DE10062421A1 - Verwendung von Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid wirksamen Verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität von Acetyl-CoA Carboxylasen kodieren, die davon kodierten Polypeptide und deren Verwendung zum Identifizieren von neuen, insektizid wirksamen Verbindungen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Auffinden von Modulatoren dieser Polypeptide sowie die Verwendung dieser Verbindungen als Inhibitoren der ACCase aus Insekten.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden und Enzympräparationen mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von neuen, insektizid wirksamen Verbindungen, sowie Verfahren zum Auffinden von Modulatoren dieser Polypeptide.

Die Acetyl-CoA Carboxylase (EC 6.4.1.2), im folgenden als ACCase bezeichnet, katalysiert die Biotin-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA und stellt den Schrittmacher der de novo Fettsäurebiosynthese dar. Die ACCase besitzt drei Domänen: Biotin-Carboxyl-Carrier (BCC), Biotin-Carboxylase (BCase) und Carboxyltransferase (CTase). Die durch die ACCase katalysierte Reaktion kann in zwei Schritte unterteilt werden. In einem ersten Schritt wird unter ATP-Spaltung durch die BCase-Aktivität eine CO₂-Gruppe aus Bicarbonat auf ein kovalent an den BCC gebundenes Biotin übertragen. Im nächsten Schritt wird die so aktivierte Carboxylgruppe durch die CTase auf Acetyl-CoA übertragen und damit Malonyl- CoA gebildet (Knowles JR, 1989). Es gibt zwei physiologisch verschiedene ACCase Formen. Bei der heteromeren Form, die in Bakterien und den Chloroplasten von Pflanzen vorkommt, werden die drei Domänen durch drei separate, dissoziierbare Proteine gebildet. Die homomere ACCase besteht aus einer Polypeptidkette, welche alle drei Domänen enthält und im Cytosol von Pflanzen, Tieren und Pilzen zu finden ist (Ke J et al., 2000). Bei Pflanzen und Vertebraten wird die ACCase durch zahlreiche Mechanismen z. B. allosterisch durch Citrat, Palmitoyl-CoA, durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung durch Proteinkinasen sowie auf der Ebene der Genexpression reguliert (Munday MR & Hemingway CJ 1999; Ke et al. 2000). Über die Regulation des Enzyms aus Insekten liegen keine Publikationen vor.

Zahlreiche Gene von ACCasen aus Pflanzen, Pilzen und Vertebraten wurden bereits kloniert (z. B. Abu-Elheiga L et al. 1994; Bailey A et al. 1995; Goffeau A et al. 1996; ACCase aus Arabidopsis thaliana Genbank AAF18638546) oder zum Patent angemeldet bzw. patentiert (z. B. Haselkorn R & Gornicki P 1999; Somers DA 1999; Jenkins AR et al. 1992). Eine annotierte, also der ACCase zugeordnete Sequenz aus Insekten liegt jedoch noch nicht vor.

Aus einer großen Zahl biochemischen Arbeiten an Pflanzen und Pilzen sind Inhibitoren der ACCase als Herbizide bzw. Fungizide bekannt (Vahlensieck HF et al. 1994; Gronwald JW 1994). Ein weiteres Dokument beschreibt die als ACCase- Hemmer bekannten Fungizide Soraphen A und B zur Bekämpfung von Milben, die nicht zur Ordnung der Insekten gehören (Sutter M. et al., 1991).

Die Wirkung von Hemmern der humanen ACCase auf Insekten wurde in einer Veröffentlichung untersucht (Popham, HJR et al. (1996): Effect of a hypolipidemic agent on the growth and development of the southwestern corn borer, Diatraea grandiosella. Comp. Biochem. Physiol., C: Pharmacol., Toxicol. Endocrinol. (1996), 115 (3), 247-249), allerdings werden hier in erster Linie physiologische Fragen beleuchtet.

In der vorliegenden Erfindung wurden nun aus verschiedenen Larvenstadien oder Adulten der Pfirsichblattlaus Myzus persicae durch Homogeniserung in geeigneten Puffern Rohextrakte gewonnen. Diese Rohextrakte wurden vorgereinigt und die ACCase Aktivität in einem radioaktiven Enzymtest bestimmt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte nun erstmalig gezeigt werden, dass Verbindungen existieren, die im Enzymtest die Aktivität der ACCase z. B. aus Myzus persicae hemmen. Der Befund, dass bestimmte Verbindungen die ACCase hemmen, zeigt, dass die ACCase den Interaktionspartner (das Target) dieser Wirkstoffe darstellt und ein Zielprotein insektizid oder akarizid wirksamer Verbindungen darstellt.

In der vorliegenden Erfindung wird weiter gezeigt, dass die Hemmung der ACCase zum Absterben von behandelten Insekten führt. Bislang war nicht bekannt, dass die ACCase in Insekten ein Zielprotein insektizid wirksamer Substanzen ist. Damit wird hier auch zum ersten Mal gezeigt, dass die ACCase ein für Insekten lebenswichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Masse dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und möglicherweise verbesserten insektiziden Wirkstoffen verwendet zu werden.

In der vorliegenden Erfindung wird weiterhin zum ersten Mal die ACCase aus Drosophila melanogaster beschrieben. Die Nukleinsäuresequenz der Accession Number AAF59156 ist bereits seit geraumer Zeit zugänglich. Die Bedeutung der Sequenz bzw. das davon kodierte Polypeptid war jedoch bislang unbekannt, ebensowenig die kodierende Region dieses Sequenzabschnitts. Bedeutung, Funktion und die kodierende Region sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Polypeptid werden nun im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals zugänglich gemacht. So wird die für die ACCase aus Drosophila melanogaster kodierende cDNA gemäß SEQ ID NO: 1 und das davon kodierte Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 in der vorliegenden Anmeldung angegeben sowie deren Verwendung zum Identifizieren von insektizid und akarizid wirksamen Substanzen beschrieben.

Da die ACCasen, im Besonderen auch die hier vorliegende ACCase aus Myzus persicae sowie Drosophila melanogaster und anderen Insekten beträchtliche Homolgien zueinander aufweisen, können auch homologe Polypeptide, die von entsprechenden homologen Nukleinsäuren kodiert werden, sowie weitere Mitglieder der Genfamilie als molekulare Interaktionspartner (Targets) insektizider Wirkstoffe, insbesondere der Verbindungen der Formel (I) verwendet werden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den homologen Polypeptiden um solche, die zur ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster eine Identität von 60%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90% und besonders bevorzugt von 95% über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über die Gesamtlänge aufweisen.

Insektizide und/oder akarizide Wirkstoffe, die gegebenenfalls mit Hilfe der erfindungsgemäßen ACCasen gefunden werden können, können demnach auch mit ACCasen aus anderen zahlreichen Akarina- oder Insektenspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in den Insekten oder Akarina vorkom­ menden ACCasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen. Besonders bevorzugte ACCasen bzw. Herkunftsorganismen sind beispielhaft und nicht abschließend in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt:

Tabelle 1

In der vorliegenden Anmeldung wird zum ersten Mal am Beispiel der ACCase aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae gezeigt, dass ACCasen Zielproteine (Targets) für insektizide Wirkstoffe sind und zur Identifizierung neuer, verbesserter insektizider Wirkstoffe in dafür geeigneten Verfahren (Assays) eingesetzt werden können.

Besonders sind dabei die ACCase aus Myzus persicae und Drosophila melanogaster zur Identifizierung neuer, insektizider und gegebenenfalls akarizider Wirkstoffe geeignet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Verwendung von aus Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer ACCase sowie diese kodierende Nukleinsäuren zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase in Insekten und/oder Akarina, insbesondere von solchen Polypeptiden, die direkt aus Insekten isoliert oder von aus Insekten stammenden Nukleinsäuresequenzen oder Fragmenten davon kodiert und durch in vivo oder in vitro Verfahren gewonnen werden. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Polypeptiden um solche, die zur ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster eine Identität von 60%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90% und besonders bevorzugt von 95% über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über die Gesamtlänge aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besonders die Verwendung der ACCase aus Myzus persicae und der ACCase aus Drosophila melanogaster gemäß SEQ ID NO: 2 sowie dazu homologer Polypeptide zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase aus Insekten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist im Besonderen die Verwendung der ACCase aus Myzus persicae zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase aus Insekten.

Ganz besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide damit eine Sequenz ausgewählt aus

• a) der Sequenz isoliert aus Mycus persicae,
• b) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2,
• c) der Sequenz kodiert von der Nukleinsäure gemäß Accession Number AAF59156,
• d) Teilsequenzen der unter a) bis c) genannten Sequenzen, die noch die biolo­ gische Aktivität einer ACCase besitzen,
• e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige, bevorzugt eine 80%ige, be­ sonders bevorzugt eine 90%ige und ganz besonders bevorzugt eine 95% Identität mit den unter a) bis d) genannten Sequenzen aufweisen.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 10.0 unter Standardeinstellungen (Devereux et al. 1984).

Gegenstand der vorliegenden Verwendung ist ebenfalls die Verwendung von für ACCasen kodierenden Nukleinsäuren aus Insekten zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase in Insekten und/oder Akarina.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auch die Verwendung der für die ACCase aus Myzus persicae kodierenden Nukleinsäure sowie der für die ACCase aus Drosophila melanogaster kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase, sowie dazu zu 60%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und besonders bevorzugt zu 95% homologer Nukleinsäuresequenzen.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.

Der Ausdruck "cDNA" wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine einzel- oder doppelsträngige Kopie eines RNA-Moleküls und ist deshalb als Kopie einer biologisch aktiven RNA intronfrei, d. h. alle kodierenden Regionen eines Gens sind in zusammenhängender Form enthalten.

Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA oder DNA-Fragmente, die genomischer DNA aus Insekten entsprechen.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA oder DNA-Fragmente, die genomischer DNA von Myzus persicae oder Drosophila melanogaster entsprechen.

Ganz besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus

• a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
• b) der Sequenz gemäß Accession Number AAF59156,
• c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter a) oder b) de­ finierten Sequenzen,
• d) Sequenzen, welche bei einer Hybridisierungstemperatur von 37°C bis 50°C an die unter a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren,
• e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige, bevorzugt eine 80%ige, be­ sonders bevorzugt eine 90%ige und ganz besonders eine 95%ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen,
• f) Sequenzen, welche zu den unter a) bis e) definierten Sequenzen komplementär sind, und
• g) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz codieren wie die unter a) bis e) definierten Sequenzen.

Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäß zu ver­ wendenden Nukleinsäuren stellt ein cDNA-Molekül mit der für ACCase aus Myzus persicae kodierenden Sequenz sowie der für ACCase aus Drosophila melanogaster kodierenden Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Polypeptide, die von der erfin­ dungsgemäßen Nukleinsäure kodiert werden.

Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor­ gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können aus­ gehend von der hierin genannten oder ableitbaren Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Insekten als Drosophila melanogaster isoliert werden, welche für ACCasen kodieren, welche dieselben oder ähnliche Eigenschaften einer der erfindungsgemäßen ACCasen aufweisen.

Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise be­ rechnet:
Die Schmelztemperatur Tm = 81,5°C + 16,6 log{c(Na⁺)] + 0,41(% G + C)) - 500/n (Lottspeich & Zorbas 1998).

Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenzab­ schnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz < 100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Na⁺ (entspricht 0.1 × SSC) gewaschen. Wird eine RNA- Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher.

Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben:
Hybridisierungslösung: DIG Easy Hyb (Roche, ZZ) Hybridisierungstemperatur: 37°C bis 50°C, bevorzugt 42°C (DNA-DNA), 50°C (DNA-RNA).

• 1. Waschschritt: 2X SSC, 0,1% SDS 2 × 5 min bei Raumtemperatur;
• 2. Waschschritt: 1X SSC, 0,1% SDS 2 × 15 min bei 50°C; bevorzugt 0,5X SSC, 0,1% SDS 2 × 15 min bei 65°C; besonders bevorzugt 0,2X SSC, 2 × 15 min bei 68°C.

Der Grad der Identität der Nukleinsäuren wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms NCBI BLASTN Version 2.0.4. (Altschul et al. 1997).

Der Ausdruck "regulatorische Regionen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf nicht-translatierte Regionen des betreffenden Gens, wie Promotoren, Enhancer, Repressor- oder Aktivator-Bindungsstellen oder Terminationssequenzen, die mit zellulären Proteinen interagieren, wodurch die Transkription gesteuert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Verwendung von DNA- Konstrukten, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure und einen heterologen Promotor umfassen, zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase.

Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, die Haupt- Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd- Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der Promotor der Sauren Phosphatase, der Baculovirus immediate early Promoter und der Promotor des α- Mating-Faktors der Hefe.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide, Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung von Vektoren, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure, oder ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-Konstrukt enthalten, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase.

Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Wirtszellen, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure, ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäß zu verwendenden Vektor enthalten, zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäuren nicht ent­ halten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zeilen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, COS1-, COS7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten.

Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natür­ liche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Ver­ fahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, De­ methylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Gly­ cosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine ein­ fache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabili­ sierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können.

Der Begriff "vollständige ACCase" wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine ACCase, die kodiert wird von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit beginnend mit dem ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für die ACCase kodierenden Gens, sowie für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.

Der Ausdruck "Gen" wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, die für die Synthese einer Polypeptidkette verantwortlich ist.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide müssen nicht vollständige ACCasen darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen ACCase aufweisen. Polypeptide, die eine gleichartige biologische Aktivität wie eine ACCase aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet. Dabei müssen die erfindungsgemäßen Polypeptide den ACCasen aus Myzus persicae oder Drosophila melanogaster hinsichtlich ihrer Sequenz oder katalytischen Aktivität nicht völlig entsprechen. Als erfindungsgemäße Polypeptide werden auch Polypeptide betrachtet, die zur ACCase beispielsweise der folgenden Insekten oder zu Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität der ACCase ausüben können, homolog sind:

Aus der Ordnung der Isopoda z. B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.

Aus der Ordnung der Diplopoda z. B. Blaniulus guttulatus.

Aus der Ordnung der Chilopoda z. B. Geophilus carpophagus, Scutigera spp.

Aus der Ordnung der Symphyla z. B. Scutigerella immaculata.

Aus der Ordnung der Thysanura z. B. Lepisma saccharina.

Aus der Ordnung der Collembola z. B. Onychiurus armatus.

Aus der Ordnung der Orthoptera z. B. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.

Aus der Ordnung der Blattaria z. B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucophaea maderae, Blattella germanica.

Aus der Ordnung der Dermaptera z. B. Forficula auricularia.

Aus der Ordnung der Isoptera z. B. Reticulitermes spp.

Aus der Ordnung der Phthiraptera z. B. Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp., Trichodectes spp., Damalinia spp.

Aus der Ordnung der Thysanoptera z. B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci, Thrips palmi, Frankliniella accidentalis.

Aus der Ordnung der Heteroptera z. B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.

Aus der Ordnung der Homoptera z. B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidieila aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp., Psylla spp.

Aus der Ordnung der Lepidoptera z. B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Mamestra brassicae, Panolis flammea, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana, Cnaphalocerus spp., Oulema oryzae.

Aus der Ordnung der Coleoptera z. B. Anobium punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes bajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinarnensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica, Lissorhoptrus oryzophilus.

Aus der Ordnung der Hymenoptera z. B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.

Aus der Ordnung der Diptera z. B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae, Tipula paludosa, Hylemyia spp., Liriomyza spp.

Aus der Ordnung der Siphonaptera z. B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden ACCasen Deletionen oder Amino­ säuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen ACCasen ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

• 1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
• 2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;
• 3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
• 4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
• 5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die Verwendung von Poly­ peptiden, welche zumindest eine biologische Aktivität einer ACCase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 60%ige Identität, vorzugs­ weise 80%ige, besonders bevorzugt 90%ige Identität und ganz besonders bevorzugt eine 95%ige Identität mit der Sequenz aus Myzus persiace oder auch der von der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 kodierten Sequenz aus Drosophila melanogaster aufweisen.

Der Ausdruck "biologische Aktivität einer ACCase", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit, die Biotin-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA zu katalysieren. Davon können alle drei Enzymfunktionen, d. h. die ATP-abhängige Abspaltung einer CO₂-Gruppe aus Bicarbonat, die Biotin-Carrier-Funktion sowie die Carboxylierung von Acetyl-CoA, aber auch nur eine oder zwei dieser Reaktionen umfasst sein.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch kurze Stücke der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können auch verwendet werden, um ausgehend von Insekten-mRNA hergestellte cDNA- Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA-Fragmente ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, be­ stehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere des von der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodierten Polypeptids, können außerdem Wirtszellen, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Be­ dingungen kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf üb­ liche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in vitro-Systemen hergestellt werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen ACCase aus Myzus persicae werden Larven oder Adulte z. B. im Mörser homogenisiert. Hierzu können sie vorher z. B. in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Das Homogenat wird in einem geeigneten Puffer aufgenommen.

Ein mögliches Reinigungsverfahren der ACCase basiert auf präparativer Elektro­ phorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie.

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäß zu ver­ wendenden Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel- Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard- Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, be­ deuten, dass die erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide können auch ohne Fusions­ partner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, die an die ACCase binden und deren Eigenschafen verändern. Aufgrund der wichtigen Funktion der ACCase stellen Modulatoren, die die Aktivität beeinflussen, neue insektizide und/oder gegebenenfalls akarizide Wirkstoffe dar. Modulatoren können Agonisten oder Antagonisten bzw. Inhibitoren oder Aktivatoren sein.

Der Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft von Verbindungen, mit anderen Verbindungen um die Bindung an der ACCase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.

Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der ACCase beschleunigt oder verstärkt.

Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der ACCase verlangsamt oder verhindert.

Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität be­ einflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.

Die Bindung der Modulatoren an die ACCase kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Insekten führt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Modulatoren von ACCasen aus Insekten, die mit Hilfe eines der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahrens zum Identifizieren von Modulatoren der ACCase gefunden werden.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verändern. Auch solche "Expressionsmodulatoren" können neue insektizide Wirkstoffe darstellen. Expressionsmodulatoren können kleine organisch- chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die regulatorischen Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren binden. Weiterhin können Expressionsmodulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an regulatorische Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren bindet, und dadurch deren Expression beeinflusst. Expressionsmodulatoren können auch Antisense-Moleküle sein.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder von Expressionsmodulatoren als Insektizide.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Expressionsmodulatoren von ACCasen, die mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens zum Auffinden von Expressionsmodulatoren gefunden werden.

Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (high throughput screening; HTS) und Ultra-Hochdurchsatz-Screening (UHTS) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z. B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umsetzung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Moleküle, die gut binden, und die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten. Es kann sich dabei auch um bekannte Verbindungen handeln, jedoch können auch völlige neue Stoffklassen diese modulatorische Aktivität aufweisen.

Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch oder radioaktiv markierte Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.

Die Aktivität vieler, z. B. membranständiger Proteine kann auf eine weitere Weise vorteilhaft gemessen werden. Die funktionelle heterologe Expression solcher Proteine in E. coli ist oft schwierig oder unmöglich. In diesem Fall kann durch geeignete Klonierung (z. B. unter Nutzung geeigneter PCR Strategien) der katalytisch aktive Teil des Proteins abgetrennt werden, so dass das Genprodukt ein (besser) lösliches Protein darstellt und leicht gereinigt werden kann. Zur Messung der Aktivität löslicher Proteine steht ein breites Repertoire von Meßmöglichkeiten zur Verfügung. Eine besonders empfindliche Messung kann z. B. unter Einsatz eines fluoreszenzmarkierten Liganden oder Substrates mittels Fluoreszenzpolarisation er­ folgen.

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungs­ gemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z. B. radioaktiv oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden ge­ bunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Agonisten oder Antagonisten ermessen.

Die folgenden Beispiele zeigen, dass die ACCase überraschenderweise ein essentielles Enzym in Insekten ist, und zeigen außerdem, dass das Enzym ein geeignetes Zielprotein für die Identifizierung von Insektiziden ist, in Verfahren zum Identifizieren von insektizid wirksamen Verbindungen verwendet werden kann und dass die in entsprechenden Verfahren identifizierten Modulatoren der ACCase als Insektizide verwendet werden können. Um die Verwendung der ACCase zu ermöglichen, wird beispielhaft die Gewinnung dieses Enzyms aus Myzus persicae beschrieben und schließlich die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung für die Suche nach insektizid wirksamen Verbindungen demonstriert.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung einer ACCase Enyzympräparation aus Myzus persicae

Larven oder Adulte von Myzus persicae werden gewogen und mit der dreifachen Menge an Extraktionspuffer im Mörser homgenisiert. Anschließend wird der Extrakt zweimal je 10 min mit 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand enthält die ACCase und wird für den Enzymtest zum Identifizieren von Inhibitoren verwendet.

Als Extrationspuffer wird bevorzugt der folgende Puffer verwendet: 0,25 M Sucrose, 15 mM Tris/HCl pH 7,4, 4 mM EDTA, 10 mM Kaliumcitrat (alle Chemikalien von Sigma, St. Louis).

Beispiel 2 Verfahren zum Auffinden von Modulatoren

Die ACCase Enzympräparation wurde zur Auffindung von Modulatoren der ACCase in einem biochemischen Test wie folgt verwendet: Zunächst wurde ein Aliquot der Enzympräparation aus Beispiel 1 mit dem Reaktionspuffer und dem radioaktiv markierten Substrat gemischt und inkubiert. Zum Nachweis des Einbaus von CO₂ wurden rauchende HCl zupipettiert, ein Aliquot des Reaktionsansatzes auf Watman- Filterpapier aufgetropft und getrocknet. Das getrocknete Filterpapier wurde mit Szintillationsflüssigkeit in Szintillationsröhrchen überführt. Die Messung erfolgte in einem Szintillationszähler (Beckman Instruments, Fullerton, USA). Zum Screening auf Modulatoren wurden die zu testenden Verbindungen in DMSO gelöst und vor dem ersten Inkubationsschritt zusammen mit der Enzympräparation zum Reaktionsansatz hinzugegeben. Die Wirkung der Modulatoren wurde in im Vergleich zur ACCase Aktivität in einem Reaktionsansatz mit Lösungsmittel aber ohne Modulator bestimmt. Abb. 2a zeigt die Hemmung der ACCase aus Myzus persicae bei unterschiedlichen Wirkstoff-Konzentrationen. Abb. 2b zeigt die Hemmung der Myzus persicae ACCase durch unterschiedliche Wirkstoffe.

Als Reaktionspuffer wurde 50 mM Tris/HCl pH 7,4, 15 mM MgCl₂, 2,5 mM ATP, 1 µg/µl Rinderserumalbumin, 10 mM Kaliumcitrat, 84 mM Natriumbicarbonat (alles von Sigma, St. Louis) verwendet.

Als radioaktiv markiertes Substrat wurde 4 mM ¹⁴C Natriumbicarbonat verwendet.

Beispiel 3 Beeinträchtigung der Lipidneogenese durch Inhibitoren der ACCase

Larven oder Adulte der Pfirsichblattlaus Myzus persicae wurden durch die Sachet- Methode (Nauen et al. 1996) für zwei Tage mit Nährlösungen mit und ohne einem der identifizierten Inhibitoren der ACCase (z. B. einer Verbindung der Formel (I)) gefüttert. Danach wurden die Tiere abgesammelt und mittels eines Mörsers in organischem Lösungsmittel homogenisiert. Durch mehrfaches Ausschütteln mit wässeriger Lösung wurde die organische Phase von wasserlöslichen Bestandteilen gereinigt und dann das Lösungsmittel abgedampft. Das verbleibende Pellet wurde in wenig Lösungsmittel aufgenommen und mittels Dünnschichtchromatographie (DC) aufgetrennt. Die aufgetrennten Lipide wurden mit Amidoschwarz angefärbt. In Lipide eingebautes ¹⁴C Acetat wurde mittels Autoradiographie nach 2-3 Tagen Expositionszeit nachgewiesen. Zur Quantifizierung des ¹⁴C Einbaus in Lipide wurden nach der Färbung die entsprechenden Banden ausgekratzt, gelöst und die Aktivität im Szintillationszähler bestimmt. Abb. 1a zeigt anhand eines aufgetrennten Lipidextraktes aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae den Lipid- Status nach Acetat-Fütterung ohne (Spuren 1-3) und mit Wirkstoff (Spuren 4-6). Es sind keine signifikanten Unterschiede in Lipidkomposition und Lipidgehalt zu erkennen. Abb. 1b zeigt die Autoradiographie der selben DC Platte. Während in den Spuren 1-3 anhand der Schwärzung diejenigen Lipide erkennbar sind, in die in den Kontroll-Blattläusen radioaktiv markiertes Acetat bei der de novo Synthese eingebaut wurde, sind in den Wirkstoff-behandelten Pfirsichblattläusen keine markierten Lipide vorhanden. Somit hat keine de novo Lipid-Synthese aus Acetat stattgefunden. Abb. 1c zeigt schematisch noch einmal, wieviel Acetat bei Anwesenheit von Inhibitoren der ACCase (0,01 ppm bis 100 ppm) noch bei der de novo Synthese im Vergleich zur Kontrolle ohne ACCase-Inhibitor eingebaut wurde.

Es ist deutlich zu erkennen, dass bei zunehmender Konzentration des Inhibitors die de novo Lipid-Biosynthese zum Erliegen kommt.

Als Laufmittel für die DC Chromatographie wurde n-Hexan : Diethylether : Eisessig (60 : 45 : 1) verwendet.

Beschreibung der Abbildungen Abb. 1a)

Aufgetrennter Lipidextrakt aus der Pfirsichblattlaus Myzus persicae nach Acetat- Fütterung ohne (Spuren 1-3) und mit einem Inhibitor der ACCase (Spuren 4-6). Die aufgetrennten Lipide wurden mittels Amidoschwarz angefärbt.

Abb. 1b)

Autoradiographie der unter Abb. 1a) gezeigten DC Platte. ¹⁴C Acetat wurde mittels eines Images nach 2-3 Tagen Expositionszeit nachgewiesen. Während in den Spuren 1-3 anhand der Schwärzung diejenigen Lipide erkennbar sind, in die in den Kontroll-Blattläusen radioaktiv markiertes Acetat bei der de novo Synthese eingebaut wurde, sind in den Wirkstoff-behandelten Pfirsichblattläusen keine markierten Lipide vorhanden.

Abb. 1c)

Einbau von ¹⁴C Acetat bei An- und Abwesenheit von Inhibitoren der ACCase (0.01 ppm bis 100 ppm) bei der de novo Synthese von Lipiden im Vergleich.

Abb. 2a)

Hemmung der ACCase aus Myzus persicae bei unterschiedlichen Wirkstoff- Konzentrationen. Lsngm = Lösungsmittel (Kontrolle). Vbdg = Verbindung (Wirkstoff).

Abb. 2b)

Hemmung der Myzus persicae ACCase durch unterschiedliche Wirkstoffe. Verbg = Verbindung.

Literatur

Abu-Elheiga L. et al. (1994): Human acetyl-CoA carboxylase: characterization, molecular cloning, and evidence for two isoforms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (9), 4011-4015.
Altschul SF et al. (1997): Gapped BLAST und PSI-BLAST generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
Bailey A et al. (1995): The ACC1 gene, encoding acetyl-CoA carboxylase, is essential for growth in Ustilago maydis. Mol. Gen. Genet. 249 (2), 191-201.
Devereux J et al. (1984): A comprehensive set of sequence analysis programs for VAX. Nucleic Acids Res. 12: 387-395.
Goffeau A et al. (1996): Life with 6000 genes. Science 274 (5287).
Gronwald JW (1994): Herbicides inhibiting acetyl-CoA carboxylase. Biochem. Soc. Trans. 22 (3): 616-621).
Haselkorn R & Gornicki P (1999): Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase. US 5972644-A.
Jenkins AR et al. (1992): Maize Acetyl CoA Carboxylase encoding DNA clones WO 9311243 A1, WO 1992 GB 0002205.
Ke J et al. (2000): Coordinate Regulation of the Nuclear and Plastidic Genes Coding for the Subunits of the Heteromeric Acetyl-Coenzyme A Carboxylase. Plant Physiology 122: 1057-1071.
Knowles JR (1989): The mechanism of biotin-dependent enzymes. Annu. Rev. Biochem. 58: 195-221.
Lottspeich, F., Zorbas H. (Hrsg.). 1998. Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Martinez-Zapater J. M. und Salina J., 1998 Humana Press ISBN 0-89603-391-0.
Mumberg D et al. (1995): Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119-122.
Munday MR & Hemingway CJ (1999): The regulation of acetyl-CoA carboxylase - a potential for the action of hypolipidemic agents. Adv. Enzyme Regul. 39: 205-234.
Nauen R et al. (1996) Aphicidal activity of imidacloprid against a tobacco feeding strain of Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) from Japan closely related to Myzus nicotinae and highly resistant to carbamates and organophosphates. Bull. Ent. Res. 86: 165-171
Puissant C & Houdebine LM (1990): An improvement of the single-step method of the RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. BioTechniques 8: 148-149.
Somers DA (1999): DNA encoding oat acetyl CoA carboxylase. WO 9967367 A1, US 0014022.
Sutter M. et ab (1991): Acaricides containing soraphen A or soraphen B, EP-A-412 937.
Vahlensieck HF et al. (1994): Identification of the yeast ACC1 gene product (acetyl- CoA carboxylase) as the target of the polyketide fungicide soraphen A. Curr. Genet. 25 (2): 95-100.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Nukleinsäure umfassend eine Sequenz ausgewählt aus

• a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
• b) der Sequenz gemäß Accession Number AAF59156,
• c) zumindest 14 Basenpaare langen Teilsequenzen der unter (a) und (b) definierten Sequenzen,
• d) Sequenzen, welche bei einer Hybridisierungstemperatur von 37°C bis 50°C an die unter (a) und (b) definierten Sequenzen hybridisieren,
• e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige Identität zu den unter (a) und (b) definierten Sequenzen aufweisen,
• f) Sequenzen, welche zu den unter (a) bis (e) definierten Sequenz komplementär sind und
• g) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter (a) bis (e) definierten Sequenzen.

2. Vektor umfassend zumindest eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1.

3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure­ molekül funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Ex­ pression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.

4. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einen Vektor gemäß Anspruch 2 oder 3.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine pro- oder eukaryotische Zelle handelt.

6. Wirtszelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die prokaryotische Zelle E. coli ist.

7. Wirtszelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotische Zelle eine Säuger- oder Insektenzelle ist.

8. Polypeptid mit einer Sequenz ausgewählt aus

• a) der Sequenz isoliert aus Myzus persicae,
• b) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2,
• c) der Sequenz kodiert von der Nukleinsäure gemäß Accession Number AAF59156,
• d) Teilsequenzen der unter a) bis c) genannten Sequenzen, die noch die biologische Aktivität einer ACCase besitzen,
• e) Sequenzen, welche eine zumindest 60%ige Identität mit den unter a) bis d) genannten Sequenzen aufweisen.

9. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäß Anspruch 8, umfassend

• a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäure gemäß An­ spruch 1 gewährleisten, und
• b) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle oder dem Kulturmedium.

10. Antikörper, welcher spezifisch mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 8 reagiert.

11. Verwendung von Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid und/oder akarizid wirksamen Verbindungen.

12. Verwendung von Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid und/oder akarizid wirksamen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Polypeptide gemäß Anspruch 8 handelt.

13. Verwendung von Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase zum Identifizieren von insektizid und/oder akarizid wirksamen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass die insektizid wirksamen Substanzen Modulatoren dieser Polypeptide sind.

14. Verwendung von Nukleinsäuren die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodieren, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren dieser Polypeptide.

15. Verwendung von Nukleinsäuren, die für Polypeptide aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodieren, zum Identifizieren von Substanzen, welche die Expression der von ihnen kodierten Polypeptide verändern.

16. Verwendung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.

17. Verwendung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder um cDNA handelt.

18. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Poly­ peptid aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase bindet, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Inkontaktbringen eines Polypetids aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase oder einer Wirtszelle enthaltend ein Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und
• b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Poly­ peptid bindet.

19. Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die die Aktivität von Acetyl- CoA Carboxylase aus Insekten und/oder Akarina modulieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) die Testsubstanz unter solchen Bedingungen mit Acetyl-CoA Carboxylase in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Testsubstanz mit Acetyl-CoA Carboxylase gestatten,
• b) die erfolgte Interaktion der Testsubstanz detektiert, indem man die Fähigkeit der Acetyl-CoA Carboxylase zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl-CoA bestimmt, und
• c) die Fähigkeit der Acetyl-CoA Carboxylase zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl-CoA bei Anwesenheit der Testsubstanz mit ihrer Fähigkeit zur Biotin-abhängigen Carboxylierung von Acetyl- CoA bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.

20. Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, welche die Expression von Polypeptiden aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase verändert, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle enthaltend eine für ein Polypeptid aus Insekten mit der biologischen Aktivität einer Acetyl-CoA Carboxylase kodierende Nukleinsäure mit einer chemischen Verbin­ dung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
• b) Bestimmen der Polypeptidkonzentration, und
• c) Bestimmen der Verbindung, welche die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.

21. Modulatoren der Acetyl-CoA Carboxylase aus Insekten und/oder Akarina, die mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 18 oder 19 gefunden werden.

22. Insektizid und/oder akarizid wirksame Substanzen, die mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 18 oder 19 gefunden werden.