DE10105208A1 - Verfahren zur Herstellung von cDNA - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cDNA mittels reverser Transkription einer RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb, bei dem die Wahrscheinlichkeit, vollständige cDNAs zu erhalten, im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren dadurch deutlich erhöht wird, daß man der Reaktion Betain und gegebenenfalls Trehalose zusetzt. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Betain bei der Auflösung von Sekundärstrukturen von RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cDNA mittels reverser Transkription von langkettiger RNA einer Länge von mindestens 3 kb, bei dem die Ausbeute an voll­ ständigen cDNAs im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren deutlich erhöht wird.

Genetische Information liegt in der Zelle in der Form ketten­ förmiger Makromoleküle vor, die aus Nukleinsäuren aufgebaut sind. Letztere umfassen jeweils einen Zuckeranteil (Ribose oder Desoxyribose), eine der Basen Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymidin bzw. Uracil, sowie Phosphorsäure. Die Reihenfolge der Basen innerhalb der Nukleinsäure-Ketten bildet die Basis für den genetischen Kode. Aufgrund dieser Bedeutung der Basen werden die einzelnen Nukleinsäuren vereinfacht auch als "Basen" bezeichnet und die Länge der Nukleinsäure-Ketten anhand der Basenzahl ange­ geben. 1000 Basen werden als "1 kb" bezeichnet.

Desoxyribose-enthaltende Nukleinsäureketten (DNA) bilden den permanenten Informationsspeicher im Kern der Zelle, während Ribose-enthaltende Nukleinsäureketten (RNA), wenn sie in der Form von messenger RNA (mRNA) vorliegen, der Übertragung der in der DNA gespeicherten Informationen an den Herstellungsort der jeweils kodierten Proteine (Aminosäure-Sequenzen) in der Zelle dienen. Andere RNAs wie beispielsweise ribosomale RNA dienen nicht als Informationsüberträger, sondern sind am Aufbau von zellulären Strukturen wie beispielsweise Ribosomen beteiligt.

DNA liegt in der Zelle in der Regel als Doppelstrang zweier sich gegenüberliegender komplementärer Einzelstränge vor, wobei die Doppelstrangbildung durch Wasserstoff-Brückenbildung zwischen den Basen Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin erfolgt. Demgegenüber liegt RNA nur einzelsträngig vor.

Die DNA ist auf solche Weise strukturiert, daß die für einzelne Proteine kodierende Information jeweils in Genen angeordnet ist, wobei jeweils drei Basen eine Aminosäure kodieren. Wenn ein Pro­ tein in den Zellen eines bestimmten Gewebes hergestellt (expri­ miert) werden soll, so wird im Kern der Zelle zunächst eine Kopie des entsprechenden Gens in Form einer mRNA hergestellt. Diese mRNA kann den Zellkern verlassen und an den Herstellungs­ ort in der Zelle gelangen. Die Basenfolge der mRNA entspricht der für das Protein kodierenden Basenfolge des jeweiligen Gens, wobei an die Stelle des Thymidins der DNA in der mRNA die Base Uracil tritt. Kennt man also die Basenfolge einer mRNA, so läßt sich daraus unter Zugrundelegung des genetischen Kodes die Struktur, d. h. die Aminosäure-Kette des von der jeweiligen mRNA kodierten Proteins ermitteln.

Aus diesem Grund ist das Studium der in bestimmten Zellen oder einem bestimmten Gewebetyp vorhandenen mRNA zu einem der wich­ tigsten Arbeitsfelder auf dem Gebiet der modernen Molekularbiologie geworden. Daneben ist aber auch die Basenfolge anderer RNAs von Interesse, da eine Untersuchung der von diesen RNAs aufgebauten Zellstrukturen eine Kenntnis dieser Basenfolge voraussetzt. Während für die Analyse von DNA eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung stehen, ist die direkte Analyse von RNA dadurch erschwert, daß RNA instabil ist und nicht leicht durch Einbringen in Vektoren und nachfolgendes Übertragen in beispielsweise Bakterienzellen (klonieren) vermehrt und analysiert werden kann.

Diese Probleme konnten bis zu einem gewissen Grade gelöst wer­ den, nachdem es sich - etwa um das Jahr 1970 - gezeigt hatte, daß einige Viren, die sogenannten Retroviren, über ein Enzym verfügen, das in der Lage ist, ausgehend von einer RNA als Ma­ trize eine DNA herzustellen, welche eine getreue Kopie der RNA ist, mit der Ausnahme, daß an die Stelle des Uracils wiederum ein Thymidin tritt. Eine derartige, durch "enzymatisches Kopie­ ren" einer RNA hergestellte DNA wird als "copy-DNA" oder "cDNA" bezeichnet, während die entsprechenden Enzyme als "reverse Transkriptasen" und die von ihnen durchgeführte Kopierreaktion als "reverse Transkription" bezeichnet werden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich "reverse Transkription" somit auf einen Vorgang, bei dem ausgehend von einer RNA mittels reverser Transkriptase eine cDNA hergestellt wird. Diese cDNA läßt sich auf die gleiche Weise klonieren und analysieren wie natürliche DNA. Insbesondere kann aus der Basen­ folge der cDNA auf die Basenfolge der zugrunde liegenden RNA und damit, im Falle von mRNA, auf die Aminosäurefolge des von der mRNA kodierten Proteins geschlossen werden.

Die reverse Transkription von RNA zur Gewinnung der korrespon­ dierenden cDNA erfolgt in Reaktionsansätzen, die als wesentliche Bestandteile mindestens eine ausreichende Menge an reverser Transkriptase in einem für die Transkription geeigneten Medium, eine Mischung der vier für die Bildung der DNA erforderlichen Desoxyribonukleinsäuren und die als Matrize dienende RNA enthal­ ten. Diese Reaktionsansätze sind in der Regel flüssig. Möglich ist aber auch, daß einzelne Bestandteile des Reaktionsansatzes, beispielsweise die reverse Transkriptase oder die zu kopierende RNA, an eine feste Matrix gebunden sind, die sich in Kontakt mit der flüssigen Mischung der anderen Bestandteile befindet.

Die genaue Zusammensetzung derartiger Reaktionsansätze hängt unter anderem von den verwendeten reversen Transkriptasen ab und ist grundsätzlich dem Fachmann bekannt [Sambrook et al., Mole­ cular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora­ tory Press, (1988)]. Ferner sind Informationen über die genaue Menge der einzusetzenden Komponenten sowie Angaben zur Durchführung der reversen Transkription auch den Hinweisen der Hersteller der reversen Transkriptasen (beispielsweise Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) zu entnehmen.

Häufig wird allerdings bei der reversen Transkription keine vollständige cDNA erhalten, da die Reaktion vorher abbricht. Dies kann darauf beruhen, daß die als Matrize dienende mRNA längere komplementäre Abschnitte enthält, die durch entspre­ chende Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin zur Bildung interner Dop­ pelstränge, d. h. zur Bildung von Schleifen führen. Die auf diese Weise entstehenden Sekundärstrukturen machen es der reversen Transkriptase häufig unmöglich, eine vollständige cDNA herzu­ stellen [Abbotts, J. et al. (1993) "Mechanism of HIV-1 reverse transcriptase. Termination of processive synthesis an a natural DNA template is influenced by the sequence of the template-pri­ mer stem." J Biol Chem 268, 10312-23; Brooks, E. M. et al. (1995) "Secondary structure in the 3' UTR of EGF and the choice of reverse transcriptases affect the detection of message diver­ sity by RT-PCR" Biotechniques 19, 806-12, 814-5; Kuo, K. W. et al. (1997) "Intrinsic secondary structure of human TNFR-I mRNA influences the determination of gene expression by RT-PCR." Mol Cell Biochem 177, 1-6]. Es hat sich gezeigt, daß insbesondere langkettige RNAs, d. h. RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb zur Bildung derartiger Sekundärstrukturen neigen.

Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung vieler moleku­ larbiologischer Untersuchungen und Verfahren ist jedoch die Verfügbarkeit vollständiger cDNA, da nur mittels vollständiger cDNA auch die gesamte Basenfolge der RNA ermittelt werden kann. Dies gilt insbesondere bei der Herstellung sog. cDNA Bibliotheken oder bei Untersuchungen der Randsequenzen von RNA mittels PCR (polymerase chain reaction). In den vergangenen Jahren kon­ zentrierten sich die Bemühungen zur Steigerung der Effizienz bei der cDNA-Herstellung in erster Linie auf die Optimierung der re­ versen Transkriptasen.

Daneben wurde auch versucht, die Effizienz der reversen Trans­ kription durch die Zugabe von Substanzen zu erhöhen, welche die Sekundärstrukturen von RNA lösen. Zu den in diesem Zusammenhang untersuchten Substanzen gehört beispielsweise die Trehalose, eine ursprünglich aus E.coli stammende Substanz, die in diesen Bakterien als Reaktion auf Streß synthetisiert wird. Seine hauptsächliche Funktion ist es, Proteine vor thermaler Denatu­ rierung zu schützen, indem die Bewegungen innerhalb des Rück­ grats der Proteine minimiert werden [Butler, S. L., und Falke, J. J. (1996) "Effects of protein stabilizing agents on thermal backbone motions: a disulfide trapping study." Biochemistry 35, 10595-600; Singer, M. A., und Lindquist, S. (1998) "Multiple effects of trehalose on protein folding in vitro and in vivo." Mol Cell 1, 639-48]. Die gleiche Wirkung übt das Molekül auch auf RNA aus. Es ist daher bereits bei der reversen Transkription verwendet worden [Carninci, P. et al. (1998) "Thermostabiliza­ tion and thermoactivation of thermolabile enzymes by trehalose and its application for the synthesis of full length cDNA." Proc Natl Acad Sci USA 95, 520-4].

Ferner ist versucht worden, Betain (Trimethylglycin; Boncompa­ gni, E. et al. (1999) "Occurrence of choline and glycine betaine uptake and metabolism in the family rhizobiaceae and their roles in osmoprotection." Appl Environ Microbiol 65, 2072-7) zur Stei­ gerung der cDNA-Ausbeute einzusetzen. Bei den bislang durchge­ führten Untersuchungen zeigte Betain jedoch keinen Effekt (Vale­ ntin et al., (2000) European Journal Biochemistry, 267, 5438).

Die Verwendung von Trehalose, wie auch von anderen Substanzen, führt zwar zur einer Steigerung der Ausbeute bei der Herstellung von langkettiger cDNAs. Allerdings wird mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren noch immer keine befriedigende Stei­ gerung der Ausbeute erzielt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mittels dessen die Ausbeute an vollständigen cDNAs bei reverser Transkription von langkettigen RNAs gegenüber dem Stand der Technik erhöht wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch das Verfahren nach An­ spruch 1 gelöst.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von cDNA mittels reverser Transkription von RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb in einem Reverse Transkriptase enthaltenden Reaktionsansatz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Reaktionsansatz Betain hinzufügt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich überraschender­ weise gezeigt, daß durch Zugabe von Betain in den Reaktionsan­ satz bei der reversen Transkription von RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb eine höhere Ausbeute an vollständiger cDNA er­ zielt wird. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von Va­ lentin et al. (s. o.), die keinen Effekt von Betain auf die Ef­ fizienz der reversen Transkription feststellen konnten (siehe Valentin et al., S. 5442, rechte Spalte, dritter Absatz). Al­ lerdings untersuchten die Autoren dort lediglich die reverse Transkription einer kurzen (ca. 700 Basen langen) mRNA. Dem­ gegenüber betrifft die vorliegende Erfindung den Einsatz von Be­ tain bei langkettigen, d. h. mindestens 3 kb langen RNAs.

Überraschenderweise sind die Effekte von Betain umso größer, je länger die als Matrize dienende RNA ist. Dies macht das erfin­ dungsgemäße Verfahren besonders wertvoll, da das Problem der nicht vollständigen cDNAs in erster Linie bei langkettigen RNAs auftritt (siehe oben).

Erfindungsgemäß weist die eingesetzte RNA eine Länge von min­ destens 3 kb auf. Dabei kann erfindungsgemäß die RNA entweder in einer Mischung mit anderen, kleineren und/oder größeren RNAs vorliegen, als auch bereits in gereinigter Form vorliegen (zur Reinigung von RNAs s. Sambrook et al., 1988 (s. o.))

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die eingesetzte RNA eine Länge von mindestens 4 kb, gemäß einer besonders bevor­ zugten Ausführungsform von mindestens 7,5 kb auf.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zu kopierende RNA eine mRNA, wobei erfindungsgemäß eingeschlossen ist, daß die zu kopierende mRNA entweder in einem Gemisch mit anderen RNAs vorliegt, oder daß sie von den anderen RNAs bereits gemäß dem Fachmann bekannten Reinigungsschritten [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)] abgetrennt worden ist.

Die Konzentration an Betain im Reaktionsansatz kann beispiels­ weise von 0,1 bis 3 M betragen, bevorzugt von 0,5 bis 2,5, be­ sonders bevorzugt von 1 bis 2 M, und liegt ganz besonders bevor­ zugt bei etwa 2 M, wobei diese Angaben, wie auch alle folgenden Konzentrationsangaben, auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansat­ zes bezogen sind, wenn nichts anderes angegeben ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jeder reversen Trans­ kriptase durchgeführt werden. Insbesondere ist das erfindungs­ gemäße Verfahren geeignet, mit AMV- und M-MuLV-(Moloney Murine Leukemia Virus)reversen Transkriptasen durchgeführt zu werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens fügt man dem Reaktionsansatz zusätzlich Trehalose zu.

Die Zugabe von Trehalose hat den überraschenden Effekt, daß die Effizienz der cDNA-Herstellung deutlich über das Maß hinaus gesteigert wird, das mit Betain oder Trehalose allein erzielt wird. Dabei kommt es zu einem nicht vorhersehbaren synergistis­ chan Effekt von Betain und Trehalose (s. Beispiel 2).

Trehalose kann beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 1,5 M dem Reaktionsansatz hinzugefügt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration an Trehalose im Reak­ tionsansatz von 0,3 bis 1 M, und ganz bevorzugt etwa 0,6 M.

Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschend gezeigt, daß Betain die Sekundärstruktur von RNAs mit der Länge von minde­ stens 3 kb lösen kann. Die Erfindung betrifft daher ebenfalls die Verwendung von Betain bei der Auflösung von Sekundärstruktu­ ren von RNA, wobei die Länge der RNA mindestens 3 kb, bevorzugt mindestens 4 kb, und ganz besonders bevorzugt mindestens 7,5 kb beträgt.

Die Erfindung wird im folgenden durch Figuren und Beispiele erläutert.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1

• A) [α³²P] dCTP markierte cDNA aus verschiedenen reversen Trans­ kriptionsreaktionen, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt wurden, aufgetrennt mittels Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel und mittels Phosphorimager analysiert.
  Bahn a: Kontrolle (kein Betain, keine Trehalose)
  Bahn b: 2 M Betain
  Bahn c: 0,6 M Trehalose
  Bahn d: 2 M Betain und 0,6 M Trehalose
  Die Molekulargewichtsangaben entsprechen den Markerbanden (1 kb Leiter), die weißen Pfeile geben Regionen an, in denen die cDNA-Synthese abgebrochen wurde, wobei dieses Problem bei den verschiedenen experimentellen Bedinungen gelöst erscheint.
• B) Densitometrische Darstellung des Autoradiographs von Tafel A.
  Die Wanderungsstrecke wurde gegen den RFU-Wert (Relative Fluorescence Unit) aus der Phosphorimager-Analyse aufgetra­ gen.
  Zeichnung 1: Kontrolle (kein Betain, keine Trehalose)
  Zeichnung 2: 2 M Betain
  Zeichnung 3: 0,6 M Trehalose
  Zeichnung 4: 2 M Betain und 0,6 M Trehalose
  Vertikale durchgezogene und gepunktete Linien stellen je­ weils 3 kb und 7,5 kb Molekulargewicht dar.
• C) [α³²P] dCTP markierte cDNA aus reversen Transkriptionen, die mit steigenden Betain-Konzentrationen durchgeführt wurden. Die cDNAs wurden mittels denaturierender Agarosegel-Elek­ trophorese aufgetrennt und einem Phosphoimagerschirm expo­ niert.

Fig. 2

Schematische Darstellung der PCR, die zur Evolution der Effi­ zienz der Erststrang-Synthese durchgeführt wurde, wobei die Erststrang-Synthese mit spezifischen Primern für verschiedene Regionen der Maus-Chlathrin-mRNA durchgeführt wurde.

Die Diagramme stellen die Anzahl an PCR-Zyklen dar, die durch­ geführt werden mußten, bis der Kreuzungspunkt (s. u.) erreicht wurde.
C: Kontrolle
B: 2 M Betain
T: 0,6 M Trehalose
B + T: 2 M Betain und 0,6 M Trehalose

Fig. 3

Sekundärstruktur des bovinen Oxytocin Rezeptor-mRNA-Fragments, berechnet durch den Zucker-RNA-Faltungslogarithmus und darge­ stellt durch RNA-draw-V 1.1.

Fig. 4

Schmelzkurven von

• a) komplexer mRNA aus Maus-Muskelgewebe
• b) 297 Basen-Fragment des bovinen Oxytocin-Rezeptors

Durchgezogene Linie: Kontrolle.
Gepunktete Linie: 2 M Betain

Beispiele Beispiel 1 Reverse Transkription

5 µg Gesamt-RNA wurden nach einem Priming mit 500 ng Oligo-dT₂₅ in einem Gesamtvolumen von 30 µl einer reversen Transkription unterworfen, wobei 10x Erststrangpuffer (500 mM Tris-HCl, 750 mM KCL, 15 mM MgCl₂, ph 8,3 bei 20°C), 10 mM DTT, 500 µM dNTPs, 200 U MMLV-reverse Transkriptase (Gibco BRL, ML) verwendet wurden. Die reverse Transkription wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers bei 42°C durchgeführt.

Für eine effizientere Erststrang-Synthese wurden entweder 1-3 M Betain (hergestellt aus einer 5 M Stocklösung), 0,6 M Trehalose (hergestellt aus einer 2 M Stocklösung) oder eine Kombination dieser zwei Verbindungen hinzugefügt. Die folgenden Temperatur­ profile wurden verwendet:
Zugabe von Betain: 90 Minuten bei 42°C
Zugabe von 0,6 M Trehalose: 30 Minuten bei 42°C, dann eine Stun­ de bei 60°C
Zugabe von 2 M Betain und 0,6 M Trehalose: 30 Minuten bei 42°C, dann eine Stunde bei 60°C

Ein 5 µl Aliquot wurde in Gegenwart von 0,2 µl (α³²-P)dCTP (100 µCi pro µl, Amersham) revers transkribiert. Alle Experimente wurden im Triplikat durchgeführt.

Beispiel 2 Denaturierende Gel-Elektrophorese

Die markierten Proben aus der reversen Transkription wurden über Nacht in einem 1%-Agarosegel in 30 mM NAOH, 1 mM EDTA bei 1 Volt/cm einer Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde auf einer Nylonmembran (Nytran, Schleicher und Schuell) getrocknet, um Verluste während des Trockungsprozesses zu vermeiden. Das Membran/Gel-Sandwich wurde einem Phosphorimager-Schirm 16 Stun­ den lang exponiert. Das Ergebnis wurde mit Hilfe eines Storm™- Phosphoimager (Molecular Dynamics), bei einer Auflösung von 50 µm bildlich dargestellt, und die Gesamtmenge an Signalen genauso wie die Verteilung der Signale wurde mit Hilfe der ImageQuant™- Software analysiert.

Fig. 1A zeigt die Autoradiographe als Resultate der Experimen­ te, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt wurden. Zwei wesentliche Effekte können beobachtet werden. Der auffäl­ ligste ist der Anstieg der Durchschnittsgröße der synthetisier­ ten cDNA in Gegenwart von Betain alleine (Bahn 2) und Trehalose alleine (Bahn 3). Der zweite Effekt ist die Eliminierung ver­ schiedener starker Banden, die in der Kontrollbahn und in der Bahn mit Trehalose alleine auftreten, gezeigt durch weiße Pfeile. Diese Banden erscheinen als das Produkt von Brüchen der cDNA-Synthese, wahrscheinlich aufgrund von Sekundärstrukturen, die in einigen hochexprimierten mRNAs vorhanden sind. In den Bahnen mit cDNA, die in Gegenwart von Betain hergestellt wurde (Bahn 2 und 49 nehmen diese Banden wesentlich ab. Generell kann gesagt werden, daß diese Bahnen allgemein homogener erscheinen.

Fig. 1B zeigt die Quantifizierung der Signalverteilung in ver­ schiedenen Größefenstern der synthetisierten cDNA. Genauergesagt enthält Fig. 1B densitometrische Plots, die die Verteilung der eingebauten "Signale", die als RFU (Relative Fluorescence Units; relative Fluoreszenzeinheiten), die mittels Phosphorimager er­ mittelt wurden, zeigen. Ebenfalls dargestellt sind zwei Linien, die unterschiedliche Molekulargrößen der cDNA zeigen (durchgezo­ gene Linie 3 kb; gepunktete Linie 7,5 kb). Die Fläche unter der Kurve wurde quantifiziert und das Verhältnis zwischen den jewei­ ligen RFU zu der Kontrolle wurde berechnet und ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Densitometrische Analyse der eingebauten radioaktiven Markierung in verschiedenen Größefenstern der cDNA

Fig. 1C zeigt, daß die optimale Betainkonzentration 2 M be­ trägt.

Verschiedene Schlußfolgerungen können aus diesen Daten gezogen werden: Der Einschluß von Betain unter Trehalose in der reversen Transkriptionsmischung führt zu einer Erhöhung der Synthese von cDNA mit einem höheren Molekulargewicht. Im unteren Bereich unter 3 kb übertrifft Trehalose Betain. Im mittleren Bereich zwischen 3 kb und 7,5 kb zeigen sowohl Betain wie Trehalose einen Effekt, wobei Trehalose effizienter erscheint. Erstaunli­ cherweise sind im Bereich überhalb von 7,5 kb Betain und Treha­ lose gleich effizient. Eine Kombination beider Verbindungen führte zu einem fünffach höheren Einbau einer radioaktiven Mar­ kierung. Daher erscheint ein kooperativer Effekt dieser beiden Verbindungen wahrscheinlich, was zu einer wesentlichen Erhöhung von Produkten mit langen Ketten führt.

Beispiel 3 Echtzeit-quantitative PCR

Ziel dieser Experimente war es, zu untersuchen, ob durch eine Zugabe von Betain und Trehalose und einer Kombination der beiden Verbindungen zu Reverse-Transkriptions-Reaktionsansatz tatsäch­ lich größeren Mengen an längeren cDNA hergestellt werden können. Dazu wurden im Rahmen einer quantitativen PCR verschiedene Pri­ mer-Paare (siehe Tabelle 2) ausgewählt, die jeweils Fragmente ergeben, die an Positionen in der jeweiligen cDNA unterschied­ lich weit entfernt von der Oligo-dT-Primingstelle befinden.

Tabelle 2

Bei diesen Experimenten wurde der Kreuzungspunkt (Anzahl der Zyklen, die zu einer Fluoreszenz oberhalb von 0,2 willkürlichen Einheiten führen) der quantitativen Echtzeit-PCR als geeigneter Marker verwendet, um die Anzahl der im Rahmen der reversen Tran­ skription entstandenen cDNA-Produkte zu untersuchen.

Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt:
2 µl der im Triplikat durchgeführten reversen Transkriptions­ reaktionen wurden 20fach verdünnt und 2 µl wurden als Matritze der Echtzeit-qualitativen PCR verwendet. Die PCR wurde im einem LightCycler™-Instrument (Roche, Basel) unter Zuhilfenahme des FastStart Kits (Roche Diagnostics) durchgeführt. Es wurden die in Tabelle 2 gezeigten Primerpaare verwendet. Die Abstände der Clathrin-Primer von der Oligo-dT-Primingstelle waren 2435 Basen­ paare (Clathrin 1), 4006 Basenpaare (Clathrin 2) und 12053 Ba­ senpaare (Clathrin 3).

Das Auftreten der resultierenden PCR Produkte wurde durch Elek­ trophorese auf einem 1,3%igen Agarose-Gel in TBE-Puffern bestä­ tigt. Die Kreuzungspunkte der Echtzeit-Fluoreszenzkurve wurden mit Hilfe der begleitenden Datenanalyse-Software berechnet.

Fig. 2 ist zu entnehmen, daß cDNA mit einer Länge von 3 oder 4,5 kb, ausgehend von der Oligo-dT-Primingstelle, in der glei­ chen Menge synthetisiert wurde. Bei einem Abstand von 12,5 kb besteht allerdings ein deutlicher Anstieg in der Menge der cDNA- Syntheseprodukte, falls Betain oder Trehalose zum Reaktionsan­ satz hinzugegeben wurde. Ferner ergibt sich ein beträchtlicher additiver Effekt, wenn beide Verbindungen zusammen verwendet wurden. Die Durchschnittsanzahl an Zyklen bis zum Kreuzungspunkt sind 31,5 +/- 0,7 für die Kontrolle und 27,7 +/- 3,8 für Betain und Trehalose in Kombination. Wenn man eine PCR-Effizienz von 1,74 annimmt (berechnet aus dem Anstieg in der linearen Amplifi­ kationsphase), bedeutet dies, daß durch eine Kombination von Betain und Trehalose etwa 8,5 mal mehr langkettige Transkrip­ tionsprodukte entstehen. Dasselbe ergab sich in ähnlichen Expe­ rimenten, wenn als Ausgangspunkt der reversen Transkription nicht Clathrin, sondern β-Actin verwendet wurde (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 4 Auswirkungen von Betain auf die Sekundärstruktur von mRNA

Bei mRNA ist das Auftreten von Sekundärstrukturen eine hochorga­ nisierte Eigenschaft der mRNA, die durch die Umgebungsbedingun­ gen (z. B. Ionenstärke) und durch die Sequenz der mRNA beeinflußt wird. Der Übergang zwischen dem geordneten und dem ungeordneten Stadium geht einher mit einer Unterbrechung der Basenpaarbindung innerhalb der RNA. Dies führt zu einer Hyperchromizitätseffekt als Konsequenz der Separierung überlappender P-Elektronensysteme der heterozyklischen Basen (Michelson, A. M. (1963). The Chemi­ stry of Nucleosides and Nucleotides (N. Y.: Academic Press), pp. 444), und kann leicht durch eine Überwachung der UV-Absorptions­ änderungen bei steigenden Temperaturen überwacht werden.

Um den möglichen auflösenden Effekt von Betain auf die Sekundär­ struktur von mRNA zu untersuchen, führten wir Schmelzkurvenun­ tersuchungen in Gegenwart von 2 M Betain durch. Wir verwendeten mRNA von Maus-Muskelgewebe und ein in vito transkribiertes 297 Basen cRNA-Fragment des bovinen Oxytoxinrezeptortranskripts als Beispiel für einen komplexen mRNA-Pool und für eine einzelne mRNA-Spezies. Letzere wurde aufgrund ihres hohen GC-Gehaltes (74%) und der hochstabilen und komplexen vorhergesagten Sekun­ därstruktur mit einer freien Energie von -349,32 kJ ausgewählt. Ferner zeigt das bovine Oxytoxinrezeptortranskript verschiedene Regionen mit einer Self-Komplementarität von 88 Nukleotiden (von denen 55 GC-Paare sind).

Genauergesagt wurden die RNA-Schmelzexperimente wie folgt durch­ geführt:
Die RNA-Schmelzkurvenexperimente wurden in einem geschlossenen, Peltier-aufgeheizten Cuvettensystem (Gilford, 2600 Photometer) durchgeführt, wobei 12 µg Maus-Muskel-mRNA, die dreimal mit Oligotex™-Latexkügelchen (Quiagen, Deutschland) gereinigt worden war, oder 12 µg des 297 Basen-cRNA-Fragments des bovinen Oxyto­ xinrezeptortranskripts verwendet wurden, das durch in vitro- Transkription synthetisiert worden war und über eine Säule ge­ reinigt worden war. Die Schmelzkurvenexperimente wurden in 0,5 N NaCl/1×PBS oder 0,5 M NaCl/1×PBS/2M-Betain durchgeführt. Eine Schmelzkurve mit 0,5 M NaCl/1×PBS/2M-Betain ohne RNA wurde als Kontrolle verwendet und von den RNA-enthaltenden Proben abgezo­ gen.

Die Cuvette wurde bei 1°C pro Minute aufgeheizt, wobei Daten­ punkte jeweils bei 0,5°C gesammelt wurden. Der T_m der Schmelzkur­ ven wurde durch ein nicht-lineares Anpassen der Datenpunkte berechnet (sigmoidale Boltzmann Annäherung). Um sicher zu sein, daß die resultierende Hyperchromizität nicht aufgrund von RNA- Degradation entstand, wurden die Proben nach dem Experiment 6 Stunden lang auf Raumtemperatur abgekühlt und dann erneut gemes­ sen. Die optische Dichte der Proben nach dem Abkühlen war innerhalb von der 3%igen Varianz der ursprünglichen Absorptions­ werte. Alle Schmelzkurvenexperimente wurde im Triplikat durch­ geführt.

Fig. 4 zeigt die zwei Schmelzkurven, die aus den Experimenten resultieren, die entweder in Abwesenheit (durchgezogene Linie) oder in Gegenwart von Betain (gepunktete Linie) durchgeführt wurden. Als Resultat ergibt sich, daß Betain tatsächlich in der Lage ist, Sekundärstrukturen von RNA aufzulösen. Im Fallen des komplexen mRNA-Pools (Fig. 4a) ist ein Anstieg der Hyperchromi­ zität bei praktisch allen Temperaturen im Vergleich zur Kontrol­ le ersichtlich. Der berechnete T_m ist 72,58°C +/- 0,083°C für die Kontrolle und 67,07°C +/- 0,72°C für 2 M Betain. Damit steigt die Gesamt-Hyperchromizität von 16,6% +/- 0,8% auf 18,6% +/- 0,6% bei 96°C. Im Fall des Oxytoxinrezeptor-cRNA-Fragments ( Fig. 4b) kommt man zu denselben Resultaten. Ein Anstieg der Hy­ perchromizität ist ersichtlich, der berechnete T_m ist 86,57°C +/- 2,3°C und 78,93°C +/- 2,8°C für jeweils Kontrolle und 2 M Be­ tain. Die Gesamthyperchromizität steigt von 20,9% +/- 1,2% auf 25,6% +/- 2,1%.

Beide Kurven (sowohl die für die komplexe mRNA als auch die für die einzelne cRNA) geben ein Bild mit vielen Phasen. Jeder Über­ gang innerhalb der Kurven kann dahingehend interpretiert werden, daß bei dieser Temperatur unter den gegebenen Bedingungen ein Teil des Moleküls aufschmilzt. Da RNA-Strukturen aus verschiede­ nen Regionen bestehen, die Duplexes, Wölbungen, Loops oder Ein­ zelstrangregionen aufweisen, führt das Schmelzen dieser Regionen zu Übergängen, die als unabhängige Spitzen auftreten, wenn die erste Ableitung der Extension gegenüber der Temperatur aufgetra­ gen wird. Im Falle des Oxytoxinrezeptor-mRNA-Fragments können die vorhergesagten Basen zu der multiphasischen Kurve beitragen. Im Falle der komplexen mRNA mit einem wesentlich reduzierten Übergangsbild scheint es zu sein, daß einige gemeinsame Eigen­ schaften, die alle mRNAs auszeichnen (d. h. Poly(A)-Schwänze) für das Übergangsbild verantwortlich sind oder daß die Übergänge ein Resultat verschiedener Sekundärstrukturen sind, die für einige wenige hochexprimierte mRNAs im Muskelgewebe typisch sind (d. h. GAPDH, β-Actin).

Beispiel 5 Berechnung von RNA-Sekundärstrukturen

Die Sekundärstruktur des in vitro transkribierten RNA-Fragments des bovinen Oxytoxinrezeptors wurde durch den Zuckeralgorithmus (Jaeger et al., (1980) Improved predictions of secondary struc­ tures for RNA. Proc Natl Acad Sci USA 86, 7706-10) berechnet, und mit Hilfe der RNAdraw V1.1-Software dargestellt (Matzura, O., und Wennborg, A. (1996). RNAdraw: an integrated program for RNA secondary structure calculation and analysis under 32-bit Microsoft Windows. Comput Appl Biosci 12, 247-9). Eine Tempera­ tur von 42°C diente als Berechnungsbasis, da dies die optimale Temperatur für die reverse Transkription mit MMLV (Murine Molo­ ney Leukemia Virus) reverse Transkriptase ist.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (12)

1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von cDNA mittels re­ verser Transkription von RNA mit einer Länge von mindestens 3 kb in einem Reverse Transkriptase enthaltenden Reaktions­ ansatz, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reaktionsansatz Betain hinzufügt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Betain im Reaktionsansatz von 0,1 M bis 3 M beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Betain etwa 2 M beträgt.

4. Verfahren nach den Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß die RNA eine Länge von mindestens 4 kb aufweist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die RNA eine Länge von mindestens 7,5 kb aufweist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die RNA eine Messenger-RNA (mRNA) ist.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeich­ net, daß man dem Reaktionsansatz zusätzlich Trehalose hinzu­ fügt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Trehalose von 0,1 M bis 1,5 M beträgt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeich­ net, daß die Konzentration an Trehalose etwa 0,6 M beträgt.

10. Verwendung von Betain bei der Auflösung von Sekundärstruktu­ ren von RNA, wobei die Länge der RNA mindestens 3 kb be­ trägt.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die RNA eine Länge von mindestens 4 kb aufweist.

12. Verwendung nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die RNA eine Länge von mindestens 7,5 kb auf­ weist.