DE10054426A1 - Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion - Google Patents
Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-DetektionInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion von Fluorophoren. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung, ein gattungsgemäßes Verfahren zu entwickeln, mit dem die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik vermieden werden und mit dem eine hochempfindliche und schnelle Detektion von Multifluoreszenzen von Fluorophoren im Bereich von Sub-Nanosekunden bis zu einigen Millisekunden gleichzeitig gewährleistet ist, wird durch eine simultane Messung der Abklingzeit der Fluoreszenzen gelöst, wobei die Anregungswellenlängen für die einzelnen Fluorophore durch ein optisches Delauy 4 im Bereich von Sub-Nanosekunden bis zu einigen Millisekunden verzögert auf die zu untersuchenden Objekt geführt werden, so daß die Fluoreszenzen nacheinander angeregt und detektiert werden können. DOLLAR A Zur Differenzierung zwischen mindestens zwei Fluorophoren wird zusätzlich zu ihrer spektralen Charakteristik das Abklingverhalten der Fluoreszenzvorgänge durch das Verschieben von elektrischen Toren im Nanosekunden-Bereich entlang einer Zeitachse untersucht.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Multi-Fluores
zenz-Detektion gemäß den Ansprüchen 1, 2 und 3.
Unter einem Fluoreszenzfarbstoff wird sowohl eine im
Untersuchungsgegenstand natürlich vorkommende als auch eine
zum Zwecke der Markierung, z. B. durch chemische Bindung,
hinzugefügte fluoreszierende Molekülespezies verstanden.
Weiterhin versteht man unter Fluoreszenzfarbstoff auch
durch Gentransfer induzierte Proteinfluoreszenzen, wie z. B.
"green fluorescent protein" (GFP), "blue fluorescent
protein" (BFP) und deren Abkömmlinge.
Fluoreszenzspektroskopische Meßmethoden erlangen aufgrund
der hohen Nachweisempfindlichkeit und Spezifität eine
wachsende Bedeutung, insbesondere in der biotechnologischen
und medizinischen Diagnostik.
Die Charakterisierung der Eigenschaften von Zellen und
Geweben spielt eine große Rolle bei der Erkennung und
Lokalisierung von krankhaft verändertem Gewebe, bei der
Qualitätskontrolle von Transplantationsmaterialien oder bei
der Prozeßsteuerung in der Zellkultivierung.
Zellen besitzen die Eigenschaft, eine charakteristische,
bläuliche Fluoreszenz nach Bestrahlung mit kurzwelligem
Licht auszusenden. Für dieses Verhalten sind insbesondere
zelleigene, am Stoffwechsel beteiligte Moleküle verantwort
lich, wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH), Flavine,
Porphyrine.
Um Fluoreszenz anzuregen, werden die Fluorophore mit
monochromatischem Licht im Absorptionsmaximum bestrahlt.
Als Anregungsquellen werden entweder gefilterte Lampen oder
Laser verwendet. Durch spektrale Filterung der Emission
wird die gewünschte Fluoreszenzbande ausgewählt.
Darüber hinaus können laserinduzierte Fluoreszenzsignale
allgemein zur Charakterisierung eines Untersuchungsgegen
standes, zum Beispiel von Lösungen oder Oberflächen fester
Körper ausgewertet werden.
Die üblichen Verfahren zur Fluoreszenzdetektion sind sta
tische Verfahren, welche Informationen über die Intensität
und die spektrale Verteilung des emittierten Lichts zumeist
in Form eines statischen Fluoreszenz-Spektrums liefern.
Über das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzen
können in der Regel keine Aussagen getroffen werden.
Liegen Proben mit mehreren unterschiedlichen Fluores
zenzmarkierungen vor, werden die einzelnen Fluorophore
zeitlich oder räumlich nacheinander nachgewiesen. Dazu ist
eine aufwendige Filterwechseleinrichtung (bei Laseranregung
mehrere Laser) sowohl bei der Fluoreszenzanregung als auch
bei der Fluoreszenzemission nötig.
Beispiele hierfür geben die von den Firmen BMG
Labtechnologies GmbH, D-77656 Offenburg, BIO-TEK Kontron
Instruments GmbH, D-85375 Neufahrn, Packard Instrument
Company, Connecticut/USA, Wallac Distribution GmbH, D-79111
Freiburg, angebotenen Fluorometer.
Nachteilig ist es bei diesen bekannten Geräten, daß keine
gleichzeitige Messung der verschiedenen Fluoreszenzmolekül-
Spezies, sondern nur eine zeitliche Nacheinandermessung der
Proben möglich ist. Diese Messungen sind mit einem
unbefriedigend hohen Zeitaufwand, der zum Teil durch den
erforderlichen Filterwechsel (Filterräder) bedingt ist,
verbunden.
Mehrere Fluorophore können durch die bisher bekannt ge
wordenen Verfahren nicht gleichzeitig nachgewiesen werden,
wenn eine hohe Empfindlichkeit verlangt wird; orts- und
zeitveränderliche Proben können nicht detektiert werden.
Würden bei Mehrfachmarkierung alle Fluorophore gleichzeitig
angeregt und detektiert werden, dann würden die Nachweis
grenzen durch Emissionsüberlagerungen, Lichtstreuung und
Anregungsüberlagerung im Detektionskanal derart stark
ansteigen, daß bei den meisten analytischen Fragestellungen
keine zufriedenstellenden Aussagen gewonnen werden können.
Ein Vierkanal-Fluoreszenzdetektor für die Anwendung in der
Kapillar-Elektrophorese (US 6,039,925) versucht das Problem
des Filterwechsels zu umgehen, indem er vier in einer Reihe
angeordnete Mikrolinsen mit vier Bandpaßfiltern versehen
längs einer Kapillare positioniert. Die Probe bewegt sich
längs der Kapillare an den vier Detektionspunkten vorbei.
Nachteilig bei dieser Anordnung ist, daß bei Gleichlicht-
Anregung ein Übersprechen der Anregungsstrahlung eines
Kanals auf einen anderen Detektionskanal nicht vermieden
werden kann. Dieses Übersprechen durch Lichtstreuprozesse
in der Lösung, in Gläsern und an Grenzflächen kann nie
vollständig vermieden werden. Die Selektivität des
Simultannachweises der vier verschiedenen Fluorophore muß
somit erheblich eingeschränkt bleiben.
Mehrfachfluoreszenzen können bei stationären Simultan
messungen nicht signifikant getrennt detektiert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein gattungsgemässes Verfah
ren zu entwickeln, mit dem die beschriebenen Nachteile des
Standes der Technik vermieden werden und mit dem eine
hochempfindliche und schnelle Detektion von Multi
fluoreszenzen von Fluorophoren im Bereich von Sub-
Nanosekunden bis zu einigen Millisekunden gleichzeitig
gewährleistet ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch Verfahren gemäß den
Merkmalen der Ansprüche 1, 2 und 3 gelöst.
Nach den Merkmalen des Anspruchs 1 werden die Anregungs
wellenlängen für die einzelnen Fluorophore durch ein
optisches Delay im Bereich von Sub-Nanosekunden bis zu
einigen Millisekunden verzögert auf die zu untersuchenden
Objekte geführt, und zur Differenzierung zwischen min
destens zwei Fluorophoren wird zusätzlich zu ihrer
spektralen Charakteristik das Abklingverhalten der
Fluoreszenzvorgänge durch das Verschieben von elektro
nischen Toren im Bereich von Sub-Nanosekunden bis zu
einigen Millisekunden entlang einer Zeitachse untersucht.
Durch die Kombination des Prinzips der verzögerten
Fluoreszenzanregung mit dem Prinzip der getorten
Signalabtastung wird eine maximale Signifikanz der Trennung
multipler Fluoreszenzen erreicht.
Nach den Merkmalen des Anspruchs 2 werden die Anregungs
wellenlängen für die einzelnen Fluorophore durch ein
optisches Delay im Bereich von Sub-Nanosekunden bis zu
einigen Millisekunden verzögert auf die zu untersuchenden
Objekte geführt, so daß die Fluoreszenzen nacheinander
angeregt und detektiert werden können.
Bei dem Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion von
Fluorophoren durch eine simultane Messung der Abklingzeit
der Fluoreszenzen nach Anspruch 3 wird zur Differenzierung
zwischen mindestens zwei Fluorophoren zusätzlich zu ihrer
spektralen Charakteristik das Abklingverhalten der Fluores
zenzvorgänge durch das Verschieben von elektronischen Toren
im Nanosekunden-Bereich entlang einer Zeitachse untersucht.
Eine erhöhte Signifikanz der Fluoreszenztrennung kann dabei
nur genutzt werden, wenn die verwendeten Fluorphore
signifikante Unterschiede der Fluoreszenz-Lebensdauer
aufweisen.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können durch die zu
sätzlich gewonnene Zeitinformation Substanzen unterschie
den werden, deren spektrale Eigenschaften sich gleichen.
Neben einer hohen Empfindlichkeit kann eine maximale
Selektivität bei der Signaldetektion erreicht werden durch
eine unterschiedliche Positionierung eines elektronischen
Zeittores.
Bei der Anwendung des Verfahrens auf die Detektion von
mehreren, unterschiedlich fluoreszenzmarkierten gelösten
Proben in der Flüssigkeits-Chromatographie ist der Nachweis
aller Fluoreszenzmarkierungen zur gleichen Zeit am gleichen
Ort möglich, wodurch Peakveränderungen im Chromatogramm
vermieden werden können.
Es ist eine selektive Detektion von durch die Chroma
tographie nicht räumlich getrennten Proben durch ihre
Fluoreszenzeigenschaften gewährleistet.
Bei der Anwendung des Verfahrens auf die Detektion von
mehreren unterschiedlichen fluoreszierenden Proben in allen
elektrophoretischen Trennverfahren ist der Nachweis aller
Fluoreszenzen in Echtzeit am gleichen Ort möglich, wodurch
Banden- bzw. Peakveränderungen im Elektrophoretogramm
vermieden werden können.
Es ist eine selektive Detektion von durch die
Elektrophorese nicht räumlich getrennten Proben durch ihre
Fluoreszenzeigenschaften gewährleistet.
Bei der Anwendung des Verfahrens auf die Detektion von
Fluoreszenzfarbstoffen in Multiwellplatten ist die Erfas
sung aller Fluoreszenzfarbstoffe quasi gleichzeitig (in
Echtzeit) innerhalb nur eines Scan-Vorgangs ohne
zeitraubendes Umschalten von Filtern möglich.
Alle Probenfluoreszenzen können unter Vermeidung eines
Temperaturganges, wie er bei sequentiellen Meßverfahren
auftreten kann, erfaßt werden.
Die Kinetik mehrerer unterschiedlich markierter Proben kann
simultan erfaßt werden.
Bei der Anwendung des Verfahrens auf die Polymerase-
Kettenreaktion (PCR), und hierbei insbesondere auf die
quantitative und die Multiplex-PCR, können während eines
Amplifikations-Vorganges simultan mehrere amplifizierte
Fluoreszenzfarbstoffe in Echtzeit quantitativ detektiert
und somit eine Endpunktbestimmung, als Abbruchbedingung für
einen erfolgreichen Vorgang, vorgenommen werden.
Bei der Anwendung des Verfahrens auf die Mehrfach-
Fluoreszenzdetektion an lebendem Gewebe besteht die
Möglichkeit der quantitativen oder semiquantitativen
Erfassung der Probenfluoreszenzen oder deren Verhältnisse
durch die Vermeidung von stochastischen oder repititiven
Bewegungen der Gewebe durch Pulsschlag, Lungenbewegung oder
anderen Ursachen. Der Einfluß einer hinreichend langsamen
Veränderung der geometrischen Anordnung von Anregungs- und
Detektionsoptik auf die Verhältnismessung der unterschied
lich fluoreszierenden Proben wird vermieden.
Bei der Anwendung auf die Mehrfach-Fluoreszenzdetektion auf
planaren, partikulären, fibrilären Trägern wie DNA-
/Protein-Chip können die Proben ohne Anhalten der Mechanik
gescannt werden, da die Bewegung keinen Einfluß auf die
Verhältnisse der Fluoreszenzsignale hat.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eröffnen eine große Anwen
dungsbreite auf Gebieten, in denen konventionelle Fluores
zenzspektrometer versagen, wie zum Beispiel Untersuchungen
an Proben in gelöster Form, Differenzierung von Gewebe
zuständen, Stoffwechseluntersuchungen, Wachstumsphasen bio
technologischer Zellkulturen in Bioreaktoren, analythische
Trennverfahren wie CZE, HPLC.
Zweckmässige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen beschrieben.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines konkreten
Ausführungsbeispiels näher dargestellt. Die zugehörige
Zeichnung zeigt:
Fig. 1 die schematische Darstellung eines
konkreten Ausführungsbeispiels für
vier verschiedene Fluoreszenzmarker
und
Fig. 2. die grafische Darstellung des
Verhaltens von Fluoreszenz
signalen zweier Farbstoffe über der
Zeit.
Entsprechend der Darstellung in der Fig. 1 wird als Anre
gungsquelle ein Impulslaser 1 verwendet, z. B. ein
Stickstofflaser mit einer Impulsbreite von ca. 1 ns. Die
emittierte Strahlung wird z. B. über halbdurchlässige
Spiegel 2 aufgeteilt und n Farbstofflasern 3 zugeführt. Die
Farbstofflaser 3 emittieren entsprechend dem eingesetzten
Laserfarbstoff die nötige Anregungsstrahlung, wobei der
Impulslaser 1 auch direkt als Anregungsquelle benutzt
werden kann. Die Anregungsstrahlung wird über ein optisches
Delay 4, z. B. Glasfasern, derart verzögert, daß immer nur
ein in der Probe enthaltener Fluoreszenzfarbstoff nahe
seinem Absorptionsmaximum angeregt wird. Durch die
Verzögerung muß sichergestellt sein, daß der jeweilige
Fluoreszenzfarbstoff bis zum nächsten Anregungsvorgang
vollständig abgeklungen ist. Das setzt die Kenntnis der
Lebensdauer der nachzuweisenden Fluoreszenzfarbstoffe
voraus. Die Anregungsstrahlung wird der Fluoreszenzprobe 7
über Lichtwellenleiter 5, 6 zugeführt. Die Fluoreszenz
signale werden auf einen optischen Detektor 9, zum Beispiel
über die faseroptischen Verbindungen 5, 6, geleitet. Die
Fluoreszenzsignale können zusätzlich über Filter 8 spektral
gefiltert werden. Der Detektor 9 muß im Zeitbereich den
Fluoreszenzsignalen annähernd folgen können (z. B. Foto
dioden, SEV). Das elektrische Signal des Detektors 9 ist
damit ein Abbild der angeregten Fluoreszenz im Zeitbereich
(Fig. 2). Ein getorter Integrator 10, mit einer Torzeit
deutlich kürzer als die Lebensdauer der Fluoreszenz (z. B.
1 ns), kann zu einem definierten Zeitpunkt das Signal
abtasten.
Entsprechend der Darstellung in der Fig. 2 kann, unter der
Voraussetzung, daß die nachzuweisenden Fluoreszenzfarb
stoffe A und B unterschiedliche Lebensdauern haben, das
Fluoreszenzsignal β, gemessen in der Torlage b, vollständig
vom Fluoreszenzsignal α des Farbstoffes A, gemessen in der
Torlage a, abgetrennt werden. Dieses Verfahren ermöglicht
die Trennung von Fluoreszenzfarbstoffen auch dann, wenn sie
sich nicht durch die Wahl der Anregungswellenlänge oder/und
der Emissionswellenlänge trennen lassen.
Das elektrische Signal, welches der getorte Integrator 10
liefert, kann danach in einem A/D-Wandler 11 digitalisiert
und in einem PC 12 weiterverarbeitet werden.
1
Impulslaser
2
Strahlteilerspiegel
3
Farbstofflaser
4
Delaymodul
5
Lichtwellenleiter
6
Lichtwellenleiter
7
Probe
8
Filter
9
Photodetektor
10
getorter Integrator
11
Analog-Digital-Wandler
12
Rechner (PC)
a Torlage
b Torlage
α/A Fluoreszenzsignal/Farbstoff
β/B Fluoreszenzsignal/Farbstoff
a Torlage
b Torlage
α/A Fluoreszenzsignal/Farbstoff
β/B Fluoreszenzsignal/Farbstoff
Claims (13)
1. Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion von Fluo
rophoren durch eine simultane Messung der Abkling-,
Zeit der Fluoreszenzen, wobei die Anregungswellen
längen für die einzelnen Fluorophore durch ein
optisches Delay (4) im Bereich von Sub-Nanosekunden
bis zu einigen Millisekunden verzögert auf die zu
untersuchenden Objekte (7) geführt werden, so daß
die Fluoreszenzen nacheinander angeregt und detek
tiert werden können, und wobei zur Differenzierung
zwischen mindestens zwei Fluorophoren zusätzlich zu
ihrer spektralen Charakteristik das Abklingverhalten
der Fluoreszenzvorgänge durch das Verschieben von
elektronischen Toren im Nanosekunden-Bereich entlang
einer Zeitachse untersucht wird.
2. Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion von Fluo
rophoren durch eine simultane Messung der Abkling
zeit der Fluoreszenzen, wobei die Anregungswellen
längen für die einzelnen Fluorophore durch ein
optisches Delay (4) im Bereich von Sub-Nanosekunden
bis zu einigen Millisekunden verzögert auf die zu
untersuchenden Objekte (7) geführt werden, so daß
die Fluoreszenzen nacheinander angeregt und
detektiert werden können.
3. Verfahren zur Multi-Fluoreszenz-Detektion von Fluo
rophoren durch eine simultane Messung der Abkling
zeit der Fluoreszenzen, wobei zur Differenzierung
zwischen mindestens zwei Fluorophoren zusätzlich zu
ihrer spektralen Charakteristik das Abklingverhalten
der Fluoreszenzvorgänge durch das Verschieben von
elektronischen Toren im Nanosekunden-Bereich entlang
einer Zeitachse untersucht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Delay (4) durch Lichtwellen
leiter gebildet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das elektronische Zeittor im
Maximum des Zeitverlaufs der Lebensdauer des Fluores
zenzsignals positioniert wird, um schnell abklingende
Fluoreszenzprozesse selektiv zu detektieren.
6. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das elektronische Zeittor im
Ausklang des Zeitverlaufs der Lebensdauer des
Fluoreszenzsignals positioniert wird, um langsam
Abklingende Fluoreszenzprozesse selektiv zu
detektieren.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß mehrere, unterschiedliche
Fluoreszenzfarbstoffe in der Flüssigkeits-
Chromatographie detektiert werden.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß Fluoreszenzfarbstoffe in Multi
wellplatten detektiert werden.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Mehrfach-Fluoreszenzdetek
tion an lebendem/totem Gewebe vorgenommen wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Mehrfach-Fluoreszenzdetek
tion auf planaren, partikulären, fibrilären Trägern
wie DNA-/Protein-Chip vorgenommen wird.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Verfahren bildgebend und
der Detektor eine Kamera ist.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Mehrfach-Fluoreszenz
detektion und Endpünktbestimmung während der PCR,
insbesondere quantitative und Multiplex PCR,
vorgenommen wird.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß mehrere Fluoreszenzfarbstoffe in
Elektrophorese-Gelen, -kapillaren und -Blots
detektiert werden.
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