DE10064353A1

DE10064353A1 - Oligonukleotidchip

Info

Publication number: DE10064353A1
Application number: DE10064353A
Authority: DE
Inventors: Horst Donner; Bernd Drescher; Andrea Huber; Jaqueline Weber
Original assignee: MWG Biotech AG
Current assignee: MWG Biotech AG
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2002-06-27

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Oligonukleotidchip, der mit Oligonukleotiden mit bestimmten Sequenzen ausgestattet ist, die nach einem bestimmten Auswahl verfahren ausgewählt wurden, und das Auswahlverfahren für Oligonukleotidsequen zen zur Entwicklung von Oligonukleotidchips.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Hefechip, der ein Oligonukleo tidchip ist. Dieser ist mit Oligonukleotiden ausgestattet, die bestimmte Sequenzen aufweisen, die als Sonden für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Ge nen und/oder deren Expression in Hefeorganismen dienen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Auswahlverfahren, mit dem Oligonukleo tidsequenzen gewählt werden, die als spezifische Sonden zum Nachweis über das Vorhandensein bestimmter Gene und/oder deren Expression geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Sogenannte Oligonukleotidchips, auch DNA-Chips genannt, sind bereits bekannt (wir zitieren Affymetrix). Diese bestehen aus einem festen Trägermaterial, auf dem aus gewählte Oligonukleotidsequenzen in diskreten Positionen in einer bestimmten An ordnung aufgebracht sind. Die Oligonukleotidsequenzen sind dabei so auf der Ober fläche angebracht, dass sie mit DNA-, RNA- oder cDNA-Material (Probenmaterial) hybridisieren können, wenn die jeweilige Kombination von Oligonukleotid und Pro benmaterial komplementäre Basenabschnitte aufweist. Die dabei entstehenden Hyb ride können u. a. durch den Einbau von geeigneten Markierungen in das Probenmate rial nachgewiesen werden. Solche Markierungen sind bereits bekannt.

Möchte man die Expression von Genen bestimmen, dann muss man herausfinden, wie oft ein bestimmter DNA-Abschnitt des untersuchten Organismus in RNA transkri biert wird. Dazu kann man mittels einer reversen Transkribierung cDNA aus der im biologischen Probenmaterial vorliegenden RNA generieren. Unter Verwendung von markierten dNTP-Basen erhält man dabei cDNA, die Markierungen aufweist. Diese Markierungen gestatten einen qualitativen und quantitativen Nachweis der cDNA. Die nachgewiesene Menge an cDNA lässt einen direkten Rückschluss auf die Menge an exprimiertem Gen zu. Genexpressionen mehrerer Gene eines Organismus, die unter bestimmten Bedingungen vorliegen, bezeichnet man als Genexpressionsmuster. Die Expression eines Gens hängt von einer Vielzahl von Bedingungen ab. Es ist von her ausragendem Interesse, herauszufinden, wann ein Gen exprimiert wird, und vor al lem, in welchem Ausmass es exprimiert wird, da eine Vielzahl biologischer Prozesse mit diesen Expressionen in Verbindung steht. Die Bestimmung mehrerer Genexpres sionsmuster erlaubt Rückschlüsse darüber, wie sich ein Organismus auf molekular biologischer Ebene verhält, wenn er bestimmten Bedingungen ausgesetzt ist.

Da biologische Systeme sehr komplex sind, ist die Anzahl der Variablen, mit denen man das System beeinflussen kann, sehr hoch. Ziel der Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Genexpressi onsmuster eines Organismus auf einfache Art und Weise bestimmt werden können.

In einer Genomsequenz bedeuten bestimmte Basenkombinationen den Anfang und das Ende eines Genabschnittes oder -fragmentes. Diese werden als Start- und als Stop-Codons bezeichnet. Umfasst der Bereich zwischen einem Start- und einem Stop-Codon eine hohe Anzahl von Basen, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass eine Basenabfolge, beziehungsweise eine Basensequenz in diesem Abschnitt vor liegt, welche in Protein umgeschrieben, also exprimiert wird. Solche Abschnitte be zeichnet man als "Open Reaging Frames" oder einfach ORF, weil man davon aus geht, dass diese Abschnitte mit einer spezifisch ausgebildeten Sonde nachgewiesen werden können.

Beschreibung der Erfindung

Bei dem Hefechip handelt es sich um einen Oligonukleotidchip, bei dem sich in dis kreten Positionen in einer bestimmten Anordnung auf einem festen Trägermaterial Oligonukleotide befinden, wobei sich an jeder diskreten Position ein bestimmtes Oli gonukleotid befindet, wobei jedes Oligonukleotid als Sonde für ein Gen oder dessen Expression ausgebildet ist, wobei das Gen ein Gen aus einem Hefeorganismus ist.

Bei einer Sonde handelt es sich um jeweils identische Oligonukleotide, die an einer diskreten Position auf einem Oligonukleotidchip aufgebracht sind. Die Sonden kön nen mit komplementären Basen von DNA, RNA oder cDNA hybridisieren, wobei die cDNA durch reverse Transkribierung von RNA, in diesem Fall aus Hefeorganismen, gewonnen werden kann. Bei der reversen Transkribierung werden cy-3 und cy-5 markierte dNTP-Basen verwendet. Die cDNA enthält somit fluoreszierende Marker. Sind die Basen der jeweiligen Sonde zu den Basen des jeweiligen Gens, Genfrag mentes oder der daraus erhaltenen cDNA weitgehend oder vollständig komplemen tär, so bilden sie ein stabiles Hybrid. Die entstandenen Hybride werden durch Mes sung der Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenzmessgerätes qualitativ und quantitativ nachgewiesen.

Zur Validierung unterschiedlicher Sonden n für ein bestimmtes Gen werden mehrere Verhältnisse von jeweils zwei Fluoreszenzwerten zweier Hybride verglichen. Im Detail erfolgt die Validierung einer bestimmten Sonde dadurch, das zwei unterschiedliche Genexpressionen A und B des gleichen Gens experimentell induziert werden, und dementsprechend mit einer bestimmten Häufigkeit cDNA aus RNA synthetisiert wird. Die Häufigkeit der cDNA ist damit proportional zur jeweiligen Expression. Bei der Synthese der cDNA werden Marker, z. B. cy-3 und cy-5 eingebaut. Für unterschiedli che Zell- bzw. RNA-Populationen werden jeweils unterschiedliche Marker verwendet.

Die zwei unterschiedlich markierten cDNA-Populationen werden gleichzeitig auf ei nen Oligonukleotidchip aufgetragen und einer entsprechenden Hybridisierungsreakti on unterworfen.

In einem Sondenpunkt sollten hierbei nur cDNA-Moleküle mit den Sonden hybridisie ren, wenn diese komplementär zueinander sind. Ist eine Sonde spezifisch für ein be stimmtes cDNA-Molekül, so hybridisiert im wesentlichen nur dieses cDNA-Molekül mit der Sonde in diesem Sondenpunkt. Da die cDNA-Moleküle mit Fluoreszenzmar kern versehen sind, ist die Helligkeit an einem Sondenpunkt mit einer für das jeweili ge cDNA-Molekül spezifischen Sonde proportional zu dessen Häufigkeit in der jewei ligen cDNA gesamt Population. Bildet man das Verhältnis zweier Helligkeitswerte zweier unterschiedlicher cDNA-Populationen am gleichen Sondenpunkt, so sollte dieses Verhältnis dem Verhältnis der Genexpressionen, das heisst den Häufigkeiten der exprimierten RNA-Moleküle entsprechen.

Führt man einen solchen Versuch zur Darstellung des oben beschriebenen Verhält nisses mehrfach durch und ergeben sich unterschiedliche Werte für das Verhältnis der gleichen beiden cDNA-Populationen, so bedeutet dies, dass die jeweilige Sonde nicht geeignet ist. Ist die Sonde hingegen für ein cDNA-Molekül spezifisch, so kann es im wesentlichen nur mit diesem cDNA-Molekül reagieren, wodurch bei der Wie derholung eines solchen Fluoreszenzexperimentes für das Verhältnis zweier be stimmter Expressionen etwa immer die gleichen Verhältnisse in den Helligkeitswerten ermittelt werden.

Vorzugsweise werden Sonden nicht nur anhand eines Verhältnisses, sondern an hand mehrerer unterschiedlicher Verhältnisse validiert. Hierzu sind mindestens drei verschiedene Expressionen A, B, C notwendig, aus welchen z. B. die Verhältnisse A/B, A/C und B/C gebildet werden können. Dabei sind die cDNA-Moleküle aus unter schiedlichen Expressionen in einem Experiment jeweils unterschiedlich markiert, so dass die Hybridisierungsreaktionen der unterschiedlichen Expressionen nacheinan der auf einem Chip gleicher Herstellungsart ausgeführt werden können.

Fig. 1 zeigt einige solcher Messergebnisse für drei Versuche. In Versuch 1 wurde das Verhältnis der Expression eines Gens X aus Hefezellen, die in einem nährstoff reichen Medium aufgewachsen sind gegenüber der entsprechenden Expression in einem nährstoffarmen Medium gemessen. In Versuch 2 wurde das Verhältnis der Expression desselben Gens X aus Hefezellen vor und nach einer Hitzeschockbe handlung gemessen. In Versuch 3 wurde die Expression desselben Gens X aus He fezellen, die mit unterschiedlichen Zuckern ernährt wurden, ermittelt.

In Fig. 1 sind die entsprechenden gemessenen Verhältnisse der Helligkeiten der drei Versuche durch Kreuze (Sonde 1), Dreiecke (Sonde 2), Quadrate (Sonde 3) und Kreise (Sonde 4) für jeweils vier unterschiedliche Messungen pro Versuch dargestellt. Die Ergebnisse der Sonde 4 variieren stark, weshalb diese Sonde als nicht spezifisch für den Nachweis der Expression des Gens X beurteilt werden kann. Die Ergebnisse der übrigen drei Sonden sind innerhalb eines Versuches relativ konstant, weshalb sie grundsätzlich als spezifische Sonden beurteilt werden könnten. Die Werte der Sonde 3 sind deutlich niedriger als die Werte der Sonden 1 und 2, weshalb die Sonden 1 und 2 als für die Detektion der Expression des Gens X am geeignetsten beurteilt werden.

Damit sind die Sonden 1 und 2 als spezifisch und geeignet für die Detektion der Ex pression des Gens X validiert.

Ausführungsbeispiel eines Oligonukleotidchips

Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist ein Oligonukleotidchip für die Analyse der Genexpression des Genoms von Saccharomyces Cerevisiae. Die Sequenz dieses Genoms ist seit längerem bekannt. Sie ist beim National Centre of Biological Infor mation (U.S.A.) hinterlegt.

In dem Genom von Saccharomyces Cerevisiae werden über 6300 Open Reading Frames (ORFs) identifiziert. Die ORFs entsprechen Abschnitten des Genoms von Saccharomyces Cerevisiae, die exprimiert werden können. Dementsprechend wer den für die ORFs nach dem oben bezeichneten Verfahren Sonden validiert. Die im vorliegenden Beispiel validierten Sonden haben eine Länge von 40 Basen.

Für die Herstellung eines Oligonukleotidchips gemäss dem Ausführungsbeispiel wer den Sonden ex situ synthetisiert. Eine Sonde gemäss dem Ausführungsbeispiel weist 40 Basen auf, die die Sondensequenz einer Sonde darstellen. Diese ist der für ein ORF spezifische Teil einer Sonde. Jede Sonde weist ausserdem am 5'-Ende einen Spacer auf, der dazu dient, einen Abstand zwischen Sondensequenz und Träger oberfläche herzustellen. Der Spacer im Ausführungsbeispiel besteht aus sechs anei nandergereihten dCTP-Basen, es handelt sich um einen sogenannten C₆-Spacer. Zwische Spacer und Trägeroberfläche weist die Sonde ausserdem einen Linker auf, der eine kovalente Bindung der Sondenmoleküle an die Trägeroberfläche ermöglicht. Zu diesem Zweck weist die Trägeroberfläche des Ausführungsbeispieles Alde hydgruppen auf, die mit einer Aminogruppe am Linker reagieren können. Auf diese Weise werden im Ausführungsbeispiel die Sonden kovalent an die Trägeroberfläche gebunden.

Die Sondenmoleküle werden mit einer entsprechenden Vorrichtung (z. B. einem Af fymetryx 417 Arrayer) auf die Oberfläche eines festen Trägers aufgebracht. Die auf gebrachten Sondenmoleküle definieren Sondenpunkte. Die Sondenpunkte sind in einem regelmässigen Raster in Reihen und Spalten angeordnet. An jedem Sonden punkt sind eine Vielzahl identischer Sondenmoleküle vorgesehen. Jeder Sonden punkt weist eine bestimmte Sonde auf, die sich von den anderen Sonden unterschei det.

Ca. 5600 Sonden, die für ca. 5600 der identifizierten ORFs von Saccharomyces Ce revisiae codieren, werden mit Hilfe eines Affymetryx 417 Arrayer auf Glasplatten in dem Raster in Reihen und Spalten aufgebracht. Auf dem fertigen Oligonukleotidchip sind die Sondenmoleküle kovalent an die Trägeroberfläche gebunden.

Saccharomyces Cerevisiae wird in einem nährstoffarmen Medium A und einem nähr stoffreichen Medium B kultiviert. Die Genexpression von Saccharomyces Cerevisiae in Medium A wird mit der Genexpression von Saccharomyces Cerevisiae in Medium B nach dem oben beschriebenen Verfahren verglichen. Dazu wird ausgehend von der jeweils exprimierten RNA eine cDNA-Population synthetisiert, die mit jeweils un terschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert wird, und zwar einmal mit cy-3 und einmal mit cy-5. Diese Markierung erfolgt üblicherweise so, dass eine der vier für die Synthese von cDNA verwandten dNTP-Basen mit dem Marker versehen ist. Beide cDNA-Populationen werden mit den Sonden auf dem Oligonukleotidchip hybridisiert. Überschüssiges cDNA-Probenmaterial wird mit entsprechenden Pufferlösungen von der Chipoberfläche weggewaschen. Der Chip wird trocken geblasen oder trocken zentrifugiert.

Die Menge an gebildetem Hybrid in jedem einzelnen Sondenpunkt lässt sich nun mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers nachweisen. Dabei wird die Intensität der Fluo reszenz gemessen. Dies geschieht bei einer für den jeweiligen Marker spezifischen Wellenlänge. Wird ein ORF von Sacharomyces Cerevisiae nur in einem der beiden Nährmedien A oder B exprimiert, wird Fluoreszenz nur bei der Wellenlänge detek tiert, die für den Marker spezifisch ist, der bei der Synthese des entsprechenden cDNA-Probenmaterials eingebaut wird. Wird ein ORF von Saccharomyces Cerevisiae in beiden Nährmedien exprimiert, wird Fluoreszenz bei Wellenlängen detektiert, die für die Marker spezifisch ist, die bei der Synthese von cDNA-Probenmaterial verwen det werden. Die im Ausführungsbeispiel verwendeten Marker sind cy-3 und cy-5. Diese beiden Marker fluoreszieren bei unterschiedlichen Wellenlängen. Es ist des halb möglich, in jedem einzelnen Sondenpunkt, der eine detektierbare Mindestmenge an Hybrid aufweist, einen Intensitätswert für die Fluoreszenz getrennt nach Wellen länge zu ermitteln. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt daher in zwei sogenannten Kanälen:

- einem cy-3-Kanal, mit dem die Fluoreszenzintensität cy-3 markierter cDNA- Moleküle gemessen wird, die mit Sonden auf dem Oligonukleotidchip Hybride gebil det haben, und
- einem cy-5-Kanal, mit dem die Fluoreszenzintensität cy-5-markierter cDNA- Moleküle gemessen wird, die mit Sonden auf dem Oligonukleotidchip Hybride gebil det haben.

Gemessen wird im jeweiligen Kanal die Fluoreszenzinstensität jedes einzelnen Son denpunktes. Gemessen wird ausserdem das sogenannte Hintergrundrauschen, dass heisst die Fluoreszenzintensität der Chipoberfläche in Bereichen zwischen den Son denpunkten. Die Differenz dieser beiden Messwerte ergibt einen korrigierten Wert für die Fluoreszenzintensität des cDNA-Moleküls, das in dem gemessenen Sondenpunkt ein Hybrid gebildet hat und mit dem entsprechenden Marker versehen ist. Dieser kor rigierte Intensitätswert ist proportional zur Menge an von Saccharomyces Cerevisiae in einem der beiden Nährmedien exprimiertem ORF, für das die gemessene Sonde spezifisch ist.

Im Messkanal, in dem die Werte ermittelt werden, die zu diesem korrigierten Intensi tätswert führen, wird spezifisch die Intensität der Fluoreszenz eines dem Messkanal entsprechenden Markers gemessen, und damit dessen relative Konzentration. Liegt der korrigierte Intensitätswert über 0, beziehungsweise hebt sich die Intensität der in einem Sondenpunkt gemessenen Fluoreszenz genügend vom Hintergrund ab, so liegt ein qualitativer Nachweis über das Vorhandensein von mit einem bestimmten Marker versehenen cDNA-Molekülen in dem entsprechenden Sondenpunkt vor.

Die Gesamtheit der in einem Kanal ermittelten Intensitätswerte entspricht einem Ge nexpressionsmuster, das Auskunft über die Expressionen derjenigen ORFs aus Sa charomyces Cerevisiae gibt, für die spezifische Sonden auf dem Chip vorgesehen sind. Das Genexpressionsmuster ist abhängig von den Bedingungen, denen die je weilige Probe Saccharomyces Cerevisiae vor der Transkribierung ihrer RNA ausge setzt ist. Man geht davon aus, dass der überwiegende Teil der Gene, bzw. ORFs ei nes Organismus, das heisst ca. 85-90%, unter verschiedenen Bedingungen expri miert wird. Würde man also mehrere Expressionsmuster des vollständigen Genoms eines Organismus ermitteln, würden zwei unterschiedliche Expressionsmuster jeweils nur einen Teil von Genen aufweisen, die in unterschiedlichen Konzentrationen vorlie gen. Aus diesem Grunde sind auf dem Oligonukleotidchip gemäss dem Ausfüh rungsbeispiel verhältnismässig viele Sonden aufgebracht, nämlich ca. 5600, die für 5600 verschiedene ORFs von ca. 6300 identifizierten ORFs aus Sacharomyces Ce revisiae spezifisch sind.

Die hohe Zahl an unterschiedlichen Sonden auf einem Oligonukleotidchip gestattet es, die in den verschiedenen Kanälen ermittelten Genexpressionsmuster direkt mit einander zu vergleichen. Zwischen den beiden Kanälen können Unterschiede in der jeweils gemessenen Intensität zurückgehen auf:

a) unterschiedliche Marker,
b) Schwankungen der Konzentrationen von Gesamt-RNA-Populationen A und B aus zwei Experimenten A und B, die nicht auf Expressionsunterschiede zurückzuführen sind,
c) unterschiedliche Expressionen eines ORFs unter verschiedenen Bedingungen. Weil die überwiegende Zahl der ORFs von Saccharomyces Cerevisiae unter ver schiedenen Bedingungen gleich exprimiert wird, lassen sich die Intensitätsunter schiede, die durch die Punkte a) und b) der eben aufgeführten Auflistung entstehen können, mit Hilfe einer Normalisierung der ermittelten intensitätswerte ausgleichen. Nach diesem Ausgleich werden die Unterschiede zwischen zwei Genexpressions mustern deutlich. Würde man dasselbe Experiment auf einem Oligonukleotidchip mit wenigen Sonden durchführen, dann wäre aus statistischen Gründen ein solcher Aus gleich hingegen kaum möglich. Es ist deshalb zweckmässig, mindestens 1000, vor zugsweise mehr als 3000 Sonden für jeweils unterschiedliche Gene auf einem Chip vorzusehen.

Im Ausführungsbeispiel wird dieser Ausgleich über eine Normalisierung wie folgt vor genommen:

- es wird jeweils die Summe über alle in einem Messkanal ermittelten Intensitätswerte gebildet,
- die grössere der ermittelten Summen wird durch die kleinere der ermittelten Sum men dividiert, woraus ein Faktor resultiert, und
- der ermittelten Intensitätswerte, aus denen die kleinere Summe zustandegekom men ist, werden mit dem Faktor multipliziert.

Die Auswertung erfolgt, indem die Differenzen zwischen den mit dem Faktor multipli zierten ermittelten Intensitätswerten des insgesamt intensitätsschwächeren Kanals und den ermittelten Intensitätswerten des anderen Kanals gebildet werden, und zwar für jeden einzelnen Sondepunkt.

Die Differenzen zwischen den normalisierten, ermittelten Intensitätswerten gestatten es, eine qualitative Aussage über die unterschiedliche Expression eines Gens unter verschiedenen Bedingungen zu machen. Die ermittelten Intensitätswerte erlauben ausserdem eine Aussage darüber, wieviel mehr ein bestimmtes Gen unter Bedin gungen A exprimiert wurde als unter Bedingungen B. Somit kann mit einem erfin dungsgemässen Oligonukleotidchip eine quantitative Aussage mittels Skalierung ge troffen werden.

Claims

1. Oligonukleotidchip, mit einer Vielzahl von Sondenpunkten, wobei in jedem Sondenpunkt eine Vielzahl von identischen Sondenmolekülen vorliegt, die gemein sam eine Sonde bilden, und die jeweils eine Sondensequenz beinhalten, die eine Sequenz von Oligonukleotiden ist, wobei

a) die Sondensequenzen der Sondenmoleküle eines Sondenpunktes sich von den Sondensequenzen anderer Sondenmoleküle an weiteren Sondenpunkten unter scheiden,
b) die Sonden Sondensequenzen aufweisen, die jeweils dazu geeignet sind, spezi fisch mit Oligonukleotidsequenzen zu hybridisieren, die in Open Reading Frames vorkommen oder auf solche zurückzuführen sind, und
c) jede Sondensequenz komplementär zu nur einer von mehreren möglichen Oligo nukleotidsequenzen ist, die Teil jeweils eines Open Reading Frames oder auf diese zurückzuführen sind.

2. Oligonukleotidchip gemäss Anspruch 1, wobei die Sonden komplementär zu Oligonukleotidsequenzen sind, die in Open Reading Frames im Genom mehrerer Organismen vorkommen.

3. Oligonukleotidchip gemäss Anspruch 1, wobei die Sonden komplementär zu Oligonukleotidsequenzen sind, die in Open Reading Frames im Genom eines Orga nismus vorkommen.

4. Oligonukleotidchip gemäss Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass eines der möglichen Genome das Genom von Sac charomyces Cerevisiae ist.

5. Ein Oligonukleotidchip gemäss Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass das Genom das Genom von Saccharomyces Cerevisiae ist.

6. Oligonukleotidchip nach einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, dass er 4000-6000 Sonden aufweist.

7. Oligonukleotidchip nach einem der Ansprüche 1-6, gekennzeichnet dadurch, dass die Sondensequenzen eine Länge von 30-80 Basen aufweisen.

8. Oligonukleotidchip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondensequenzen eine Länge von 35-45 Basen aufweisen.

9. Oligonukleotidchip, mit einer Vielzahl von Sondenpunkten, wobei in jedem Sondenpunkt eine Vielzahl von identischen Sondenmolekülen vorliegt, die gemein sam eine Sonde bilden, und die jeweils eine Sondensequenz beinhalten, die eine Sequenz von Oligonukleotiden ist, wobei

a) die Sondensequenzen der Sondenmoleküle eines Sondenpunktes sich von den Sondensequenzen anderer Sondenmoleküle an weiteren Sondenpunkten unter scheiden,
b) die Sonden Sondensequenzen aufweisen, die jeweils dazu geeignet sind, spezi fisch mit Oligonukleotidsequenzen zu hybridisieren, die in Open Reading Frames vorkommen oder auf solche zurückzuführen sind, und
c) eine Anzahl von n unterschiedlichen Sondensequenzen auf dem Chip in n Sonden in n Sondenpunkten vorgesehen ist,
d) zu der Anzahl n gemäss c) eine gleiche Anzahl n unterschiedlicher Oligonukleotid sequenzen exisitiert, die für ein bestimmtes Open Reading Frame spezifisch sein können, und
e) m Anzahlen n gemäss c) und/oder d) für m unterschiedliche Open Reading Fra mes vorgesehen sind.

10. Verfahren zu Validierung von Sondensequenzen mit den Schritten:

a) Induzieren einer Genexpression A aus einem Genom unter Bedingungen A,
b) Induzieren einer Genexpression B aus einem Genom unter Bedingungen B,
c) Transkribieren der Genexpressionen A, B in cDNA-Populationen A, B, wobei je weils unterschiedliche Marker a, b in die cDNA-Populationen A, B eingebaut werden,
d) gleichzeitiges Aufbringen der cDNA-Populationen A, B auf einen Oligonukleotid chip gemäss Anspruch 9,
e) Durchführung einer Hybridisierungsreaktion,
f) Entfernen der unreagierten Bestandteile der cDNA-Populationen,
g) Trocknen des Oligonukleotidchips,
h) Detektion und Quantifizierung der in den Sondenpunkten der Chip-Oberfläche de tektierbaren Marker a, wobei ein Messwert Aa erhalten wird,
i) Detektion und Quantifizierung der in den Sondenpunkten der Chip-Oberfläche de tektierbaren Marker b, wobei ein Messwert Bb erhalten wird
j) Vergleich der in jedem Sondenpunkt gemessenen Werte Aa und Bb.

11. Verfahren zum Vergleich von Genexpressionsmustern mit den Schritten:

a) Induzieren einer Genexpression A aus einem Genom unter Bedingungen A,
b) Induzieren einer Genexpression B aus einem Genom unter Bedingungen B,
c) Transkribieren der Genexpressionen A, B in cDNA-Populationen A, B, wobei je weils unterschiedliche Marker a, b in die cDNA-Populationen A, B eingebaut werden,
d) gleichzeitiges Aufbringen der cDNA-Populationen A, B auf einen Oligonukleotid chip gemäss einem der Ansprüche 1-8,
e) Durchführen einer Hybridisierungsreaktion,
f) Entfernen der unreagierten Bestandteile der cDNA-Populationen,
g) Trocknen des Oligonukleotidchips,
h) Detektion und Quantifizierung der in den Sondenpunkten der Chip-Oberfläche de tektierbaren Marker a, wobei ein Messwert Aa erhalten wird,
i) Detektion und Quantifizierung der in den Sondenpunkten der Chip-Oberfläche de tektierbaren Marker b, wobei ein Messwert Bb erhalten wird
j) Vergleich der in jedem Sondenpunkt gemessenen Werte Aa und Bb.

12. Verfahren gemäss Anspruch 10 oder 11, in dem die Marker Fluoreszenzmar ker sind.

13. Verfahren gemäss Anspruch 12, in dem die Fluoreszenzmarker cy-3 und cy-5 sind.

14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10-13, in dem die Trocknung des Oligonukleotidchips durch trocken blasen oder trocken zentrifugieren erfolgt.