DE10060602A1

DE10060602A1 - Verfahren und Vorrichtung zur enzymatischen Co-Faktor-Regenerierung

Info

Publication number: DE10060602A1
Application number: DE2000160602
Authority: DE
Inventors: Thomas Stillger; Murillo Villela Filho; Andreas Liese; Christian Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2000-12-05
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2020-12-06
Also published as: DE10060602B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur enzymatischen Co-Faktorregenerierung. DOLLAR A Für die Umsetzung einiger enzymatischer Reaktionen ist die Anwesenheit von Co-Faktoren, wie z. B. NAD·+· notwendig. Diese Co-Faktoren müssen nach Ablauf der Reaktion dem System zur weiteren Aufrechterhaltung der enzymatischen Umsetzung wieder zugesetzt werden. Da diese Co-Faktoren z. T. sehr teuer sind, ist ein Regenerationssystem von Vorteil. Die nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Regeneration von Co-Faktoren basieren auf enzymatischen Reaktionen, die zwar die Co-Faktor-Regenrationen bewirken, aber durch Nebenproduktbildung zu einer Beeinträchtigung der eigentlichen Enzymreaktion führen können. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung wird es möglich, eine enzymatische C-Faktorregenerierung durchzuführen, ohne eine Anreicherung von schädigenden Nebenprodukten und eine negative Beeinflussung der eigentlichen Enzymreaktion zu bewirken. Dabei wird das Co-Produkt, welches in der enzymatischen Regenarationsreaktion gebildet wird, aus dem Reaktionsgemisch durch ein Membranverfahren entfernt und gleichzeitig eine Umsatzsteigerung durch Verschieben des Reaktionsgleichgewichts erreicht.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vor richtung zur enzymatischen Co-Faktor-Regenerierung.

Chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lacto ne stellen wertvolle Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika, Inhibitoren und Pheromonen dar [AKITA, H. ET AL (1984), Chemical. Pharm. Bull. (Tokio), 32: 1242-1243; GEORG, G. 1., KANT, J. (1988), J. Organ. Chem., 53: 692-695]. Zugänglich sind diese Substanzen u. a. durch eine biokatalytische Reduktion prochiraler Aus gangsverbindungen, wobei Oxidoreduktasen zum Einsatz kommen. Zur enzymatischen Ketonreduktion wurden bereits verschiedene Oxidoreduktasen präparativ eingesetzt. Zu ihnen gehören beispielsweise die (R)-spezifischen NADPH-abhängigen Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacil lus kefir und Lactobacillus brevis sowie die (S)-spe zifischen und NADH-abhängigen Enzyme aus Candida boidinii, Rhodococcus erythropolis und Candida parapsilosis.

Oxidoreduktasen katalysieren die Übertragung von Was serstoff bzw. Elektronen. Zu den Oxidoreduktasen werden beispielsweise die Alkoholdehydrogenase, die Glukose oxidase, die Katalase, die Glutamatdehydrogenase, die Fumaratreduktase sowie die Formiatdehydrogenase ge zählt. Oxidoreduktasen benötigen zur Katalyse von Redoxreaktionen zusätzliche Stoffe, die die Reaktionen erst ermöglichen. Diese Stoffe werden Co-Faktoren (CoEnzyme) genannt und sind komplexe organische Molekü le. Die Kosten der Co-Faktoren für Alkoholdehydrogena sen (NAD⁺: 45,00 DM/g; NADP⁺: 459,00 DM/g; NADH: 167,00 DM/g; NADPH: 1492,00 DM/g) machen deutlich, daß bei präparativen, enzymatischen Reaktionen der stöchio metrische Einsatz von Co-Faktoren aus ökonomischen Gründen nicht sinnvoll ist. Nicht nur für die Kosten entwicklung eines enzymatischen Verfahrens ist es von Bedeutung, den Co-Faktor in geringen Mengen kombiniert mit einer effizienten Co-Faktor-Regenerierung einzuset zen. Auch die Produktaufarbeitung wird durch geringe Co-Faktormengen vereinfacht.

Nach dem Stand der Technik sind u. a. enzymatische Methoden der Co-Faktor-Regenerierung bekannt (LIESE, A. ET AL (2000), Industrial Biotrasformations, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim). Die enzymatische Co-Faktor- Regenerierung kann enzymgekoppelt oder substratgekop pelt erfolgen.

Bei der enzymgekoppelten Co-Faktor-Regenerierung wird die Regenerierung des Co-Faktors durch ein zweites Enzym (Enzym 2) katalysiert [WANDREY, C. ET AL, (1981), Biotech. Bioeng., 23: 2789-2802]. Dabei kommt meistens die Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus cereus [WONG, C. H. ET AL (1985), Jour. Amer. Chem. Soc., 107: 4028-4031] oder die Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii zum Einsatz. Für die Regenerierungsre aktion wird ein zweites Substrat benötigt, welches durch das Enzym 2 unter Regenerierung des Co-Faktors zu einem zweiten Produkt umgesetzt wird. Die enzymgekoppelte Methode der Co-Faktor-Regenerierung zeigt folgen des Reaktionsschema:

Bei der substratgekoppelten Co-Faktor-Regenerierung wird sowohl die eigentliche Produktionsreaktion als auch die Co-Faktor-Regenerierung durch ein und dasselbe Enzym katalysiert [UHLENBROCK, K. (1994), Dissertation Rhein.-Friedr.-Wilh.-Univ. Bonn]. Das Substrat für die Co-Faktor-Regenerierung wird auch als Co-Substrat be zeichnet. Das daraus gebildete Produkt dementsprechend als Co-Produkt. Aus thermodynamischen Gründen muß die Triebkraft der Regenerierungsreaktion erhöht werden, um eine effiziente Co-Faktor-Regenerierung zu gewährleis ten. Eine Möglichkeit dazu ist der Einsatz hoher Kon zentrationen an Co-Substrat [PETERS, J. ET AL (1993c), Tetrahed. Asymm., 4 (7): 1683-1692]. Weiterhin führt die Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch zu einer Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Co- Produktbildung und damit verbunden zu einer erhöhten Co-Faktor-Regenerierung. Die substratgekoppelte Methode der Co-Faktor-Regenerierung zeigt folgendes Reaktions schema:

Für die enzymgekoppelte Co-Faktor-Regenerierung kann beispielhaft das System aus der Carbonylreduktase (CPCR) aus Candida parapsilosis und einer Formiatde hydrogenase (FDH) aus Candida boidinii angegeben wer den. Die Enzyme können dabei in frei gelöster Form oder auch in immobilisierter Form, z. B. matrixeingehüllt oder trägergebunden, eingesetzt werden. Die Carbonylre duktase (CPCR) setzt unter Oxidation von NADH und H⁺ Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexan säureethylester (HHEE) um. Die Formiatdehydrogenase (FDH) setzt unter Reduktion des NAD⁺ Formiats zu CO₂ um. Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt dabei ein deutig auf der Seite des CO₂. Nachteilig wirkt sich in einer Nebenreaktion die Reduktion des Formiats durch die Carbonylreduktase (CPCR) zu Formaldehyd aus. Eine Desaktivierung des Enzyms und nichtquantitative Umsätze sind die Folge [RISSOM, S. (1999), Diss. Rhein.-Friedr.- Wilh.-Univ., Bonn].

Alternativ dazu ist die Co-Faktor-Regenerierung durch Verwendung eines zweiten Substrates für dasselbe Enzym möglich. Der Einsatz eines zweiten Enzyms entfällt so mit. Co-Substrat ist hier Isopropanol, das durch die Carbonylreduktase (CPCR) zu Aceton oxidiert wird. Die dabei freiwerdenden Reduktionsäquivalente dienen zur Regenerierung des NAD⁺.

Aufgrund der Thermodynamik muß die Triebkraft der Rege nerierungsreaktion erhöht werden. Eine im Verlaufe der Reaktion ansteigende Acetonkonzentration begünstigt im Sinne einer Gleichgewichtseinstellung die Rückreaktion: Aceton wird unter NADH-Verbrauch wieder zu Isopropanol reduziert. Die Anreicherung des Co-Produkts im Reakti onsgemisch führt zu einer Verschiebung der Gleichge wichtseinstellung und limitiert damit den Umsatz. Daher ist für die integrierte Co-Faktor-Regenerierung die Ab trennung des Acetons aus dem Reaktionsgemisch nötig. Die Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsge misch über herkömmliche Verfahren, z. B. Destillation, kann aufgrund thermischer oder mechanischer Belastung zur Inaktivierung der Enzyme führen. Weiterhin ist eine Abtrennung von Co-Produkten aus einem Gemisch von Ver bindungen mit ähnlichem Siedepunkt bei der Destillation nicht möglich. Verbindungen ähnlicher Molekülgröße oder ähnlicher chemisch-physikalischer Eigenschaften können mit Hilfe eines Membrantrennverfahrens, basierend auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip, ebenfalls nur schwer von einander getrennt werden.

Besonders interessant ist die substratgekoppelte Co- Faktor-Regenerierung für NADPH-abhängige Enzyme, da hier derzeit keine enzymgekoppelte Co-Faktor-Regene rierung durch das System FDH/Formiat kommerziell ver fügbar ist.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur enzymkatalysierten Co-Faktor- Regenerierung für Oxidoreduktasen zu schaffen, mit denen eine enzymschonende sowie auch die übrigen Reak tionspartner schonende, effektive Abtrennung des Co- Produktes aus dem Reaktionsgemisch möglich wird, um dadurch eine hohe Umsatzrate zu ermöglichen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des An spruchs 23 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeich nenden Teil des Anspruchs 23 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung ist es nunmehr möglich, enzymatische Reaktionen, die Co-Faktoren verbrauchen, wirtschaftlicher zu gestalten, indem eine kostenintensive Co-Faktorzugabe durch die enzymatische Regenerierung entfällt. Weiterhin wird durch die Entfernung von bestimmten Substanzen, insbe sondere Co-Produkten, aus dem Reaktionsgleichgewicht eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichts in Rich tung der Produktbildung und folglich eine Umsatzsteige rung erreicht. Durch die Entfernung von Co-Produkten wird zum einen die Produktaufarbeitung erleichtert und zum anderen eine Beeinflussung des Enzyms oder des ge samten Reaktionsprozesses durch die gebildeten Co- Produkte vermindert. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Vorrichtung ermöglicht eine im Sinne eines Hybridprozesses bzw. einer Hybridvorrichtung enzymati sche Reaktion und die Abtrennung des bei der Co-Faktor- Regenerierung entstehenden Co-Produktes. Ein Hybridpro zeß ist nach Lipnizki dadurch definiert, daß in einer Prozeßanordnung verschiedene Prozeßeinheiten integriert und optimiert sind [LIPNIZKI, F. ET AL (1998), Chem. Ing. Tech., 70: 1587-1595], d. h. neben einer Prozeßeinheit zur enzymatischen Umsetzung ist eine weitere Prozeßein heit zur selektiven Abtrennung von Substanzen enthal ten. Letztere kann beispielsweise durch ein Membranver fahren erfolgen.

Hauptmerkmal aller Membranverfahren ist die Membran selbst. Als Membran werden natürlich oder künstlich hergestellte flächige Gebilde, die fluide Phasen oder auch Volumina einer Phase mit unterschiedlicher Zusam mensetzung von einander zu trennen imstande sind und deren Fähigkeit darin besteht, den Stofftransport zwi schen ihnen zu ermöglichen, bezeichnet. Beim Passieren der Membran trennt sich das zu trennende Komponentenge misch (Feed) in Retentat, das die Membran nicht pas siert, und Permeat. Die Trennung beruht darauf, daß die Membran dem Durchtritt der einzelnen Stoffe unter schiedlichen Widerstand entgegensetzt oder auf die Kom ponenten unterschiedliche Triebkräfte wirken. Hinsicht lich des Trennmechanismus lassen sich drei ideale Grenzfälle unterscheiden, deren Übergänge fließend sind. Die neutrale Porenmembran trennt nach dem Größen- Ausschluß-Prinzip, wobei im günstigsten Fall nur die Porengröße und nicht das Membranmaterial Einfluß auf die Trennung hat. Hier kommt es zu einer Anreicherung von großen Molekülen im Retentat.

Im Gegensatz dazu bestimmen bei Löslichkeitsmembranen das Zusammenwirken von Löslichkeit eines Stoffes im Polymermaterial und nachfolgender Diffusion den Trenn effekt. Wenn sich die Löslichkeiten ausreichend unter scheiden, können gleich große Moleküle oder sogar größere Moleküle von kleineren abgetrennt werden. Po renmembranen und Löslichkeitsmembranen können elektri sche Ladungen tragen und werden dann als Ionenaustau schermembranen bezeichnet. Der Trenneffekt beruht auf dem Ausschluß von Teilchen, welche die gleiche Ladung wie die Membran haben.

Zur enzymschonenden sowie auch die übrigen Reaktions partner schonenden effektiven Abtrennung des Co-Produk tes aus dem Reaktionsgemisch eignen sich bevorzugt Membranen, die zur Pervaporation eingesetzt werden. Sie können als Komposit-Membranen bezeichnet werden, da sie im allgemeinen aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht aufgebaut sind. Sie werden bezüglich ihrer Struktur als dichte, porenfreie Membranen angesehen. In diesem Zusammenhang soll der Begriff "porenfrei" Membranen umfassen, deren Trenn prinzip nicht das Größen-Ausschluß-Prinzip sein soll, sondern deren Trennwirkung auf Grund der unterschiedli chen Diffusion und Löslichkeit der zu trennenden Sub stanzen hinsichtlich der Membran beruht. Dabei können die Membranen z. B. Poren mit einer Größe bis 2 nm auf weisen.

Die selektive Trennschicht wird von einem Polymer ge bildet. Organophile Membranen besitzen beispielsweise eine polymere Trennschicht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS). Zur Steigerung der Selektivität gegenüber der organischen Komponente und gleichzeitiger Verringerung des Wasserpartialflusses werden neben den reinen PDMS- Membranen auch Membranen eingesetzt, die Zeolithe in der aktiven Schicht enthalten [ADNADJEVIC, B. ET AL (1997), J. Membr. Sci., 136: 173-179]. Bei den Zeo lithen handelt es sich um Gerüstsilicate, in denen ein Teil der Silciumatome durch Aluminium ersetzt sind. In den Zeolithestrukturen existieren große Hohlräume, die durch Kanäle verbunden sind. In diese Hohlräume können sich Wassermoleküle einlagern, so daß die Zeolithe als Molekularsiebe in der Membran fungieren.

Die Stützschicht besteht beispielsweise aus Polyacryl nitril (PAN) oder Polyetherimid (PEl) und dient zur Verbesserung der mechanischen Stabilität.

Die Vliesschicht dient der zusätzlichen Stabilisierung und besteht beispielsweise aus Polyethylen (PE).

Pervaporation ist der Transport von Stoffen durch eine porenfreie, polymere Membran, wobei ein Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig stattfindet. Das Trennprinzip be ruht auf einer bevorzugten Löslichkeit und Diffusion der permeierenden Stoffe im polymeren Membranmaterial. In der Literatur werden für Pervaporation auch hin und wieder die Begriffe Membranverdampfung und Verdampfungspermeati on verwendet. Zu unterscheiden ist der Effekt aber von der Membrandestillation, da hier eine mikroporöse Membran eingesetzt wird, die lediglich die Aufgabe hat, die flüs sige von der gasförmigen Phase zu trennen und selbst kei nen Einfluß auf die Selektivität nimmt.

Der für die Pervaporation charakteristische Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig kann mit der Destillation ver glichen werden. Bei der Destillation befinden sich Tempe ratur, Druck und chemisches Potential einer Komponente in beiden Phasen im Gleichgewicht. Die Trennung erfolgt auf grund von Konzentrationsunterschieden dieser Gleichge wichtsstufe.

Bei der Pervaporation ist die Triebkraft für den trans membranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Po tentials Δµ_i, der durch eine Aktivitätsdifferenz der per meierenden Komponente i zu beiden Seiten der Membran auf geprägt wird. Es gilt:

x_i = Molenbruch der Komponente i im Feed
y_i = Molenbruch der Komponente i im Permeat
γ_i,F = Aktivitätskoeffizient der Komponente i im Feed
p^o _i = Sattdampfdruck der Komponente i
p_P = Permaeatdruck

Durch Anlegen eines Vakuums auf der Permeatseite (P_Feed » P_Permeat) wird der Gradient aufrecht erhalten.

µ_iF = chemisches Potential der permeierenden Kompo nente im Feedstrom
µ_iP = chemisches Potential der permeierenden Kompo nente im Permeatstrom
a_F = Aktivität Feedstrom
a_P = Aktivität Permeatstrom
P_Feed = Druck Feedstrom
P_permeat = Druck Permeatstrom

Um eine hohe Selektivität zu erreichen, wird der Wider stand der Membran für die aus der Mischung bevorzugt ab zutrennende Komponente möglichst gering und für die im Permeat unerwünschte möglichst hoch gehalten. Durch Ver wendung verschiedener Membranmaterialien können unter schiedliche Affinitäten der Membran zu einzelnen Gemisch komponenten erzielt werden. Hinsichtlich ihrer Trennei genschaften können drei Klassen von Pervaporationsmembra nen unterschieden werden:

1. Hydrophile Membranen → Abtrennung von Wasser aus or ganischen Gemischen
2. Hydrophobe Membranen → Abtrennung von Organika aus wäßrigen Lösungen
3. Ziel-Organophil → Abtrennung von Organika aus organi schen Gemischen

Hydrophile Membranen bestehen beispielsweise aus Polyvi nylalkohol (PVA). Zu den hydrophoben Membranen können Membranen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethyl octyl-vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) gezählt werden. Bei der Auswahl der Pervaporationsmembran muß für eine wirtschaftliche Trennung neben der Selektivität auch die Flußdichte der Membran berücksichtigt werden. Membranen mit hoher Selektivität weisen überwiegend geringere Fluß dichten auf als Membranen mit geringer Selektivität. Eine Membran mit hoher Selektivität muß dementsprechend eine größere Membranfläche aufweisen als eine Membran mit ge ringerer Selektivität, um einen jeweils gleichen Per meatfluß zu erreichen. Die Schichtdicke der Membranen hat in diesem Zusammenhang daher ebenfalls einen Einfluß. Die Dicken der selektiven Schichten liegen beispielsweise in einem Größenbereich von 1 bis 40 µm.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü chen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungs form der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des Verfah rens sowie experimentelle Daten:

Es zeigt:

Fig. 1 Pervaporationsanlage

Fig. 2 Pervaporations-Reaktor

Fig. 3 Messung der Konzentrationsverläufe von Acetbut tersäureethylester (ABEE), Isopropanol und (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) bei Umsatz mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton

Fig. 4 Messung der Umsatzrate von Acetbuttersäureethyl ester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethyl ester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Fig. 5 Messung der Konzentrationsverläufe von Acetbut tersäureethylester (ABEE), Isopropanol und (S)-5-Hydroxyhexan-säureethylester (HHEE) bei Umsatz mit einer Carbonylreduktase (CPCR) unter Abtrennung des Co-Produktes Aceton

Fig. 6 Messung der Umsatzrate von Acetbuttersäureethyl ester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethyl ester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Die in Fig. 1 dargestellte Pervaporationsanlage zeigt ein Membranmodul (1) mit zugehöriger Pervaporations membran (2). Das zu trennende Stoffgemisch (Feed) (3) wird mittels einer Pumpe (4) in das Membranmodul (1) geleitet, nachdem durch einen Wärmetauscher (5) die gewünschte Zulauftemperatur eingestellt wurde. Im Membranmodul (1) treten die einzelnen Gemisch-Kompo nenten mit der Pervaporationsmembran (2) in Wechselwir kung und diffundieren in Abhängigkeit ihrer Affinität zum verwendeten Material durch die Pervaporationsmembran (2), so daß eine Trennung in Retentat (6) und Permeat (7) möglich wird. Auf der Rückseite der Perva porationsmembran verdampft das Permeat (7) in den durch die Vakuumpumpe (8) evakuierten Raum. Im Kondensator (9) wird die Verdampfungswärme wieder abgeführt und das Permeat (7) rückkondensiert.

Der in Fig. 2 dargestellte Pervaporationsreaktor zeigt den Reaktionsreaktor (10) mit externem Membranmodul (1) zur Pervaporation. Der Reaktionsreaktor (10) wird mit den erforderlichen Reaktionskomponenten über eine Zu laufleitung (11) befüllt. Die Durchmischung der Kompo nenten kann über einen Rührer (12) erfolgen. Die Ein stellung der Reaktionstemperatur kann über einen um den Reaktionsreaktor (10) angeordneten Kühlmantel (13) er folgen. Das zu trennende Gemisch wird über eine Ablauf leitung (14) mit Hilfe einer Pumpe (15) zum Membranmo dul (1) geleitet. Dort erfolgt die Trennung in Reten tatstrom und Permeatstrom. Der Retentatstrom wird über eine Leitung (16) wieder in den Reaktionsreaktor (10) zurückgeführt. Der Permeatstrom wird über eine zweite Leitung (17) aus dem Membranmodul (1) in den durch die Vakuumpumpe (9) evakuierten Raum abgezogen. Die Ver dampfungswärme wird im Kondensator (8) wieder abgeführt und das Permeat (7) wird wieder rückkondensiert.

Fig. 3 zeigt Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung mit einer Carbonylreduktase (CPCR) von Acetbuttersäu reethylester (ABEE) und Isopropanol zu (S)-5-Hydroxy hexansäureethylester (HHEE) bzw. Aceton, ohne Abtren nung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Konzentration [mM]

Fig. 4 zeigt eine Messung der Ergebnisse der Umsatzra te, symbolisiert durch "", von Acetbuttersäureethyl ester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) ohne Abtren nung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Umsatzrate (dimensionslos)

Fig. 5 zeigt Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung mit einer Carbonylreduktase (CPCR) von Acetbuttersäu reethylester (ABEE) und Isopropanol zu (S)-5-Hydroxy hexansäureethylester (HHEE) bzw. Aceton mit Abtrennung des Co-Produktes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Konzentration [mM]

Fig. 6 zeigt die Messung der Umsatzrate, symbolisiert durch "", von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexan-säureethylester (HHEE) mit einer Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produk tes Aceton.

Es zeigt:
Die Abszisse X: Zeit [min]
Die Ordinate Y: Umsatzrate (dimensionslos)

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden. In den Reaktor (10) werden über die Zulauflei tung (11) eine Lösung der Reaktionskomponenten, beste hend aus Ispropanol als Co-Substrat, Acetbuttersäu reethylester (ABEE) als Substrat, NADH als Co-Faktor, gelöst in TEA-Puffer mit Dithiothreitol, als Oxidati onsschutz eingefüllt. Die Lösung wird mit Hilfe des Temperiermantels (13) auf 35°C temperiert. Die Reakti on wird durch Zugabe einer definierten Menge von Carbo nylreduktase aus Candida parapsilosis über die Zulauf leitung (11) zu der temperierten Lösung im Reaktor (10) gestartet. Zur besseren Durchmischung kann mit Hilfe eines Rührers (12) eine Umwälzung der Lösung erreicht werden. Die umgesetzte Reaktionslösung wird mittels einer Umwälzpumpe (15), z. B. Schlauchpumpe, in das Membranmodul (1) gepumpt. Hier erfolgt die Abtrennung des Co-Produktes Aceton, welches über die Abzugsleitung (17) aus der Pervaporationsanlage (1) durch einen Wär metauscher (8) aus der Pervaporationsanlage (1) ent fernt wird. Die Pervaporation wird durch Anlegen eines permeatseitigen Druckes < 15 mbar mit Hilfe einer Vaku umpumpe (9) beschleunigt. Die übrigen Reaktionsproduk te, wie z. B. noch nicht umgesetztes Substrat, Co- Substrat, Co-Faktoren, Produkt und Enzym, werden dem Reaktor (10) über eine Leitung (16) aus dem Membranmo dul (1) wieder zugeführt. An verschiedenen Stellen der Anlage, z. B. an den Leitungen (14), (16) und (17), können Proben zur analytischen Kontrolle, z. B. mittels Gaschromatographie, der Reaktionsprodukte entnommen werden.

Die erfindungsgemäße Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, in dem zur Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch ein Membranverfahren eingesetzt wird, ermöglicht eine Co-Faktor abhängige enzymatische Umsetzung, wobei die Co-Faktoren im Reaktionsgleichge wicht durch Regeneration erhalten bleiben und dem System nicht kontinuierlich zugeführt werden müssen. Die Co-Faktor-Regenerierung erfolgt enzymatisch und er fordert ein sogenanntes Co-Substrat. Durch die Entfer nung des daraus gebildeten Co-Produktes wird der Reak tionsschritt der Regeneration in Richtung der Co- Produktbildung verschoben und damit die Regeneration des Co-Faktors, die mit diesem Reaktionsschritt verbun den ist, beschleunigt. Die selektive Entfernung des Co- Produktes mittels eines Membranverfahrens ermöglicht eine kontinuierliche Entfernung der Verbindungen. Das Membranverfahren ermöglicht eine Separation des ge wünschten Stoffes, ohne die im Reaktionssystem verblei benden Verbindungen, insbesondere die Enzyme beispiels weise durch starke mechanische Scherkräfte zu schädigen oder zu inaktivieren. Gegenüber herkömmlichen Verfahren zur selektiven Abtrennung von Stoffen, wie z. B der Destillation, erfolgt die Abtrennung produkt- und en zymschonend. Sauerstoffempfindliche Produkte und Enzyme werden nicht geschädigt. Das Produkt und die Co- Faktoren werden nicht abgereichert. Eine thermodynami sche Limitierung sowie eine Co-Produktinhibierung der Enzyme aufgrund ansteigender Co-Produktbildung findet nicht statt. Weiterhin kann dadurch eine Umsatzsteige rung erzielt werden.

Durch das vorteilhafte Verfahren gemäß Anspruch 2, in dem als Membranverfahren die Pervaporation eingesetzt wird, ist es möglich, auf Grund unterschiedlicher Stofflöslichkeiten und Diffusionsverhalten der jeweili gen Substanzen, diese voneinander zu trennen. Da der Trenneffekt nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip be ruht, ist die Porengröße der Membran nicht entschei dend. Es kann nicht zu einem Verstopfen der Membran durch z. B. Proteinanlagerung kommen. Weiterhin ist eine Trennung von Stoffen möglich, die sich anhand ihrer Molekülgröße nicht voneinander unterscheiden. Das Membranmaterial wird je nach Affinität zur einzelnen Gemischkomponente ausgewählt. Zur Trennung von wässri gen Verbindungen aus organischen Gemischen werden hydrophile Membranen eingesetzt, zur Trennung von organischen Verbindungen aus wäßrigen Lösungen werden hydrophobe Membranen, und zur Trennung verschiedener Organika voneinander werden ziel-organophile Membranen eingesetzt. Durch die Auswahl der eingesetzten Membran kann die Trennung der Stoffgemische und damit die Ab trennung des Co-Produktes von den übrigen Reaktions partnern selektiv gesteuert werden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens nach An spruch 3, in der als Co-Substrat niedrig siedende Alko hole eingesetzt werden, bewirkt, daß diese Verbindungen enzymatisch zu niedrig siedenden Ketonen umgesetzt wer den können. Zu den niedrig siedenden Alkoholen können Alkohole mit einem Siedepunkt unter 100°C gezählt wer den.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß An spruch 4, in der als Co-Substrat Isopropanol eingesetzt wird, ermöglicht eine effektive Regeneration der Co- Faktoren durch die Oxidoreduktasen. Das Substrat wird zu Aceton umgesetzt. Es werden keine weiteren Nebenpro dukte gebildet, die das Enzym schädigen oder durch das Verfahren nicht entfernt werden können. Die Enzyme be sitzen für Isopropanol eine hohe Affinität, so daß das Reaktionsgleichgewicht in Richtung der Co-Produktbil dung und damit in eine effektive Co-Faktor-Regenerie rung verschoben wird.

Die niedrig siedenden Ketone können gemäß der vorteil haften Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 5, in der als Co-Produkt niedrig siedende Ketone entfernt werden, gut aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden. Zu den niedrig siedenden Ketonen können Verbin dungen mit einem Siedepunkt unter 100°C gezählt wer den. Der niedrige Siedepunkt dieser Verbindungen ermög licht einen Phasenwechsel von flüssig nach gasförmig schon bei geringen Temperaturen, so daß die Pervapora tion schon bei einem Temperaturbereich von 25 bis 30°C durchgeführt werden kann, so daß auch die Enzyme nicht thermisch geschädigt werden. Bei Einsatz von thermisch stabilen Enzymen kann die Pervaporation auch bei höhe ren Temperaturen, z. B. bei 60 bis 80°C durchgeführt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 6, in dem als Co-Produkt Aceton entfernt wird, kann das Co-Produkt spezifisch aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Dadurch, daß ein niedrig siedendes Co- Produkt gebildet wird, kann die Pervaporation bei nied rigen Temperaturen (25 bis 35°C) durchgeführt werden, wodurch eine Schädigung von beispielsweise temperatur empfindlichen Enzymen verhindert wird.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß An spruch 7, in dem ein Enzym verwendet wird, welches so wohl das Substrat, als auch das Co-Substrat unter Rege nerierung des Co-Faktors umsetzt, ermöglicht eine Ver einfachung des enzymatischen Systems. Zum einen können durch ein zweites Enzym zusätzliche Kosten entstehen. Zum anderen kann das Zweienzymsystem Bedingungen erfor dern, die nicht für beide Enzyme gleichermaßen optimal sind, was zu einer Limitierung des ganzen Reaktions systems führt. Bei Verwendung eines Enzyms für beide Reaktionen treten weniger Nebenreaktionen auf.

Die Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 8, in dem Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen einge setzt werden, bewirkt, daß mit Hilfe dieser Enzyme Was serstoff und Elektronen übertragen werden können und somit Co-Faktoren, die Wasserstoff und Elektronen über tragen, regeneriert werden können.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ge mäß Anspruch 9, in dem eine Carbonylreduktase einge setzt wird, wird es möglich Ketoester, wie z. B. Acet buttersäureethylester (ABEE), aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoacetale enantiomerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydroxy säuren, deren Ester, z. B. (S)-5-Hydroxyhexansäure ethylester (HHEE) und Lactonen zu reduzieren und gleichzeitig den verbrauchten Co-Faktor NAD⁺ zu regene rieren, indem ein niedrig siedender Alkohol, z. B. Isopropanol zu einem niedrig siedenden Keton, z. B. Aceton umgesetzt wird.

In der vorteilhaften Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 10, in dem eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis eingesetzt wird, wird es möglich, ein breites Substratspektrum, wie z. B. Ketoester, alipha tische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehy de, Ketoacetale mit hoher Enantioselektivität und hohen Umsätzen, enzymatisch zu reduzieren. Durch das breite Aktivitätsmaximum des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und bei Temperaturen von 35°C bis 42°C wird die technische Anwendung des Verfahrens erleichtert, da die Reaktionsbedingungen relativ breit variiert werden können. Das Enzym kann mit den üblichen biochemischen Methoden aus Candida parapsilosis isoliert und aufge reinigt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ge mäß Anspruch 11, in dem Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren eingesetzt werden, können teure wasserstoffübertragende Co-Faktoren, zu denen beispielsweise die Pyridinnukleotide NAD⁺ und NADP⁺ sowie FMN, FAD, Ubichinon, Zellhämine und Lipon säuren gezählt werden, regeneriert werden. Die Regene ration von Pyrididnukleotiden ist zum einen von Bedeutung, da ihr Einsatz sehr kostenintensiv ist und es zum anderen beispielsweise für NADP⁺ kein kommerziell ver fügbares Regenerationssystem gibt. Weiterhin ist die Regeneration von Pyridinnukleotiden als Co-Faktoren von besonderer Bedeutung, da sie für die Produktion vieler wirtschaftlich interessanter pharmazeutischer Produkte eingesetzt werden, wie z. B. Vorläufer für ACE- Inhibitoren (ACE = angiotensine converting enzyme) oder chirale Synthesebausteine für HIV Proteaseinhibitoren.

In der vorteilhaften Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 12, in dem als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ eingesetzt werden, können die Co-Faktoren NAD⁺ und NADP⁺, die für viele enzymatische Reaktionen wichtig sind, regeneriert werden. Da die Enzyme und Ausgangs verbindungen für die Regeneration von NADP⁺ noch sehr teuer sind, ist die Ausführung des Verfahrens nach die sem Anspruch von besonderem Vorteil.

Die Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 13, in dem eine Pervaporationsmembran eingesetzt wird, bewirkt eine Trennung von Flüssigkeitsgemischen aufgrund unter schiedlicher Sorption und Diffusion der einzelnen Kom ponenten des Stoffgemisches. Da die Trennwirkung nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prizip beruht, können auch Stoffe mit gleichem Molekulargewicht selektiv voneinan der getrennt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14, in dem eine porenfreie, polymere Membran eingesetzt wird, absorbieren Substanzen, die getrennt werden sollen, an die polymere Trennschicht der Membran und diffundieren durch sie hindurch. Die Eigenschaft der Polymerschicht bestimmt die Selektivität der Membran. Die Porengröße der Trennschicht hat dabei nur eine untergeordnete Bedeutung für die Trennwirkung.

Durch die Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 15, in dem eine Komposit-Membran verwendet wird, ist es möglich, die Membran an die jeweiligen Anforderungen an Selektivität, Durchfluß des Permeats und Stabilität an zupassen. Das Material und die Verarbeitung können die Trennleistung beeinflussen. Weiterhin ist eine getrenn te Optimierung der einzelnen Schichten möglich.

In der vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 16, in dem eine Membran eingesetzt wird, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, kann durch die selekti ve Schicht die Trennung des Gemisches erzielt werden. Durch wahlweise Verwendung einer Stützschicht und einer Vliesschicht kann die Stabilität der Membran den jewei ligen Bedingungen angepaßt werden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß An spruch 17, in dem für die selektive Trennschicht Poly dimethylsiloxan (PDMS), Polymethyloctyl-vinylmethyl dimethylsiloxan (POMS) oder auch Polydimethylsiloxan (PDMS) mit Zeolithe eingesetzt wird, und für die Stütz schicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) verwendet wird sowie als Vliesschicht Polyethylen (PE) eingesetzt wird, bewirkt, daß Organika, wie beispiels weise Aceton, aus wäßrigen Lösungen getrennt werden können. Zur Unterstützung der Stabilität wird eine poröse Stützschicht, z. B. aus Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI), eingesetzt. Eine weitere Sta bilitätserhöhung erfolgt durch die Vliesschicht, die beispielsweise aus Polyethylen (PE) bestehen kann.

In der Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 18, in dem eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften eingesetzt wird, kann durch die Auswahl geeigneter Membranmaterialien die Se lektionseigenschaft an die Substanzen, die selektiv entfernt werden sollen, angepaßt werden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß An spruch 19, in dem das Permeat durch Anlegen eines Vaku ums aus dem Reaktionsraum entfernt wird, bewirkt, daß die Diffusion der Substanzen durch die Pervaporations membran beschleunigt wird. Bei der Pervaporation ist die Triebkraft für den transmembranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Potentials, der durch eine Aktivitätsdifferenz der permeierenden Komponente zu beiden Seiten der Membran ausgeprägt wird. Durch Anle gen des Vakuums auf der Permeatseite wird der Gradient aufrecht erhalten. Das Vakuum kann beispielsweise durch den Einsatz einer Vakuumpumpe erzeugt werden.

In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 20, in dem das zu trennende Stoffgemisch dem Reaktionsraum kontinuierlich zugeführt und das Retentat sowie das Permeat aus dem Reaktionsraum kontinuierlich abgeführt wird, wird eine kontinuierliche Prozeßführung möglich. Dadurch können Substrat und Produktkonzentra tion auf der gewünschten Konzentration gehalten werden.

Es ergibt sich keine Zeit- und Ortsabhängigkeit der Konzentrationen. Durch Variation von Verweilzeit und Katalysatorkonzentration können unterschiedliche Sub strat- und Produktkonzentrationen gesteuert werden. Das Membranmodul mit der Pervaporationsmembran kann dabei extern angeordnet sein oder sich intern z. B. im Boden des Reaktionsreaktors oder als Säule im Zentrum des Re aktors befinden.

Die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß An spruch 21, in dem die Kontrolle der Produktbildung bzw. Co-Produktbildung kontinuierlich analytisch überprüft wird, ermöglicht es, Substratverbrauch sowie Produkt und Co-Produktbildung während der enzymatischen Reakti on kontinuierlich zu überprüfen und dementsprechend durch Zugabe von Substrat/Co-Substrat bzw. Abfuhr von Produkt/Co-Produkt einen Einfluß auf die Reaktion zu nehmen, um die Effektivität des Prozesses zu optimie ren. Mit Hilfe der On-line Analytik, wie z. B. HPLC, NMR, GC, können die jeweiligen Substanzen während der gesamten Reaktion überprüft werden und auf Störungen kann direkt reagiert werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 22, in dem chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lactone, enzymatisch sythetisiert wer den, ist es möglich, Ketoester, aliphatische, aromati sche und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoaceta le enantiomerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydro xysäuren, deren Estern und Lactonen unter gleichzeiti ger Co-Faktor-Regenerierung mit aus Organismen isolier ten Enzymen umzusetzen. Die Verwendung isolierter Enzyme gegenüber der Umsetzung mit ganzen Organismen bietet eine höhere Reproduzierbarkeit und häufig bessere Se lektivität, da z. B. Nebenreaktionen durch Isoenzyme ausbleiben. Eine rein chemische Synthese enantiomeren reiner Produkte ist z. T. unmöglich oder aber mit einem sehr hohen technischen Aufwand verbunden.

Die erfindungsgemäße Ausgestaltung der Vorrichtung ge mäß Anspruch 23, die zur Entfernung des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch eine Membran enthält, ermög licht eine Co-Faktor abhängige enzymatische Umsetzung, wobei die Co-Faktoren im Reaktionsgleichgewicht durch Regeneration erhalten bleiben, und dem System nicht kontinuierlich zugeführt werden müssen. Die Co-Faktor- Regenerierung erfolgt enzymatisch und erfordert ein Co- Substrat. Durch die Entfernung des daraus gebildeten Co-Produktes wird der Reaktionsschritt der Regeneration in Richtung der Co-Produktbildung verschoben und damit die Regeneration des Co-Faktors, die mit diesem Reakti onsschritt verbunden ist, beschleunigt. Die selektive Entfernung des Co-Produktes mittels einer Membran er möglicht eine kontinuierliche Entfernung der Verbindun gen. Die Membran ermöglicht eine Separation des ge wünschten Stoffes, ohne die im Reaktionssystem verblei benden Verbindungen, insbesondere die Enzyme, bei spielsweise durch starke mechanische Scherkräfte zu schädigen oder zu inaktivieren. Das Produkt und die Co- Faktoren werden nicht abgereichert. Gegenüber herkömm lichen Abtrennungsvorrichtungen, wie z. B. Destillati onsanlagen, wird eine Schädigung sauerstoffempfindli cher Enzyme und Produkte verhindert. Eine thermodynami sche Limitierung sowie Co-Produktinhibierung der Enzyme aufgrund ansteigender Co-Produktbildung findet nicht statt. Weiterhin kann dadurch eine Umsatzsteigerung er zielt werden.

Die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 24, die eine Pervaporationsmembran enthält, bewirkt eine Tren nung von Flüssigkeitsgemischen aufgrund unterschiedli cher Sorption und Diffusion der einzelnen Komponenten des Stoffgemisches. Da die Trennwirkung nicht auf dem Größen-Ausschluß-Prinzip beruht, können auch Stoffe mit gleichem Molekulargewicht selektiv voneinander getrennt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 25, die eine porenfreie, polymere Membran ent hält, absorbieren Substanzen, die getrennt werden sol len, an die polymere Trennschicht der Membran und dif fundieren durch sie hindurch. Die Eigenschaft der Poly merschicht bestimmt die Selektivität der Membran. Die Porengröße der Trennschicht hat dabei nur eine unterge ordnete Bedeutung für die Trennwirkung.

Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 26, die eine Komposit-Membran enthält, ist es möglich, die Membran an die jeweiligen Anforde rungen an Selektivität, Durchfluß des Permeats und Sta bilität anzupassen. Das Material und die Verarbeitung können die Trennleistung beeinflussen. Weiterhin ist eine getrennte Optimierung der einzelnen Schichten mög lich.

In der vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ge mäß Anspruch 27, die eine Membran enthält, die aus einer selektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht, kann durch die selektive Schicht die Trennung des Gemisches erzielt werden. Op tional enthält die Membran eine Stützschicht und eine Vliesschicht, um die Stabilität der Membran den jewei ligen Bedingungen anzupassen.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 28, die als selektive Trennschicht Polydi methylsiloxan (PDMS), Polymethyloctyl-vinylmethyl dimethylsiloxan (POMS) oder auch Polydimethylsiloxan (PDMS) mit Zeolithe umfaßt, und als Stützschicht Poly acrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI) sowie als Vliesschicht Polyethylen (PE) umfaßt, bewirkt, daß Organika, wie beispielsweise Aceton, aus wäßrigen Lösungen getrennt werden können. Zur Unterstützung der Stabilität enthält die poröse Stützschicht z. B. Poly acrylnitril (PAN) oder Polyetherimid (PEI). Eine weite re Stabilitätserhöhung erfolgt durch die Vliesschicht, die beispielsweise aus Polyethylen (PE) bestehen kann.

In der Ausgestaltung der Vorrichtung nach Anspruch 29, die eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften umfaßt, kann durch die Auswahl geeigneter Membranmaterialien die Selektions eigenschaft an die Substanzen, die selektiv entfernt werden sollen, angepaßt werden.

Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 30, die als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole umfaßt, bewirkt, daß diese Verbindungen enzy matisch zu niedrig siedenden Ketonen umgesetzt werden können. Zu den niedrig siedenden Alkoholen können Alko hole mit einem Siedepunkt unter 100°C gezählt werden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 31, die als Co-Substrat Isopropanol umfaßt, ermöglicht eine effektive Regeneration der Co-Faktoren durch die Oxidoreduktasen. Das Substrat wird zu Aceton umgesetzt. Es werden keine weiteren Nebenprodukte ge bildet, die das Enzym schädigen oder durch die Vorrich tung nicht entfernt werden können. Die Enzyme besitzen für Isopropanol eine hohe Affinität, so daß das Reakti onsgleichgewicht in Richtung der Co-Produktbildung und damit in eine effektive Co-Faktor-Regenerierung ver schoben wird.

Die niedrig siedenden Ketone können gemäß der vorteil haften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 32, die als Co-Produkt niedrig siedende Ketone umfaßt, gut aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden. Zu den niedrig siedenden Ketonen können Verbindungen mit einem Siedepunkt unter 100°C gezählt werden. Der niedrige Siedepunkt dieser Verbindungen ermöglicht einen Phasen wechsel von flüssig nach gasförmig schon bei geringen Temperaturen, so daß die Pervaporation schon bei einem Temperaturbereich von 25 bis 30°C durchgeführt werden kann, so daß auch die Enzyme nicht thermisch geschädigt werden. Bei Einsatz von thermisch stabilen Enzymen kann die Pervaporation auch bei höheren Temperaturen, z. B. bei 60 bis 80°C durchgeführt werden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 33, die als Co-Produkt Aceton umfaßt, kann das Co-Produkt spezifisch aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Dadurch, daß ein niedrig siedendes Co-Produkt gebildet wird, kann die Pervaporation bei niedrigen Temperaturen (25 bis 35°C) durchgeführt werden, wo durch eine Schädigung von beispielsweise temperatur empfindlichen Enzymen verhindert wird.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 34, die ein Enzym umfaßt, welches sowohl das Substrat als auch das Co-Substrat unter Regenerierung des Co-Faktors umsetzt, ermöglicht eine Vereinfachung des enzymatischen Systems. Zum einen können durch ein zweites Enzym zusätzliche Kosten entstehen. Zum anderen kann das Zweienzymsystem Bedingungen erfordern, die nicht für beide Enzyme gleichermaßen optimal sind, was zu einer Limitierung des ganzen Systems führt. Umfaßt die Vorrichtung nur ein Enzym für beide Reaktionen, treten weniger Nebenreaktionen auf.

Die Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 35, die Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen umfaßt, bewirkt, daß mit Hilfe dieser Enzyme Wasserstoff und Elektronen übertragen werden können und somit Co- Faktoren, die Wasserstoff und Elektronen übertragen, regeneriert werden können.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 36, die eine Carbonylreduktase umfaßt, wird es möglich, Ketoester, wie z. B. Acetbuttersäu reethylester (ABEE), aliphatische, aromatische und cyclische Ketone sowie Aldehyde und Ketoacetale enanti omerenspezifisch zu chiralen Alkoholen, Hydroxysäuren, deren Ester, z. B. (S)-5-Hydroxyhexansäureethylester (HHEE) und Lactonen, zu reduzieren und gleichzeitig den verbrauchten Co-Faktor NAD⁺ zu regenerieren, indem ein niedrig siedender Alkohol, z. B. Isopropanol, zu einem niedrig siedenden Keton, z. B. Aceton, umgesetzt wird.

In der vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 37, die eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis umfaßt, wird es möglich, ein breites Sub stratspektrum, wie z. B. Ketoester, aliphatische, aro matische und cyclische Ketone sowie Aldehyde, Ketoace tale mit hoher Enantioselektivität und hohen Umsätzen, enzymatisch zu reduzieren. Durch das breite Aktivitäts maximum des Enzyms bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und bei Temperaturen von 35°C bis 42°C wird die tech nische Anwendung der Vorrichtung erleichtert, da die Reaktionsbedingungen relativ breit variiert werden kön nen. Das Enzym kann mit den üblichen biochemischen Me thoden aus Candida parapsilosis isoliert und aufgerei nigt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 38, die Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffübertragenden Co-Faktoren umfaßt, können teure wasserstoffübertragende Co-Faktoren zu denen bei spielsweise die Pyridinnukleotide NAD⁺ und NADP⁺ sowie FMN, FAD, Ubichinon, Zellhämine und Liponsäuren gezählt werden, regeneriert werden. Die Regeneration von Pyri dinnukleotiden ist zum einen von Bedeutung, da ihr Ein satz sehr kostenintensiv ist und es zum anderen beispielsweise für NADP⁺ kein kommerziell verfügbares Re generationssystem gibt. Weiterhin ist die Regeneration von Pyridinnukleotiden als Co-Faktoren von besonderer Bedeutung, da sie für die Produktion vieler wirtschaft lich interessanter pharmazeutischer Produkte eingesetzt werden, wie z. B. Vorläufer für ACE-Inhibitoren (ACE = angiotensine converting enzyme) oder chirale Synthese bausteine für HIV-Proteaseinhibitoren.

In der vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 39, die als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ um faßt, können die Co-Faktoren NAD⁺ und NADP⁺, die für viele enzymatische Reaktionen wichtig sind, regeneriert werden. Da die Enzyme und Ausgangsverbindungen für die Regeneration von NADP⁺ sehr teuer sind, ist die Ausfüh rung der Vorrichtung nach diesem Anspruch von besonde rem Vorteil.

Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß An spruch 40, die Mittel umfaßt, die das Permeat durch An legen eines Vakuums aus dem Reaktionsraum entfernen, bewirkt, daß die Diffusion der Substanzen durch die Pervaporationsmembran beschleunigt wird. Bei der Perva poration ist die Triebkraft für den transmembranen Stofftransport ein Gradient des chemischen Potentials, der durch eine Aktivitätsdifferenz der permeierenden Komponente zu beiden Seiten der Membran ausgeprägt wird. Durch Anlegen des Vakuums auf der Permeatseite wird der Gradient aufrecht erhalten. Das Vakuum kann beispielsweise durch den Einsatz einer Vakuumpumpe er zeugt werden.

In einer vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 41, die Mittel zur kontinuierlichen Zufuhr des zu trennenden Stoffgemisches sowie Mittel zur kontinu ierlichen Entfernung des Retentats und Permeats aus dem Reaktionsraum umfaßt, wird eine kontinuierliche Prozeß führung möglich. Dadurch können Substrat- und Produkt konzentration in dem gewünschten Konzentrationsbereich gehalten werden. Es ergibt sich keine Zeit- und Ortsab hängigkeit der Konzentrationen. Durch Variation von Verweilzeit und Katalysatorkonzentration können unter schiedliche Substrat- und Produktkonzentrationen ge steuert werden. Das Pervaporationsmodul mit der Perva porationsmembran kann dabei extern angeordnet sein oder sich intern z. B. im Boden des Reaktionsreaktors oder als Säule im Zentrum des Reaktors befinden.

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 42, welche Mittel umfaßt, welche die Produkt bildung bzw. Co-Produktbildung kontinuierlich analy tisch überprüfen, wird es möglich, Substratverbrauch sowie Produkt und Co-Produktbildung während der enzyma tischen Reaktion kontinuierlich zu überprüfen und dem entsprechend durch Zugabe von Substrat/Co-Substrat bzw. Abfuhr von Produkt/Co-Produkt einen Einfluß auf die Re aktion zu nehmen, um die Effektivität des Prozesses zu optimieren. Mit Hilfe der On-line Analytik, wie z. B. HPLC, NMR, GC, können die jeweiligen Substanzen während der gesamten Reaktion überprüft und auf Störungen kann direkt reagiert werden.

Ausführungsbeispiele

Um die Gleichgewichtslage des Systems zu untersuchen, wird ein ansatzweises Verfahren, ohne Abtrennung des bei der Co-Faktor-Regenerierung entstehenden Acetons, durch geführt. Die Ergebnisse dieses Versuchs dienen als Grund lage für einen Vergleich mit den Ergebnissen analoger Versuche, bei denen das Aceton durch Pervaporation abge trennt wird.

1. Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) mit substratgekoppelter Co-Faktor-Regenerierung durch eine Carbonylredukaase (CPRC) ohne Abtrennung des Co-Produkts Aceton

Eine Lösung aus 130 mM Isopropanol, welches als Co- Substrat dient, 30 mM Acetbuttersäureethylester (ABEE), welches als Substrat dient, 0,2 mM NADH als Co-Faktor, 1 mM Dithiothreitol als Oxidationsschutz in 100 mM Triethanolamin-Puffer; pH = 7, 8), wird auf 35°C tempe riert. Es werden 0,15 U/ml Carbonylreduktase (CPRC) aus Candida parapsilosis zugegeben und leicht gerührt. Der Verlauf der Konzentrationen und des Umsatzes von Acet buttersäureethylester (ABEE) zu (S)-5-Hydroxyhexan säureethylester (HHEE) bzw. des Umsatzes von Isopropa nol zu Aceton, wird gaschromatographisch verfolgt. Die Ansatzgröße beträgt 2 ml. Die Fig. 3 und 4 zeigen die Konzentrationsverläufe sowie den Umsatz der Reakti on.

Es wird ein Endumsatz von 75% erreicht. Das Ende der Re aktion ist aufgrund einer thermodynamischen Limitierung der Co-Faktor-Regenerierung bedingt und nicht etwa durch Enzymdesaktivierung aufgrund einer ansteigenden Aceton konzentration.

2. Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) mit substratgekoppelter Co-Faktor-Regenerierung durch eine Carbonylreduktase (CPCR) mit Abtrennung des Co-Produkts Aceton

Um einen Einfluß der Abtrennung des Co-Produktes Aceton auf die Gleichgewichtslage der enzymatischen Reduktion von Acetbuttersäureethylester (ABEE) zu erkennen, wird die enzymatische Umsetzung im ansatzweisen Verfahren in Kombination mit Abtrennung des Acetons durch Pervaporati on durchgeführt.

Vor dem eigentlichen Pervaporationsexperiment muß die neu eingesetzte Membran mindestens zwei Stunden unter Perva porationsbedingungen konditioniert werden. Die Feedzusam mensetzung wird dafür entsprechend den Konzentrationen der späteren Versuchslösung gewählt. Die Membran und der Pumpenschlauch werden durch Zugabe von 30 mg BSA während der Konditionierung vorbelegt. Nach der Konditionierung wird das Feedgemisch abgelassen und die Anlage mit fri scher Feedlösung gespült. Dies ist wichtig, um Verdün nungseffekte durch in der Anlage verbliebene, während der Konditionierung abgereicherte Feedlösung vorzubeugen.

Für das Pervaporationsexperiment wird die Feedpumpe auf einen Volumenstrom von 0,5 l/min eingestellt. Die Feed temperatur beträgt 35°C und der permeatseitige Unter druck ist < 15 mbar. Alle kondensierbaren Anteile des Permeatdampfes werden in einer Kühlfalle, die hinter dem Pervaporationsmodul angeordnet ist, bei einer Temperatur von -196°C ausgefroren.

Zur Durchführung der Permeatmessung wird die gewogene Kühlfalle in die permeatseitige Leitungsführung einge setzt und das Absperrventil zur Membran geöffnet. Nach einer festgesetzten Versuchszeit wird die Kühlfalle mit dem ausgefrorenen Permeat entnommen und die permeatseiti ge Leitungsführung durch eine neue Kühlfalle verschlos sen. Durch erneutes Wiegen der aufgetauten Kühlfalle wird die Masse des Permeats ermittelt. Für die gaschromato graphische Untersuchung wird eine Probe des Permeats im Verhältnis 1 : 50 verdünnt.

Zur Korrelation der Partialflüsse mit der entsprechenden Feedkonzentration wird vor und nach der Messung eine Feedprobe genommen und ebenfalls gaschromatographisch analysiert. Die Feedkonzentration ergibt sich als Mittel wert beider Konzentrationen. Nach festgesetzten Zeitin tervallen, in denen die Anlage weiter betrieben wird und sich die Feedkonzentration weiter verringert, werden wei tere Messungen vorgenommen.

Die Versuche werden in dem in Fig. 2 beschriebenen Perva porationsreaktor durchgeführt. Die verwendete PDMS- Membran wird, wie oben beschrieben, mit einer Lösung aus 100 mM Isopropanol als Co-Substrat, 30 mM Acetbuttersäu reethylester (ABEE) als Substrat, 1 mM Dithiothreitol als Oxidationsschutz und 30 mg BSA in 100 mM TEA-Puffer (pH = 7,8) zwei Stunden unter Pervaporationsbedingungen kondi tioniert.

Nach dem Spülen der Anlage wird eine Lösung von 100 mM Isopropanol als Co-Substrat, 30 mM Acetbuttersäureethylester (ABEE), 0,2 mM NADH als Co-Faktor, 1 mM Dithi othreitol als Oxidationsschutz in 100 mM TEA-Puffer (pH = 7,8) in den Reaktionsraum eingefüllt und auf 35°C tempe riert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 0,15 U/ml Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis ge startet. Die Leistung der Umwälzpumpe wird auf einen Vo lumenstrom von 0,5 l/min eingestellt. Der permeatseitige Druck ist < 15 mbar. Die Umsatzkontrolle wird gaschrom tographisch durchgeführt. Um einen Verschluß der Kühlfal le durch ausgefrorenes Permeat zu vermeiden, wird die Kühlfalle alle 60 min gewechselt.

Die Ergebnisse der enzymatischen Ketonreduktion mit Ace tonabtrennung zeigen die Fig. 5 und 6.

Wie die Konzentrationsverläufe in Fig. 5 zeigen, ist durch Kombination eines Bioreaktors mit einer Pervapo rationstrennstufe ein Austrag des bei der substratge koppelten Co-Faktorregenerierung gebildeten Acetons möglich. Die Acetonkonzentration kann während der ge samten Reaktionszeit auf niedrigem Niveau (unter 8 mM) gehalten werden. Das vorübergehende Ansteigen der Ace tonkonzentration kann durch die hohe Reaktionsgeschwin digkeit zu Beginn der Reaktion erklärt werden. Die Ace tonbildung kann bei hoher Reaktionsgeschwindigkeit nicht durch den transmembranen Acetonpartialfluß kom pensiert werden. Gegen Ende der Reaktion verlangsamt sich die Reaktionsgeschwindigkeit. Der Acetonaustrag überwiegt die Acetonbildung und die Konzentration sinkt wieder ab. Dadurch bleibt die thermodynamische Trieb kraft für die Co-Faktorregenerierung erhalten und die Limitierung bleibt aus. Der damit verbundene Anstieg der NADH-Konzentration erhöht wiederum die Triebkraft der Ketonreduktion, was sich durch eine Umsatzsteige rung bemerkbar macht. Im Vergleich zu einem ansatzwei sen Verfahren ohne Acetonabtrennung ist eine Umsatz steigerung von 75% auf über 95% möglich. Eine Pro duktabreicherung durch Pervaporation findet nicht statt.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Regeneration von Co-Fak toren in Anwesenheit eines Co-Substrates, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung des Co-Produktes aus dem Reakti onsgemisch ein Membranverfahren eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Membranverfahren die Pervaporation einge setzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole ein gesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Substrat. Isopropanol eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Produkt niedrig siedende Ketone entfernt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Produkt Aceton entfernt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym verwendet wird, welches sowohl das Substrat als auch das Co-Substrat unter Regenerie rung des Co-Faktors umsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen ein gesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbonylreduktase eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis eingesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoffüber tragenden Co-Faktoren eingesetzt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ eingesetzt wer den.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pervaporationsmembran eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine porenfreie, polymere Membran eingesetzt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Komposit-Mambran verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran eingesetzt wird, die aus einer se lektiven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß für die selektive Trennschicht Polydimethylsi loxan (PDMS), Polymethyloctyl-vinylmethyl dimethylsiloxan (POMS) oder auch Polydimethylsilo xan (PDMS) mit Zeolithe eingesetzt wird, für die Stützschicht Polyacrylnitril (PAN) oder Polyetheri mid (PEI) verwendet wird und für die Vliesschicht Polyethylen (PE) eingesetzt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften eingesetzt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Permeat durch Anlegen eines Vakuums aus dem Reaktionsraum entfernt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das zu trennende Stoffgemisch dem Reaktionsraum kontinuierlich zugeführt wird und das Retentat so wie das Permeat aus dem Reaktionsraum kontinuier lich abgeführt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrolle der Produktbildung bzw. Co- Produktbildung kontinuierlich analytisch geprüft und gesteuert wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß chirale Alkohole, Hydroxysäuren, deren Ester und Lactone, enzymatisch synthetisiert werden.

23. Vorrichtung zur enzymatischen Regeneration von Co- Faktoren in Anwesenheit eines Co-Substrates, umfassend Mittel zum Entfernen des Co-Produktes aus dem Reaktionsgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Membran enthält.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Pervaporationsmembran enthält.

25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine porenfreie, polymere Membran enthält.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Komposit-Membran umfaßt.

27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Membran umfaßt, die aus einer selekti ven Trennschicht, einer Stützschicht und einer Vliesschicht besteht.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine selektive Trennschicht aus Polydi methylsiloxan (PDMS) oder Polymethyloctyl vinylmethyl-dimethylsiloxan (POMS) oder auch Poly dimethylsiloxan (PDMS) mit Zeolithe umfaßt, eine Stützschicht aus Polyacrylnitril (PAN) oder Polye therimid (PEI) sowie eine Vliesschicht aus Poly ethylen (PE) umfaßt.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Membran mit hydrophilen, hydrophoben oder ziel-organophilen Eigenschaften umfaßt.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Co-Substrat niedrig siedende Alkohole umfaßt.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Co-Substrat Isopropanol umfaßt.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Co-Produkt niedrig siedende Ketone um faßt.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Co-Produkt Aceton umfaßt.

34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Enzym enthält, welches sowohl das Sub strat als auch das Co-Substrat unter Co-Faktor- Regenerierung umsetzt.

35. Vorrichtung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Enzym aus der Klasse der Oxidoredukta sen enthält.

36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Carbonylreduktase enthält.

37. Vorrichtung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Carbonylreduktase aus Candida parapsi losis enthält.

38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß sie Co-Faktoren aus der Gruppe der wasserstoff übertragenden Co-Faktoren enthält.

39. Vorrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Co-Faktoren NAD⁺ oder NADP⁺ enthält.

40. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel zum Anlegen eines Vakuums an den Re aktionsraum enthält.

41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel zur kontinuierlichen Zufuhr des zu trennenden Stoffgemisches sowie Mittel zur kontinu ierlichen Entfernung des Retentats und Permeats aus dem Reaktionsraum umfaßt.

42. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel zur kontinuierlichen Analyse und Steuerung der Produkt- bzw. Co-Produktbildung um faßt.