochinin
und Deferiprone
-
Die beiden Strukturanaloga bewirkten
kaum eine Verringerung des Anteils an befallenen Zellen. IC50-Werte
konnten aufgrund der mangelnden Wirkung nicht ermittelt werden.
Mikroskopisch war eine toxische Wirkung von Deferiprone auf die
Makrophagen festzustellen. In der Konzentration 60 μg/ml erschien
die Zellgröße verringert
und die Zellen hatten sich abgerundet.
-
Beide Substanzen sind nicht wirksam
gegen L. donovani.
-
Tabelle
20: Wirkung der Strukturanaloga auf Leishmania donovani (%NIZ =
Anteil nichtinfizierter Zellen).
-
1.2.2. Zytotoxiziät auf Makrophagen
-
Im Leishmania-donovani-Assay vermehren
sich die Parasiten in einer Lage von Makrophagen aus der Maus. Es
wurde daher die Toxizität
der drei im L.-donovani-Assay aktivsten Substanzen auf diese Zellen
ermittelt. Hiermit sollte geprüft
werden, ob die Wirkung auf die Leishmanien auf einer Schädigung der
Wirtszellen beruht. Das Maß für die zytotoxische
Wirkung der Substanzen war die Wachstumshemmung der Makrophagen im
Vergleich zu einem Kontrollansatz.
-
Es ergab sich ein IC50-Wert von 7,04 μg/ml für Antidesmon
und 11,12 μg/ml
für AdAc
(Tab. 21). Die geringste Toxizität
besaß AdOMeb
(IC50 28,03 μg/ml).
-
Ein IC50-Wert für die Referenzsubstanz Natriumstibogluconat
konnte nicht ermittelt werden, da selbst in höchsten Konzentration (1000 μg/ml) nur
geringe Wachstums hemmung der Makrophagen eintrat. Eine höhere Dosierung
war nicht möglich,
da das Medikament bereits in der Konzentration von 1000 μg/ml teilweise ausfiel.
-
Aus den ermittelten IC50-Werten wurde
der Selektivitätsindex
(SI) berechnet (Tab. 22). AdOMeb hat mit 21,6 den größten Selektivitätsindex.
Der niedrige SI für
Antidesmon (1,5) und AdAc (2,0) weist darauf hin, daß bei diesen
Substanzen keine spezifische Wirkung auf die Leishmanien vorliegt.
Ein SI für
Natriumstibogluconat konnte nicht bestimmt werden, der Wert ist
muß erheblich
größer als
18 sein. Dies ist kennzeichnend für die spezifische Wirkung dieser
Substanz gegen L. donovani.
-
Tabelle
21: Wirkung der aktiven Substanzen auf die Wirtszellen von Leishmania
donovani
-
Tabelle
22: Selektivitätsindices
(IC50 Makrophagen/IC50 Leishmanien) für L. donovani
-
Von den untersuchten Substanzen erwiesen
sich AdOMeb, Antidesmon und AdAc als schwach wirksam gegen L. donovani.
AdOMeb hatte wie auch im T.-cruzi-Assay den niedrigsten IC50-Wert
aller Substanzen.
-
Tabelle
23: Wirkung, mittlere IC-50-Werte und Standardabweichung σ aller getesteten
Substanzen im In-Vitro-Assay gegen Leishmania donovani in μg/ml
-
1.3. Test auf Aktivität gegen
Plasmodium falciparum
-
Antidesmon, seine Derivate und Strukturanaloga
wurden auf Aktivität
gegen zwei Stämme
des Malariaerregers Plasmodium falciparum getestet. Der Stamm K1
weist eine partielle Chloroquinresistenz auf, der Stamm NF54 ist
nicht resistent. Als Referenzsubstanz diente Chloroquin, ein bewährtes Malaria-Chemotherapeutikum.
-
Das Maß für die Wirkung einer Substanz
war die Wachstumshemmung der Parasiten. Alle Substanzen wurden je
zweimal gegen NF54 und K1 getestet. Die Anfangskonzentration betrug
einheitlich 5 μg/ml.
Das Resultat eines jeden Versuchs war ein IC50-Wert für die jeweilige
Substanz. Nach diesem Wert wurde die Wirksamkeit eingeschätzt (Tab.
24)
-
Tabelle
24: Bewertung der Aktivität
der Testsubstanzen im P. falciparum-Assay
-
Antidesmon, Derivate und
Strukturanaloga
-
Da die Resultate der Tests für alle Substanzen ähnlich waren,
werden die Ergebnisse im folgenden für alle Substanzgruppen zusammenfassend
dargestellt.
-
Für
die Referenzsubstanz Chloroquin fand sich ein IC50-Wert von 0,058 μg/ml im Test
gegen den partiell resistenten Stamm K1 und ein Wert von 0,004 μg/ml für den nicht
resistenten Stamm NF54 (Tab. 24).
-
Antidesmon hat einen IC50-Wert von
4,1 μg/ml
im Test gegen den Stamm K1 und 3,0 μg/ml gegen den Stamm NF54 (Mittelwerte).
-
In der Derivategruppe I fanden sich
für AdOMec
und AdOMeb mittlere IC50-Werte von 2,2 und 2,4 μg/ml gegen K1 und 1,6 und 2,1 μg/ml gegen
NF54. Die beiden Substanzen wirken damit in niedrigerer Konzentration
als Antidesmon gegen den jeweiligen Parasitenstamm.
-
AdOL vermochte in der höchsten Konzentration
von 5 μg/ml
das Wachstum von K1 nicht auf Werte unter 50 Prozent zu reduzieren,
die IC50 für
NF54 war 4,0 μg/ml.
Keine der Substanzen in der Gruppe I erwies sich als aktiv gegen
die Plasmodien.
-
Die beiden Derivate der Gruppe bewirkten
in der höchsten
Konzentration von 5 μg/ml
eine nur sehr geringe Wachstumsreduktion von K1 und NF54. IC50-Werte
konnten daher nicht ermittelt werden.
-
Aus dem gleichen Grund ließen sich
für das
eine der Derivate der Gruppe III, AdAml, keine IC50-Werte bestimmen.
Die mittleren IC50-Werte für
AdAC betrugen 2,9 μg/ml für K1 und
2 μg/ml
für NF54.
Beide Substanzen zeigen keine spezifische Aktivität gegen
Plasmodien.
-
Für
beide Substanzen der Gruppe IV konnten IC50-Werte im Test gegen
K1 bestimmt werden. Sie betrugen im Mittel 1,4 μg/ml bei Ad-glc und 2,2 μg/ml bei
Deoxo-Ad. Im Test gegen NF54 bewirkten beide Substanzen in der Höchstkonzentration
nui geringe Wachstumsreduktion. Auch die Derivate der Gruppe IV
weisen keine Aktivität
gegen die Parasiten auf.
-
Gleiches gilt für die Strukturanaloga Melochinin
und Deferiprone. In dieser Gruppe konnte nur für Melochinin ein IC50-Wert
ermittelt werden; er betrug 3,9 μg/ml
im Test gegen NF54.
-
Tabelle
25: Wirkung gegen die Plasmodium falciparum- Stämme K1 und NF54 in vitro
-
Antidesmon, seine Derivate und Strukturanaloga
wurden in zwei Versuchsreihen gegen die Plasmodium-falciparum-Stämme K1 und
NF54 getestet. Unter den untersuchten Substanzen wirkte Ad-glc in
der niedrigsten Konzentration gegen den Stamm K1 ( 10). Dieses Derivat hatte keine Aktivität gegen
L. donovani oder T. cruzi gezeigt.
-
Den niedrigsten IC50-Wert im Test
gegen den Stamm NF54 wies das Derivat AdOMec auf (11).
-
Tabelle
26: Mittlere IC50-Werte in μg/ml
und Standardabweichung σ im
Test gegen P. falciparum
-
1.4. Test auf toxische
Wirkung
-
1.4.1. Test auf zytotoxische
Wirkung in vitro
-
Um einen Aufschluß über die allgemeine Zytotoxizität von Antidesmon
im Vergleich zu in Anwendung befindlichen antiparasitären Medikamenten
zu bekommen, wurde die Substanz vergleichend mit den Chemotherapeutika
Mefloquin und Benznidazol auf toxische Wirkung auf verschiedenen
humane und murine Zelllinine geprüft.
-
Die Höchstkonzentration von Antidesmon
und Mefloquin war in allen Versuchen 100 μg/ml, die von Benznidazol 1000 μg/ml. Es
wurden sechs Reihenverdünnungen
von 1:2 hergestellt. Pro Zellinie wurde ein Versuch im Parallelansatz
durchgeführt
und die gemessene Wachstumshemmung in beiden Ansätzen Bemittelt. Die IC50 wurde
gemäß Formel
(I) berechnet.
-
Humane Zellen
-
Die Toxizität auf humane Zellen wurde an
den Zellinien HepG2 (hepatozelluläre Karzinomzellen), MRC5 (Lungenfibroblasten)
und HT29 (kolorektale Adenokarzinomzellen) untersucht (Tab. 27).
-
Im Versuch mit HepG2 fand sich ein
IC50-Wert von 3,5 μg/ml
für Antidesmon
und 516 μg/ml
für Benznidazol.
Aus technischen Gründen
konnte die Toxizität
von Mefloquin hier nicht untersucht werden.
-
Der IC50-Wert für die Zelllinie HT29 betrug
9,2 μg/ml
für Antidesmon
und 4,7 μg/ml
für Mefloquin. Benznidazol
verringerte das Wachstum der Zellen in der Höchstkonzentration von 1000 μg/ml nicht
auf weniger als 50 Prozent, weshalb hier keine IC50 bestimmt werden
konnte.
-
Für
MRC5 ergaben sich IC50-Werte von 54 μg/ml (Antidesmon), 438 μg/ml (Benznidazol)
und 6,7 μg/ml
(Mefloquin).
-
Tab.
27: IC50-Werte im Test auf Zytotoxizität gegen humane Zellinien.
-
Murine Zellinien
-
Die toxische Wirkung von Antidesmon
auf murine Makrophagen und Myofibroblasten wurde bereits untersucht.
Ergänzend
wurde die Wirkung auf die Zellinie NB2a (Neuroblastomzellen aus
der Maus) betrachtet.
-
Hier fanden sich IC50-Werte von 42,36 μg/ml für Antidesmon,
745 μg/ml
für Benznidazol
und 8,1 μg/ml für Mefloquin
(Tab. 28).
-
Tab.
28: IC50-Werte im Test auf Zytotoxizität gegen Neuroblastomzellen
der Maus
-
1.4.1. Toxizitätsprüfung in
vivo
-
An zwei gesunden CD1-Mäusen wurde
die toxische Wirkung von Antidesmon in vivo untersucht. Dadurch
konnte die höchste
tolerierte Dosis von Antidesmon ermittelt werden. Dies diente der
Vorbereitung von Therapieversuchen bei parasiteninfizierten Mäusen mit
Antidesmon.
-
Den Mäusen wurde nach einem Schema
Antidesmon-Lösungen
steigender Konzentration bis zur Ermittlung der letalen Dosis intraperitoneal
gespritzt (Tab. 28). Die toxische Dosis von Antidesmon wurde mit
50 mg/kg, die höchste
tolerierte Dosis mit 20 mg/kg bei intraperitonealer Gabe bestimmt
(Tab. 29).
-
Tab.
29: Toxizität
von Antidesmon (intraperitonealer Applikation bei zwei Mäusen)
-
Antidesmon wirkte auf alle Zelllinien
in erheblich kleineren Konzentrationen als Benznidazol toxisch (12, 14). Im Vergleich mit Mefloquin ist die
Toxizität
von Antidesmon jedoch geringer (13).
Die höchste
toxische Wirkung von Antidesmon wurde bei den humanen kolorektalen
Adenokarzinomzellen festgestellt. Am wenigsten toxisch wirkte es
auf die humanen Lungenfibroblasten.
worin 
