DE10060602B4

DE10060602B4 - Verfahren und Vorrichtung zur enzymatischen Co-Faktor-Regenerierung

Info

Publication number: DE10060602B4
Application number: DE2000160602
Authority: DE
Inventors: Thomas Stillger; Murillo Villela Filho; Andreas Dr. Liese; Christian Prof. Dr. Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2000-12-05
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-12-06
Also published as: DE10060602A1

Abstract

Verfahren zur enzymatischen Regeneration von Co-Faktoren in Anwesenheit eines Co-Substrates, bei dem zur selektiven Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch die Pervaporation eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran eingesetzt wird, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, wobei für die selektive Trennschicht Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) eingesetzt wird, für die Stützschicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) verwendet wird und für die Vliesschicht Polyethylen (PE) eingesetzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur enzymatischen Co-Faktor-Regenerierung.

Chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lactone stellen wertvolle Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika, Inhibitoren und Pheromonen dar [AKITA, H. ET AL (1984), Chemical. Pharm. Bull. (Tokio), 32: 1242-1243; GEORG, G. I., KANT, J. (1988), J. Organ. Chem., 53: 692-695]. Zugänglich sind diese Substanzen u. a. durch eine biokatalytische Reduktion prochiraler Ausgangsverbindungen, wobei Oxidoreduktasen zum Einsatz kommen. Zur enzymatischen Ketonreduktion wurden bereits verschiedene Oxidoreduktasen präparativ eingesetzt. Zu ihnen gehören beispielsweise die (R)-spezifischen NADPH-abhängigen Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis sowie die (S)-spezifischen und NADH-abhängigen Enzyme aus Candida boidinii, Rhodococcus erythropolis und Candida parapsilosis.

Oxidoreduktasen katalysieren die Übertragung von Wasserstoff bzw. Elektronen. Zu den Oxidoreduktasen werden beispielsweise die Alkoholdehydrogenase, die Glukoseoxidase, die Katalase, die Glutamatdehydrogenase, die Fumaratreduktase sowie die Formiatdehydrogenase gezählt. Oxidoreduktasen benötigen zur Katalyse von Redoxreaktionen zusätzliche Stoffe, die die Reaktionen erst ermöglichen. Diese Stoffe werden Co-Faktoren (CoEnzyme) genannt und sind komplexe organische Moleküle. Die Kosten der Co-Faktoren für Alkoholdehydrogenasen (NAD⁺: 45,00 DM/g; NADP⁺: 459,00 DM/g; NADH: 167,00 DM/g; NADPH: 1492,00 DM/g) machen deutlich, daß bei präparativen, enzymatischen Reaktionen der stöchiometrische Einsatz von Co-Faktoren aus ökonomischen Gründen nicht sinnvoll ist. Nicht nur für die Kostenentwicklung eines enzymatischen Verfahrens ist es von Bedeutung, den Co-Faktor in geringen Mengen kombiniert mit einer effizienten Co-Faktor-Regenerierung einzusetzen. Auch die Produktaufarbeitung wird durch geringe Co-Faktormengen vereinfacht.

Nach dem Stand der Technik sind u.a. enzymatische Methoden der Co-Faktor-Regenerierung bekannt (LIESE, A. ET AL (2000), Industrial Biotransformations, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim). Die enzymatische Co-Faktor-Regenerierung kann enzymgekoppelt oder substratgekoppelt erfolgen.

Bei der enzymgekoppelten Co-Faktor-Regenerierung wird die Regenerierung des Co-Faktors durch ein zweites Enzym (Enzym 2) katalysiert [WANDREY, C. ET AL, (1981), Biotech. Bioeng., 23: 2789-2802]. Dabei kommt meistens die Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus cereus [WONG, C.H. ET AL (1985), Jour. Amer. Chem. Soc., 107: 4028-4031] oder die Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii zum Einsatz. Für die Regenerierungsreaktion wird ein zweites Substrat benötigt, welches durch das Enzym 2 unter Regenerierung des Co-Faktors zu einem zweiten Produkt umgesetzt wird. Die enzymgekop pelte Methode der Co-Faktor-Regenerierung zeigt folgendes Reaktionsschema:

Bei der substratgekoppelten Co-Faktor-Regenerierung wird sowohl die eigentliche Produktionsreaktion als auch die Co-Faktor-Regenerierung durch ein und dasselbe Enzym katalysiert [UHLENBROCK, K. (1994), Dissertation Rhein.-Friedr.-Wilh.-Univ. Bonn]. Das Substrat für die Co-Faktor-Regenerierung wird auch als Co-Substrat bezeichnet. Das daraus gebildete Produkt dementsprechend als Co-Produkt. Aus thermodynamischen Gründen muß die Triebkraft der Regenerierungsreaktion erhöht werden, um eine effiziente Co-Faktor-Regenerierung zu gewährleisten. Eine Möglichkeit dazu ist der Einsatz hoher Konzentrationen an Co-Substrat [PETERS, J. ET AL (1993c), Tetrahed. Asymm., 4(7): 1683-1692]. Weiterhin führt die Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch zu einer Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Co-Produktbildung und damit verbunden zu einer erhöhten Co-Faktor-Regenerierung. Die substratgekoppelte Methode der Co-Faktor-Regenerierung zeigt folgendes Reaktionsschema:

Für die enzymgekoppelte Co-Faktor-Regenerierung kann beispielhaft das System aus der Carbonylreduktase (CPCR) aus Candida parapsilosis und einer Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii angegeben werden. Die Enzyme können dabei in frei gelöster Form oder auch in immobilisierter Form, z. B. matrixeingehüllt oder trägergebunden, eingesetzt werden. Die Carbonylreduktase (CPCR) setzt unter Oxidation von NADH und H⁺ Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) um. Die Formiatdehydrogenase (FDH) setzt unter Reduktion des NAD⁺ Formiat zu CO₂ um. Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt dabei eindeutig auf der Seite des CO₂. Nachteilig wirkt sich in einer Nebenreaktion die Reduktion des Formiats durch die Carbonylreduktase (CPCR) zu Formaldehyd aus. Eine Desaktivierung des Enzyms und nichtquantitative Umsätze sind die Folge [RISSOM, S. (1999), Diss. Rhein.-Friedr.-Wilh.-Univ., Bonn].

Alternativ dazu ist die Co-Faktor-Regenerierung durch Verwendung eines zweiten Substrates für dasselbe Enzym möglich. Der Einsatz eines zweiten Enzyms entfällt somit. Co-Substrat ist hier Isopropanol, das durch die Carbonylreduktase (CPCR) zu Aceton oxidiert wird. Die dabei freiwerdenden Reduktionsäquivalente dienen zur Regenerierung des NAD⁺.

Aufgrund der Thermodynamik muß die Triebkraft der Regenerierungsreaktion erhöht werden. Eine im Verlaufe der Reaktion ansteigende Acetonkonzentration begünstigt im Sinne einer Gleichgewichtseinstellung die Rückreaktion: Aceton wird unter NADH-Verbrauch wieder zu Isopropanol reduziert. Die Anreicherung des Co-Produkts im Reaktionsgemisch führt zu einer Verschiebung der Gleichgewichtseinstellung und limitiert damit den Umsatz. Daher ist für die integrierte Co-Faktor-Regenerierung die Abtrennung des Acetons aus dem Reaktionsgemisch nötig. Die Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch über herkömmliche Verfahren, z. B. Destillation, kann aufgrund thermischer oder mechanischer Belastung zur Inaktivierung der Enzyme führen. Weiterhin ist eine Abtrennung von Co-Produkten aus einem Gemisch von Verbindungen mit ähnlichem Siedepunkt bei der Destillation nicht möglich. Verbindungen ähnlicher Molekülgröße oder ähnlicher chemisch-physikalischer Eigenschaften können mit Hilfe eines Membrantrennverfahrens, basierend auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip, ebenfalls nur schwer voneinander getrennt werden.

Besonders interessant ist die substratgekoppelte Co-Faktor-Regenerierung für NADPH-abhängige Enzyme, da hier derzeit keine enzymgekoppelte Co-Faktor-Regenerierung durch das System FDH/Formiat kommerziell verfügbar ist.

Die deutsche Patentschrift DE 41 16 426 C2 offenbart ein Verfahren zur selektiven Abtrennung vom Bestandteilen aus der hydrophoben Phase von reversmicellaren Systemen oder von W/O-Mikroemulsionen unter Verwendung von Pervaporationsverfahren.

Die Patentschrift DE 40 41 896 C1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur enzymatischen Synthese, insbesondere Cyanhydrinen mit einer Abtrennung von Produkt durch Pervaporation.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur enzymkatalysierten Co-Faktor-Regenerierung für Oxidoreduktasen zu schaffen, mit denen eine enzymschonende sowie auch die übrigen Reaktionspartner schonende, effektive Abtrennung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch möglich wird, um dadurch eine hohe Umsatzrate zu ermöglichen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 18 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 18 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung ist es nunmehr möglich, enzymatische Reaktionen, die Co-Faktoren verbrauchen, wirtschaftlicher zu gestalten, indem eine kostenintensive Co-Faktorzugabe durch die enzymatische Regenerierung entfällt. Weiterhin wird durch die Entfernung von bestimmten Substanzen, insbesondere Co-Produkten, aus dem Reaktionsgleichgewicht eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichts in Richtung der Produktbildung und folglich eine Umsatzsteigerung erreicht. Durch die Entfernung von Co-Produkten wird zum einen die Produktaufarbeitung erleichtert und zum anderen eine Beeinflussung des Enzyms oder des gesamten Reaktionsprozesses durch die gebildeten Co-Produkte vermindert. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Vorrichtung ermöglicht eine im Sinne eines Hybridprozesses bzw. einer Hybridvorrichtung enzymatische Reaktion und die Abtrennung des bei der Co-Faktor-Regenerierung entstehenden Co-Produktes. Ein Hybridprozeß ist nach Lipnizki dadurch definiert, daß in einer Prozeßanordnung verschiedene Prozeßeinheiten integriert und optimiert sind [LIPNIZKI, F. ET AL (1998), Chem. Ing. Tech., 70: 1587-1595], d. h. neben einer Prozeßeinheit zur enzymatischen Umsetzung ist eine weitere Prozeßeinheit zur selektiven Abtrennung von Substanzen enthalten. Letztere kann beispielsweise durch ein Membranverfahren erfolgen.

Hauptmerkmal aller Membranverfahren ist die Membran selbst. Als Membran werden natürlich oder künstlich hergestellte flächige Gebilde, die fluide Phasen oder auch Volumina einer Phase mit unterschiedlicher Zusammensetzung von einander zu trennen imstande sind und deren Fähigkeit darin besteht, den Stofftransport zwischen ihnen zu ermöglichen, bezeichnet. Beim Passieren der Membran trennt sich das zu trennende Komponentengemisch (Feed) in Retentat, das die Membran nicht passiert, und Permeat. Die Trennung beruht darauf, daß die Membran dem Durchtritt der einzelnen Stoffe unterschiedlichen Widerstand entgegensetzt oder auf die Komponenten unterschiedliche Triebkräfte wirken. Hinsichtlich des Trennmechanismus lassen sich drei ideale Grenzfälle unterscheiden, deren Übergänge fließend sind. Die neutrale Porenmembran trennt nach dem Größen-Ausschluß-Prinzip, wobei im günstigsten Fall nur die Porengröße und nicht das Membranmaterial Einfluß auf die Trennung hat. Hier kommt es zu einer Anreicherung von großen Molekülen im Retentat.

Im Gegensatz dazu bestimmen bei Löslichkeitsmembranen das Zusammenwirken von Löslichkeit eines Stoffes im Polymermaterial und nachfolgender Diffusion den Trenneffekt. Wenn sich die Löslichkeiten ausreichend unterscheiden, können gleich große Moleküle oder sogar größere Moleküle von kleineren abgetrennt werden. Porenmembranen und Löslichkeitsmembranen können elektrische Ladungen tragen und werden dann als Ionenaustauschermembranen bezeichnet. Der Trenneffekt beruht auf dem Ausschluß von Teilchen, welche die gleiche Ladung wie die Membran haben.

Zur enzymschonenden sowie auch die übrigen Reaktionspartner schonenden effektiven Abtrennung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch eignen sich Membranen, die zur Pervaporation eingesetzt werden. Sie können als Komposit-Membranen bezeichnet werden, da sie im allgemeinen aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht aufgebaut sind. Sie werden bezüglich ihrer Struktur als dichte, porenfreie Membranen angesehen. In diesem Zusammenhang soll der Begriff "porenfrei" Membranen umfassen, deren Trennprinzip nicht das Größen-Ausschluß-Prinzip sein soll, sondern deren Trennwirkung auf Grund der unterschiedlichen Diffusion und Löslichkeit der zu trennenden Substanzen hinsichtlich der Membran beruht. Dabei können die Membranen z. B. Poren mit einer Größe bis 2 nm aufweisen.

Die selektive Trennschicht wird von einem Polymer gebildet. Organophile Membranen besitzen beispielsweise eine polymere Trennschicht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS). Zur Steigerung der Selektivität gegenüber der organischen Komponente und gleichzeitiger Verringerung des Wasserpartialflusses werden neben den reinen PDMS-Membranen auch Membranen eingesetzt, die Zeolithe in der aktiven Schicht enthalten [ADNADJEVIC, B. ET AL (1997), J. Membr. Sci., 136: 173-179]. Bei den Zeolithen handelt es sich um Gerüstsilicate, in denen ein Teil der Silciumatome durch Aluminium ersetzt sind. In den Zeolithestrukturen existieren große Hohlräume, die durch Kanäle verbunden sind. In diese Hohlräume können sich Wassermoleküle einlagern, so daß die Zeolithe als Molekularsiebe in der Membran fungieren.

Die Stützschicht besteht beispielsweise aus Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) und dient zur Verbesserung der mechanischen Stabilität.

Die Vliesschicht dient der zusätzlichen Stabilisierung und besteht beispielsweise aus Polyethylen (PE).

Pervaporation ist der Transport von Stoffen durch eine porenfreie, polymere Membran, wobei ein Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig stattfindet. Das Trennprinzip beruht auf einer bevorzugten Löslichkeit und Diffusion der permeierenden Stoffe im polymeren Membranmaterial. In der Literatur werden für Pervaporation auch hin und wieder die Begriffe Membranverdampfung und Verdampfungspermeation verwendet. Zu unterscheiden ist der Effekt aber von der Membrandestillation, da hier eine mikroporöse Membran eingesetzt wird, die lediglich die Aufgabe hat, die flüssige von der gasförmigen Phase zu trennen und selbst keinen Einfluß auf die Selektivität nimmt.

Der für die Pervaporation charakteristische Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig kann mit der Destillation verglichen werden. Bei der Destillation befinden sich Temperatur, Druck und chemisches Potential einer Komponente in beiden Phasen im Gleichgewicht. Die Trennung erfolgt aufgrund von Konzentrationsunterschieden dieser Gleichgewichtsstufe.

Bei der Pervaporation ist die Triebkraft für den transmembranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Potentials Δμ_i, der durch eine Aktivitätsdifferenz der permeierenden Komponente i zu beiden Seiten der Membran aufgeprägt wird. Es gilt:

x_i = Molenbruch der Komponente i im Feed
y_i = Molenbruch der Komponente i im Permeat
γ_i,F = Aktivitätskoeffizient der Komponente i im Feed
p°_i= Sattdampfdruck der Komponente i
p_P = Permeatdruck

Durch Anlegen eines Vakuums auf der Permeatseite (P_Feed ≫ P _Permeat) wird der Gradient aufrecht erhalten.

μ_iF = chemisches Potential der permeierenden Komponente im Feedstrom
μ_i _P = chemisches Potential der permeierenden Komponente im Permeatstrom
a_F = Aktivität Feedstrom
a_P = Aktivität Permeatstrom
P_Feed = Druck Feedstrom
P_Permeat = Druck Permeatstrom

Um eine hohe Selektivität zu erreichen, wird der Widerstand der Membran für die aus der Mischung bevorzugt abzutrennende Komponente möglichst gering und für die im Permeat unerwünschte möglichst hoch gehalten. Durch Verwendung verschiedener Membranmaterialien können unterschiedliche Affinitäten der Membran zu einzelnen Gemischkomponenten erzielt werden. Hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften können drei Klassen von Pervaporationsmembranen unterschieden werden:

1. Hydrophile Membranen → Abtrennung von Wasser aus organischen Gemischen
2. Hydrophobe Membranen → Abtrennung von Organika aus wäßrigen Lösungen
3. Ziel-Organophil → Abtrennung von Organika aus organischen Gemischen

Hydrophile Membranen bestehen beispielsweise aus Polyvinylalkohol (PVA). Zu den hydrophoben Membranen können Membranen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) gezählt werden. Bei der Auswahl der Pervaporationsmembran muß für eine wirtschaftliche Trennung neben der Selektivität auch die Flußdichte der Membran berücksichtigt werden. Membranen mit hoher Selektivität weisen überwiegend geringere Flußdichten auf als Membranen mit geringer Selektivität. Eine Membran mit hoher Selektivität muß dementsprechend eine größere Membranfläche aufweisen als eine Membran mit geringerer Selektivität, um einen jeweils gleichen Permeatfluß zu erreichen. Die Schichtdicke der Membranen hat in diesem Zusammenhang daher ebenfalls einen Einfluß. Die Dicken der selektiven Schichten liegen beispielsweise in einem Größenbereich von 1 bis 40 μm.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des Verfahrens sowie experimentelle Daten:

Es zeigt:

1: Pervaporationsanlage

2: Pervaporations-Reaktor

3: Messung der Konzentrationsverläufe von Acetbuttersäureethylester (ABEE), Isopropanol und (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) bei Umsatz mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton

4: Messung der Umsatzrate von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

5: Messung der Konzentrationsverläufe von Acetbuttersäureethylester (ABEE), Isopropanol und (S)-5-Hydroxyhexan-säureethylester (HHEE) bei Umsatz mit einer Carbonylreduktase (CPCR) unter Abtrennung des Co-Produktes Aceton

6: Messung der Umsatzrate von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Die in 1 dargestellte Pervaporationsanlage zeigt ein Membranmodul (1) mit zugehöriger Pervaporationsmembran (2). Das zu trennende Stoffgemisch (Feed) (3) wird mittels einer Pumpe (4) in das Membranmodul (1) geleitet, nachdem durch einen Wärmetauscher (5) die gewünschte Zulauftemperatur eingestellt wurde. Im Membranmodul (1) treten die einzelnen Gemisch-Komponenten mit der Pervaporationsmembran (2) in Wechselwirkung und diffundieren in Abhängigkeit ihrer Affinität zum verwendeten Material durch die Pervaporations membran (2), so daß eine Trennung in Retentat (6) und Permeat (7) möglich wird. Auf der Rückseite der Pervaporationsmembran verdampft das Permeat (7) in den durch die Vakuumpumpe (8) evakuierten Raum. Im Kondensator (9) wird die Verdampfungswärme wieder abgeführt und das Permeat (7) rückkondensiert.

Der in 2 dargestellte Pervaporationsreaktor zeigt den Reaktionsreaktor (10) mit externem Membranmodul (1) zur Pervaporation. Der Reaktionsreaktor (10) wird mit den erforderlichen Reaktionskomponenten über eine Zulaufleitung (11) befüllt. Die Durchmischung der Komponenten kann über einen Rührer (12) erfolgen. Die Einstellung der Reaktionstemperatur kann über einen um den Reaktionsreaktor (10) angeordneten Kühlmantel (13) erfolgen. Das zu trennende Gemisch wird über eine Ablaufleitung (14) mit Hilfe einer Pumpe (15) zum Membranmodul (1) geleitet. Dort erfolgt die Trennung in Retentatstrom und Permeatstrom. Der Retentatstrom wird über eine Leitung (16) wieder in den Reaktionsreaktor (10) zurückgeführt. Der Permeatstrom wird über eine zweite Leitung (17) aus dem Membranmodul (1) in den durch die Vakuumpumpe (9) evakuierten Raum abgezogen. Die Verdampfungswärme wird im Kondensator (8) wieder abgeführt und das Permeat (7) wird wieder rückkondensiert.

3 zeigt Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung mit einer Carbonylreduktase (CPCR) von Acetbuttersäureethylester (ABEE) und Isopropanol zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) bzw. Aceton, ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Konzentration [mM]

4 zeigt eine Messung der Ergebnisse der Umsatzrate, symbolisiert durch " ⧠ ", von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Umsatzrate (dimensionslos)

5 zeigt Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung mit einer Carbonylreduktase (CPCR) von Acetbuttersäureethylester (ABEE) und Isopropanol zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) bzw. Aceton mit Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Konzentration [mM]

6 zeigt die Messung der Umsatzrate, symbolisiert durch " ⧠ ", von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexan-säureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Umsatzrate (dimensionslos)

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden. In den Reaktor (10) werden über die Zulaufleitung (11) eine Lösung der Reaktionskomponenten, bestehend aus Ispropanol als Co-Substrat, Acetbuttersäureethylester (ABEE) als Substrat, NADH als Co-Faktor, gelöst in TEA-Puffer mit Dithiothreitol, als Oxidationsschutz eingefüllt. Die Lösung wird mit Hilfe des Temperiermantels (13) auf 35 °C temperiert. Die Reaktion wird durch Zugabe einer definierten Menge von Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis über die Zulaufleitung (11) zu der temperierten Lösung im Reaktor (10) gestartet. Zur besseren Durchmischung kann mit Hilfe eines Rührers (12) eine Umwälzung der Lösung erreicht werden. Die umgesetzte Reaktionslösung wird mittels einer Umwälzpumpe (15), z. B. Schlauchpumpe, in das Membranmodul (1) gepumpt. Hier erfolgt die Abtrennung des Co-Produktes Aceton, welches über die Abzugsleitung (17) aus der Pervaporationsanlage (1) durch einen Wärmetauscher (8) aus der Pervaporationsanlage (1) entfernt wird. Die Pervaporation wird durch Anlegen eines permeatseitigen Druckes < 15 mbar mit Hilfe einer Vakuumpumpe (9) beschleunigt. Die übrigen Reaktionsprodukte, wie z. B. noch nicht umgesetztes Substrat, Co-Substrat, Co-Faktoren, Produkt und Enzym, werden dem Reaktor (10) über eine Leitung (16) aus dem Membranmodul (1) wieder zugeführt. An verschiedenen Stellen der Anlage, z. B. an den Leitungen (14), (16) und (17), können Proben zur analytischen Kontrolle, z. B. mittels Gaschromatographie, der Reaktionsprodukte entnommen werden.

Die erfindungsgemäße Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, in dem zur Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch ein Pervaporationsverfahren eingesetzt wird, ermöglicht eine Co-Faktor abhängige enzymatische Umsetzung, wobei die Co-Faktoren im Reaktionsgleichgewicht durch Regeneration erhalten bleiben und dem System nicht kontinuierlich zugeführt werden müssen. Die Co-Faktor-Regenerierung erfolgt enzymatisch und erfordert ein sogenanntes Co-Substrat. Durch die Entfernung des daraus gebildeten Co-Produktes wird der Reaktionsschritt der Regeneration in Richtung der Co-Produktbildung verschoben und damit die Regeneration des Co-Faktors, die mit diesem Reaktionsschritt verbunden ist, beschleunigt. Die selektive Entfernung des Co-Produktes mittels eines Pervaporationsverfahrens ermöglicht eine kontinuierliche Entfernung der Verbindungen. Das Membranverfahren ermöglicht eine Separation des gewünschten Stoffes, ohne die im Reaktionssystem verbleibenden Verbindungen, insbesondere die Enzyme beispielsweise durch starke mechanische Scherkräfte zu schädigen oder zu inaktivieren. Gegenüber herkömmlichen Verfahren zur selektiven Abtrennung von Stoffen, wie z. B der Destillation, erfolgt die Abtrennung produkt- und enzymschonend. Sauerstoffempfindliche Produkte und Enzyme werden nicht geschädigt. Das Produkt und die Co-Faktoren werden nicht abgereichert. Eine thermodynamische Limitierung sowie eine Co-Produktinhibierung der Enzyme aufgrund ansteigender Co-Produktbildung findet nicht statt. Weiterhin kann dadurch eine Umsatzsteigerung erzielt werden.

Durch das vorteilhafte Verfahren, in dem als Membranverfahren die Pervaporation eingesetzt wird, ist es möglich, auf Grund unterschiedlicher Stofflöslichkeiten und Diffusionsverhalten der jeweiligen Substanzen, diese voneinander zu trennen. Da der Trenneffekt nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip beruht, ist die Porengröße der Membran nicht entscheidend. Es kann nicht zu einem Verstopfen der Membran durch z. B. Proteinanlagerung kommen. Weiterhin ist eine Trennung von Stoffen möglich, die sich anhand ihrer Molekülgröße nicht voneinander unterscheiden. Das Membranmaterial wird je nach Affinität zur einzelnen Gemischkomponente ausgewählt. Zur Trennung von wässrigen Verbindungen aus organischen Gemischen werden hydrophile Membranen eingesetzt, zur Trennung von organischen Verbindungen aus wäßrigen Lösungen werden hydrophobe Membranen, und zur Trennung verschiedener Organika voneinander werden ziel-organophile Membranen eingesetzt. Durch die Auswahl der eingesetzten Membran kann die Trennung der Stoffgemische und damit die Abtrennung des Co-Produktes von den übrigen Reaktionspartnern selektiv gesteuert werden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 2, in der als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole eingesetzt werden, bewirkt, daß diese Verbindungen enzymatisch zu niedrig siedenden Ketonen umgesetzt werden können. Zu den niedrig siedenden Alkoholen können Alkohole mit einem Siedepunkt unter 100 °C gezählt werden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 3, in der als Co-Substrat Isopropanol eingesetzt wird, ermöglicht eine effektive Regeneration der Co-Faktoren durch die Oxidoreduktasen. Das Substrat wird zu Aceton umgesetzt. Es werden keine weiteren Nebenprodukte gebildet, die das Enzym schädigen oder durch das Verfahren nicht entfernt werden können. Die Enzyme besitzen für Isopropanol eine hohe Affinität, so daß das Reaktionsgleichgewicht in Richtung der Co-Produktbildung und damit in eine effektive Co-Faktor-Regenerierung verschoben wird.

Die niedrig siedenden Ketone können gemäß der vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 4, in der als Co-Produkt niedrig siedende Ketone entfernt werden, gut aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden. Zu den niedrig siedenden Ketonen können Verbindungen mit einem Siedepunkt unter 100 °C gezählt werden. Der niedrige Siedepunkt dieser Verbindungen ermöglicht einen Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig schon bei geringen Temperaturen, so daß die Pervaporation schon bei einem Temperaturbereich von 25 bis 30 °C durchgeführt werden kann, so daß auch die Enzyme nicht thermisch geschädigt werden. Bei Einsatz von thermisch stabilen Enzymen kann die Pervaporation auch bei höheren Temperaturen, z. B. bei 60 bis 80 °C durchgeführt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 5, in dem als Co-Produkt Aceton entfernt wird, kann das Co-Produkt spezifisch aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Dadurch, daß ein niedrig siedendes Co-Produkt gebildet wird, kann die Pervaporation bei niedrigen Temperaturen (25 bis 35 °C) durchgeführt werden, wodurch eine Schädigung von beispielsweise temperaturempfindlichen Enzymen verhindert wird.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 6, in dem ein Enzym verwendet wird, welches sowohl das Substrat, als auch das Co-Substrat unter Regenerierung des Co-Faktors umsetzt, ermöglicht eine Vereinfachung des enzymatischen Systems. Zum einen können durch ein zweites Enzym zusätzliche Kosten entstehen. Zum anderen kann das Zweienzymsystem Bedingungen erfordern, die nicht für beide Enzyme gleichermaßen optimal sind, was zu einer Limitierung des ganzen Reaktionssystems führt. Bei Verwendung eines Enzyms für beide Reaktionen treten weniger Nebenreaktionen auf.

Die Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 7, in dem Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen eingesetzt werden, bewirkt, daß mit Hilfe dieser Enzyme Wasserstoff und Elektronen übertragen werden können und somit Co-Faktoren, die Wasserstoff und Elektronen übertragen, regeneriert werden können.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 8, in dem eine Carbonylreduktase eingesetzt wird, wird es möglich Ketoester, wie z. B. Acetbuttersäureethylester (ABEE), aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoacetale enantiomerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydroxysäuren, deren Ester, z. B. (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) und Lactonen zu reduzieren und gleichzeitig den verbrauchten Co-Faktor NAD⁺ zu regenerieren, indem ein niedrig siedender Alkohol, z. B. Isopropanol zu einem niedrig siedenden Keton, z. B. Aceton umgesetzt wird.

In der vorteilhaften Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 9, in dem eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis eingesetzt wird, wird es möglich, ein breites Substratspektrum, wie z. B. Ketoester, aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde, Ketoacetale mit hoher Enantioselektivität und hohen Umsätzen, enzymatisch zu reduzieren. Durch das breite Aktivitätsmaximum des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und bei Temperaturen von 35 °C bis 42 °C wird die technische Anwendung des Verfahrens erleichtert, da die Reaktionsbedingungen relativ breit variiert werden können. Das Enzym kann mit den üblichen biochemischen Methoden aus Candida parapsilosis isoliert und aufgereinigt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 10, in dem Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren eingesetzt werden, können teure wasserstoffübertragende Co-Faktoren, zu denen beispielsweise die Pyridinnukleotide NAD⁺ und NADP⁺ sowie FMN, FAD, Ubichinon, Zellhämine und Liponsäuren gezählt werden, regeneriert werden. Die Regeneration von Pyrididnukleotiden ist zum einen von Bedeu tung, da ihr Einsatz sehr kostenintensiv ist und es zum anderen beispielsweise für NADP⁺ kein kommerziell verfügbares Regenerationssystem gibt. Weiterhin ist die Regeneration von Pyridinnukleotiden als Co-Faktoren von besonderer Bedeutung, da sie für die Produktion vieler wirtschaftlich interessanter pharmazeutischer Produkte eingesetzt werden, wie z. B. Vorläufer für ACE-Inhibitoren (ACE= angiotensine converting enzyme) oder chirale Synthesebausteine für HIV Proteaseinhibitoren.

In der vorteilhaften Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 11, in dem als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ eingesetzt werden, können die Co-Faktoren NAD⁺ und NADP⁺, die für viele enzymatische Reaktionen wichtig sind, regeneriert werden. Da die Enzyme und Ausgangsverbindungen für die Regeneration von NADP⁺ noch sehr teuer sind, ist die Ausführung des Verfahrens nach diesem Anspruch von besonderem Vorteil.

In einer Ausführungsform des Verfahrens, in dem eine Pervaporationsmembran eingesetzt wird, bewirkt eine Trennung von Flüssigkeitsgemischen aufgrund unterschiedlicher Sorption und Diffusion der einzelnen Komponenten des Stoffgemisches. Da die Trennwirkung nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prizip beruht, können auch Stoffe mit gleichem Molekulargewicht selektiv voneinander getrennt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 12, in dem eine porenfreie, polymere Membran eingesetzt wird, absorbieren Substanzen, die getrennt werden sollen, an die polymere Trennschicht der Membran und diffundieren durch sie hindurch. Die Eigenschaft der Polymerschicht bestimmt die Selektivität der Membran. Die Porengröße der Trennschicht hat dabei nur eine untergeordnete Bedeutung für die Trennwirkung.

Durch die Ausgestaltung des Verfahrens bei dem eine Komposit-Membran verwendet wird, ist es möglich, die Membran an die jeweiligen Anforderungen an Selektivität, Durchfluß des Permeats und Stabilität anzupassen. Das Material und die Verarbeitung können die Trennleistung beeinflussen. Weiterhin ist eine getrennte Optimierung der einzelnen Schichten möglich.

Durch die Ausgestaltung des Verfahrens bei dem eine Membran eingesetzt wird, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, kann durch die selektive Schicht die Trennung des Gemisches erzielt werden. Durch wahlweise Verwendung einer Stützschicht und einer Vliesschicht kann die Stabilität der Membran den jeweiligen Bedingungen angepaßt werden.

Durch die Ausgestaltung des Verfahrens bei dem für die selektive Trennschicht Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) oder auch Polydimethylsiloxan (PDMS) mit Zeolithe eingesetzt wird, und für die Stützschicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) verwendet wird sowie als Vliesschicht Polyethylen (PE) eingesetzt wird, bewirkt, daß Organika, wie beispielsweise Aceton, aus wäßrigen Lösungen getrennt werden können. Zur Unterstützung der Stabilität wird eine poröse Stützschicht, z. B. aus Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI), eingesetzt. Eine weitere Stabilitätserhöhung erfolgt durch die Vliesschicht, die beispielsweise aus Polyethylen (PE) bestehen kann.

In der Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 13, in dem eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften eingesetzt wird, kann durch die Auswahl geeigneter Membranmaterialien die Selektionseigenschaft an die Substanzen, die selektiv entfernt werden sollen, angepaßt werden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14, in dem das Permeat durch Anlegen eines Vakuums aus dem Reaktionsraum entfernt wird, bewirkt, daß die Diffusion der Substanzen durch die Pervaporationsmembran beschleunigt wird. Bei der Pervaporation ist die Triebkraft für den transmembranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Potentials, der durch eine Aktivitätsdifferenz der permeierenden Komponente zu beiden Seiten der Membran ausgeprägt wird. Durch Anlegen des Vakuums auf der Permeatseite wird der Gradient aufrecht erhalten. Das Vakuum kann beispielsweise durch den Einsatz einer Vakuumpumpe erzeugt werden.

In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 15, in dem das zu trennende Stoffgemisch dem Reaktionsraum kontinuierlich zugeführt und das Retentat sowie das Permeat aus dem Reaktionsraum kontinuierlich abgeführt wird, wird eine kontinuierliche Prozeßführung möglich. Dadurch können Substrat und Produktkonzentration auf der gewünschten Konzentration gehalten werden.

Es ergibt sich keine Zeit- und Ortsabhängigkeit der Konzentrationen. Durch Variation von Verweilzeit und Katalysatorkonzentration können unterschiedliche Substrat- und Produktkonzentrationen gesteuert werden. Das Membranmodul mit der Pervaporationsmembran kann dabei extern angeordnet sein oder sich intern z. B. im Boden des Reaktionsreaktors oder als Säule im Zentrum des Reaktors befinden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 16, in dem die Kontrolle der Produktbildung bzw. Co-Produktbildung kontinuierlich analytisch überprüft wird, ermöglicht es, Substratverbrauch sowie Produkt und Co-Produktbildung während der enzymatischen Reaktion kontinuierlich zu überprüfen und dementsprechend durch Zugabe von Substrat/Co-Substrat bzw. Abfuhr von Produkt/Co-Produkt einen Einfluß auf die Reaktion zu nehmen, um die Effektivität des Prozesses zu optimieren. Mit Hilfe der On-line Analytik, wie z. B. HPLC, NMR, GC, können die jeweiligen Substanzen während der gesamten Reaktion überprüft werden und auf Störungen kann direkt reagiert werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 17, in dem chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lactone, enzymatisch sythetisiert werden, ist es möglich, Ketoester, aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoacetale enantiomerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydroxysäuren, deren Estern und Lactonen unter gleichzeitiger Co-Faktor-Regenerierung mit aus Organismen isolierten Enzymen umzusetzen. Die Verwendung isolierter Enzy me gegenüber der Umsetzung mit ganzen Organismen bietet eine höhere Reproduzierbarkeit und häufig bessere Selektivität, da z. B. Nebenreaktionen durch Isoenzyme ausbleiben. Eine rein chemische Synthese enantiomerenreiner Produkte ist z. T. unmöglich oder aber mit einem sehr hohen technischen Aufwand verbunden.

Die erfindungsgemäße Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 18, die zur Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch eine Membran enthält, ermöglicht eine Co-Faktor abhängige enzymatische Umsetzung, wobei die Co-Faktoren im Reaktionsgleichgewicht durch Regeneration erhalten bleiben, und dem System nicht kontinuierlich zugeführt werden müssen. Die Co-Faktor-Regenerierung erfolgt enzymatisch und erfordert ein Co-Substrat. Durch die Entfernung des daraus gebildeten Co-Produktes wird der Reaktionsschritt der Regeneration in Richtung der Co-Produktbildung verschoben und damit die Regeneration des Co-Faktors, die mit diesem Reaktionsschritt verbunden ist, beschleunigt. Die selektive Entfernung des Co-Produktes mittels einer Membran ermöglicht eine kontinuierliche Entfernung der Verbindungen. Die Membran ermöglicht eine Separation des gewünschten Stoffes, ohne die im Reaktionssystem verbleibenden Verbindungen, insbesondere die Enzyme, beispielsweise durch starke mechanische Scherkräfte zu schädigen oder zu inaktivieren. Das Produkt und die Co-Faktoren werden nicht abgereichert. Gegenüber herkömmlichen Abtrennungsvorrichtungen, wie z. B. Destillationsanlagen, wird eine Schädigung sauerstoffempfindlicher Enzyme und Produkte verhindert. Eine thermodynamische Limitierung sowie Co-Produktinhibierung der Enzyme aufgrund ansteigender Co-Produktbildung findet nicht statt. Weiterhin kann dadurch eine Umsatzsteigerung erzielt werden.

Die Ausführung der Vorrichtung, die eine Pervaporationsmembran enthält, bewirkt eine Trennung von Flüssigkeitsgemischen aufgrund unterschiedlicher Sorption und Diffusion der einzelnen Komponenten des Stoffgemisches. Da die Trennwirkung nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip beruht, können auch Stoffe mit gleichem Molekulargewicht selektiv voneinander getrennt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung, die eine porenfreie, polymere Membran enthält, absorbieren Substanzen, die getrennt werden sollen, an die polymere Trennschicht der Membran und diffundieren durch sie hindurch. Die Eigenschaft der Polymerschicht bestimmt die Selektivität der Membran. Die Porengröße der Trennschicht hat dabei nur eine untergeordnete Bedeutung für die Trennwirkung.

Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung, die eine Komposit-Membran enthält, ist es möglich, die Membran an die jeweiligen Anforderungen an Selektivität, Durchfluß des Permeats und Stabilität anzupassen. Das Material und die Verarbeitung können die Trennleistung beeinflussen. Weiterhin ist eine getrennte Optimierung der einzelnen Schichten möglich.

In der Ausgestaltung der Vorrichtung, die eine Membran enthält, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, kann durch die selektive Schicht die Trennung des Gemisches erzielt werden. Optional enthält die Membran eine Stützschicht und eine Vliesschicht, um die Stabilität der Membran den jeweiligen Bedingungen anzupassen.

Die Ausgestaltung der Vorrichtung, die als selektive Trennschicht Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) oder auch Polydimethylsiloxan (PDMS) mit Zeolithe umfaßt, und als Stützschicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) sowie als Vliesschicht Polyethylen (PE) umfaßt, bewirkt, daß Organika, wie beispielsweise Aceton, aus wäßrigen Lösungen getrennt werden können. Zur Unterstützung der Stabilität enthält die poröse Stützschicht z. B. Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI). Eine weitere Stabilitätserhöhung erfolgt durch die Vliesschicht, die beispielsweise aus Polyethylen (PE) bestehen kann.

In der Ausgestaltung der Vorrichtung, die eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften umfaßt, kann durch die Auswahl geeigneter Membranmaterialien die Selektionseigenschaft an die Substanzen, die selektiv entfernt werden sollen, angepaßt werden.

Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 20, die als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole umfaßt, bewirkt, daß diese Verbindungen enzymatisch zu niedrig siedenden Ketonen umgesetzt werden können. Zu den niedrig siedenden Alkoholen können Alkohole mit einem Siedepunkt unter 100 °C gezählt werden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 21, die als Co-Substrat Isopropanol umfaßt, ermöglicht eine effektive Regeneration der Co-Faktoren durch die Oxidoreduktasen. Das Substrat wird zu Aceton umgesetzt. Es werden keine weiteren Nebenprodukte gebildet, die das Enzym schädigen oder durch die Vorrichtung nicht entfernt werden können. Die Enzyme besitzen für Isopropanol eine hohe Affinität, so daß das Reaktionsgleichgewicht in Richtung der Co-Produktbildung und damit in eine effektive Co-Faktor-Regenerierung verschoben wird.

Die niedrig siedenden Ketone können gemäß der vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 22, die als Co-Produkt niedrig siedende Ketone umfaßt, gut aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden. Zu den niedrig siedenden Ketonen können Verbindungen mit einem Siedepunkt unter 100 °C gezählt werden. Der niedrige Siedepunkt dieser Verbindungen ermöglicht einen Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig schon bei geringen Temperaturen, so daß die Pervaporation schon bei einem Temperaturbereich von 25 bis 30 °C durchgeführt werden kann, so daß auch die Enzyme nicht thermisch geschädigt werden. Bei Einsatz von thermisch stabilen Enzymen kann die Pervaporation auch bei höheren Temperaturen, z. B. bei 60 bis 80 °C durchgeführt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 23, die als Co-Produkt Aceton umfaßt, kann das Co-Produkt spezifisch aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Dadurch, daß ein niedrig siedendes Co-Produkt gebildet wird, kann die Pervaporation bei niedrigen Temperaturen (25 bis 35 °C) durchgeführt werden, wodurch eine Schädigung von beispielsweise temperaturempfindlichen Enzymen verhindert wird.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 24, die ein Enzym umfaßt, welches sowohl das Substrat als auch das Co-Substrat unter Regenerierung des Co-Faktors umsetzt, ermöglicht eine Vereinfachung des enzymatischen Systems. Zum einen können durch ein zweites Enzym zusätzliche Kosten entstehen. Zum anderen kann das Zweienzymsystem Bedingungen erfordern, die nicht für beide Enzyme gleichermaßen optimal sind, was zu einer Limitierung des ganzen Systems führt. Umfaßt die Vorrichtung nur ein Enzym für beide Reaktionen, treten weniger Nebenreaktionen auf.

Die Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 25, die Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen umfaßt, bewirkt, daß mit Hilfe dieser Enzyme Wasserstoff und Elektronen übertragen werden können und somit Co-Faktoren, die Wasserstoff und Elektronen übertragen, regeneriert werden können.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 26, die eine Carbonylreduktase umfaßt, wird es möglich, Ketoester, wie z. B. Acetbuttersäureethylester (ABEE), aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoacetale enantiomerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydroxysäuren, deren Ester, z. B. (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) und Lactonen, zu reduzieren und gleichzeitig den verbrauchten Co-Faktor NAD⁺ zu regenerieren, indem ein niedrig siedender Alkohol, z. B. Isopropanol, zu einem niedrig siedenden Keton, z. B. Aceton, umgesetzt wird.

In der vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 27, die eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis umfaßt, wird es möglich, ein breites Substratspektrum, wie z. B. Ketoester, aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde, Ketoacetale mit hoher Enantioselektivität und hohen Umsätzen, enzymatisch zu reduzieren. Durch das breite Aktivitätsmaximum des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und bei Temperaturen von 35 °C bis 42 °C wird die technische Anwendung der Vorrichtung erleichtert, da die Reaktionsbedingungen relativ breit variiert werden können. Das Enzym kann mit den üblichen biochemischen Methoden aus Candida parapsilosis isoliert und aufgereinigt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 28, die Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren umfaßt, können teure wasserstoffübertragende Co-Faktoren zu denen beispielsweise die Pyridinnukleotide NAD⁺ und NADP⁺ sowie FMN, FAD, Ubichinon, Zellhämine und Liponsäuren gezählt werden, regeneriert werden. Die Regeneration von Pyridinnukleotiden ist zum einen von Bedeutung, da ihr Einsatz sehr kostenintensiv ist und es zum anderen bei spielsweise für NADP⁺ kein kommerziell verfügbares Regenerationssystem gibt. Weiterhin ist die Regeneration von Pyridinnukleotiden als Co-Faktoren von besonderer Bedeutung, da sie für die Produktion vieler wirtschaftlich interessanter pharmazeutischer Produkte eingesetzt werden, wie z. B. Vorläufer für ACE-Inhibitoren (ACE= angiotensine converting enzyme) oder chirale Synthesebausteine für HIV-Proteaseinhibitoren.

In der vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 29, die als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ umfaßt, können die Co-Faktoren NAD⁺ und NADP⁺, die für viele enzymatische Reaktionen wichtig sind, regeneriert werden. Da die Enzyme und Ausgangsverbindungen für die Regeneration von NADP⁺ sehr teuer sind, ist die Ausführung der Vorrichtung nach diesem Anspruch von besonderem Vorteil.

Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 30, die Mittel umfaßt, die das Permeat durch Anlegen eines Vakuums aus dem Reaktionsraum entfernen, bewirkt, daß die Diffusion der Substanzen durch die Pervaporationsmembran beschleunigt wird. Bei der Pervaporation ist die Triebkraft für den transmembranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Potentials, der durch eine Aktivitätsdifferenz der permeierenden Komponente zu beiden Seiten der Membran ausgeprägt wird. Durch Anlegen des Vakuums auf der Permeatseite wird der Gradient aufrecht erhalten. Das Vakuum kann beispielsweise durch den Einsatz einer Vakuumpumpe erzeugt werden.

In einer vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 31, die Mittel zur kontinuierlichen Zufuhr des zu trennenden Stoffgemisches sowie Mittel zur kontinuierlichen Entfernung des Retentats und Permeats aus dem Reaktionsraum umfaßt, wird eine kontinuierliche Prozeßführung möglich. Dadurch können Substrat- und Produktkonzentration in dem gewünschten Konzentrationsbereich gehalten werden. Es ergibt sich keine Zeit- und Ortsabhängigkeit der Konzentrationen. Durch Variation von Verweilzeit und Katalysatorkonzentration können unterschiedliche Substrat- und Produktkonzentrationen gesteuert werden. Das Pervaporationsmodul mit der Pervaporationsmembran kann dabei extern angeordnet sein oder sich intern z. B. im Boden des Reaktionsreaktors oder als Säule im Zentrum des Reaktors befinden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 32, welche Mittel umfaßt, welche die Produktbildung bzw. Co-Produktbildung kontinuierlich analytisch überprüfen, wird es möglich, Substratverbrauch sowie Produkt und Co-Produktbildung während der enzymatischen Reaktion kontinuierlich zu überprüfen und dementsprechend durch Zugabe von Substrat/Co-Substrat bzw. Abfuhr von Produkt/Co-Produkt einen Einfluß auf die Reaktion zu nehmen, um die Effektivität des Prozesses zu optimieren. Mit Hilfe der On-line Analytik, wie z. B. HPLC, NMR, GC, können die jeweiligen Substanzen während der gesamten Reaktion überprüft und auf Störungen kann direkt reagiert werden.

Ausführungsbeispiele:
Um die Gleichgewichtslage des Systems zu untersuchen, wird ein ansatzweises Verfahren, ohne Abtrennung des bei der Co-Faktor-Regenerierung entstehenden Acetons, durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Versuchs dienen als Grundlage für einen Vergleich mit den Ergebnissen analoger Versuche, bei denen das Aceton durch Pervaporation abgetrennt wird.
1.) Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) mit substratgekoppelter Co-Faktor-Regenerierung durch eine Carbonylreduktase (CPRC) ohne Abtrennung des Co-Produkts Aceton
Eine Lösung aus 130 mM Isopropanol, welches als Co-Substrat dient, 30 mM Acetbuttersäureethylester (ABEE), welches als Substrat dient, 0,2 mM NADH als Co-Faktor, 1 mM Dithiothreitol als Oxidationsschutz in 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH = 7,8), wird auf 35 °C temperiert. Es werden 0,15 U/ml Carbonylreduktase (CPRC) aus Candida parapsilosis zugegeben und leicht gerührt. Der Verlauf der Konzentrationen und des Umsatzes von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE), bzw. des Umsatzes von Isopropanol zu Aceton, wird gaschromatographisch verfolgt. Die Ansatzgröße beträgt 2 ml. Die 3 und 4 zeigen die Konzentrationsverläufe sowie den Umsatz der Reaktion.
Es wird ein Endumsatz von 75 % erreicht. Das Ende der Reaktion ist aufgrund einer thermodynamischen Limitierung der Co-Faktor-Regenerierung bedingt und nicht etwa durch Enzymdesaktivierung aufgrund einer ansteigenden Acetonkonzentration.
2.) Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) mit substratgekoppelter Co-Faktor-Regenerierung durch eine Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produkts Aceton
Um einen Einfluß der Abtrennung des Co-Produktes Aceton auf die Gleichgewichtslage der enzymatischen Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu erkennen, wird die enzymatische Umsetzung im ansatzweisen Verfahren in Kombination mit Abtrennung des Acetons durch Pervaporation durchgeführt.
Vor dem eigentlichen Pervaporationsexperiment muß die neu eingesetzte Membran mindestens zwei Stunden unter Pervaporationsbedingungen konditioniert werden. Die Feedzusammensetzung wird dafür entsprechend den Konzentrationen der späteren Versuchslösung gewählt. Die Membran und der Pumpenschlauch werden durch Zugabe von 30 mg BSA während der Konditionierung vorbelegt. Nach der Konditionierung wird das Feedgemisch abgelassen und die Anlage mit frischer Feedlösung gespült. Dies ist wichtig, um Verdünnungseffekte durch in der Anlage verbliebene, während der Konditionierung abgereicherte Feedlösung vorzubeugen.
Für das Pervaporationsexperiment wird die Feedpumpe auf einen Volumenstrom von 0,5 l/min eingestellt. Die Feedtemperatur beträgt 35 °C und der permeatseitige Unterdruck ist < 15 mbar. Alle kondensierbaren Anteile des Permeatdampfes werden in einer Kühlfalle, die hinter dem Pervaporationsmodul angeordnet ist, bei einer Temperatur von -196 °C ausgefroren.
Zur Durchführung der Permeatmessung wird die gewogene Kühlfalle in die permeatseitige Leitungsführung eingesetzt und das Absperrventil zur Membran geöffnet. Nach einer festgesetzten Versuchszeit wird die Kühlfalle mit dem ausgefrorenen Permeat entnommen und die permeatseitige Leitungsführung durch eine neue Kühlfalle verschlossen. Durch erneutes Wiegen der aufgetauten Kühlfalle wird die Masse des Permeats ermittelt. Für die gaschromatographische Untersuchung wird eine Probe des Permeats im Verhältnis 1:50 verdünnt.
Zur Korrelation der Partialflüsse mit der entsprechenden Feedkonzentration wird vor und nach der Messung eine Feedprobe genommen und ebenfalls gaschromatographisch analysiert. Die Feedkonzentration ergibt sich als Mittelwert beider Konzentrationen. Nach festgesetzten Zeitintervallen, in denen die Anlage weiter betrieben wird und sich die Feedkonzentration weiter verringert, werden weitere Messungen vorgenommen.
Die Versuche werden in dem in 2 beschriebenen Pervaporationsreaktor durchgeführt. Die verwendete PDMS-Membran wird, wie oben beschrieben, mit einer Lösung aus 100 mM Isopropanol als Co-Substrat, 30 mM Acetbuttersäureethylester (ABEE) als Substrat, 1 mM Dithiothreitol als Oxidationsschutz und 30 mg BSA in 100 mM TEA-Puffer (pH = 7,8) zwei Stunden unter Pervaporationsbedingungen konditioniert.
Nach dem Spülen der Anlage wird eine Lösung von 100 mM Isopropanol als Co-Substrat, 30 mM Acetbuttersäure ethylester (ABEE), 0,2 mM NADH als Co-Faktor, 1 mM Dithiothreitol als Oxidationsschutz in 100 mM TEA-Puffer (pH = 7,8) in den Reaktionsraum eingefüllt und auf 35 °C temperiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 0,15 U/ml Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis gestartet. Die Leistung der Umwälzpumpe wird auf einen Volumenstrom von 0,5 l/min eingestellt. Der permeatseitige Druck ist < 15 mbar. Die Umsatzkontrolle wird gaschromtographisch durchgeführt. Um einen Verschluß der Kühlfalle durch ausgefrorenes Permeat zu vermeiden, wird die Kühlfalle alle 60 min gewechselt.
Die Ergebnisse der enzymatischen Ketonreduktion mit Acetonabtrennung zeigen die 5 und 6.
Wie die Konzentrationsverläufe in 5 zeigen, ist durch Kombination eines Bioreaktors mit einer Pervaporationstrennstufe ein Austrag des bei der substratgekoppelten Co-Faktorregenerierung gebildeten Acetons möglich. Die Acetonkonzentration kann während der gesamten Reaktionszeit auf niedrigem Niveau (unter 8 mM) gehalten werden. Das vorübergehende Ansteigen der Acetonkonzentration kann durch die hohe Reaktionsgeschwindigkeit zu Beginn der Reaktion erklärt werden. Die Acetonbildung kann bei hoher Reaktionsgeschwindigkeit nicht durch den transmembranen Acetonpartialfluß kompensiert werden. Gegen Ende der Reaktion verlangsamt sich die Reaktionsgeschwindigkeit. Der Acetonaustrag überwiegt die Acetonbildung und die Konzentration sinkt wieder ab. Dadurch bleibt die thermodynamische Triebkraft für die Co-Faktorregenerierung erhalten und die Limitierung bleibt aus. Der damit verbundene Anstieg der NADH-Konzentration erhöht wiederum die Triebkraft der Ketonreduktion, was sich durch eine Umsatzsteigerung bemerkbar macht. Im Vergleich zu einem ansatzweisen Verfahren ohne Acetonabtrennung ist eine Umsatzsteigerung von 75 % auf über 95 % möglich. Eine Produktabreicherung durch Pervaporation findet nicht statt.

Claims

Verfahren zur enzymatischen Regeneration von Co-Faktoren in Anwesenheit eines Co-Substrates, bei dem zur selektiven Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch die Pervaporation eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran eingesetzt wird, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, wobei für die selektive Trennschicht Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) eingesetzt wird, für die Stützschicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) verwendet wird und für die Vliesschicht Polyethylen (PE) eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Co-Substrat Isopropanol eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Co-Produkt niedrig siedende Ketone entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Co-Produkt Aceton entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym verwendet wird, welches sowohl das Substrat als auch das Co-Substrat unter Regenerierung des Co-Faktors umsetzt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carbonylreduktase eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine porenfreie, polymere Membran eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Permeat durch Anlegen eines Vakuums aus dem Reaktionsraum entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das zu trennende Stoffgemisch dem Reaktionsraum kontinuierlich zugeführt wird und das Retentat sowie das Permeat aus dem Reaktionsraum kontinuierlich abgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontrolle der Produktbildung bzw. Co-Produktbildung kontinuierlich analytisch geprüft und gesteuert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lactone, enzymatisch synthetisiert werden.
Vorrichtung zur enzymatischen Regeneration von Co-Faktoren in Anwesenheit eines Co-Substrates, umfassend eine Pervaporationsmembran zum selektiven Entfernen des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Pervaporationsmembran umfaßt, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, wobei sie eine selektive Trennschicht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) umfaßt, eine Stützschicht aus Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) sowie eine Vliesschicht aus Polyethylen (PE) umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften umfaßt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Co-Substrat Isopropanol umfaßt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Co-Produkt niedrig siedende Ketone umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Co-Produkt Aceton umfaßt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Enzym enthält, welches sowohl das Substrat als auch das Co-Substrat unter Co-Faktor-Regenerierung umsetzt.
Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Enzym aus der Klasse der Oxidoreduktasen enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Carbonylreduktase enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis enthält.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ enthält.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zum Anlegen eines Vakuums an den Reaktionsraum enthält.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zur kontinuierlichen Zufuhr des zu trennenden Stoffgemisches sowie Mittel zur kontinuierlichen Entfernung des Retentats und Permeats aus dem Reaktionsraum umfaßt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zur kontinuierlichen Analyse und Steuerung der Produkt- bzw. Co-Produktbildung umfaßt.