DE10051259A1 - Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-Rezeptor - Google Patents
Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-RezeptorInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein nicht-menschliches Säugetier, das einen veränderten, vorzugsweise inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptor (PAC1) aufweist. Ferner werden Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Charakterisierung von Genen und/oder Testung von Substanzen, Arzneimitteln und Therapieansätzen hinsichtlich Erkrankungen, wie z. B. viszerale Schmerzzustände, Lernschwäche, Angstzustände oder dilatative Kardiomyopathie, beschrieben.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches
Säugetier, das einen veränderten, vorzugsweise inaktivierten
PACAP-Typ-I-Rezeptor (PAC1) aufweist. Ferner betrifft die
vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines solchen
Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Charakterisierung von
Genen und/oder Testung von Substanzen, Arzneimitteln und
Therapieansätzen hinsichtlich verschiedener Erkrankungen, wie
z. B. viszerale Schmerzzustände, Lernschwäche, Angstzustände
oder dilatative Kardiomyopathie.
Der PACAP-Typ-I-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter
Rezeptor, der das stark konservierte Neuropeptid PACAP
("pituitary adenylate cyclase activating polypeptide") mit
einer tausendfach höheren Affinität als das verwandte Peptid
VIP bindet. Es wird angenommen, dass die hiermit von dem
PACAP-Typ-I-Rezeptor vermittelte Signalübertragung an einer
breiten Palette von physiologischen Prozessen beteiligt ist,
zu denen Neurotransmitter/neurotrophe Aktionen, neuronale
Differenzierung, synaptische Plastizität und Fruchtbarkeit
zählen.
Die Therapie von Erkrankungen, die mit einem gestörten
Lernverhalten, z. B. Lernschwäche, oder mit Schmerzen,
übermäßigem Angstverhalten oder dilatativer Kardiomyopathie
einhergehen, konnte bisher nur unbefriedigend durchgeführt
werden, was zum großen Teil daran liegt, dass - wenn überhaupt
- nur Medikamente zur Verfügung stehen, die relativ
unspezifisch wirken bzw. unerwünschte Nebenwirkungen
aufweisen. Um eine neue Gruppe von Therapeutika erhalten zu
können, die diese Nachteile nicht haben, wäre es somit
wünschenswert, Zielgene und deren Produkte charakterisieren zu
können, die mit diesen Erkrankungen in Zusammenhang stehen,
wobei als Zielorgan in erster Linie das Gehirn in Frage kommt.
Die Identifizierung von Zielgenen wird dann neue Ansatzpunkte
für Therapien ermöglichen. So könnten Medikamente entwickelt
werden, die im Vergleich zu den bisher eingesetzten
Medikamenten eine höhere Spezifität und daher geringere
Nebenwirkungen aufweisen. Allerdings fehlten bisher die
Voraussetzungen für die Entwicklung solcher Medikamente, vor
allem aufgrund des Mangels geeigneter Modellsysteme, d. h.,
z. B. von genetisch modifizierten Tieren, die die Untersuchung
der Auswirkungen der Veränderung oder Inaktivierung von Genen
erlauben, die mit diesen Erkrankungen in Zusammenhang stehen,
vor allem da solche Gene bisher nicht oder nur unzureichend
bekannt waren.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem
zugrunde, Mittel bereitzustellen, die die Identifizierung von
Genen erlauben, die an der Entstehung von Erkrankungen
beteiligt sind, die mit einem gestörten Lernverhalten, z. B.
Lernschwäche, mit Schmerzen, übermäßigem Angstverhalten oder
dilatativer Kardiomyopathie einhergehen, und somit von
therapeutischem Nutzen sind, da durch Beeinflussung der
Expression dieser Gene die gewünschte therapeutische Wirkung
erzielt werden kann.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die in
den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.
Es stellte sich heraus, dass es sich bei dem für den PACAP-
Typ-I-Rezeptor kodierenden Gen um ein Gen handelt, das für die
vorstehenden Zwecke sehr gut geeignet ist. Daher können die
vorstehend diskutierten Probleme durch die Bereitstellung
eines Modellsystems angegangen werden, indem Tiere, z. B.
Mäuse, erzeugt werden, bei denen das für den PACAP-Typ-I-
Rezeptor kodierende Gen verändert bzw. inaktiviert ist. Bei
den zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen
wurden zwei verschiedene Mausmutanten erzeugt, die zum einen
eine ubiquitäre Inaktivierung und zum anderen eine
gewebespezifische Inaktivierung des PACAP-Typ-I-Rezeptors
aufweisen. In beiden Fällen wurde das Cre loxP-System
verwendet und Exon 11 des PAC1-Gens mit loxP-Stellen
flankiert. Mäuse mit einer ubiquitären Inaktivierung des
PACAP-Typ-I-Rezeptors zeigten eine verringerte Ängstlichkeit
und gesteigerte Lokomotion. Außerdem zeigten diese Tiere ein
spezifisches Defizit im Hippocampus-abhängigen
Assoziationslernen. Andere Gedächtnistests (deklaratives
Gedächtnis) blieben unbeeinflußt. Desweiteren war das
viszerale Schmerzempfinden der Mäuse mit einer ubiquitären
Inaktivierung des Rezeptors drastisch verringert.
Darüberhinaus wiesen diese Mäuse eine dilatative
Kardiomyopathie auf. Mäuse mit einer vorderhirnspezifischen
Inaktivierung des Rezeptorgens zeigten keine Auffälligkeiten
im Angstverhalten oder in der Lokomotion, jedoch - wie die
Mäuse mit einer ubiquitären Inaktivierung des Rezeptorgens -
ein Defizit im hippocampusabhängigen Assoziationslernen. Somit
konnte gezeigt werden, dass eine Zerstörung dieses
Rezeptorgens in vivo weitreichende Folgen für das viszerale
Schmerzempfinden, das Assoziationslernen und die Ängstlichkeit
hat sowie dilatative Kardiomyopathie hervorruft, wodurch der
PACAP-Typ-I-Rezeptor bzw. das für diesen Rezeptor kodierende
Gen einen wertvollen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer
Medikamente darstellt. Die erfindungsgemäßen Knockout-Mäuse
erlauben die Suche nach Genen, die über den PACAP-Typ-I-
Rezeptor reguliert werden und deren Mißregulation in den
PACAP-Typ-I-Rezeptor-defizienten Mäusen der Grund für die
vorstehend beschriebenen Defizite ist. Somit ermöglichen diese
Knockout-Mäuse die Identifizierung neuer Gene, die an
Prozessen, wie Lernen, Schmerz, Ängstlichkeit und dilatativer
Kardiomyopathie, beteiligt sind und ihrerseits Ausgangspunkt
für die Entwicklung neuer Medikamente, z. B. Anxiolytika oder
gedächtnisfördernde Therapeutika, sein können. Da der PACAP-
Typ-I-Rezeptor besonders für die Weiterleitung des viszeralen
Schmerzes, nicht jedoch des somatischen Schmerzes von
Bedeutung ist, können sehr selektive Therapeutika,
vorzugsweise zur Behandlung des Tumorschmerzes, entwickelt
werden, deren Nebenwirkungen deutlich unter denen breiter
wirkender Analgetika liegen dürften.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein nicht-
menschliches Säugetier, bei dem der PACAP-Typ-I-Rezeptor
(PAC1) ubiquitär oder gewebespezifisch verändert,
vorzugsweise inaktiviert ist. Charakteristisch für dieses
Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-Rezeptor ist eine
Kombination von zwei genetischen Manipulationen: (a) Einfügung
von zwei Erkennungsstellen für eine Rekombinase so in das für
PAC1 kodierende Gen, dass dieses in seiner Funktion nicht
beeinträchtigt wird, jedoch die Exzision der zwischen den
Erkennungsstellen liegenden Information zur Expression eines
inaktiven PAC1 führt und (b) Einfügung eines Gens, das für
eine Rekombinase kodiert, die die vorstehenden
Erkennungsstellen erkennt und unter Kontrolle eines
gewebespezifischen Promotors steht. Die Begrenzung der
Veränderung, vorzugsweise Inaktivierung des PAC1 in
definierten Zieltypen bzw. Zielorganen, erlaubt somit eine
direkte Charakterisierung der Rezeptorfunktion in diesen
Zellen ohne Beeinträchtigung durch weitere Einflüsse, die auf
eine zusätzliche Inaktivierung des PAC1 in anderen Zelltypen
zurückzuführen wäre. Für die Erzeugung von Tieren mit einem
ubiquitär veränderten Gen kann neben anderen Vorgehensweisen
auch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise verwendet
werden, wobei das für die Rekombinase kodierende Gen unter der
Kontrolle eines nicht-gewebespezifischen Promotors steht.
Der hier verwendete Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier"
umfaßt jedes Säugetier, dessen PAC1 ubiquitär oder
gewebespezifisch verändert, vorzugsweise inaktiviert werden
kann, beispielsweise Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind,
Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus
bevorzugt ist.
Der hier verwendete Ausdruck "ubiquitär oder gewebespezifisch
veränderter PACAP-Typ-I-Rezeptor" umfaßt jeden PACAP-Typ-I-
Rezeptor eines nicht-menschlichen Säugetiers, der sich
hinsichtlich der biologischen Funktion von dem Wildtyp
unterscheidet, vorzugsweise inaktiv ist. Die Herstellung eines
erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Säugetiers kann
beispielsweise durch die in den nachstehenden Beispielen
beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Inaktivierung des PACAP-
Typ-I-Rezeptors kann beispielsweise dadurch erreicht werden,
dass das kodierende Gen so verändert wird, dass ein PACAP-Typ-
I-Rezeptor exprimiert wird, bei dem die Liganden-bindende
Domäne inaktiviert ist oder eine oder mehrere Transmembran-
Domänen deletiert sind. Vorzugsweise ist eine Transmembran-
Domäne oder ein Teil davon deletiert, wobei am meisten
bevorzugt eine Deletion von Exon 11 ist, die zur Deletion des
größten Teils der Transmembran-Domäne IV des Rezeptors führt.
Die gewebespezifische Veränderung/Inaktivierung des PACAP-Typ-
I-Rezeptors ist nicht auf bestimmte Gewebe beschränkt und kann
letztendlich alle Gewebe betreffen, für die entsprechende
gewebespezifische Promotoren zur Verfügung stehen.
Vorzugsweise ist die Funktion des PACAP-Typ-I-Rezeptors im
Gehirn inaktiviert, beispielsweise durch Verwendung einer
unter Kontrolle des Nestin-Promotors stehenden Rekombinase,
noch mehr bevorzugt ist die vorderhirnspezifische
Inaktivierung, was z. B. durch die Verwendung einer unter
Kontrolle des CaMKIIα-Promotors (Kellendonk et al., J. Mol.
Biol. 285 (1999), 175-182) stehenden Rekombinase erreicht
werden kann.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann
vorzugsweise durch ein Verfahren erhalten werden, das folgende
Schritte umfaßt:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht- menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der nach Rekombination mit dem Genom des nicht-menschlichen Säugetiers zur Insertion von zwei Erkennungsstellen für eine Rekombinase in die für den PACAP-Typ-I-Rezeptor kodierende DNA führt, wobei einerseits die Insertion der beiden Erkennungsstellen die Expression eines biologisch aktiven Rezeptors nicht nachteilig beeinflußt und andererseits die beiden Erkennungsstellen einen Genbereich flankieren, dessen Verlust zur Expression eines in seiner biologischen Aktivität veränderten oder inaktivierten Rezeptors führt;
- b) Isolierung von in Schritt (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in ein erstes nicht- menschliches Säugetier;
- c) Injektion von Oocyten eines zweiten nicht-menschlichen Säugetiers mit einem das Gen für eine Rekombinase unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors enthaltenden Vektor;
- d) Einführung der injizierten Oocyten von Schritt (c) in ein zweites nicht-menschliches Säugetier;
- e) Kreuzung der nicht-menschlichen Säugetiere aus Schritt (b) und (d); und
- f) Selektion der nach Schritt (e) erhaltenen Nachkommen auf solche mit einem gewebespezifisch veränderten, insbesondere inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptor.
Für die Ausdrücke "nicht-menschliches Säugetier" und
"ubiquitär oder gewebespezifisch veränderter PACAP-Typ-I-
Rezeptor" gelten die vorstehenden Ausführungen entsprechend.
Der hier verwendete Ausdruck "embryonale Stammzellen" umfaßt
alle embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen
Säugetiers, die sich zur Mutation der für den PACAP-Typ-I-
Rezeptor kodierenden DNA eignen. Vorzugsweise sind die
embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere E14/1-
Zellen.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" betrifft jeden Vektor,
der (a) nach Rekombination mit dem Genom des nicht-
menschlichen Säugetiers zur Insertion von zwei
Erkennungsstellen für eine Rekombinase in die für den PACAP-
Typ-I-Rezeptor kodierende DNA führt, wobei hinsichtlich der
Funktion/Lokalisation der Erkennungsstellen die vorstehend
gemachten Angaben gelten, oder der (b) die Integration eines
für eine Rekombinase kodierenden, unter Kontrolle eines
(gewebespezifischen) Promotors stehenden Gens in das Genom
erlaubt, wobei die Erkennungsstellen des Vektors aus (a) mit
der Rekombinase des Vektors aus (b) kompatibel sein müssen,
d. h. von dieser erkannt werden. Die gewebespezifische
Ausschaltung des PACAP-Typ-I-Promotors kann beispielsweise
dadurch erreicht werden, daß die beiden Erkennungsstellen für
die Rekombinase so in das Genom inseriert werden, daß mittels
der entsprechenden, unter Kontrolle eines gewebespezifischen
Promotors liegenden Rekombinase die vorstehend diskutierten
Bereiche des Rezeptors inaktiviert oder deletiert werden.
Ferner ist es günstig, wenn der Vektor einen Marker aufweist,
mit dem auf Stammzellen selektioniert werden kann, in denen
die gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker
ist beispielsweise die loxP/tkneo-Kassette, die mit Hilfe des
Cre/loxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um
die Schritte (a) bis (f) des vorstehenden Verfahrens
durchzuführen. Beispielsweise wird er die in Schritt (a)
stabil transfizierten Zellen in Blastozysten eines Säugetier-
Spenderweibchens injizieren. Die Blastozysten werden dann in
scheinschwangere Säugetier-Weibchen eingeführt. Einige der
transferierten Blastozysten entwickeln sich zu Maus-Chimären,
von denen einige ein modifiziertes PACAP-Typ-I-Rezeptor-Allel
in den Keimzellen tragen. Durch entsprechende Kreuzungen
werden dann hetero- und homozygote Säugetiere erhalten. Durch
Verpaarung dieser Säugetiere und Kreuzung mit Säugetieren, die
für eine unter der Kontrolle eines gewebespezifischen
Promotors stehende Rekombinase kodieren, werden Säugetiere
erhalten, die homozygot für das modifizierte PACAP-Typ-I-
Rezeptor-Allel und heterozygot für das Rekombinase-Gen sind.
Hinsichtlich des Selektionsschritts (f) wird der Fachmann
Verfahren anwenden, bei denen in den gewünschten Geweben
nachgewiesen werden kann, dass der Rezeptor hinsichtlich
seiner biologischen Aktivität verändert oder inaktiviert ist,
z. B. dadurch, dass bestimmt wird, inwieweit die Induktion von
PACAP-Typ-I-Rezeptor-abhängigen Genen abgeschwächt bzw.
verhindert ist.
Die Wahl des die Rekombinase kontrollierenden Promotors hängt
davon ab, in welchem Gewebe bei dem erfindungsgemäßen nicht-
menschlichen Säugetier der PACAP-Typ-I-Rezeptor in seiner
biologischen Funktion verändert, vorzugsweise inaktiviert,
werden soll. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt.
Solche werden z. B. für das Nervensystem (Neuronen und
Gliazellen) als Nestin-Cre in Zimmermann et al., Neuron 12
(1994), 11-24, für postnatale Neuronen als Thy-1/2 Cre in
Vidal et al., EMBO J. 9 (1990), 833-840, für postnatales
Vorderhirn als CamkIIα-Cre z. B. in Mayford et al., Cell 81
(1995), 891-904, für Hepatozyten als Albumin/α-Fetoprotein-
Cre in Pinkert et al., Genes and Dev. 1 (1987), 268-276, für
T-Zellen als Lck-Cre in Orban et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
89 (1992), 6861-6865, und für Makrophagen als Lysozym-Cre
beschrieben.
Für das erfindungsgemäße nicht-menschliche Säugetier bzw.
Verfahren kann jedes System aus Erkennungsstelle/Rekombinase
verwendet werden, das die wirksame Exzision des zwischen den
Erkennungsstellen für die Rekombinase liegenden Gens bzw.
Genabschnitts erlaubt. Geeignete Systeme sind dem Fachmann
bekannt. Hierzu zählen z. B. das LoxP/Cre-Rekombinase-System
oder das FRT/FLP-Rekombinase-System (Sauer and Hendersen,
Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 5166-5170), wobei das
LoxP/Cre-System bevorzugt wird. Besonders bevorzugt ist es,
wenn die LoxP-Stellen Exon 11 des für den PACAP-Typ-I-Rezeptor
kodierenden Gens flankieren.
Das vorstehend beschriebene Vorgehen eignet sich auch für die
Herstellung eines erfindungsgemäßen nicht-menschlichen
Säugetiers, bei dem der PACAP-Typ-I-Rezeptor ubiquitär
verändert/inaktiviert ist. Dies kann dadurch erreicht werden,
dass die Rekombinase unter der Kontrolle eines nicht-
gewebespezifischen Promotors steht; siehe dazu auch die
Ausführungen im nachstehenden Beispiel 1. Alternativ kann ein
solches erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier mit
einem ubiquitär veränderten PACAP-Typ-I-Rezeptor auch durch
ein Verfahrens erhalten werden, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht- menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der nach homologer Rekombination mit dem Genom des nicht- menschlichen Säugetiers zur Erzeugung eines für einen veränderten oder inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptor kodierenden Gens führt;
- b) Isolierung der in Schritt (a) erhaltenen Zellen und Einbringung dieser in Blastozysten;
- c) Einführung der injizierten Blastozysten von Schritt (b) in ein nicht-menschliches Säugetier; und
- d) Untersuchung des nach Schritt (c) erhaltenen nicht- menschlichen Säugetiers hinsichtlich eines ubiquitär veränderten, insbesondere inaktivierten PACAP-Typ-I- Rezeptors.
Mit dem erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Säugetier ist es
möglich, die Auswirkungen einer, z. B. gewebespezifischen,
Veränderung bzw. Inaktivierung des PACAP-Typ-I-Rezeptors zu
untersuchen, beispielsweise hinsichtlich der Veränderung der
Expression spezifischer Gene und/oder der damit einhergehenden
phänotypischen Besonderheiten. Beispielsweise hat die
ubiquitäre Inaktivierung des PACAP-Typ-I-Rezeptors
beträchtliche anxiolytische Wirkungen, d. h., der PACAP-Typ-I-
Rezeptor ist an der Entwicklung von Angstzuständen beteiligt.
Auch führt eine solche Inaktivierung des PACAP-Typ-Rezeptors
zu dilatativer Kardiomyopathie. Die vorderhirnspezifische
Inaktivierung führt, genauso wie die ubiquitäre Inaktivierung,
zu einem Defizit hinsichtlich des hippocampusabhängigen
Assoziationslernens. Ein Vergleich der Genexpression in
Tieren, bei denen der PACAP-Typ-I-Rezeptor ubiquitär bzw. nur
im Vorderhirn inaktiviert wurde, mit Kontrolltieren, erlaubt
somit die Identifizierung von Genen, die an Prozessen, wie
Lernen, Schmerz, Ängstlichkeit oder dilatativer
Kardiomyopathie, beteiligt sind und ihrerseits Ausgangspunkt
für die Entwicklung neuer Medikamente, z. B. Anxiolytika oder
gedächtnisfördernde Therapeutika, sein können. Die Kenntnis
dieser Gene und deren Funktion erlaubt dann auch die
Entwicklung neuer Ansatzpunkte für die pharmakologische
Beeinflussung der vorstehend beschriebenen Prozesse,
beispielsweise durch die Bereitstellung von Verbindungen, die
die Expression dieser Gene oder die Aktivität der Genprodukte
spezifisch beeinflussen. Somit können mit dem
erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Säugetier nicht nur Gene
identifiziert werden, die unter der Kontrolle des PACAP-Typ-I-
Rezeptors stehen, sondern darüber hinaus deren Funktion bzw.
die durch Störung der Funktion ausgelösten, möglicherweise
pathogenen Zustände ermittelt werden. Da der PACAP-Typ-I-
Rezeptor besonders für die Weiterleitung des viszeralen
Schmerzes, nicht jedoch des somatischen Schmerzes von
Bedeutung ist, können sehr selektive Therapeutika,
vorzugsweise zur Behandlung des Tumorschmerzes, entwickelt
werden, deren Nebenwirkungen deutlich unter denen breiter
wirkender Analgetika liegen dürften.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung
des nicht-menschlichen Säugetiers zur Charakterisierung von
Genen und/oder Testung von Substanzen, Arzneimitteln und/oder
Therapieansätzen, die einen Einfluß auf mit Lernfähigkeit,
Schmerz, Angstverhalten und dilatativer Kardiomyopathie in
Zusammenhang stehenden Prozessen haben, vorzugsweise handelt
es sich bei diesen Prozessen um Erkrankungen oder damit in
Zusammenhang stehenden Symptomen wie z. B. viszerale
Schmerzustände, Lern- oder Gedächtnisschwäche, Angstzustände
oder dilatative Kardiomyopathie.
Fig. 1: Erzeugung von Mäusen mit einer PAC1-Defizienz
(a) Organisation des PAC1-Gens mit den Exons 7 bis 13: Die Flankierung von Exon 11 mit LoxP-Stellen erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde das modifizierte Allel durch homologe Rekombination in ES-Zellen erzeugt. Dann wurde durch transiente Expression der Cre-Rekombinase die Selektionskasette entfernt, was zur Erzeugung von PAC1loxP und PAC1-Allelen führte. Schemata des Wildtyp-Genlocus, des Zielvektors und der resultierenden Allele sind gezeigt (schwarze Dreiecke: LoxP; K: KpnI; X: XbaI; A und B stellen Sonden außerhalb der Homologie-Arme dar, die für Southern- Blot-Analysen der mit Elektroporation behandelten ES-Zellen verwendet wurden.)
(b, c) RNase-Schutz-Analyse von RNA des gesamten Hirns vom Wildtyp (wt) und PAC1-/--Mäusen
(b) Das 400 bp Wildtyp-Transkript fehlt zwar in PAC1-/-- Gehirnen, es ist jedoch ein schwaches 340 bp Fragment nachweisbar, das ein alternativ gespleißtes Transkript darstellt, das zu einem verkürzten Rezeptor-Protein führt.
(c) PACAP-Typ-II-Rezeptoren (VPAC1 und VPAC2) werden in PAC1-/- -Gehirnen nicht hochreguliert (M: 1 kb-Leiter; GAPDH: Glycerinaldhyd-3-phosphatdehydrogenase).
(d, e, f) In situ-Hybridisierung von Kontroll-, PAC1-/-- und PAC1CaMKCre2-Gehirnen: Im Vergleich zur Kontrolle (d) fehlt PAC1- mRNA im Hippocampus-Bereich von PAC1CaMKCre2-Gehirnen (f) fast völlig und ist auch in PAC1-/--Gehirnen (e) nicht nachweisbar.
(a) Organisation des PAC1-Gens mit den Exons 7 bis 13: Die Flankierung von Exon 11 mit LoxP-Stellen erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde das modifizierte Allel durch homologe Rekombination in ES-Zellen erzeugt. Dann wurde durch transiente Expression der Cre-Rekombinase die Selektionskasette entfernt, was zur Erzeugung von PAC1loxP und PAC1-Allelen führte. Schemata des Wildtyp-Genlocus, des Zielvektors und der resultierenden Allele sind gezeigt (schwarze Dreiecke: LoxP; K: KpnI; X: XbaI; A und B stellen Sonden außerhalb der Homologie-Arme dar, die für Southern- Blot-Analysen der mit Elektroporation behandelten ES-Zellen verwendet wurden.)
(b, c) RNase-Schutz-Analyse von RNA des gesamten Hirns vom Wildtyp (wt) und PAC1-/--Mäusen
(b) Das 400 bp Wildtyp-Transkript fehlt zwar in PAC1-/-- Gehirnen, es ist jedoch ein schwaches 340 bp Fragment nachweisbar, das ein alternativ gespleißtes Transkript darstellt, das zu einem verkürzten Rezeptor-Protein führt.
(c) PACAP-Typ-II-Rezeptoren (VPAC1 und VPAC2) werden in PAC1-/- -Gehirnen nicht hochreguliert (M: 1 kb-Leiter; GAPDH: Glycerinaldhyd-3-phosphatdehydrogenase).
(d, e, f) In situ-Hybridisierung von Kontroll-, PAC1-/-- und PAC1CaMKCre2-Gehirnen: Im Vergleich zur Kontrolle (d) fehlt PAC1- mRNA im Hippocampus-Bereich von PAC1CaMKCre2-Gehirnen (f) fast völlig und ist auch in PAC1-/--Gehirnen (e) nicht nachweisbar.
Fig. 2: PAC1-/--Mäuse zeigen gesteigerte lokomotorische
Aktivität und verringertes Angstverhalten
(a) Während des Beobachtungszeitraums von drei Tagen zeigten PAC1-/--Mäuse gesteigerte horizontale (p < 0,01) und vertikale lokomotorische Aktivität (p < 0,01). Es sind die Ergebnisse des ersten Beobachtungstags dargestellt.
(b, c, d, e, f) "Open field"-Analysen. Es sind zwei tägliche Beobachtungsperioden über einen Zeitraum von fünf Minuten an zwei aufeinanderfolgenden Tagen dargestellt. PAC1-/--Mäuse zeigten gesteigerte lokomotorische Aktivität, was sich aus gesteigerter Allgemeinaktivität (b) (p < 0,0001) und verringerter Ruhezeit (c) (p < 0,0001) ergibt. Darüber hinaus sind PAC1-/--Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp-Nachkommen weniger ängstlich. Sie verbrachten im zentralen Feld mehr Zeit (d) (p < 0,005) und führten im zentralen Feld mehr Stopps durch (e) (p < 0,001), auch legten sie im offenen Feld weniger Faeces-Boli ab (f) (p < 0,0005).
(g, h) PACS-/--Mäuse zeigten ein erniedrigtes Zögern hinsichtlich des Betretens der offenen Abschnitte des "elevated zero-maze" (g) (p < 0,01; vier Pfoten außerhalb) und verbrachten mehr Zeit (p < 0,01) in den offenen Abschnitten (h) (vier Pfoten außerhalb). Wildtyp-Kontrollen (n = 28; offene Balken), PAC1-/- (n = 28; schwarze Balken)
(a) Während des Beobachtungszeitraums von drei Tagen zeigten PAC1-/--Mäuse gesteigerte horizontale (p < 0,01) und vertikale lokomotorische Aktivität (p < 0,01). Es sind die Ergebnisse des ersten Beobachtungstags dargestellt.
(b, c, d, e, f) "Open field"-Analysen. Es sind zwei tägliche Beobachtungsperioden über einen Zeitraum von fünf Minuten an zwei aufeinanderfolgenden Tagen dargestellt. PAC1-/--Mäuse zeigten gesteigerte lokomotorische Aktivität, was sich aus gesteigerter Allgemeinaktivität (b) (p < 0,0001) und verringerter Ruhezeit (c) (p < 0,0001) ergibt. Darüber hinaus sind PAC1-/--Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp-Nachkommen weniger ängstlich. Sie verbrachten im zentralen Feld mehr Zeit (d) (p < 0,005) und führten im zentralen Feld mehr Stopps durch (e) (p < 0,001), auch legten sie im offenen Feld weniger Faeces-Boli ab (f) (p < 0,0005).
(g, h) PACS-/--Mäuse zeigten ein erniedrigtes Zögern hinsichtlich des Betretens der offenen Abschnitte des "elevated zero-maze" (g) (p < 0,01; vier Pfoten außerhalb) und verbrachten mehr Zeit (p < 0,01) in den offenen Abschnitten (h) (vier Pfoten außerhalb). Wildtyp-Kontrollen (n = 28; offene Balken), PAC1-/- (n = 28; schwarze Balken)
Fig. 3: PAC1-/-- und PAC1CaMKCre2-Mäuse zeigen ein selektives
Defizit im hippocampusabhängigen assoziativen
Lernverhalten
(a) PAC1-/--Mäuse (n = 14 Mutanten, 14 Wildtyp-Tiere; p < 0, 005) sowie PAC1CaMKCre2-Mäuse (n = 12 Mutanten, 20 Wildtyp- Tiere; p < 0,01) zeigten eine stark verringerte "freezing"- Antwort bei der kontextuellen Angst-Konditionierung, jedoch nicht bei der "cued fear"-Konditionierung [Bitte, falls möglich, deutsche Bezeichnungen angeben.] (24 Stunden-Test).
(b) Im Gegensatz zu PAC1-/--Mäusen (n = 9 Mutanten, 12 Wildtyp-Tiere) zeigten PAC1-/--Mäuse (n = 14 Mutanten, 13 Wildtyp-Tiere) auch ein Defizit im Kurzzeit-Test der kontextuellen Angst-Konditionierung (p < 0,005). Wildtyp- Kontrollen (leere Balken), PAC1CaMKCre2-Mäuse (graue Balken), PAC1-/--Mäuse (schwarze Balken)
(a) PAC1-/--Mäuse (n = 14 Mutanten, 14 Wildtyp-Tiere; p < 0, 005) sowie PAC1CaMKCre2-Mäuse (n = 12 Mutanten, 20 Wildtyp- Tiere; p < 0,01) zeigten eine stark verringerte "freezing"- Antwort bei der kontextuellen Angst-Konditionierung, jedoch nicht bei der "cued fear"-Konditionierung [Bitte, falls möglich, deutsche Bezeichnungen angeben.] (24 Stunden-Test).
(b) Im Gegensatz zu PAC1-/--Mäusen (n = 9 Mutanten, 12 Wildtyp-Tiere) zeigten PAC1-/--Mäuse (n = 14 Mutanten, 13 Wildtyp-Tiere) auch ein Defizit im Kurzzeit-Test der kontextuellen Angst-Konditionierung (p < 0,005). Wildtyp- Kontrollen (leere Balken), PAC1CaMKCre2-Mäuse (graue Balken), PAC1-/--Mäuse (schwarze Balken)
Fig. 4: PAC1-/--Mäuse weisen eine dilatative
Kardiomyopathie auf
(a) Etwa 90% der in den C57b16 Hintergrund zurückgekreuzten PAC1-/-- Mäuse verstarben am Tag 8-14. Ferner zeigten diese Mäuse eine progrediente Schwäche und ein Ausbleiben der Gewichtszunahme ab Tag 6.
(b) Desweiteren wiesen diese Mäuse eine dilatative Kardiomyopathie auf, die alle 4 Herzkammern betraf. Auch zeigten diese Mäuse eine zentroazinöse Leberverfettung.
(c) Darüberhinaus zeigten diese Mäuse eine veränderte Genexpression. Beispielsweise war ANP (atrialer natriuret. Faktor) hoch- und SERCA (sarcoplasmat. Calcium ATPase) unterreguliert (etwa 30-40%).
(a) Etwa 90% der in den C57b16 Hintergrund zurückgekreuzten PAC1-/-- Mäuse verstarben am Tag 8-14. Ferner zeigten diese Mäuse eine progrediente Schwäche und ein Ausbleiben der Gewichtszunahme ab Tag 6.
(b) Desweiteren wiesen diese Mäuse eine dilatative Kardiomyopathie auf, die alle 4 Herzkammern betraf. Auch zeigten diese Mäuse eine zentroazinöse Leberverfettung.
(c) Darüberhinaus zeigten diese Mäuse eine veränderte Genexpression. Beispielsweise war ANP (atrialer natriuret. Faktor) hoch- und SERCA (sarcoplasmat. Calcium ATPase) unterreguliert (etwa 30-40%).
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele
erläutert.
Der PAC1-Lokus in ES-
Zellen wurde wie von Gu et al., (Science 265 (1994), 103-106)
beschrieben modifiziert. Der "Targeting"-Vektor wurde von
isogener DNA konstruiert (Kaestner et al., Genomics 20 (1994),
377-385). Die stromaufwärts gelegene loxP-Stelle wurde mittels
überlappender PCR zusammen mit einer zusätzlichen XbaI-Stelle
in das Intron eingeführt, das vor Exon 11 lag. Die verwendeten
Primer waren wie folgt:
Der 5'-Homologie-Arm, ein 3,5 kbp-SpeI/BamHI-Fragment, das
Exons 7 bis 10 des PAC1-Gens trägt (alle verwendeten DNA-
Fragmente stammen von einem genomischen λ-Phagen 18, der aus
einer genomischen Bibliothek isoliert wurde (Kastner et al.,
Genomics 20 (1994), 377-385)), wurde in den "Bluescript"-
Vektor Bluescript IIKS+/- (Stratagene) subkloniert und mit dem
0,35 kbp-BamHI/HindIII-Fragment fusioniert, das die
stromaufwärts gelegene loxP-Stelle und Exon 11 umfaßt. Die von
zwei loxP-Stellen flankierte Selektionskassette wurde
stromabwärts des BamHI/HindIII-Fragments unter Verwendung
einer HindIII/XhoI-Spaltung eingeführt. Schließlich wurde der
3'-Homologie-Arm, ein 4,5 kbp-HindIII-Fragment, zuerst in den
"Bluescript"-Vektor Bluescript IIKKS+/-(supra) subkloniert,
der innerhalb einer zerstörten Sacl-Stelle eine zweite XhoI-
Stelle beherbergte, danach über XhoI-Spaltung ausgeschnitten
und in die XhoI-Stelle des "Targeting"-Konstrukts subkloniert.
Damit wurden ES-Zellen und Klone in Gegenwart von G418 (350 µg/ml)
selektiert. G418-resistente Klone wurden mittels
Southern-Blot analysiert, wobei Sonden außerhalb der
Homologle-Arme verwendet wurden. Die 5-Sonde stellt ein 500 bp
großer PstI-SpeI Fragment dar, welches direkt an den 5'-
Homologiearm anschließt. Die 3'-Sonde ist ein 350 bg großes
HindIII-Fragment, welches direkt an den 3'-Homologiearm
anschließt. Die Häufigkeit der homologen Rekombination betrug
12%. Homolog rekombinierte Klone wurden transient mit einem
Cre-Expressionsplasmid pHD2 (von F. Weih, DKFZ, Heidelberg,
Deutschland bereitgestellt)(20 µg) transient transfiziert und
Subklone in Gegenwart von Gancyclovir (1 µM) selektiert. Die
das PAC1-/-- oder PAC1CaMKCre2-Allel tragenden Mäuse wurden
mittels Blastozysten-Injektion (Hogan et al., Manipulating the
Mouse Embryo; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994)
erhalten.
Zur Erzeugung von CaMKCre2-Mäusen wurde nlsCre in einen
CaMKIIα-Vektor wie kürzlich beschrieben kloniert (Kellendonk
et al., J. Mol. Biol. 285 (1999), 175-182). Linearisierte
pMM403-Cre-Insertions-DNA wurde in die Pronuclei von C57BI/6
Oozyten (Kellendonk et al., J. Mol. Biol. 285 (1999), 175-182)
injiziert und es wurden verschiedene transgene Linien
erhalten. In der CaMKCre2-Linie wurde das Expressionsmuster
der Cre-Rekombinase unter Verwendung eines anti-Cre-
Rekombinase-Antikörpers definiert (Kellendonk et al., J. Mol.
Biol. 285 (1999), 175-182). In 30% der PACCaMKCre2-Mäuse wurde
eine Mosaik-Inaktivierung des Cre-Rekombinase-Transgens
beobachtet. Diese Mäuse wurden post mortem durch Anfärbung mit
anti-Cre-Rekombinase-Antikörpern identifiziert und von
weiteren Experimenten ausgeschlossen.
RNase-
Schutz-Analysen und in situ-Hybridisierung wurden wie kürzlich
beschrieben durchgeführt (Otto et al., Mol. Brain Res. 66
(1999), 163-174). Folgende Sonden wurden für die RNase-Schutz-
Analysen verwendet: PAC1 (nt 1308-1644 der murinen PAC1-
cDNA; Hashimoto et al., Biochim. Biophys. Acta 1281 (1996),
129-133), VPAC1 (nt 1-232 der murinen VPAC1-cDNA; Johnson et
al., J. Neuroimmunol. 68 (1996), 109-119), und VPAC2 (nt 106-
446 der murinen VPAC2-cDNA; Inagaki et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91 (1994), 2679-2683).
Mutantenmäuse und Kontrollmäuse wurden
hinsichtlich Geschlecht und Alter aufeinander abgestimmt und
die Tiere eines Wurfes zusammen untergebracht. Die folgenden
Verhaltensstudien wurden durchgeführt: Test bezüglich
lokomotorischer Aktivität (Maldonado et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96 (1999), 14094-14099); "elevated zero-maze"
(Tronche et al., Nature Genet. 96 (1999), 99-103), "elevated
radial maze" (Maldonado et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96
(1999), 14094-14099); "Hell/Dunkel-Box" (Tronche et al.,
Nature Genet. 96 (1999), 99-103); "open field"-Test
(Leittinger et al., Behav. Genet. 24 (1994), 273-284); "morris
water maze", "social transmission of food preference" und
"fear conditioning" (Gass et al., Learn Mem. 5 (1998), 274-
288). Zur Beurteilung der allgemeinen lokomotorischen
Aktivität und des mit Angst in Zusammenhang stehenden
Verhaltens wurden verschiedene Gruppen von Mäusen in drei
unterschiedlichen Labors/Ländern untersucht. Die Ergebnisse
waren hochreproduzierbar und wurden mit dem Student T-Test und
ANOVA analysiert. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ±
Standardabweichung dargestellt. Zum direkten Vergleich der
beiden Mutantenmäusestämme wurden alle Experimente dieser
Studie mit dem gleichen genetischen Hintergrund (75% C75BI/6
/25% 129 Ola) durchgeführt.
Die Mutantenmäuse wurden gemäß vorstehendem Beispiel 1
hergestellt. Dabei wurde Exon 11, das für den größten Teil der
Transmembran-Domäne IV des Rezeptorproteins kodiert, zur
Inaktivierung aller bisher bekannten Spleißvarianten von PAC1
inaktiviert. Nach homologer Rekombination in embryonalen
Stammzellen (ES) wurden zwei unterschiedliche PAC1-Allele
erzeugt (Fig. 1a). Das PAC1-/--Allel mit fehlendem Exon 11
wurde zur Erzeugung von PAC1-/--Mäusen mit einer ubiquitären
Inaktivierung von PAC1 in Blastozysten injiziert. Im PAC1loxP_
Allel war Exon 11 von zwei loxP-Erkennungsstellen für die
Rekombinase-gesteuerte Exzision der dazwischenliegenden DNA-
Sequenz flankiert (Fig. 1a). PAC1loxP wird somit in jeder
Zelle, die die Rekombinase exprimiert, inaktiviert. Für PAC1loxP
homozygote Mäuse erscheinen normal und die Expression der
PAC1-mRNA ist mit der von Wildtyp-Mäusen identisch. Zur
Erzeugung der Mutanten-Mäuse mit einer vorderhirnspezifischen
Inaktivierung von PAC1 (PAC1loxP/loxP CaMKCre2, abgekürzt
PAC1CaMKCre2), wurden PAC1loxP-Mäuse mit transgenen Mäusen
(CaMKCre-Mäusen) gekreuzt, die Cre-Rekombinase unter Kontrolle
des CaMKIIα-Promotors exprimieren.
PAC1CaMKCre2-Mäuse zeigen, entsprechend des Expressionsmusters
für Cre-Rekombinase, eine Inaktivierung von PAC1 hauptsächlich
in drei Hirnbereichen, den Riechkolben, den Rindenbereichen des
Vorderhirns und dem gezähnten Gyrus (Fig. 1f). Im Gegensatz
dazu zeigten PAC1-/--Mäuse eine ubiquitäre Inaktivierung von
PAC1. Dabei fehlen Wildtyp-Transkripte von PAC1 vollständig
(Fig. 1b, e). Anstelle davon ist in PAC1-/--Hirnen ein
alternativ gespeißtes Transkript nachweisbar, das 8% der
Wildtyp-RNA-Spiegel erreicht (Fig. 1b). Die Sequenzierung
dieses Transkripts offenbarte ein alternatives Spleißen von
Exon 11 zu Exon 12, was zu einer Leserahmenverschiebung mit
der Entstehung eines darauffolgenden Stopcodons und dadurch zu
einem verkürzten Rezeptorprotein führt, das aufgrund des
Fehlens des dritten intrazellulären Loops G-Proteine nicht
mehr koppeln kann. Interessanterweise wurden die anderen, zu
der Klasse der PACAP-Typ-II-Rezeptoren zu zählenden PACAP-
Rezeptoren VPAC1 und VPAC2 nicht hochreguliert (Fig. 1c).
Zum Zeitpunkt der Entwöhnung fanden sich PAC1CaMKCre2-Mäuse zu
einem erwarteten Mendelschen Verhältnis (n = 381), während
PAC1-/--Mäuse nur mit einer Häufigkeit von 19% (anstelle von
25%) (n = 589) zu finden waren. Beide Mutantentypen waren
fertil, erschienen gesund und waren auf den ersten Blick von
ihren Wildtyp-Geschwistern nicht unterscheidbar. Die
histologische Untersuchung der Organe von beiden Mutanten-
Mauslinien ergab keine pathologischen Anomalien. Insbesondere
wurden innerhalb der Hippocampus-Formation weder neuronale
Proliferations- oder Differenzierungsdefekte noch "mossy
fibre" (Moosfaser)-Anomalien gefunden. Die neurologischen
Untersuchungen, zu denen Tests auf einer heißen Platte sowie
Tests der Reflexe, der motorischen Stärke und Koordination
("rotarod") zählten, ergaben keine Defizite hinsichtlich
sensorischer oder motorischer Fähigkeiten.
Aufgrund der hauptsächlichen Expression von PAC1 im
Zentralnervensystem waren vor allem Verhaltensstudien von
Interesse. PAC-/--Mäuse jedoch nicht PAC1CaMKCre2-Mäuse zeigten
sowohl eine gesteigerte lokomotorische Aktivität und ein
gesteigertes exploratives Verhalten als auch ein stark
verringertes Angstverhalten (Fig. 2). In einer fast
vollständig dunklen, nicht mit Streß verbundenen Umgebung war
die spontane lokomotorische Aktivität von PAC-/--Mäusen sowohl
in horizontalen als auch vertikalen Richtungen eindeutig
verstärkt (Fig. 2a). Selbst unter mit Streß verbundenen
Bedingungen in dem hell erleuchteten offenen Feld waren PAC-/--
Mäuse aktiver (Fig. 2b). Sie wanderten im Vergleich zu den
Kontroll-Mäusen längere Strecken, bewegten sich schneller,
untersuchten den offenen Bereich ausführlicher und
absolvierten weniger Ruhepausen (Fig. 2c). Außerdem waren die
PAC1-/--Mäuse im Vergleich zu ihren Wildtyp-Geschwistern weniger
ängstlich, was anhand der im Zentrum verbrachten Gesamtzeit
(Fig. 2d) oder der Menge an Stopps im Zentrum des offenen
Felds (Fig. 2e) belegt wird. Im Gegensatz dazu bevorzugten
die Kontroll-Tiere das Verbleiben in engem Wandkontakt und sie
versuchten, den Aufenthalt im zentralen Feld zu vermeiden
(Fig. 2e). Da die Defäkation unter Streßbedingungen eines der
sichersten Anzeichen von Angst ist, ist die stark verringerte
Menge an faekalen Boli, die von den PAC-/--Mäusen im offenen
Feld abgelegt wurden (Fig. 2f) in Übereinstimmung mit dem
verringerten Angstverhalten dieser Mäuse. Das verringerte
Angstverhalten der PAC-/--Mäuse wurde außerdem durch drei das
Verhalten untersuchende Paradigmen weiter bestätigt, die auf
dem natürlichen Vermeidungsverhalten von Mäusen beruhen:
"elevated zero-maze", "Hell/Dunkel-Box" und "elevated zero
maze" (Fig. 2g, h,). Im Vergleich zu den Kontrolltieren
betraten PAC-/--Mäuse die offenen Bereiche des "elevated zero
maze" früher mit allen vier Pfoten (Fig. 2g), öfter und sie
verbrachten dort auch mehr Zeit (Fig. 2h). Es wurde zwar
berichtet, dass Hippocampus-Schäden zu einer Hyperaktivität
führen, die in den PAC-/--Mäusen beobachtete erhöhte
lokomotorische Aktivität und das verringerte Angstverhalten
beruhen jedoch höchstwahrscheinlich nicht auf einer
Hippocampus-Inaktivierung von PAC1, da PACCaMKCre2-Mäuse mit
einer fast vollständigen Inaktivierung von PAC1 im Hippocampus
(Fig. 1f) keinen vergleichbaren Phänotyp zeigten. Andere
Strukturen, die am mit Angst in Beziehung stehenden Verhalten
beteiligt sind, sind die Amygdala, das "periaqueductal gray"
(zentrales grau) und das laterale Septum. Diese zeigten alle
eine starke Expression von PAC1, der Rezeptor war in diesen
Bereichen allderings nur bei den PAC-/--Mäusen inaktiviert und
nicht bei den PACCaMKCre2-äusen, was die beobachteten
Unterschiede im Phänotyp erklären könnte.
Bei zwei hippocampusabhängigen Aufgaben, die das deklarative
Lernen und das Gedächtnis nachbilden, das "Morris water maze"
und die "social transmission of food preference" wurden keine
Defizite beobachtet. Da die Hippocampus-Expression von PAC1
fast ausschließlich auf die "mossy fibre"-Synapsen beschränkt
ist, ist das Ausbleiben von Defiziten hinsichtlich des
räumlichen Lernens in den Mutanten-Mäusen keineswegs
überraschend. Im Gegensatz zu der Synapse zwischen CA3 und CA1
scheinen die "mossy fibre"-Synapsen für das räumliche Lernen
weniger wichtig zu sein. Der größte Teil der räumlichen
Information wird vermutlich direkt von der entorhinalen Rinde
zu pyramidalen Zellen von CA3 und CA1 übertragen, wobei die
"mossy fibre"-Synapse umgangen wird und nicht der
traditionelle trisynaptische Kreislauf beschritten wird. Beide
Mausmutanten zeigten ein selektives Defizit im
hippocampusabhängigen Assoziationslernen. Sowohl PAC-/--Mäuse
als auch PACCaMKCre2-Mäuse zeigten eine drastische Verringerung
der "freezing"-Antwort im Langzeittest der kontextuellen
Konditionierung, jedoch nicht bei der "cued fear"-
Konditionierung (Fig. 3a). Aufgrund dieser Ergebnisse, d. h.
der Angstkonditionierung hinsichtlich des Tones, und der
bisher beobachteten Rolle des Hippocampus hinsichtlich dieser
Konditionierungen wird davon ausgegangen, dass die
beeinträchtigte "freezing"-Antwort im Langzeittest der
kontextuellen Furchtkonditionierung ein hippocampusabhängiges
Defizit hinsichtlich des Lernverhaltens wiederspiegelt.
Hirnbereiche mit einer vollständigen Inaktivierung von PA1
sowohl bei PAC-/--Mäusen als auch PACCaMKCre2-Mäusen sind der
gezähnte Gyrus und Neokortex-Bereiche des Vorderhirns. Da
Läsionen des Neokortex die kontextuelle Angstkonditionierung
nicht beeinträchtigten, scheint die präsynaptische PAC1-
vermittelte Signalübertragung an der "mossy fibre"-Synapse
eine kritische Rolle für die Festigung der kontextuellen Angst
im Langzeitgedächtnis zu spielen. Im Gegensatz zu PACCaMKCre2-
Mäusen zeigten PAC-/--Mäuse ein Defizit beim Hippocampus
abhängige Kurzzeittest hinsichtlich der Konditionierung der
kontextuellen Angst (Fig. 3b). Dieser Befund steht in
Übereinstimmung mit der früheren und ubiquitären Inaktivierung
von PAC1 in diesen Mutanten.
PAC1-/-- Mäuse wurden in den C57b16 Hintergrund zurückgekreuzt
und es wurde eine phänotypische und genotypische Analyse der
Mäuse durchgeführt. Es zeigte sich, daß 90% der Mäuse am Tag
8-14 verstarben. Ferner zeigten die Mäuse eine progrediente
Schwäche und ein Ausbleiben der Gewichtszunahme ab Tag 6 nach
der Geburt (Fig. 4(a)). Desweiteren zeigten die Mäuse eine
dilatative Kardiomyopathie, die alle 4 Herzkammern betraf.
Auch wiesen die Mäuse eine hierzu passende zentroazinäre
Leberverfettung auf, wie man sie bei einer Hypoxämie erwarten
würde, und die hier durch die reduzierte Pumpleistung des
Herzens bedingt ist (Fig. 4(b)). Auf molekularer Ebene wurde
eine für das insuffiziente Herz typische Veränderung der
Genexpression bzgl. ANP (Hochregulierung) und SERCA
(Unterregulierung) beobachtet.
Claims (11)
1. Nicht-menschliches Säugetier, bei dem der PACAP-Typ-I-
Rezeptor ubiquitär oder gewebespezifisch verändert ist.
2. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1, wobei der
PACAP-Typ-I-Rezeptor inaktiviert ist.
3. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 2, wobei der
PACAP-Typ-I-Rezeptor gewebespezifisch inaktiviert ist.
4. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 3, wobei der
PACAP-Typ-I-Rezeptor vorderhirnspezifisch inaktiviert
ist.
5. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1
bis 4, wobei Exon 11 des für den PACAP-Typ-I-Rezeptor
kodierenden Gens deletiert ist.
6. Verfahren zur Herstellung des nicht-menschlichen
Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem
gewebespezifisch veränderten PACAP-Typ-I-Rezeptor,
umfassen die folgenden Schritte:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der nach Rekombination mit dem Genom des nicht- menschlichen Säugetiers zur Insertion von zwei Erkennungsstellen für eine Rekombinase in die für den PACAP-Typ-I-Rezeptor kodierende DNA führt, wobei einerseits die Insertion der beiden Erkennungsstellen die Expression eines biologisch aktiven Rezeptors nicht nachteilig beeinflußt und andererseits die beiden Erkennungsstellen einen Genbereich flankieren, dessen Verlust zur Expression eines in seiner biologischen Aktivität veränderten, insbesondere inaktivierten Rezeptors führt;
- b) Isolierung von in Schritt (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in ein erstes nicht-menschliches Säugetier;
- c) Injektion von Oocyten eines zweiten nicht- menschlichen Säugetiers mit einem das Gen für eine Rekombinase unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors enthaltenden Vektor;
- d) Einführung der injizierten Oocyten von Schritt (c) in ein zweites nicht-menschliches Säugetier;
- e) Kreuzung der nicht-menschlichen Säugetiere aus Schritt (b) und (d); und
- f) Selektion der nach Schritt (e) erhaltenen Nachkommen auf solche mit einem gewebespezifisch veränderten, insbesondere inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptor.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Erkennungsstellen
für Rekombinase LoxP-Stellen sind und die Rekombinase
Cre-Rekombinase ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der von den LoxP-Stellen
flankierte Bereich des den PACAP-Typ-I-Rezeptor
kodierenden Gens Exon 11 ist.
9. Verfahren zur Herstellung des nicht-menschlichen
Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem
ubiquitär veränderten PACAP-Typ-I-Rezeptor, umfassend die
folgenden Schritte:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der nach homologer Rekombination mit dem Genom des nicht-menschlichen Säugetiers zur Erzeugung eines für einen veränderten, insbesondere inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptor kodierenden Gens führt;
- b) Isolierung der in Schritt (a) erhaltenen Zellen und Einbringung dieser in Blastozysten;
- c) Einführung der injizierten Blastozysten von Schritt (b) in ein nicht-menschliches Säugetier; und
- d) Untersuchung des nach Schritt (c) erhaltenen nicht-menschlichen Säugetiers hinsichtlich eines ubiquitär veränderten, insbesondere inaktivierten PACAP-Typ-I-Rezeptors.
10. Verwendung des nicht-menschlichen Säugetiers nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des nach dem
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9
erhältlichen nicht-menschlichen Säugetiers zur
Charakterisierung von Genen und/oder Testung von
Substanzen, Arzneimitteln und/oder Therapieansätzen,
die einen Einfluß auf mit Lernfähigkeit, Schmerz
,Angstverhalten und/oder dilatativer Kardiomyopathie
in Zusammenhang stehenden Prozessen haben.
11. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der
Ansprüche 1 bis 5, Verfahren nach einem der
Ansprüche 6 bis 9 oder Verwendung nach Anspruch 10,
wobei das nicht-menschliche Säugetier eine Maus ist.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000151259 DE10051259A1 (de) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-Rezeptor |
| PCT/DE2001/003957 WO2002033103A2 (de) | 2000-10-16 | 2001-10-16 | Nicht-menschliches säugetier mit verändertem pacap-typ-i-rezeptor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000151259 DE10051259A1 (de) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-Rezeptor |
Publications (1)
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|---|---|
| DE10051259A1 true DE10051259A1 (de) | 2002-05-08 |
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ID=7659979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000151259 Ceased DE10051259A1 (de) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem PACAP-Typ-I-Rezeptor |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10051259A1 (de) |
| WO (1) | WO2002033103A2 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009033489A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Glostrup Hospital | Selective pacl inhibitors for use in the treatment of migraine and headaches |
-
2000
- 2000-10-16 DE DE2000151259 patent/DE10051259A1/de not_active Ceased
-
2001
- 2001-10-16 WO PCT/DE2001/003957 patent/WO2002033103A2/de active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GU, H., MARTH, J.D., ORBAN, P.C., MOSSMANN, H., & RAJEWSKY, K.: Deletion of a DNA Polymerase b gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. In: Science, 1994, Vol. 265, S. 103-106 * |
| JAMEN, F., PERSSON, K., BERTRAND, G., RODRIGUEZ- HENCHE, N., PUECH, R., BOCKAERT, J., AHREN, B., & BRABET, P.: PACI receptor-deficient mice display impaired insulinotropic response to glucose and reduced glucose tolerance. In: J.Clin.Invest. 2000, Vol. 105, S. 1307-1315 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO2002033103A2 (de) | 2002-04-25 |
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